CN107475255B - 一种基因载体介导的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用基因载体（包括但不限于9型腺相关病毒）介导的，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统直接编辑超氧化物歧化酶1（Superoxide Dismutase 1，简称SOD1）突变基因，在体外及转基因小鼠中治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，简称ALS）的基因治疗方法。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为ALS基因治疗的候选病毒。

Description

一种基因载体介导的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA 及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种AAV9病毒载体介导的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA及其用途，包含与该sgRNA的组合物、重组表达载体和基因治疗方式。

背景技术

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一种致死性的神经退行性疾病，作为运动神经元病的一个类型(ALS/MND)，是最常见的成年发病的运动神经元疾病。ALS与阿尔茨海默病、帕金森病同为神经系统常见变性疾病，但发展速度和性质较其他两种变性疾病更加严重。患者以脊髓、脑干、大脑皮层的运动神经元发生退行性改变为特征，表现为进行性肌肉无力，多死于呼吸衰竭；成年发病，中位生存期仅为3-5年[1]。其患病率4-6/10万，发病率1-3/10万。至今尚无有效的治疗方法[2]。现临床上用于治疗ALS的药物“力如太”仅能延缓病程数月。神经科专家多称ALS为“不是癌症的癌症”。由于本病好发于中年人群，即社会及家庭的主要支撑人群，因此给家庭带来了沉重的负担，对国家和社会造成了严重的危害。通过建立有效的治疗措施，不仅能减轻患者的痛苦，而且会给家庭、国家及社会减轻负担。

ALS以散发病人多见，约占总病人的90％，家族性约占10％。基因突变是ALS鉴定明确的病因。超过50％的家族性肌萎缩侧索硬化(FALS)病人的相关致病基因已经发现，其中包括：C9orf72(24％)，SOD1(20％)，TDP-43(5％)，FUS(5％)等。散发性肌萎缩侧索硬化(SALS)病人中包括：C9orf72(4％)，SOD1(2％)，TDP-43(1％)，FUS(1％)等[3]。对突变基因进行基因编辑，修复突变基因有可能从根本上阻止运动神经元变性。

成簇的规律间隔的短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Cas9)系统是最近建立的能够在真核细胞中应用的，由RNA调控对DNA修饰的基因编辑系统。与其他编辑系统相比，如锌指核酸酶(ZFNs)和类转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，CRISPR-Cas9系统编辑效率和靶向性更高，打靶容易，具有多位点修饰等特点[4,5]。Cas9核酸酶在sgRNA的引导下介导目的基因的原间区毗邻序列(PAM序列，NGG)上游3个碱基的双链断裂，Cas9上的HNH结构域切割与sgRNA形成互补的单链DNA，Ruv C结构域切割非互补的单链，通过内源性DNA修复，进行非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)，形成插入或缺失突变(indel mutation)，完成基因敲除；在模板链存在的条件下，完成同源重组修复(Homology-Directed Repair,HDR)[6-8]。

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体作为一类新型的安全载体，其重要性正被研究者逐渐认识到。它是细小病毒家族成员，为无包膜的线性单链DNA病毒，具有广泛的宿主范围，既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，并能介导外源基因的长期表达。作为病毒载体的重要一员，AAV不具有明显的细胞毒性效应，并且不会像其他病毒载体那样引起细胞强烈的免疫反应；同时在构建重组AAV病毒时，可使其编码序列完全缺失而仅保留其145bp的末端重复序列，从而有效降低其重组和表达自身蛋白的可能性，使安全性得到进一步提高。因此，AAV作为一种理想的基因治疗载体，正在越来越多地引起人们兴趣和关注[9,10]。

