CN108026498A

CN108026498A - 细胞培养容器

Info

Publication number: CN108026498A
Application number: CN201680053995.5A
Authority: CN
Inventors: 三轮达明; 阿里米扬·伊迪里斯; 伊藤亨
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Techno Glass Co Ltd; AGC Inc
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2016-09-16
Publication date: 2018-05-11
Also published as: JP2020195412A; US20180201888A1; WO2017047735A1; JP6767375B2; EP3351615A4; EP3351615A1; EP3351615B1; JPWO2017047735A1

Abstract

细胞培养容器具备底部、周壁部及分隔部。细胞培养容器的底部具有形成有多个凹坑的培养面。周壁部从底部的周缘部分立起。分隔部将由周壁部包围的培养面上的区域分隔成多个区域。

Description

细胞培养容器

技术领域

本发明涉及对细胞等被培养物进行培养而用于得到球体(细胞凝集块)的细胞培养容器。

背景技术

将由人或动物等得来的细胞通过培养容器等进行人工培养而使其三维地凝集的球体培养广为周知。在球体培养中，细胞团形成立体性的构造，细胞彼此相互作用，因此可认为能够以更接近于生物体内的三维构造的状态进行培养或维持，已知其与通常的平面粘结培养相比表现出优异的特性。实际上，在使用了癌细胞的抗癌剂筛查、多能干细胞等的增殖或分化等中广泛利用球体培养。

另外，也已知有如下的细胞培养容器：在容器主体的底部具备用于收容细胞及培养液的凹部，在该凹部的底面设有用于利用重力使细胞集合的多个微小凹坑，进而，以随着接近该凹部的开口端而开口面积变宽的方式利用倾斜面来构成凹部的侧面(参照专利文献1)。

另外，也提出了如下的细胞培养容器等：在培养面上呈阶梯状地形成两级的凹凸图案，由此构成有用于培养细胞的矩形形状的凹部和以包围该矩形形状的凹部的四边的方式呈格子状地配置的两级的凸部(参照专利文献2)。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2015-029431号公报

专利文献2：国际公开第2007/049576号

发明内容

发明要解决的课题

然而，这样的现存的细胞培养容器在适用形成有一次能够进行大量的培养的多个凹坑的结构时，相对于培养基的量的细胞的个数增多，伴随于此，培养基(培养液)中的pH(氢离子浓度指数)的变化等培养基的劣化也存在加快的倾向。这种情况下，成为导致培养基的更换频度增加的结果。而且，为了制作大量的球体，需要使用形成有多个凹坑且培养面的面积大的培养容器(例如，培养面的面积为100mm的培养皿等)。

然而，如果使用培养面的面积大的培养容器，则与使用培养面的面积小的培养容器时相比，在容器的移动时、基于培养基更换的吸引、添加时，培养容器内的培养基可能会较大地流动。由此，存在细胞或形成的球体从凹坑内飞出而移动到其他的凹坑内的情况等，其结果是，会产生球体的形成效率下降或难以得到均一的尺寸的球体等问题。

因此，本发明为了解决上述课题而作出，其目的在于提供一种能够减少培养容器内的培养基(培养液)的流动引起的细胞或球体的在凹坑间的移动并能够大量地培养出尺寸均一化了的球体的细胞培养容器。

用于解决课题的方案

本发明的细胞培养容器具备底部、周壁部及分隔部。细胞培养容器的底部具有形成有多个凹坑的培养面。周壁部从底部的周缘部分上升。分隔部将由周壁部包围的培养面上的区域分隔成多个区域。

