CN107601681B - 一种修复苯嗪草酮污染水体的复合菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，公开了一种修复苯嗪草酮污染水体的复合菌剂，其按照如下步骤制备而得：1）将代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液均匀，然后接种于无机盐驯化培养基中，培养得到复合菌液；2）将复合菌液放入两倍质量的载体中制得复合菌剂。本发明复合菌剂能够有效地修复苯嗪草酮污染水体，去除率高，环境友好性强。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种修复苯嗪草酮污染水体的复合菌剂。
背景技术
苯嗪草酮（metamitron）的化学名称为4-氨基-3-甲基-6-苯基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮，属三嗪酮类选择性芽前除草剂，应用范围广泛，主要通过植物根部吸收，再输送到叶子内，通过抑制光合作用的希尔反应而起到杀草作用。可防除单、双子叶杂草，是一种应用于防除甜菜田禾本科和阔叶杂草的除草剂，主要用于旱地作物，如玉米、甜菜等作物的田间除草，还可以防治黎龙葵、繁缕、野芝麻、早熟禾等多种杂草。
苯嗪草酮农药流失到环境中，将造成严重的环境污染，有时甚至造成极其危险的后果。流失到环境中的农药通过蒸发、蒸腾，飘到大气之中，飘动的农药又被空气中的尘埃吸附住。并随风扩散。造成大气环境的污染。大气中的农药，又通过降雨，这些农药又流入水里，从而造成水环境的污染，对人、畜，特别是水生生物（如鱼、虾）造成危害。同时，流失到土壤中的农药，也会造成土壤板结。农药污染的水体治理较为困难，至今为止，绝大多数采用物理、化学方法加以处理，但这些方法处理费用偏高，技术要求较为严格，在实际应用上难以推广。
生物处理方法是利用微生物的作用，使苯胺类化合物得到分解。由于生物处理方法比物理、化学方法成本低得多，又无二次污染，且微生物又具有较强的可变异性及适应性，因此它已成为处理污染水体的理想方法。目前处理苯嗪草酮农药污染水体的菌剂研究较少，降解菌剂并不多见。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种修复苯嗪草酮污染水体的复合菌剂。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种修复苯嗪草酮污染水体的复合菌剂，其按照如下步骤制备而得：
1）将代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液均匀，然后接种于无机盐驯化培养基中，培养得到复合菌液；
2）将复合菌液放入两倍质量的载体中制得复合菌剂。
具体地，
所述菌剂按照如下步骤制备而得：
1）将代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液按照1-2:2-3:2-3:3-5的体积比均匀，然后按照10%的接种量接种于无机盐驯化培养基中，在30℃、150rpm条件下振荡培养12h，得到复合菌液；
2）将复合菌液放入两倍质量的载体中，在20℃搅拌30min，4℃静置24小时，在生物载体上逐渐形成菌群生物膜，滤干，即得。
进一步地，
所述载体的制备方法包括如下步骤：将聚苯醚用饱和食盐水浸泡2小时，然后排出液体，再用3wt%的氢氧化钠溶液浸泡6h，排出液体，然后用75%的乙醇冲洗至中性，然后添加壳聚糖、甘油以及水，充分混合均匀，置于60℃水浴锅中加热1h，真空抽滤后，加入浓度为2％的戊二醛溶液，交联1h，用水冲洗去掉多余的戊二醛，再加入浓度为0.5M的CaCl2水溶液室温静置12小时，真空干燥，得到载体。
优选地，所述聚苯醚、壳聚糖、甘油、水、戊二醛溶液以及CaCl2水溶液的比例为：1-2kg:50-80g:5-7kg:2-3kg:5-7L:3-5L。
优选地，所述无机盐驯化培养基的制备方法包括如下步骤：
取(NH4)SO4 2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，微量元素溶液1mL、苯嗪草酮200mg，加水定容至1000mL，调pH＝7.0，121℃灭菌20min，备用；
其中，微量元素溶液的配制为：FeCl3 0.5g，FeSO4 0.5g，MnSO4 0.2g，ZnSO40.1g，CoCl20.1g，加水定容至1000mL，过滤除菌即得。
优选地，所述代尔夫特食酸菌为ATCC 15668，所述铜绿假单细胞菌为ATCC 9027，所述萎缩芽孢杆菌为ATCC 9372，所述黑色假单胞菌为ATCC 19375。
优选地，所述代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液的浓度均为（1-5）×107cfu/ml。
