CN107641615A

CN107641615A - 一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法

Info

Publication number: CN107641615A
Application number: CN201710870122.XA
Authority: CN
Inventors: 李敏; 徐薇; 颜克鹏; 卫林
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2018-01-30

Abstract

一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方。方法：用胶原酶IV，DNA酶I和RPMI1640混合消化液消化胰腺组织后，通过100μm的尼龙滤网过滤，经过密度梯度离心，收集离心后中间层细胞，分析细胞获得率、存活率和细胞种类。结果：每只小鼠可获取(3.0±1.2)x10⁵个细胞；分离得到的细胞活率为(96.7±2.2)％；经流式细胞术分析，CD45阳性T细胞含量为(97.1±3.5)％，CD3阳性T细胞含量为(61.2±5.7)％，CD4阳性T细胞含量为(49.1±5.1)％，CD8阳性T细胞含量为(47.2±5.3)％，CD19阳性B细胞含量为(32.8±4.3)％。结论：该方法简化、高效、稳定，且获取的细胞数量多、活率高、纯度高，可为分离胰腺浸润的免疫细胞相关研究提供可靠的方法。

Description

一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法

技术领域

本申请涉及一种组织内细胞分离方法，特别是一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法。

背景技术

胰腺作为人体中最重要的器官之一，其生理作用和病理变化都与生命息息相关。近年来，随着人们生活质量的提高，人们的饮食结构也发生着变化，从而也出现了越来越多的胰腺疾病。目前在我国乃至世界范围内胰腺疾病的发病率均有上升的趋势。有关胰腺的疾病，诸如急慢性胰腺炎、特发性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰腺癌等的报道越来越多，胰腺疾病逐渐被引起重视。很多研究学者对胰腺的研究多集中在对胰腺癌相关信号转导通路研究、对胰腺癌发病分子机制研究、对胰腺癌的分子遗传学研究等。因此分离胰腺内浸润的免疫细胞成为多种研究的重要基础工作。但目前没有系统的胰腺内浸润免疫细胞的分离方法，已有其他组织器官内细胞的分离方法则耗时长、得率低、步骤复杂，并且无法用于胰腺内细胞的分离。

发明内容

针对现有分离方法耗时长、得率低、步骤复杂且无法用于胰腺内浸润免疫细胞的缺陷，本发明提供一套简化、高效、稳定的小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法。具体的，本发明的小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法，包括如下步骤：

(1)胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm直径放置于冰上的培养皿，用磷酸盐缓冲溶液清洗1-2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至1mm2的均匀体积块；

(2)胰腺组织块分离和消化：将剪碎的胰腺组织块中放入0.5mg/ml胶原酶IV和0.01mg/ml DNA酶I消化液中，置于37℃恒温摇床中消化1.5h后，取出，吸出消化液，过100μm的尼龙滤网到新的15ml离心管中，1500rpm/5min,收集细胞；

(3)密度梯度离心：将4ml80％的percoll溶液加入到15ml的离心管中，离心管倾斜60度，然后将用8ml40％的percoll溶液重悬的细胞轻轻缓慢沿管壁加入流至80％的percoll溶液的液面之上，所述4ml80％及8ml40％的percoll溶液由RPMI-1640完全培养基稀释，两层液体间可见清晰的分界面；在25度、400g、25min、升速为1、降速为0的条件下离心；离心后可见分界面有一层模糊状的细胞；吸取最上层少许液体弃掉，吸分界面中间细胞层液体至新的15ml离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液至15ml，上下颠倒混匀；离心，常温、1500rpm/5min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲溶液重悬沉淀，即得所需细胞。

采用酶消化提取小鼠胰腺淋巴细胞，提取步骤简化、高效、稳定，获取细胞的数量多、活率高、纯度高，为研究胰腺相关炎症或肿瘤疾病的分子免疫学机制提供可靠方法，为胰腺疾病发病机制的阐明奠定坚实的基础。

附图说明

图1为台盼蓝染色法检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的活细胞数量

图2为Annexin V/PI凋亡试剂检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的细胞活率

图3为CD45、CD3、CD4、CD8、CD19抗体标记检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的细胞类型的比例