发明效果

根据本发明，能够提供一种可减少培养基(培养液)的流动引起的细胞或球体的在凹坑间的移动并可大量地培养出尺寸均一化了的球体的细胞培养容器。

附图说明

图1是概略性地表示本发明的第一实施方式的细胞培养容器的俯视图。

图2是概略性地表示图1的细胞培养容器的构造的垂直剖视图。

图3是将图1的细胞培养容器具备的分隔部的周边放大表示的俯视图。

图4是概略性地表示分隔部的构造与图1的细胞培养容器不同的另一细胞培养容器的俯视图。

图5是概略性地表示分隔部的构造与图1及图4的细胞培养容器不同的另一细胞培养容器的俯视图。

图6是概略性地表示分隔部的构造与图1、图4及图5的细胞培养容器不同的另一细胞培养容器的俯视图。

图7是概略性地表示分隔部的构造与图1及图4～图6的细胞培养容器不同的另一细胞培养容器的俯视图。

图8是概略性地表示分隔部的构造与图1及图4～图7的细胞培养容器不同的另一细胞培养容器的俯视图。

图9是概略性地表示本发明的第二实施方式的细胞培养容器的俯视图。

图10是将图9的细胞培养容器具备的分隔部的周边放大表示的俯视图。

图11是例示了在图10的分隔部形成的狭缝的形状的变化的垂直剖视图。

图12是例示了图10的分隔部的上端部分的形状的变化的垂直剖视图。

图13是将与图10的分隔部的构造不同的另一分隔部的周边放大表示的俯视图。

图14是将与图10及图13的分隔部的构造不同的另一分隔部的周边放大表示的俯视图。

图15是概略性地表示本发明的第三实施方式的细胞培养容器的俯视图。

图16示出在本发明的实施例1的细胞培养容器设置的分隔部。

图17示出本发明的实施例1的培养试验结果。

图18示出比较例1的培养试验结果。

具体实施方式

以下，基于附图，说明本发明的实施方式。

<第一实施方式>

如图1、图2所示，本实施方式的细胞培养容器10是对作为被培养物的细胞进行培养并且在培养的过程中用于得到使细胞三维地凝集的球体(细胞凝集块)5的有底圆筒状的容器。如图2所示，在细胞培养容器10内，收容培养基(培养液)14。需要说明的是，细胞培养容器10除了能够适用于圆筒状的容器之外，也可以适用于烧瓶或盘等不同形态的容器等。

如图1～图3所示，细胞培养容器10主要具备底部12、周壁部11及分隔部15。底部12具有构成为圆板状且形成有多个凹坑(well)2的培养面3。培养面3形成于底部12的上表面。培养面3使用聚苯乙烯等合成树脂材料而利用例如注塑成形来得到。

周壁部11从底部12的周缘部分立起。周壁部11的形状是使周缘部分立起的状态。圆板状的底部12以直径为例如85mm、板厚为例如1mm形成。而且，如图2所示，周壁部11的高度H1以底部12(用于载置细胞培养容器10主体的底部12的载置面12a)为基准，以例如20mm形成。需要说明的是，底部12与周壁部11由一体零件构成。而且，细胞培养容器10也可以具备用于将上端的开口部10a覆盖的盖体等。

如图2、图3所示，培养面3上的多个凹坑2是培养球体5的隔室(凹陷部)。具备多个凹坑2的培养面3由没有平坦面的连续的曲面构成。即，在凹坑与凹坑之间没有平坦的面(凹坑没有间隙地铺满)，因此能抑制细胞停留于凹坑间(顶部16)的情况(播种的细胞可靠地落入凹坑2内)，由此，能够防止细胞未成为球体的情况。在此，“细胞未成为球体”包括单层培养或单细胞浮游培养、未成为球状的层叠培养、细胞粘结于培养面而被培养的未被取入球体而以单细胞的状态死亡的情况等。

此外，在培养面3至少形成有20个以上的凹坑2。具体而言，在直径为例如85mm的圆板状的底部12的培养面3上形成有14200个左右(约250个/cm²)的凹坑2。在1个凹坑2内，形成有所希望的尺寸的1个球体5。

