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CN108314739B - 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用 - Google Patents

多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的NK细胞及应用。该嵌合抗原受体包括第一片段、第二片段以及连接第一片段与第二片段的自裂解多肽T2A，第一片段包括依次连接的第一信号肽、TCRγ链以及TCRδ链，第二片段包括依次连接的第二信号肽SP、肿瘤抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域及DAP12‑ITAM结构域，自裂解多肽T2A的C端与TCRδ链相连，自裂解多肽T2A的N端与第二信号肽SP相连。实验结果表明，上述多信号嵌合抗原受体能够在NK细胞中稳定表达，能够更为快速特异性的识别恶性肿瘤细胞并进行杀伤，降低治疗的毒副作用。

Description

多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的NK细胞及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的NK细胞及应用。
背景技术
新陈代谢是机体生命活动的基本特征，包括物质代谢和与之相伴的能量代谢。有机体在物质代谢过程中能量的释放、转换和利用过程，称为能量代谢。恶性肿瘤的一个重要特征为肿瘤细胞的高代谢能力，肿瘤细胞高代谢可以特异性地过度产生肿瘤磷酸化抗原小分子。
近年来过继性细胞治疗技术中，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞技术在治疗肿瘤的临床应用中取得了显著的突破，在临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。但是，最新的临床实验中发现CAR-T技术具有引起细胞因子风暴及系统性神经毒性等高风险因素。
自然杀伤细胞(Natural Killer Cell，NK细胞)是人体先天免疫的核心组成部分，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞，来源于造血干细胞，在骨髓内发育成熟。在外周血中约占淋巴细胞总数的10％～15％，脾内约有3％～4％，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。与T细胞比较，NK细胞具有很多特点：固有免疫细胞、非特异性直接杀伤靶细胞、不需要预先由抗原致敏、不需要抗体参与、无MHC限制性、发挥免疫杀伤作用早。因此，研究人员希望通过嵌合抗原受体修饰的NK细胞用于治疗肿瘤。
然而，传统的嵌合抗原受体修饰的NK细胞存在识别过程不灵敏、治疗毒副作用多的问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够在NK细胞中稳定表达、识别肿瘤细胞过程灵敏、治疗毒副作用少的多信号嵌合抗原受体及其表达基因。
此外，还提供一种表达载体以及一种多信号嵌合抗原受体修饰的NK细胞及其应用。
一种多信号嵌合抗原受体，包括第一片段、第二片段以及连接所述第一片段与所述第二片段的自裂解多肽T2A，所述第一片段包括依次连接的第一信号肽、TCRγ链以及TCRδ链，所述第二片段包括依次连接的第二信号肽SP、肿瘤抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域，所述自裂解多肽T2A的C端与所述TCRδ链相连，所述自裂解多肽T2A的N端与所述第二信号肽SP相连。
在一个实施方式中，所述第一片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第二片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在一个实施方式中，编码所述第一片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码所述第二片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
在一个实施方式中，所述嵌合抗原受体为：
(a)由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，
(b)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
在一个实施方式中，所述嵌合抗原受体为：
(a)由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，
(b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
一种表达基因，用于表达多信号嵌合抗原受体，所述多信号嵌合抗原受体包括第一片段、第二片段以及连接所述第一片段与所述第二片段的自裂解多肽T2A，所述第一片段包括依次连接的第一信号肽、TCRγ链以及TCRδ链，所述第二片段包括依次连接的第二信号肽SP、肿瘤抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域，所述自裂解多肽T2A的C端与所述TCRδ链相连，所述自裂解多肽T2A的N端与所述第二信号肽SP相连。
在一个实施方式中，所述表达基因为：
(a)如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或，
(b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述嵌合抗原受体活性的核苷酸序列。
一种表达载体，所述表达载体中含有上述的表达基因。
一种多信号嵌合抗原受体修饰的NK细胞，所述NK细胞中能够表达上述任一项所述的嵌合抗原受体，或者所述NK细胞中导入了上述任一项所述的表达基因，或者所述NK细胞中转染了上述所述的表达载体。
上述任一项所述的嵌合抗原受体、上述任一项所述的表达基因、上述的表达载体、或上述的多信号嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备抗肿瘤的药物中的应用。
实验结果表明，上述多信号嵌合抗原受体能够在NK细胞中稳定表达，从而形成嵌合抗原受体修饰的NK细胞。该多信号嵌合抗原受体表达后能够通过第一片段中的TCRγ链以及TCRδ链识别高代谢恶性肿瘤磷酸化抗原小分子，使CAR-NK细胞靶向结合肿瘤细胞，此为第一信号。如果该肿瘤细胞表面表达了嵌合抗原受体中肿瘤抗体对应的肿瘤抗原，进一步激活CAR下游信号，从而杀伤肿瘤细胞，此为第二信号。产生的第一信号与第二信号配合，使得经该嵌合抗原受体修饰的NK细胞(CAR-NK)能够更为快速特异性的识别恶性肿瘤细胞并进行杀伤，降低治疗的毒副作用。
附图说明
图1为实施例1中第三组的嵌合抗原受体的结构示意图；
图2为实施例1中构建的pLenti7.3-γδTCR/c-Met-CAR慢病毒表达载体的谱图；
图3为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在不同条件下体外杀伤细胞的流式散点结果比对图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的多信号嵌合抗原受体，包括第一片段、第二片段以及连接第一片段与第二片段的自裂解多肽T2A。其中，第一片段包括依次连接的第一信号肽、TCRγ链以及TCRδ链，第二片段包括依次连接的第二信号肽SP、肿瘤抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域。自裂解多肽T2A的C端与TCRδ链相连，自裂解多肽T2A的N端与第二信号肽SP相连。