具体实施方式

1材料和方法

1.1实验动物:C57BL/6雄性鼠,6～8周龄，购于上海斯莱克动物中心，饲养在SPF级动物房内。

1.2主要试剂及器材：

试剂：RPMI1640培养液(美国Gibco公司)，胎牛血清(ICP，New Zealand)，1XPBS(磷酸盐缓冲液,0.01mol/L),anti-mouse CD45单克隆抗体，anti-CD3单克隆抗体,anti-mouseCD4单克隆抗体,anti-mouse CD8单克隆抗体,anti-mouse CD19单克隆抗体(美国BD)；胶原酶IV消化液(50mg/ml)；DNA酶I(1mg/ml)；

Percoll分离液等。

器材：15ml、50ml离心管；细胞培养皿；手术器械；Eppendorf离心机,Niko显微镜，BD FACSCantoTM II流式细胞仪等

1.3小鼠胰腺淋巴细胞分离方法

1.3.1胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm(直径)培养皿中(放置于冰上)，用磷酸盐缓冲溶液清洗1-2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至适度大小(1mm²)的均匀体积块；

1.3.2胰腺组织块分离和消化：将剪碎的胰腺组织块中放入0.5mg/ml胶原酶IV和0.01mg/ml DNA酶I消化液中，置于37℃恒温摇床中消化1.5h后，取出；吸出消化液，过100μm的尼龙滤网到新的15ml离心管中，1500rpm/5min,收集细胞；

1.3.3密度梯度离心：将4ml 80％的percoll溶液(1640完全培养基稀释)加入到15ml的离心管中，离心管倾斜至水平(离心管倾斜约60度)，然后将用8ml 40％的percoll溶液(1640完全培养基稀释)重悬的细胞轻轻缓慢沿管壁加入流至80％的percoll溶液的液面之上，两层液体间可见清晰的分界面；离心(室温，25度，400g,25min,升速为1，降速为0)；离心后可见分界面有一层模糊状的细胞；吸取最上层少许液体弃掉，吸中间层细胞层液体至新的15ml离心管中，加入PBS至15ml,上下颠倒混匀；离心(常温，1500rpm/5min)，弃去上清液，用PBS重悬沉淀，待用。

1.4小鼠胰腺淋巴细胞计数：

将分离重悬的细胞在倒置相差显微镜下观察分离得到的胰腺组织淋巴细胞分离情况，人工进行细胞计数。

1.5小鼠胰腺淋巴细胞活力检测：

采用台盼兰染色法鉴定细胞活力。将0.4％台盼蓝溶液90μl加入至10μl细胞悬液中，充分混匀，于20℃下孵育3min，在3min内，用计数板分别计数活细胞和死细胞，不着色的为活细胞。

1.6小鼠胰腺淋巴细胞活率检测：

采用Annexin V/PI凋亡试剂检测。用预冷的PBS洗涤细胞2次，1500rpm，4℃离心5min。收集1-3×105细胞。加入100μl 1×Binding Buffer重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC和5μl Pl Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温反应10min。加入400μl 1×Binding Buffer，混匀，用流式细胞仪检测。

1.7小鼠胰腺淋巴细胞CD45、CD3、CD4、CD8、CD19阳性细胞含量检测：

细胞计数，后取100μl(1x106细胞)细胞重悬液于干净的EP管中，离心沉淀细胞，1xPBS重悬细胞后，加入FITC标记的抗小鼠CD45、CD3、CD4、CD8、CD19抗体各0.5ul，轻轻混匀，4℃避光孵育20min。后加1ml 1xPBS，4℃离心，1500rpm，5min，弃上清，最后加入200ul1xPBS重悬后经流式细胞仪检测。收集10000个细胞用于数据分析，采用FITC标记的同型抗体作为阴性对照。

1.8统计学方法：数据采用Graphpad Prism5统计软件进行处理分析,以x±s表示。单样本用t检验方法计算细胞产量和存活率。

2结果

2.1小鼠胰腺淋巴细胞观察

2.2小鼠胰腺淋巴细胞数量、活力及特性：采用上述分离方法，共分离2只小鼠的胰腺，每只小鼠可获取1-3x10⁵个淋巴细胞。台盼兰染色后细胞活力较高，死细胞少，见图1，不着色的为活细胞

