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CN108864284A - 兔抗人pd-l1蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途 - Google Patents

兔抗人pd-l1蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兔抗人PD‑L1蛋白的单克隆抗体，能够特异性地识别细胞表面表达的PD‑L1蛋白，表现稳定且效价高，与细胞内其它蛋白无交叉反应，具有一定的医学基础研究价值。本发明还涉及上述单克隆抗体在制备用于检测PD‑L1蛋白的免疫组化检测工具中的应用。本发明采用免疫组织化学的方法检测肿瘤细胞表面PD‑L1的表达，主要包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌，为是否使用PD‑1/PD‑L1抑制剂进行免疫治疗和肿瘤的预后判断提供科学参考，有效降低治疗费用，具有重要的应用价值。

Description

兔抗人PD-L1蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种兔抗人PD-L1蛋白的单克隆抗体，以及该抗体的免疫组化用途。
背景技术
细胞程序性死亡受体-配体1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)，属于I型跨膜蛋白，全长290个氨基酸，分子量约为40kDa。近年来，研究发现PD-L1在多种肿瘤细胞表面表达上调，这一现象与肿瘤的免疫逃逸相关。机体的免疫系统通常会识别肿瘤细胞并对其产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增生，因而将肿瘤细胞杀死或排除。但机体对肿瘤的免疫排除作用受到免疫调节点的控制，其中最重要的调节点就是细胞程序性死亡受体-1(Programmed cell death-1，PD-1)。当T细胞表面的PD-1识别肿瘤细胞表面的PD-L1，可以传导抑制性的信号，降低T细胞的增生，T细胞就不能发现肿瘤细胞，不能向肿瘤细胞发出攻击信号，导致肿瘤免疫逃逸的发生。同时，在肿瘤微环境中，PD-L1也是造成肿瘤细胞逃逸免疫监控的重要因子之一。一方面，肿瘤微环境存在的一些炎性细胞因子，如IFN-α，IFN-β，IFN-γ和TNF-α，可促进肿瘤细胞表面的PD-L1表达。另一方面，PD-L1还可促进肿瘤细胞发生上皮间质化而促进肿瘤的转移和浸润。研究和临床试验结果显示，利用PD-1/PD-L1抑制剂阻断PD-1/PD-L1信号通路，恢复T细胞的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果。但这一疗法仅对于存在PD-L1高表达的肿瘤具有理想的疗效，对于无PD-L1高表达的肿瘤疗效甚微，且具有副作用。因此，研制出一种特异性高、表现稳定的PD-L1抗体，用于检测肿瘤表面PD-L1的表达，对于后续是否使用PD-1/PD-L1抑制剂进行免疫治疗具有重要意义。
目前，国际上对于选择合适的PD-1/PD-L1抑制剂需要相应的PD-L1检测方法，鉴于每种检测所使用的PD-L1抗体和技术都不同，在使用这些抗体进行辅助诊断时费用较高，同时在配套仪器和应用方面受国外供应商限制。而国内研发的PD-L1抗体稀少，特异性和亲和力方面均有待提高，因此亟待研发新的性能优异的抗PD-L1单克隆抗体，填补国内本行业的空白，降低治疗费用，减轻病人负担。本发明成功研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的兔源PD-L1蛋白的单克隆抗体，可用于不同免疫细胞和肿瘤细胞PD-L1的表达水平研究，疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究以及PD-L1调节机体免疫功能的机理研究，具有一定的医学基础研究价值。本发明采用免疫组织化学方法(IHC)检测肿瘤细胞表面PD-L1的表达，主要包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌，为是否使用PD-1/PD-L1抑制剂进行免疫治疗及肿瘤的预后判断提供科学参考，有效降低治疗费用，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗PD-L1蛋白的单克隆抗体，及该抗体在制备用于检测PD-L1蛋白的免疫组织化学检测工具中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性结合人PD-L1蛋白的单克隆抗体。
本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：
(1)免疫源的制备：根据PD-L1基因(BC113734)序列信息，订购合成N末端带BSA序列(提高多肽的免疫原性)的人类PD-L1多肽(加拿大应用生物材料有限公司，AppliedBiological Materials Inc.)，用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。
(2)免疫前采血：选取纯种新西兰白兔(New Zealand white rabbit)，酒精擦拭兔耳部，取耳缘静脉血液为免疫前血样。
(3)单抗的筛选与制备：采用合成的N末端带BSA序列的人类PD-L1多肽免疫纯种新西兰白兔，取兔耳缘静脉血采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测试血清中PD-L1抗体滴度。对阳性动物血清制备外周血单核细胞悬液，应用荧光标记的上述多肽抗原进行染色，采用流式细胞仪选取PD-L1抗体阳性表达的单个细胞加入到96孔中。对各个上述选取的单个细胞采用RT-PCR扩增兔抗体轻、重链。由同一细胞获得的配套轻、重链扩增产物分别克隆到相应的表达载体。Sanger测序并进行序列功能分析后，选择具有有效抗体生成功能的载体质粒转染293T细胞。收集细胞培养液应用ELISA和Western Blot(结果见图1)筛选阳性抗体克隆。进一步通过proteinA柱层析纯化PD-L1单抗。通过免疫组化实验(结果见图2)验证该单抗的灵敏度和特异性。
本发明的另一个目的在于提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测PD-L1蛋白的免疫组化工具中的应用。
所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。
本发明还提供了应用上述单克隆抗体在制备用于检测多种实体肿瘤中PD-L1表达的应用。由于PD-L1是肿瘤细胞逃逸免疫监控的重要因子之一，因此检测PD-L1在肿瘤细胞表面的表达对于选择适当的免疫检查点抑制剂治疗具有重要的指导意义。