本发明有益效果主要包括以下几个方面：
将本发明的复合菌剂投入水体中，菌株在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、分解污水中的苯嗪草酮；
本发明采用四种菌株，配伍合理，协同性能好，能够相互促进促进增殖以及酶活力，修复效果好；
经过复合菌剂处理后，苯嗪草酮含量大大降低，低浓度组去除率可达到99.8%，高浓度组为99.4%，效果大大优于对照组，经过对比实验可知，各菌株之间能够共生增殖，协同性能好。
本发明通过对聚苯醚进行改性处理，提高了孔隙率和比表面积，吸附效果好，菌株附着力高，苯嗪草酮的去除率可达到99.7%，COD的去除率可达到94.8%，与常规载体相比，能够显著提高苯嗪草酮以及COD的去除率。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂渠道购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
一种修复苯嗪草酮污染水体的复合菌剂，其按照如下步骤制备而得：
将聚苯醚用饱和食盐水浸泡2小时，然后排出液体，再用3wt%的氢氧化钠溶液浸泡6h，排出液体，然后用75%的乙醇冲洗至中性，然后添加壳聚糖、甘油以及水，充分混合均匀，置于60℃水浴锅中加热1h，真空抽滤后，加入浓度为2％的戊二醛溶液，交联1h，用水冲洗去掉多余的戊二醛，再加入浓度为0.5M的CaCl2水溶液室温静置12小时，真空干燥，得到载体；所述聚苯醚、壳聚糖、甘油、水、戊二醛溶液以及CaCl2水溶液的比例为：1kg:50g:5kg:2kg:5L:3L；所述聚苯醚的孔径为100-300μm，比表面积为40-90m2/g；
将代尔夫特食酸菌ATCC 15668、铜绿假单细胞菌ATCC 9027、萎缩芽孢杆菌ATCC9372以及黑色假单胞菌ATCC 19375分别经过斜面培养和种子培养，获得代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液，控制四种种子液浓度均为1×107cfu/ml。
取(NH4)SO4 2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，微量元素溶液1mL、苯嗪草酮200mg，加水定容至1000mL，调pH＝7.0，121℃灭菌20min，制得无机盐驯化培养基备用； 其中，微量元素溶液的配制为：FeCl3 0.5g，FeSO4 0.5g，MnSO4 0.2g，ZnSO40.1g，CoCl20.1g，加水定容至1000mL，过滤除菌，即得；
将代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液按照1:2:2:3的体积比均匀，然后按照10%的接种量接种于无机盐驯化培养基中，在30℃、150rpm条件下振荡培养12h，得到复合菌液；
将复合菌液放入两倍质量的载体中，在20℃搅拌30min，4℃静置24小时，在生物载体上逐渐形成菌群生物膜，滤干待用。
实施例2
一种修复苯嗪草酮污染水体的复合菌剂，其按照如下步骤制备而得：
将聚苯醚用饱和食盐水浸泡2小时，然后排出液体，再用3wt%的氢氧化钠溶液浸泡6h，排出液体，然后用75%的乙醇冲洗至中性，然后添加壳聚糖、甘油以及水，充分混合均匀，置于60℃水浴锅中加热1h，真空抽滤后，加入浓度为2％的戊二醛溶液，交联1h，用水冲洗去掉多余的戊二醛，再加入浓度为0.5M的CaCl2水溶液室温静置12小时，真空干燥，得到载体；所述聚苯醚、壳聚糖、甘油、水、戊二醛溶液以及CaCl2水溶液的比例为：1-2kg:50-80g:5-7kg:2-3kg:5-7L:3-5L；所述聚苯醚的孔径为100-300μm，比表面积为40-90m2/g；
将代尔夫特食酸菌ATCC 15668、铜绿假单细胞菌ATCC 9027、萎缩芽孢杆菌ATCC9372以及黑色假单胞菌ATCC 19375分别经过斜面培养和种子培养，获得代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液，控制四种种子液浓度均为3×107cfu/ml。
取(NH4)SO4 2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，微量元素溶液1mL、苯嗪草酮200mg，加水定容至1000mL，调pH＝7.0，121℃灭菌20min，备用； 其中，微量元素溶液的配制为：FeCl3 0.5g，FeSO4 0.5g，MnSO4 0.2g，ZnSO40.1g，CoCl20.1g，加水定容至1000mL，过滤除菌，即得；
将代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液按照2:3:3:5的体积比均匀，然后按照10%的接种量接种于无机盐驯化培养基中，在30℃、150rpm条件下振荡培养12h，得到复合菌液；