上述多信号嵌合抗原受体表达后能够通过第一片段中的TCRγ链以及TCRδ链识别高代谢恶性肿瘤磷酸化抗原小分子，使CAR-NK细胞靶向结合肿瘤细胞，此为第一信号。如果该肿瘤细胞表面表达了嵌合抗原受体中肿瘤抗体对应的肿瘤抗原，进一步激活CAR下游信号，从而杀伤肿瘤细胞，此为第二信号。产生的第一信号与第二信号配合，使得经该嵌合抗原受体修饰的NK细胞(CAR-NK)能够更为快速特异性的识别恶性肿瘤细胞并进行杀伤，降低治疗的毒副作用。
在一个实施方式中，第一片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其中SEQID No.1中第1号氨基酸～第22号氨基酸为第一信号肽序列，第23号氨基酸～第296号氨基酸为TCRγ链序列，第297号氨基酸～第556号氨基酸为TCRδ链序列。
进一步地，经过密码子优化，获得编码第一片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
具体地，第二片段中的肿瘤抗体选自CD19抗体、CD20抗体、NY-ESO-1抗体、MUC1抗体、VEGFR1抗体、VEGFR2抗体、EGFR抗体、EGFRvIII抗体、c-Met抗体和Meso抗体中至少一种。
在本实施方式中，肿瘤抗体为c-Met抗体，利用筛选的抗c-Met的单克隆抗体序列，选出其中VH和VL的序列，用于设计CAR载体中的scFv序列，得到如c-Met单链抗体的氨基酸序列。
具体地，第二片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。其中SEQ ID No.2中第1号氨基酸～第22号氨基酸为第二信号肽序列，第23号氨基酸～第119号氨基酸为c-Met抗体VH(重链)序列，第120号氨基酸～第134号氨基酸为连接氨基酸，第135号氨基酸～第240号氨基酸为c-Met抗体VL(轻链)序列。第241号氨基酸～第244号氨基酸为酶切位点，第245号氨基酸～第315号氨基酸为CD8结构域(包括铰链区及跨膜结构域)，第316号氨基酸～第357号氨基酸为41BB胞内结构域(共刺激信号胞内结构域)，第358号氨基酸～第405号氨基酸为DAP12-ITAM结构域(DAP12免疫受体酪氨酸活化基序ITAM结构域)。
进一步地，经过密码子优化，获得编码第二片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本实施方式中，嵌合抗原受体为：(a)由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，(b)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
具体地，SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中，第1号氨基酸～第556号氨基酸为第一片段，第556号为终止子。第558号氨基酸～第578号氨基酸为自裂解多肽T2A，第579号氨基酸～第983号氨基酸为第二片段。
进一步地，嵌合抗原受体为：(a)由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，(b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。因此在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有嵌合抗原受体活性的蛋白质，或在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有多信号嵌合抗原受体活性的衍生的蛋白，得到的蛋白与嵌合抗原受体没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。
经过不断的研究探索，成功设计出上述功能结构的多信号嵌合抗原受体(CAR)。经试验验证该多信号嵌合抗原受体(CAR)能够快速特异性的识别恶性肿瘤细胞并进行杀伤，降低治疗的毒副作用。
上述多信号嵌合抗原受体(CAR)能够运用在抗肿瘤的药物中。
此外，本申请还提供一实施方式的表达基因，该表达基因用于表达多信号嵌合抗原受体。
具体地，嵌合抗原受体的特征请参见上文的描述，在此不作赘述。
具体地，该表达基因为：(a)如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或，(b)在SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有嵌合抗原受体活性的核苷酸序列。
上述表达基因能够表达多信号嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体经试验验证能够能够在NK细胞中稳定表达，并快速特异性的识别恶性肿瘤细胞并进行杀伤，降低治疗的毒副作用。
上述表达基因能够运用在抗肿瘤的药物中。
此外，本申请还提供一实施方式的表达载体，该表达载体中含有上述表达基因。
在一个实施方式中，该表达载体为含有上述表达基因的慢病毒。
该表达载体能够用于表达上述嵌合抗原受体，表达效率高，表达量稳定，能够运用在抗肿瘤的药物中。
此外，本申请还提供一种实施方式多信号嵌合抗原受体修饰的NK细胞。该NK细胞能够表达上述的嵌合抗原受体，或者该NK细胞中导入了上述的表达基因，或者该NK细胞中转染了上述的表达载体。
具体地，嵌合抗原受体的特征请参见上文的描述，在此不作赘述。
实验结果表明，上述多信号嵌合抗原受体修饰的NK细胞对肿瘤具有特异性的高效杀伤作用。
本专利应用基因工程方法，将γδTCR(包含TCRγ链以及TCRδ链)和靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体克隆至NK细胞，肿瘤抗原可以选自CD19、CD20、NY-ESO-1、MUC1、VEGFR1、VEGFR2、EGFR、EGFRvIII、c-Met、Meso中的一种或数种，γδTCR和嵌合抗原受体结构用自裂解多肽T2A分别表达于NK细胞表面。表达γδTCR和嵌合抗原受体的NK细胞，通过γδTCR识别高代谢恶性肿瘤磷酸化抗原小分子，使CAR-NK细胞靶向结合肿瘤细胞，此为第一识别信号。如果该肿瘤细胞表面表达了嵌合抗原受体对应的肿瘤抗原，此为第二识别信号，则会激活CAR下游信号，从而杀伤肿瘤细胞。该多信号嵌合抗原受体修饰的NK细胞(CAR-NK)能够更为快速特异性的识别恶性肿瘤细胞并进行杀伤，降低治疗的毒副作用。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。单位mM表示mmol/L，M表示mol/L。
实施例1
1、慢病毒表达载体的构建
1.1c-Met scFv序列
利用本实验室筛选的抗c-Met的单克隆抗体序列，选出其中VH和VL的序列，用于设计CAR载体中的scFv序列。
1.2序列合成及载体构建
根据实验要求，分别合成三段序列用于构建慢病毒表达载体：
表达载体一(第一组)：pLenti7.3-γδTCR慢病毒表达载体，序列如SEQ IDNo.3所示，包括信号肽SP、TCRγ链、TCRδ链。
表达载体二(第二组)：pLenti7.3-c-Met-CAR慢病毒表达载体，序列如SEQID No.4所示，包括c-Met单链抗体(scFv)、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域。
表达载体三(第三组)：pLenti7.3-γδTCR/c-Met-CAR慢病毒表达载体，序列如SEQID No.6所示，包括信号肽SP、TCRγ链、TCRδ链、T2A、信号肽SP、c-Met单链抗体(scFv)、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域。人工构建的基因片段结构如图1所示，质粒谱图如图2所示。
三段序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成整个表达框，分别克隆至pLenti7.3慢病毒表达载体中。
2、慢病毒的包装制备
2.1Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10mL 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