以使用Leica的免疫组化自动染色机BondMax为例，应用该PD-L1单克隆抗体进行免疫组化染色的条件为：
(1)使用机器自带的IHC protocol F，将过氧化物酶封闭步骤由使用一抗前移至DAB显色前；
(2)抗体使用终浓度为1.0μg/ml，室温孵育30min；
(3)抗原修复使用pH 9.0的抗原修复液(ER2)，100℃加热孵育30min。
使用其他IHC自动染色机或进行手工染色时，请参照上述条件进行。
本发明所述针对PD-L1的特异性单抗，可与PD-L1蛋白特异结合，提高了实验的特异性和可靠性，并建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术，主要用于对黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌或相关肿瘤的抑制剂治疗方案选择和肿瘤的预后判断提供科学参考。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明单克隆抗体的Western Blot结果：上样样品均为同一转染PD-L1基因的293T细胞裂解液，由左向右依次为：M泳道为Marker，1泳道为筛选的PD-L1单克隆样本，2泳道为使用β-Actin抗体检测的阳性对照的结果，3泳道为无一抗阴性对照的结果。
图2为以本发明单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测非小细胞肺癌组织中PD-L1蛋白的表达染色图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1抗PD-L1单克隆抗体的制备
一、免疫源的制备：根据PD-L1基因(BC113734)序列信息，订购合成N末端带BSA序列的人类PD-L1多肽，用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。
二、免疫前采血：选取纯种新西兰白兔，取耳缘静脉血液为免疫前血样。
三、单抗的筛选与制备
1、动物免疫：上述合成的的N末端带BSA序列的人类PD-L1多肽与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，制备完全乳化的免疫源，采用皮下注射方法初次免疫纯种新西兰白兔，免疫剂量为500μg/只。两周后，进行第二次免疫，使用不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为500μg/只。两周后，取兔耳缘静脉血用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清效价，根据结果确定是否加强免疫。
2、筛选和克隆：一周后，取兔耳缘静脉血液制备外周血单核细胞悬液，PD-L1多肽抗原采用Alexa Fluor 488 NHS-Ester标记，应用荧光标记的多肽抗原进行染色，使用流式细胞技术(FACS)将单个抗体生成细胞分别打入预加有反转录反应试剂10μl的96孔板中，进行RT-PCR反应扩增兔抗体轻、重链。由同一细胞获得的配套轻、重链扩增产物分别克隆到相应的表达载体。Sanger测序并进行序列功能分析后，选择具有有效抗体生成功能的载体质粒转染293T细胞。收集细胞培养液进行抗体克隆筛选。采用ELISA和Western Blot(结果见图1)筛选阳性抗体克隆。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。
3、单抗的制备与纯化：收集ELISA阳性的细胞培养液20ml进行protein A柱层析纯化，纯化后的单抗先进行浓度测定，后分装、冻存在-20℃。
实施例2以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化实验
1、分别取24种不同类型的癌组织取样制作组织芯片，使用Leica RM2235型组织切片机进行切片，切片厚度为4μm；
2、使用Leica BondMax免疫组化自动染色机对本发明抗体进行免疫组化染色测试，使用机器自带的脱蜡与水化条件，具体步骤为：60℃孵育30min，应用脱蜡溶液(Leica)洗3遍。抗原修复采用抗原修复液2(ER2，Leica)，100℃孵育30min。一抗使用本发明抗体，采用抗体稀释液(Leica)稀释到终浓度为1.0μg/ml，150μl。抗体室温孵育30min。使用配套的二抗(Leica)150μl，室温孵育8min。使用多聚物检测液(Leica)150μl，室温孵育8min。使用内源性过氧化物酶封闭液150μl室温孵育5min。使用DAB显色液(Leica)150μl，室温孵育10min。苏木素复染，室温孵育5min；
3、脱水和透明：去离子水清洗1min，95％乙醇1min，100％乙醇2min x 2次，二甲苯2min x 3次，中性树胶封片；
4、镜检，结果：部分肿瘤显示阳性染色，包括肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌等，部分肿瘤显示阴性无PD-L1染色，包括脑癌、乳腺癌、肝癌等。其中非小细胞肺癌组织染色如图2所示，可见明显细胞膜染色，染色细胞包括部分肿瘤浸润淋巴细胞及部分肿瘤细胞。染色模式正确，信号较强，未见明显非特异染色。
实施例3本发明单克隆抗体的特异性检测
应用本发明抗体检测未经转染的293T细胞未见任何阳性条带。
应用本发明抗体采用ELISA检测无关抗原预铺的96孔板(Her-2)，结果为阴性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种兔抗人单克隆抗体，其特征在于能够特异性结合人PD-L1蛋白。
2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测PD-L1蛋白的免疫组化检测工具中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫组化检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该免疫组化检测工具可以用于辅助治疗方案选择、肿瘤的预后判断及医学基础研究。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的辅助治疗方案选择可用于包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌或相关肿瘤。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的医学基础研究可用于对PD-L1在不同免疫细胞和肿瘤细胞的表达水平，疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究及PD-L1调节机体免疫功能的机理研究。
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