这样的凹坑2例如利用朝向底部12的培养面3的激光的照射而形成。该激光照射通过将激光向底部12的上表面(培养面3)照射来实现。

详细而言，在将底部12的平面方向设为x-y轴时，首先，使激光照射装置的照射部向x轴的正方向扫描，并每隔一定的间隔(例如800μm)照射激光，从而形成沿x轴方向并列的多个凹坑2。接下来，使照射部沿y轴方向扫描了一定的距离(例如400μm)之后，使照射部向x轴的负方向扫描，并每隔一定的间隔(例如800μm)照射激光，从而形成沿x轴方向并列的多个凹坑2。同样，使照射部沿y轴方向扫描一定的距离(例如400μm)。将其反复进行，从而在底部12的上表面形成有规则地排列的多个凹坑2。

另外，凹坑2在培养面3的每单位面积优选形成10个/cm²以上，更优选形成10个/cm²～10000个/cm²。进一步优选为15个/cm²～5000个/cm²，更进一步优选为20个/cm²～1000个/cm²。需要说明的是，上述的表示数值范围的“～”在包含其前后记载的数值作为下限值及上限值的意思下使用，以后记述的“～”也具有同样的意思。

在本实施方式中，在利用激光来形成凹坑时，激光光源使用CO₂激光，激光以输出10W、照射速度6100mm/min进行脉冲照射。照射点的形状为圆形，其直径为约400μm。球体5如果过小，则无法产生所希望的生理机能，而且，如果过大，则球体5的中心部坏死。考虑到这种情况时，照射点的直径为20μm～1500μm适当。

在本发明中，在培养面3中优选以凹坑2的尺寸均一的方式形成。如果凹坑2的尺寸不同，则所形成的球体的尺寸不均一，因此不优选。为了实现凹坑2的尺寸的均一化，在培养面3形成凹坑2的情况下，需要不改变激光的输出及照射速度地使激光照射装置的照射部扫描。

当向培养面3(底部12的上表面)照射激光时，构成底部12的合成树脂材料熔化及气化，形成具有非常平滑的表面的凹坑2。此外，也可以在凹坑2的开口周边使熔化的合成树脂材料凸起，来形成堤坝部。彼此相邻的2个凹坑2、及与凹坑2相邻的周壁部11经由1个或多个堤坝部而形成，如图2所示，在处于彼此相邻的凹坑2间、及与凹坑2相邻的周壁部11和凹坑2之间的顶部16未残留平坦面。即，彼此相邻的凹坑2间、及与凹坑2相邻的周壁部11和凹坑2之间的培养面由不是平坦面的连续的曲面构成。进而培养面被进行细胞粘结抑制，因此能够防止如上所述细胞未成为球体的情况。

另外，通过调节激光的照射位置、输出量等照射条件，能够调节接近的凹坑2间的距离、凹坑2的直径及深度、堤坝部的宽度及高度等。在本实施方式中，以避免在相互接近的凹坑2间、及与凹坑2相邻的周壁部11和凹坑2之间的培养面3残留平坦面的方式，即，以使彼此相邻的凹坑2间、及与凹坑2相邻的周壁部11和凹坑2之间的顶部16成为曲面(非平坦面)的方式，适当设定激光的照射条件，来进行激光照射。在此，优选遍及底部12的整个上表面地进行激光照射，使底部12的整个上表面成为曲面(形成有凹坑2的培养面3)。但是，在培养面3中，关于培养未使用的部位也可以形成平坦面。例如底部12的周缘部分是与周壁部11交界的交界部分，有可能难以适当地照射激光。因此，如果该底部12的周缘部分为分隔部15的外侧，则可以不形成为曲面(向底部12的周缘部分不照射激光)而形成为平坦面。

需要说明的是，凹坑2的深度(即，以激光照射前的底部12的上表面为基准的深度)优选以10μm～1500μm形成，在本实施方式中，以200μm±20μm形成。而且，底部12的厚度根据凹坑2的深度(以避免凹坑2产生的凹陷自身贯通的方式)适当设定。

凹坑2的椭圆状的开口面的长径优选以10μm～1500μm形成，在本实施方式中，以500μm±20μm形成。此外，堤坝部(顶部16)的高度(以激光照射前的底部12的上表面为基准的高度)优选以10μm～50μm形成，在本实施方式中，以25μm±5μm形成。