2.3小鼠胰腺淋巴细胞的细胞活率：通过流式细胞仪检测，采用上述方法获取小鼠的胰腺淋巴细胞活率为96.7％，阴性对照的活率为98.1％。其中左下象限为活细胞，提示所分离细胞中凋亡和死亡细胞较少，见图2。

2.4小鼠胰腺淋巴细胞CD45、CD3、CD4、CD8和CD19阳性细胞含量：将上述方法分离的小鼠胰腺淋巴细胞用CD45、CD3、CD4、CD8、CD19阳性抗体进行标记，通过流式细胞仪检测分离纯度，采用上述分离方法获得的小鼠胰腺淋巴细胞中，CD45阳性细胞含量为97.1％，CD3阳性T细胞含量为61.2％，CD4阳性T细胞含量为49.1％，CD8阳性T细胞含量为47.2％，CD19阳性B细胞含量为32.8％，见图3。

3.讨论

胰腺癌是消化系统中侵袭性最高的恶性肿瘤，以导管腺癌为主。虽然和其它肿瘤相比，胰腺癌发病率较低，但由于其极低的生存率(小于5％)，使胰腺癌成为癌症相关死亡因素的第四大主因[9]；因此研究胰腺相关疾病具有重大意义。而分离获取小鼠胰腺淋巴细胞对于研究胰腺相关疾病和胰腺疾病发病机制的阐明奠定坚实的基础。我们由分离LPL的方法获得启发，参照Sanos、朱思莹等提供的LPL的分离方法并加以改进，用以分离小鼠胰腺淋巴细胞，并观察分析获取的胰腺淋巴细胞效果，成功分离出高效、稳定的小鼠胰腺淋巴细胞，本方法具有简化、高效、稳定等优点，具有良好的推广价值。

在分离的过程中，我们发现了影响小鼠胰腺淋巴细胞获取的因素有：温度：37℃摇床中消化处理组织，可提高分离效率，而其余步骤保持在低温环境下，易于提高细胞成活率。如图3所示，通过流式分析检测细胞活率为96.7％。消化时间：消化过程中应严格控制消化时间，防止消化过度或不足。密度梯度离心：在配制的Percoll工作液浓度必须准确；在加入上层低浓度细胞悬液分离液至高浓度percoll分离液时，动作要轻且保持界面清晰；否则直接影响离心效果。实验时需注意：①消化时：一般消化时间约为1.5h，肉眼观察瓶底由大颗粒状转为小颗粒半透明白茫状时，即可取出消化液。②Percoll密度梯度离心：一般采用离心力为400g，时间20-25min。由于不同层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。我们所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，轻轻去除上层Percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。③台盼蓝染色法：染色时间不宜太长，否则活细胞也会由于染料积累而着色，使监测结果偏低；④Annexin V/PI凋亡试剂检测：由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后尽快进行分析。Annexin V-FITC和PI是光敏感物质，在染色操作过程中注意避光操作。⑤流式细胞仪检测：应保证样本在上机检测前的浓度为1X10⁶细胞/ml，细胞浓度过低会影响到检测结果准确性。荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。判定结果时，应注意减去本底荧光。注意染色后避光，保证细胞免疫荧光的稳定。

采用酶消化提取小鼠胰腺淋巴细胞，提取步骤简化、高效、稳定，获取细胞的数量多、活率高、纯度高，为研究胰腺免疫的研究提供可靠方法，为胰腺疾病发病机制的阐明奠定坚实的基础。

Claims

1.一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法，包括如下步骤：

(3)密度梯度离心：将4ml 80％的percoll溶液加入到15ml的离心管中，离心管倾斜60度，然后将用8ml 40％的percoll溶液重悬的细胞轻轻缓慢沿管壁加入流至80％的percoll溶液的液面之上，所述8ml 40％的percoll溶液由RPMI-1640完全培养基稀释，两层液体间可见清晰的分界面；在25度、400g、25min、升速为1、降速为0的条件下离心；离心后可见分界面有一层模糊状的细胞；吸取最上层少许液体弃掉，吸分界面中间细胞层液体至新的15ml离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液至15ml，上下颠倒混匀；离心，常温、1500rpm/5min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲溶液重悬沉淀，即得所需细胞。