2.2Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5mL含10％FBS的Opti-
Figure BDA0001569587280000081
I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)。
2.3DNA-
Figure BDA0001569587280000082
2000复合物的制备：
a)将1.5mL无血清的Opti-
Figure BDA0001569587280000083
I培养液加入5mL离心管中，加入9μg ViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒，轻柔混合。
b)将1.5mL无血清的Opti-
Figure BDA0001569587280000084
I培养液加入另一个5mL离心管中，加入36μL
Figure BDA0001569587280000085
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
c)将a)、b)两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
d)室温下孵育20min，得到DNA-
Figure BDA0001569587280000086
2000复合物。
2.4将得到的DNA-
Figure BDA0001569587280000087
2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
2.5Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10mL DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48-72h。
2.6Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15mL离心管中，在4℃条件下2000g离心15min。
2.7吸取上清液，收集慢病毒，分装入1mL冻存管中，置于-80℃长期保存。
3、γδTCR-NK细胞、c-Met-CAR-NK细胞、γδTCR/c-Met-CAR-NK细胞的制备
3.1分离健康志愿者PBMC细胞
(1)抽取健康志愿者外周血25mL，肝素抗凝，室温离心(700g，20min)；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，离心(900g，30min)，取自体血浆4℃保存备用。
(2)取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50mL，混匀，缓慢加到装有20mL人淋巴细胞分离液的50mL离心管中，室温离心(800g，15min)。
(3)吸取白膜层细胞，加入到装有5mL RPMI 1640的50mL离心管中。
(4)RPMI 1640洗涤两次(600g，10min离心)，收集细胞即为PBMC细胞。
3.2细胞的制备
(1)用含50ng/mL CD16单抗、1000U/mL IL-2、100ng/mL IL-15和0.5％自体血浆的Alys505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/mL，转入六孔板中，2mL/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
(2)每3天调整细胞密度为1×106/mL，添加含1000U/mL IL-2和0.5％自体血浆的Alys505培养液。
(3)第7天，将NK细胞分成四组，每组细胞均按1×105/孔的密度转移至24孔板中，100μL/孔，每组设三个复孔。
第1组：转染pLenti7.3-γδTCR慢病毒，命名为γδTCR组。
第2组：转染pLenti7.3-c-Met-CAR慢病毒，命名为c-Met-CAR组。
第3组：转染pLenti7.3-γδTCR/c-Met-CAR，命名为γδTCR/c-Met-CAR组。
第4组：空白NK细胞对照组，命名为NC组。
第1至第3组按照MOI值＝20(此处MOI表示病毒数与细胞数量的比值)分别加入含有慢病毒颗粒的原液，取慢病毒溶液加Alys505完全培养基共配制成100μL，用移液管将慢病毒溶液加至细胞中，轻轻吹打混匀。第4组加入空白Alys505完全培养基100μL。四组细胞分别加入终浓度为6μg/mL的Polybrene，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。
(4)第8天，细胞取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，用200μL Alys-505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液。
(5)第10天，收获成熟的细胞用于后续分析。
测试一
双信号CAR-NK细胞体外抗肿瘤活性检测
以上述各组细胞分别作为效应细胞，CFSE标记的肝癌细胞HepG-2作为靶细胞，按照20:1的效靶比混合效应细胞和靶细胞，轻轻混匀，置于5％CO2，37℃培养箱中孵育。
24h后，加入1μg/mL PI染液，混匀，室温避光孵育15min后，利用流式细胞仪检测CFSE+PI+细胞(死亡的HepG-2细胞)的百分率。结果如图3所示，γδTCR组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为27.93％，c-Met-CAR组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为34.87％，γδTCR/c-Met-CAR组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为65.2％，NC组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为13.31％。说明实施例1第三组制备的双信号CAR-NK细胞对肝癌细胞具有高效的杀伤作用。
测试二
双信号CAR-NK细胞动物体内抗肿瘤活性检测
取对数生长期的人肝癌HepG-2细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，将含1×107个癌细胞的悬液0.1mL于裸鼠肩胛部皮下注射。实验分组及治疗情况见下表，每日观察各组动物的饮食、活动等方面的变化，隔日测量裸鼠体重，观察体重变化情况；隔2天测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)，观察肿瘤生长的情况，按照公式计算：瘤体积＝1/12π×a×b2。第(3)组治疗结束后第13天计算各组裸鼠的抑瘤率，抑瘤率＝(1-治疗组肿瘤平均体积/阴性对照组肿瘤平均体积)×100％。实验分组及治疗情况如表1所示。
表1：实验分组及治疗情况
Figure BDA0001569587280000111
*FAC化疗方案：氟尿嘧啶500mg/M2；阿霉素50mg/M2；环磷酰胺500mg/M2，第一天给药，21天一个疗程。各组裸鼠体重、肿瘤体积及抑瘤率的比较如表2所示。
表2：各组裸鼠体重、肿瘤体积及抑瘤率
Figure BDA0001569587280000112
上述CAR-NK细胞进行体内抗肿瘤实验结果表明，各组裸鼠均存活，以阴性对照组裸鼠为参照，化疗组裸鼠体重下降，肿瘤体积减小，但进食及活动减少。γδTCR-NK治疗组裸鼠存活状况一般，体重无明显下降，抑瘤率达到34.11％。c-Met-CAR-NK治疗组裸鼠存活状况较为良好，体重无明显下降，抑瘤率达到49.42％。γδTCR/c-Met-CAR-NK治疗组裸鼠存活状况较为良好，体重无明显下降，且肿瘤体积明显较小，抑瘤率达到74.38％。说明实施例1第三组双信号CAR-NK细胞能够更加有效的抑制体内恶性肿瘤的生长，治疗副作用少，特异性高。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司