另外，如图2所示，对于底部12上的培养面3实施使用了细胞粘结抑制剂(蛋白质低粘结剂)的表面处理，由此形成用于抑制细胞的粘结的覆膜(涂层)3a。即，对培养面3实施用于抑制细胞的粘结的表面处理。作为该细胞粘结抑制剂，可列举例如磷脂质聚合物(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱等)、聚甲基丙烯酸羟乙基、含氟化合物、或聚乙二醇等。除了以涂层来发挥细胞粘结的抑制以外，也可以是例如利用硅酮树脂等具有细胞粘结抑制效果的树脂来成型培养容器的方法。通过在包含凹坑2的内表面的培养面3形成这样的覆膜3a，细胞不会粘结于培养面，因此细胞彼此凝集而形成球体，而且球体5从凹坑2内的取出也变得容易。

接下来，对分隔部15进行说明。如图1～图3所示，分隔部15形成为大致圆筒状，配置在圆板状的底部12(培养面3)上。以呈圆筒形状的方式连续形成的分隔部15与底部12及周壁部11由使用彼此相同的材料或不同的材料形成的分体的零件构成。如图2所示，大致圆筒状的分隔部15的一端部(下端部)例如利用粘结等方法接合在底部12的培养面3上。由此，分隔部15的其他端部(上端部)朝向细胞培养容器10主体的上端的开口部10a侧配置。如上所述，底部12及周壁部11构成作为与分隔部15分体的零件，由此根据细胞培养容器的规格等，能够适当调整分隔部15的设置数目、形状、细胞培养容器上的设置位置等。而且，也可以在进行上述的激光加工而形成了凹坑2之后，在底部12的凹坑2上接合分隔部15。这种情况下，由于凹坑的存在而底部与分隔部的粘结强度提高。此外，也可以取代于此，在将分隔部15接合于底部12之后，进行激光加工而形成凹坑2。在分隔部15的接合后进行激光加工的后者的情况下，由于将分隔部15接合于形成凹坑2(曲面)之前的底部12上的平坦面，因此能够容易地进行粘结等。

另外，如图2所示，分隔部15以分隔部15的内周面及外周面与底部12的载置面12a正交的方式(以分隔部15的一端部侧的内外径与其他端部侧的内外径相同的方式)构成。即，分隔部15沿着与底部12的载置面12a正交的方向，从培养面3上立起。这样，分隔部15优选以相对于底部12的载置面12a垂直地立起的状态配置。

需要说明的是，也可以使分隔部稍倾斜。通过使分隔部的一部分或整体倾斜，在播种细胞时与分隔部接触的细胞容易落入凹坑。这种情况下的分隔部以其其他端部(上端部)侧的内径比一端部(下端部)侧的内径增大的方式，相对于与底部12的载置面12a正交的方向倾斜。在此，底部12的载置面12a与该分隔部所成的倾斜角度优选在95度～110度的范围内形成。

另外，如图1、图2所示，上述的分隔部15将由周壁部11包围的培养面3上的区域分隔成多个区域。在本实施方式中，分隔部15将培养面3上的区域分隔成分隔部15的内周侧的区域15b、由分隔部15的外周侧和周壁部11的内周侧夹着的区域12b。因此，例如在培养基的更换时或细胞培养容器10的搬运时等，通过这样设置的分隔部15，能够抑制细胞培养容器10内的培养基(培养液)的流动。由此，能抑制细胞或球体从凹坑2内飞出而移动到其他的凹坑2内的情况等，其结果是，能够得到均一的尺寸的球体5。

此外，如图2所示，在分隔部15的表面，通过使用了细胞粘结抑制剂(培养面3的表面处理的说明中例示的细胞粘结抑制剂)的表面处理来形成用于抑制细胞的粘结的覆膜(涂层)15a。即，对分隔部15的表面实施用于抑制细胞的粘结的表面处理。通过在分隔部15的表面形成这样的覆膜15a，能抑制细胞停留在分隔部15的表面上的情况等(沿着分隔部15的表面将细胞收容在凹坑2内)，由此，能够减少凹坑2内的未成为球体的细胞。