将复合菌液放入两倍质量的载体中，在20℃搅拌30min，4℃静置24小时，在生物载体上逐渐形成菌群生物膜，滤干待用。
实施例3
试验一：
水体样品选择：苯嗪草酮污染水体来自杭州地区的农业种植区，设定水体中苯嗪草酮的浓度为100mg/L和1000mg/L；
组别：实施例1复合菌剂为实验组；对照组1：不添加代尔夫特食酸菌，其余同实施例1；对照组2：不添加铜绿假单细胞菌，其余同实施例1；对照组3：不添加萎缩芽孢杆菌，其余同实施例1；对照组4：不添加黑色假单胞菌，其余同实施例1；
使用方法：栅栏拦截去除固体杂质，调节水体的pH为6.5-7.2之间，然后按照
每立方米3g的量投加复合菌剂，处理时间为72小时。经过各组处理后排出的水的苯嗪草酮污染物含量见表1：
表1
| 指标 | 100mg/L | 1000mg/L |
| 实验组 | 0.2 | 3.9 |
| 对照组1 | 7.7 | 43.4 |
| 对照组2 | 5.6 | 31.7 |
| 对照组3 | 6.8 | 27.9 |
| 对照组4 | 4.3 | 31.4 |
结论：经过复合菌剂处理后，苯嗪草酮含量大大降低，低浓度组去除率可达到99.8%，高浓度组为99.4%，效果大大优于对照组1-4，经过对比实验可知，各菌株之间能够共生增殖，协同性能好。
试验二：
水体样品选择：苯嗪草酮污染水体来自杭州地区的农业种植区，设定水体中苯嗪草酮的浓度为100mg/L、COD为560mg/L；
组别：实施例2的复合菌剂为实验组；对照组1：载体选用常规的硅藻土载体，其余同实施例2；对照组2：载体选用常规的草炭土：锯末为1:1的复合载体，其余同实施例2；
使用方法：栅栏拦截去除固体杂质，调节水体的pH为6.5-7.2之间，然后按照
每立方米3g的量投加复合菌剂，处理时间为72小时。经过各组处理后排出的水的苯嗪草酮污染物含量见表2：
表2
| 指标 | 苯嗪草酮 mg/L | COD mg/L |
| 实验组 | 0.3 | 29.3 |
| 对照组1 | 7.1 | 74.8 |
| 对照组2 | 6.9 | 83.6 |
如表2所示，本发明通过对聚苯醚进行改性处理，提高了孔隙率和比表面积，吸附效果好，菌株附着力高，苯嗪草酮的去除率可达到99.7%，COD的去除率可达到94.8%，与常规载体相比，能够显著提高苯嗪草酮以及COD的去除率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种修复苯嗪草酮污染水体的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂按照如下步骤制备而得：
1）将代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液按照1-2:2-3:2-3:3-5的体积比均匀，然后按照10%的接种量接种于无机盐驯化培养基中，在30℃、150rpm条件下振荡培养12h，得到复合菌液；所述代尔夫特食酸菌为ATCC 15668，所述铜绿假单细胞菌为ATCC 9027，所述萎缩芽孢杆菌为ATCC 9372，所述黑色假单胞菌为ATCC 19375；
2）将复合菌液放入两倍质量的载体中，在20℃搅拌30min，4℃静置24小时，在载体上逐渐形成菌群生物膜，滤干，即得；
所述载体的制备方法包括如下步骤：将聚苯醚用饱和食盐水浸泡2小时，然后排出液体，再用3wt%的氢氧化钠溶液浸泡6h，排出液体，然后用75%的乙醇冲洗至中性，然后添加壳聚糖、甘油以及水，充分混合均匀，置于60℃水浴锅中加热1h，真空抽滤后，加入浓度为2％的戊二醛溶液，交联1h，用水冲洗去掉多余的戊二醛，再加入浓度为0.5M的CaCl2水溶液室温静置12小时，真空干燥，得到载体；所述聚苯醚、壳聚糖、甘油、水、戊二醛溶液以及CaCl2水溶液的比例为：1-2kg:50-80g:5-7kg:2-3kg:5-7L:3-5L；
所述无机盐驯化培养基的制备方法包括如下步骤：
取(NH4)SO4 2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，微量元素溶液1mL、苯嗪草酮200mg，加水定容至1000mL，调pH＝7.0，121℃灭菌20min，备用；
所述微量元素溶液的配制方法为：FeCl3 0.5g，FeSO4 0.5g，MnSO4 0.2g，ZnSO40.1g，CoCl20.1g，加水定容至1000mL，过滤除菌，即得；
所述代尔夫特食酸菌种子液、铜绿假单细胞菌种子液、萎缩芽孢杆菌种子液以及黑色假单胞菌种子液的浓度均为（1-5）×107cfu/ml。
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