<120> 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的NK细胞及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Leu Ser Leu Leu His Ala Ser Thr Leu
20 25 30
Ala Val Leu Gly Ala Leu Cys Val Tyr Gly Ala Gly His Leu Glu Gln
35 40 45
Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ala Arg Leu Glu
50 55 60
Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala Thr Ser Val Tyr Trp Tyr
65 70 75 80
Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe Leu Val Ser Ile Ser Tyr
85 90 95
Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile Pro Ser Gly Lys Phe Glu
100 105 110
Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile His Asn
115 120 125
Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Glu Ala
130 135 140
Gln Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe Gly Pro Gly Thr Lys
145 150 155 160
Leu Ile Ile Thr Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro
165 170 175
Thr Ile Phe Leu Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly
180 185 190
Thr Tyr Leu Cys Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile
195 200 205
His Trp Glu Glu Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly
210 215 220
Asn Thr Met Lys Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr
225 230 235 240
Val Pro Glu Lys Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His
245 250 255
Glu Asn Asn Lys Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile
260 265 270
Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp
275 280 285
Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Met Gln Arg Ile Ser Ser Leu Ile
290 295 300
His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val
305 310 315 320
Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu
325 330 335
Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp
340 345 350
Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys
355 360 365
Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp
370 375 380
Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg
385 390 395 400
Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly
405 410 415
Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val
420 425 430
Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys
435 440 445
Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp
450 455 460
Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro
465 470 475 480
Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly
485 490 495
Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn
500 505 510
Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp
515 520 525
His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser
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Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys
545 550 555
<210> 2
<211> 405
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Tyr Val Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Asp Met Leu Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Tyr Pro Ser
165 170 175
Gly Gly Leu Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
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Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Pro Arg
210 215 220
Ser Leu Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Pro Lys Leu Gly Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
260 265 270
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
275 280 285
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
290 295 300
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Lys Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
325 330 335