另外，如图2所示，以底部12(底部12的载置面12a)为基准，分隔部15的高度H2为周壁部11的高度H1的90％以下。该分隔部15的高度H2以底部12(底部12的载置面12a)为基准而优选为周壁部11的高度H1的0.5％～90％的范围内。通过该结构，能够提高分隔部15的内周侧的区域15b与由分隔部15的外周侧和周壁部11的内周侧夹着的区域12b之间的培养基(培养液)的循环效率。分隔部的高度越高，则培养基的循环越差，分隔部的高度越低，则凹坑2内的球体越容易向其他的凹坑移动。因此，上述的分隔部15的高度H2以底部12为基准而优选为周壁部11的高度H1的5～80％的范围内，更优选为10～70％的范围内，进一步优选为15～60％的范围内，最优选为20～50％的范围内。

此外，利用分隔部15分隔的规定的一个区域(在本实施方式中，分隔部15的内周侧的区域15b)的培养面的面积为底部12具有的培养面3整体的面积的80％以下。更具体而言，利用分隔部15分隔的规定的一个区域(在本实施方式中为分隔部15的内周侧的区域15b)的培养面的面积优选处于底部12具有的培养面3整体的面积的5％～80％的范围内。通过该结构，能够减少细胞培养容器10内的相对于培养基(培养液)的量的细胞的个数。由此，在培养细胞的过程中，例如，由于培养的废物的蓄积等引起的培养基的pH的变动等培养基的劣化变慢，因此能够降低培养基的更换频度。

另外，分隔部15也可以将培养基14能够通过的材料例如膜片(多孔质膜)使用为材料来形成。这种情况下，能够提高利用分隔部15分隔的区域15b与区域12b之间的培养基(培养液)14的循环效率。而且，分隔部15也可以由包含具有遮光性的着色剂(例如，呈白色的氧化钛或呈黑色的碳黑等)的材料形成。即，在通过包含具有遮光性的着色剂的材料来形成分隔部15的情况下，能够提高利用显微镜等对于在细胞培养容器10内培养的细胞或球体5进行荧光观察时的视觉辨认性。需要说明的是，如前所述，分隔部15与底部12及周壁部11可以使用彼此相同的材料形成，作为相同的材料，可以例示玻璃等。

在此，说明使用了本实施方式的细胞培养容器10的球体5的形成方法。将均一地搅拌的细胞悬浊液以避免超过分隔部15的高度加入到区域15b内。然后，进行一定程度静置，在细胞落入至细胞培养容器的底部时，以避免细胞浮起到比分隔部15的上端部靠上方处的方式平缓地将培养基14向区域15b内添加。进而，如图2所示，以使培养基14的液面成为比分隔部15的上端部靠上方的方式使培养基14流入到细胞培养容器10内。由此，细胞收容于比分隔部15靠内侧的区域15b内的凹坑2。或者，也可以将细胞悬浊液以避免超过分隔部15的高度添加到区域15b内，进行几小时～几天培养而形成了球体5之后，以使培养基14的液面成为比分隔部15的上端部靠上方的方式使培养基14流入到细胞培养容器10内。

然后，在该状态下，将细胞培养容器10在保持为例如37℃、饱和水蒸气下、5％二氧化碳气氛的细胞培养装置内进行几小时～几天培养(孵化)。由于在凹坑2的内表面形成有使用了细胞粘结抑制剂的覆膜3a，因此凹坑2内的细胞不会粘结于容器，细胞彼此粘结而形成球体(细胞凝集块)。此时，细胞对应于凹坑2的形状及尺寸而三维地凝集。这样，得到球体5。然后，进一步继续培养，由此构成球体5的细胞进行增殖及分化，表现出任意的生理活性。

如已述那样，根据本实施方式的细胞培养容器10，能够降低培养基14的更换频度，并能够大量地培养出尺寸均一化了的球体5。而且，也可以取代这样的细胞培养容器10，将如图4所示使前述的构造的一对分隔部15空出间隔而相对地配置在底部12(培养面)上的细胞培养容器20适用作为实施方式。

此外，也可以将如图6所示矩形管状的分隔部45配置于底部12上的中央部分的细胞培养容器40适用作为实施方式，或者将如图7所示六角柱等多角柱形成为中空的多角管状的分隔部55配置于底部12上的中央部分的细胞培养容器50适用于实施方式。而且，也可以将如图8所示以将周壁部11包围的底部12(培养面)上的圆柱状的区域分隔成一对半圆柱状的区域的方式在底部12上将平板状的分隔部65与周壁部11的内周面的2个部位连接的细胞培养容器60适用作为实施方式。

<第二实施方式>

接下来，主要基于图9～图12来说明第二实施方式。需要说明的是，在图9～图12中，对于与图1～图3所示的第一实施方式中的构成要素相同的构成要素，标注同一标号并省略重复的说明。

如图9～图12所示，第二实施方式的细胞培养容器70取代第一实施方式的细胞培养容器10具备的分隔部15而具备分隔部75。如图9、图10所示，从平面方向观察细胞培养容器70时，分隔部75形成为格子状。呈格子状地连续形成的该分隔部75将由周壁部11包围的底部12(培养面)上的圆柱状的区域分隔成格子状的多个区域。这样的分隔部75的各端部与周壁部11的内壁面连接。

另外，如图10、图11所示，在形成为格子状的分隔部75也可以形成多个狭缝75a(75b)。图11例示出狭缝的形状的变化。如图11所示，狭缝75a形成为薄板状，另一方面，狭缝75b形成为楔状。狭缝75a、75b都可以是分隔部75的上端部侧及下端部开口的贯通型的狭缝，也可以是上端部开口且下端部侧不开口的非贯通型的狭缝。为了进一步减少凹坑附近的培养基的流动，狭缝75a、75b优选为非贯通型的狭缝。

通过将这样的狭缝75a、75b形成于分隔部75，能够提高由分隔部75分隔成格子状的区域彼此之间的培养基(培养液)14的循环效率。需要说明的是，也可以将未形成这样的狭缝的格子状的分隔部适用于细胞培养容器70。

在分隔部75形成有狭缝的情况下，狭缝的横宽优选为3mm以下。如果狭缝的横宽超过3mm，则容易产生培养基的流动，因此不优选。

在分隔部75，也可以取代形成狭缝而形成一个或多个孔。未图示的孔与狭缝75a、75b同样地贯通分隔部75。孔的位置、个数没有特别限定。而且，孔的直径优选为3mm以下。如果孔的直径超过3mm，则容易产生培养基的流动，因此不优选。而且，也可以形成孔和狭缝这两方。

另外，图12例示出分隔部75的上端部分的形状的变化。如图12所示，作为分隔部75的形状的变化可列举例如使上端部分的截面形状形成为圆形形状的分隔部75c、使上端部分的截面形状形成为矩形形状的分隔部75d、使上端部分的截面形状形成为楔状的分隔部75e等。

另外，如图12所示，分隔部75(分隔部75c、75d、75e)沿着与底部12的载置面12a正交的方向从培养面3上立起。换言之，分隔部75以与底部12的载置面12a正交的方式，在培养面3上以立起的状态配置。

在此，说明使用了本实施方式的细胞培养容器70的球体5的形成方法。第二实施方式与第一实施方式不同，将细胞悬浊液向细胞培养容器70加入至超过分隔部75的高度，然后，不需要将培养基进而向细胞培养容器70添加，只要将添加有细胞悬浊液的细胞培养容器70在设定为与第一实施方式同样的条件的细胞培养装置内收容并培养即可。