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu
355 360 365
Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln
370 375 380
Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln
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Arg Pro Tyr Tyr Lys
405
<210> 3
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaatgc tgtcactgct ccacgcatca acgctggcag tccttggggc tctgtgtgta 120
tatggtgcag gtcacctaga gcaacctcaa atttccagta ctaaaacgct gtcaaaaaca 180
gcccgcctgg aatgtgtggt gtctggaata acaatttctg caacatctgt atattggtat 240
cgagagagac ctggtgaagt catacagttc ctggtgtcca tttcatatga cggcactgtc 300
agaaaggaat ccggcattcc gtcaggcaaa tttgaggtgg ataggatacc tgaaacgtct 360
acatccactc tcaccattca caatgtagag aaacaggaca tagctaccta ctactgtgcc 420
ttgtgggagg cccagcaaga gttgggcaaa aaaatcaagg tatttggtcc cggaacaaag 480
cttatcatta cagataaaca acttgatgca gatgtttccc ccaagcccac tatttttctt 540
ccttcaattg ctgaaacaaa gctccagaag gctggaacat acctttgtct tcttgagaaa 600
tttttccctg atgttattaa gatacattgg gaagaaaaga agagcaacac gattctggga 660
tcccaggagg ggaacaccat gaagactaat gacacataca tgaaatttag ctggttaacg 720
gtgccagaaa agtcactgga caaagaacac agatgtatcg tcagacatga gaataataaa 780
aacggagttg atcaagaaat tatctttcct ccaataaaga cagatgtcat cacaatggat 840
cccaaagaca attgttcaaa agatgcaaat gatacactac tgctgcagat gcagaggatc 900
tcctccctca tccatctctc tctcttctgg gcaggagtca tgtcagccat tgagttggtg 960
cctgaacacc aaacagtgcc tgtgtcaata ggggtccctg ccaccctcag gtgctccatg 1020
aaaggagaag cgatcggtaa ctactatatc aactggtaca ggaagaccca aggtaacaca 1080
atgactttca tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaaga caatttccaa 1140
ggtgacattg atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga 1200
gatgaagggt cttactactg tgcctgtgac accttgggga tgggggggga atacaccgat 1260
aaactcatct ttggaaaagg aacccgtgtg actgtggaac caagaagtca gcctcatacc 1320
aaaccatccg tttttgtcat gaaaaatgga acaaatgtcg cttgtctggt gaaggaattc 1380
taccccaagg atataagaat aaatctcgtg tcatccaaga agataacaga gtttgatcct 1440
gctattgtca tctctcccag tgggaagtac aatgctgtca agcttggtaa atatgaagat 1500
tcaaattcag tgacatgttc agttcaacac gacaataaaa ctgtgcactc cactgacttt 1560
gaagtgaaga cagattctac agatcacgta aaaccaaagg aaactgaaaa cacaaagcaa 1620
ccttcaaaga gctgccataa acccaaagcc atagttcata ccgagaagta a 1671
<210> 4
<211> 1215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gtcgggcaag tcagagcatt aggaactatt taaattggta tcagcaggaa 180
ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gacttcattc tcaccatcag cagtctgcag 300
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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275 280 285
Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Met Gln Arg Ile Ser Ser Leu Ile
290 295 300
His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val
305 310 315 320
Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu
325 330 335
Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp
340 345 350
Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys
355 360 365
Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp
370 375 380
Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg
385 390 395 400
Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly
405 410 415
Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val
420 425 430
Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys
435 440 445
Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp
450 455 460
Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro
465 470 475 480
Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly
485 490 495
Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn
500 505 510
Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp
515 520 525
His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser
530 535 540
Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Xaa Gly Ser Gly
545 550 555 560
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
565 570 575
Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro
580 585 590
His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
595 600 605
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
610 615 620
Ser Gln Ser Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly
625 630 635 640
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly
645 650 655
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu
660 665 670
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
675 680 685
Gln Ser Tyr Val Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
690 695 700
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
705 710 715 720
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Asp Met Leu Trp
725 730 735
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Tyr
740 745 750
Pro Ser Gly Gly Leu Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
755 760 765
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
770 775 780
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala
785 790 795 800
Pro Arg Ser Leu Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
805 810 815
Val Ser Pro Lys Leu Gly Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
820 825 830
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
835 840 845
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
850 855 860
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
865 870 875 880
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Lys Arg Gly
885 890 895
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
900 905 910
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
915 920 925
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala
930 935 940
Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro
945 950 955 960
Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn
965 970 975
Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
980
<210> 6
<211> 2949
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaatgc tgtcactgct ccacgcatca acgctggcag tccttggggc tctgtgtgta 120
tatggtgcag gtcacctaga gcaacctcaa atttccagta ctaaaacgct gtcaaaaaca 180
gcccgcctgg aatgtgtggt gtctggaata acaatttctg caacatctgt atattggtat 240
cgagagagac ctggtgaagt catacagttc ctggtgtcca tttcatatga cggcactgtc 300
agaaaggaat ccggcattcc gtcaggcaaa tttgaggtgg ataggatacc tgaaacgtct 360
acatccactc tcaccattca caatgtagag aaacaggaca tagctaccta ctactgtgcc 420
ttgtgggagg cccagcaaga gttgggcaaa aaaatcaagg tatttggtcc cggaacaaag 480
cttatcatta cagataaaca acttgatgca gatgtttccc ccaagcccac tatttttctt 540
ccttcaattg ctgaaacaaa gctccagaag gctggaacat acctttgtct tcttgagaaa 600
tttttccctg atgttattaa gatacattgg gaagaaaaga agagcaacac gattctggga 660
tcccaggagg ggaacaccat gaagactaat gacacataca tgaaatttag ctggttaacg 720
gtgccagaaa agtcactgga caaagaacac agatgtatcg tcagacatga gaataataaa 780
aacggagttg atcaagaaat tatctttcct ccaataaaga cagatgtcat cacaatggat 840
cccaaagaca attgttcaaa agatgcaaat gatacactac tgctgcagat gcagaggatc 900
tcctccctca tccatctctc tctcttctgg gcaggagtca tgtcagccat tgagttggtg 960
cctgaacacc aaacagtgcc tgtgtcaata ggggtccctg ccaccctcag gtgctccatg 1020
aaaggagaag cgatcggtaa ctactatatc aactggtaca ggaagaccca aggtaacaca 1080
atgactttca tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaaga caatttccaa 1140