在这样构成的本实施方式的细胞培养容器70中，利用格子状的分隔部75将由周壁部11包围的底部12(培养面3)上的区域分隔成多个比较小的区域，因此能够提高在培养基的更换时等之际抑制细胞培养容器70内的培养基(培养液)的流动的效果。由此，抑制细胞或球体5从凹坑2内的飞出等的功能提高，能够得到更均一的形状及尺寸的球体5。

另外，也可以取代这样的细胞培养容器70，适用将如图13所示具有狭缝85a的蜂巢构造的分隔部85设置在底部12(培养面3)上的细胞培养容器作为实施方式。而且，也可以如图14所示，构成设有一部分构造与分隔部75不同的格子状的分隔部95的细胞培养容器。在图14的俯视图中，为了明确与分隔部75的构造的差异而在分隔部95的狭缝的非形成部分标注了剖面线。即，如图14所示，格子状的分隔部95在分隔部主体彼此交叉的拐角部分设有狭缝95a。也可以将具备这样的分隔部95的细胞培养容器适用作为实施方式。

<第三实施方式>

接下来，主要基于图15来说明第三实施方式。需要说明的是，在图15中，对于与图1～图14所示的第一、第二实施方式中的构成要素相同的构成要素，标注相同的标号并省略重复的说明。

如图15所示，第三实施方式的细胞培养容器100在包含分隔部15的第一实施方式的细胞培养容器10的结构的基础上，在上述的分隔部15的内侧具有与第二实施方式的细胞培养容器70具备的图9所示的分隔部75相同构造的格子状的分隔部105。

在此，细胞培养容器100的分隔部105也可以是具有与图13所示的蜂巢构造的分隔部85相同的构造的分隔部，还可以是具有与图14所示的分隔部95相同的构造的分隔部。而且，细胞培养容器100的分隔部15也可以置换为图6所示的分隔部45或图7所示的分隔部55。而且，细胞培养容器100也可以如图4、图5所示那样具备多个分隔部15。这种情况下，在各个分隔部15的内侧配置分隔部105。此外，细胞培养容器100也可以具备图8所示的分隔部65。这种情况下，在分隔部65的一方侧(图8中的分隔部65的例如右侧)的区域和分隔部65的另一方侧(图8中的分隔部65的例如左侧)的区域中的任一方配置分隔部105。

在此，由在细胞培养容器100设置的分隔部15的内侧的分隔部105分隔的规定的一个区域的培养面的面积为底部12具有的培养面3整体的面积的40％以下。更具体而言，由分隔部105分隔的规定的一个区域的培养面的面积优选处于底部12具有的培养面3整体的面积的1％～20％的范围内。通过该结构，能够进一步抑制细胞培养容器100内的培养基(培养液)的流动。

因此，在第三实施方式的细胞培养容器100中，能够一并得到第一及第二实施方式的各细胞培养容器所起到的效果。即，根据第三实施方式的细胞培养容器100，能够降低培养基的更换频度并能够大量地培养出尺寸均一化的球体，而且，在培养基的更换时等之际能够更可靠地抑制细胞培养容器内的培养基(培养液)的流动。

实施例

以下，通过实施例来具体地说明本发明，但是本发明没有限定为以下的内容。

(实施例1)

如图13所示，本实施例制造的细胞培养容器具备在从平面方向观察细胞培养容器时形成为蜂巢状的分隔部。该分隔部将由周壁部包围的底部(培养面)上的圆柱状的区域分隔成蜂巢状的多个区域。

设于细胞培养容器的分隔部通过3D打印机来制作。分隔部的构造由蜂巢构造形成，设为其蜂巢的宽度为6mm并遍及35mm培养皿的培养面整体的尺寸。需要说明的是，在此所说的蜂巢的宽度是指蜂巢(六角形)的面对的边与边之间的最短的长度。从该分隔部的强度上的理由出发，在分隔部的外周部设置了宽度约4mm的边缘。分隔部的高度为约1mm。在35mm培养皿的情况下，培养基的高度通常成为2～3mm，该分隔部以完全沉入培养基中的方式设计。安装有制作的分隔部的培养皿如图16所示。为了确认细胞培养容器的效果，按照以下的次序进行了培养试验。