ggtgacattg atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga 1200
gatgaagggt cttactactg tgcctgtgac accttgggga tgggggggga atacaccgat 1260
aaactcatct ttggaaaagg aacccgtgtg actgtggaac caagaagtca gcctcatacc 1320
aaaccatccg tttttgtcat gaaaaatgga acaaatgtcg cttgtctggt gaaggaattc 1380
taccccaagg atataagaat aaatctcgtg tcatccaaga agataacaga gtttgatcct 1440
gctattgtca tctctcccag tgggaagtac aatgctgtca agcttggtaa atatgaagat 1500
tcaaattcag tgacatgttc agttcaacac gacaataaaa ctgtgcactc cactgacttt 1560
gaagtgaaga cagattctac agatcacgta aaaccaaagg aaactgaaaa cacaaagcaa 1620
ccttcaaaga gctgccataa acccaaagcc atagttcata ccgagaagta aggaagcgga 1680
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acctatgctt 1740
ctcctggtga caagccttct gctctgtgag ttaccacacc cagcattcct cctgatccca 1800
atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 1860
acttgtcggg caagtcagag cattaggaac tatttaaatt ggtatcagca ggaaccaggg 1920
aaagccccta agctcctgat ctatgctgca tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg 1980
ttcagtggca gtggatctgg gacagacttc attctcacca tcagcagtct gcagcctgaa 2040
gattttgcaa cttactactg tcaacagagt tacgttaccc cgctcacttt cggtggtggt 2100
ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt ggatctcagc ctggtggttc tttacgtctt 2160
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtacgata tgctttgggt tcgccaagct 2220
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctatcctt ctggtggcct tactgagtat 2280
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 2340
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagacgggct 2400
ccccggtccc tttcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcccccaag 2460
cttggggcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 2520
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 2580
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 2640
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttaca aacggggcag aaagaaactc 2700
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 2760
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgcggct ggtccctcgg 2820
gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct 2880
tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat gtctacagcg acctcaacac acagaggccg 2940
tattacaaa 2949

Claims (8)

1.一种多信号嵌合抗原受体，其特征在于，包括第一片段、第二片段以及连接所述第一片段与所述第二片段的自裂解多肽T2A，所述第一片段包括依次连接的第一信号肽、TCRγ链以及TCRδ链，所述第二片段包括依次连接的第二信号肽SP、肿瘤抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域，所述自裂解多肽T2A的N端与所述TCRδ链相连，所述自裂解多肽T2A的C端与所述第二信号肽SP相连；所述第一片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第二片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的多信号嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述第一片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码所述第二片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.根据权利要求1所述的多信号嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.根据权利要求1或3所述的多信号嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质。
5.一种表达基因，用于表达多信号嵌合抗原受体，其特征在于，所述多信号嵌合抗原受体包括第一片段、第二片段以及连接所述第一片段与所述第二片段的自裂解多肽T2A，所述第一片段包括依次连接的第一信号肽、TCRγ链以及TCRδ链，所述第二片段包括依次连接的第二信号肽SP、肿瘤抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域，所述自裂解多肽T2A的N端与所述TCRδ链相连，所述自裂解多肽T2A的C端与所述第二信号肽SP相连，所述表达基因为如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求5所述的表达基因。
7.一种多信号嵌合抗原受体修饰的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞中能够表达如权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体，或者所述NK细胞中导入了如权利要求5所述的表达基因，或者所述NK细胞中转染了如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的表达基因、如权利要求6所述的表达载体、或如权利要求7所述的多信号嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。
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