首先，将253G1株iPS细胞在Matrigel(康宁(Corning)公司制)涂层上，mTeSR1(干细胞技术(STEMCELL TECHNOLOGIES)公司制)培养基中，培养至约70％汇合。以Accutase(西格玛(Sigma)公司制)进行了37℃、5分钟处理后，将添加有10μM Y-27632(和光纯药(Wako)公司制)的mTeSR1等量加入，通过吸移而向单细胞离解。通过离心分离而对细胞进行回收，向设置有分隔部的微细加工培养容器(旭硝子科技玻璃(AGC TECHNO GLASS)株式会社制、EZSPHERE(注册商标)Type#900 35mm培养皿(Dish))，以每一个的mTeSR1为3mL且细胞数成为4.8×10⁵个的方式进行播种，形成了球体。

在培养开始1天后和2天后，将培养容器从孵化器安静地取出，移动至显微镜而进行了观察之后，将培养基更换为半量(1.5mL)的新的mTeSR1。接下来在3天后，以添加有2倍浓度的活-死细胞染色试剂盒(Live/Dead Cell Staining Kit)II(PromoKine公司制)的mTeRS1进行半量培养基更换，在37℃、5％二氧化碳条件下进行了30分钟孵化。然后，利用荧光显微镜EVOS FL Auto(生命技术(life technologies)公司制)进行了明视野及激励波长470nm的荧光观察。其结果如图17所示。

(比较例1)

除了未使用分隔部以外，通过与实施例1相同的方法进行了培养试验。而且，通过与实施例1相同的方法进行了荧光观察。其结果如图18所示。

图17所示的显微镜图像是本发明的实施例，是使用蜂巢的宽度为6mm的分隔部进行了培养的结果。图18所示的显微镜图像是本发明的比较例，是未使用分隔部而进行了培养的结果。在比较例1的条件下，较多的球体从微小凹坑飞出。另一方面，在实施例1的条件下，大部分的球体未飞出而留在凹坑内。由此，确认到基于分隔部的球体的飞出防止效果。

以上，利用实施方式而具体地说明了本发明，但是本发明没有原封不动地限定为该实施方式，在实施阶段，在不脱离其主旨的范围内能够进行各种变更。例如，也可以从实施方式所示的全部构成要素中删除若干的构成要素，还可以将上述实施方式公开的多个构成要素适当组合。

标号说明

10、20、30、40、50、60、70、100…细胞培养容器，2…凹坑，3…培养面，3a、15a…覆膜，5…球体，10a…开口部，11…周壁部，12…底部，12a…载置面，12b、15b…区域，14…培养基，15、45、55、65、75、75c、75d、75e、85、95、105…分隔部，16…顶部，75a、75b、85a、95a…狭缝。

Claims

1.一种细胞培养容器，其特征在于，具备：

底部，具有形成有多个凹坑的培养面；

周壁部，从所述底部的周缘部分立起；及

分隔部，将由所述周壁部包围的所述培养面上的区域分隔成多个区域。

2.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其特征在于，

所述培养面由连续的曲面构成。

3.根据权利要求1或2所述的细胞培养容器，其特征在于，

以所述底部为基准，所述分隔部的高度为所述周壁部的高度的0.5～90％的范围内。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

由所述分隔部分隔出的规定的一个区域的培养面的面积为所述底部具有的培养面整体的面积的5～80％的范围内。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

在所述培养面至少形成有每单位面积为10个/cm²以上的凹坑。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

在所述分隔部形成有狭缝及/或孔。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

所述分隔部连续地形成。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

所述分隔部沿着与所述底部的载置面正交的方向从所述培养面上立起。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

所述分隔部由与所述底部及所述周壁部分体的零件构成。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

对所述培养面实施用于抑制细胞的粘结的表面处理。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

对所述分隔部实施用于抑制细胞的粘结的表面处理。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的细胞培养容器，其特征在于，

所述分隔部与所述周壁部连接。