Chengzu Long等在杜氏肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)转基因小鼠中利用CRISPR-Cas9系统，完成了对受精卵细胞中突变基因的修复，在试验中观察到新生小鼠只要部分细胞的基因修复就可以达到表型的完全恢复[11]。Lukasz Swiech等建立了AAV-SpGuide，AAV-SpCas9分开表达的系统，通过1:1混合在小鼠海马注射，SpGuide和SpCas9共转导效率为75％，脱靶率为0-1.6％，AAV介导的SpCas9在神经元中表达没有表现出对神经元的毒性。进而，作者观察到，AAV介导的Dnmt1等位基因修饰效率>60％，Dnmt3a和Dnmt3b等位基因修饰率分别为42％和17％；Dnmt1蛋白水平的表达显著下降，Dnmt3a蛋白下降超过了50％，而Dnmt3b蛋白几乎检测不到。这些结果提示CRISPR-Cas9系统能够通过非同源末端连接修复敲除突变的基因，达到治疗的效果[12]。最近，张峰等实现了sgRNA和saCas9在一个AAV载体中表达，saCas9的编码碱基数较spCas9小25％，进一步提高了基因编辑的效率[13,14]。

SOD1基因突变导致的肌萎缩侧索硬化在家族性ALS中为20％，散发性ALS中为2％。SOD1突变引起运动神经元变性的机制尚不清楚，可能与氧化应激，内质网应激，线粒体功能障碍，蛋白酶体/自噬通路异常，营养障碍，胶质细胞的激活等有关。但是，突变SOD1的神经毒性是一种获得性毒性，与SOD1突变后功能丢失无关[15]。因此，利用CRISPR-Cas9系统对突变SOD1基因进行基因编辑，在DNA水平上修饰SOD1的一段序列，通过内源性DNA修复，敲除突变SOD1基因，去除突变SOD1的获得性毒性。

SOD1-G93A半合子转基因小鼠是研究神经肌肉障碍疾病，比如ALS或葛雷克氏症很好的动物模型。该转基因小鼠高拷贝数表达人SOD1基因的G93A突变，因而有由于脊髓运动神经元损伤而出现的一个或多个肢体麻痹瘫痪，表现出类似于人ALS的表型。因此SOD1^G93A基因表达模式可成为独特的标签性的ALS动物模型。

在突变SOD1转基因小鼠上对突变基因编辑还需要一个能够靶向运动神经元的载体系统。腺相关病毒9是一种低毒性，低免疫源性，并且可以应用于临床的一种通过轴突逆行运输靶向运动神经元的载体病毒[16-18]。2012年，欧洲药品管理局批准了由腺相关病毒将有活性的LPL基因插入肌细胞中治疗脂蛋白脂酶缺乏症。在最近的临床实验中，证实了腺相关病毒载体能够携带治疗基因对目前尚无治疗手段的疾病，如血友病，无脉络膜症等，能达到治愈或控制疾病进展的疗效[19,20]。

因此，将CRISPR-Cas9系统结合靶向运动神经元运输的AAV9载体系统在体编辑突变的SOD1基因是一个能够从根本上解决SOD1突变导致运动神经元变性的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种AAV9病毒载体介导的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA及其用途、包含该sgRNA的组合物、重组表达载体和基因治疗方式。该sgRNA能有效编辑突变的SOD1基因，修复变性的运动神经元，从而达到治疗ALS的目的。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为ALS基因治疗的候选病毒。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种sgRNA，其特征在于，其具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的互补序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(Ⅳ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有70％同源性的序列。

本发明还提供了所述sgRNA用于编辑SOD1基因的用途。

本发明还提供了一种组合物，包括AAV9和SaCas9和所述的sgRNA。

本发明还提供了所述组合物的制备方法：

步骤1：将编码AAV9复制所需蛋白与编码SaCas9蛋白与所述的sgRNA的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载体；

步骤2：将所述表达载体转化宿主细胞，表达，收集表达产物，即得。

本发明还提供了一种重组载体表达单元，包括：

(1)编码AAV9复制所需蛋白的核苷酸序列；和/或

(2)编码SaCas9蛋白的核苷酸序列；和/或

(3)编码如权利要求1所述的sgRNA的DNA。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组载体表达单元的构建方法，将编码AAV9复制所需蛋白与编码SaCas9蛋白与所述sgRNA的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法中的载体为质粒或病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法中病毒包括但不限于腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病毒及相关衍生物。

所述重组载体表达单元的结构为ITR-CMV promoter-SaCas9-BGH poly(A)signal-U6promoter-SOD1 sgRNA-ITR的AAV9重组表达载体，简称AAV9-SaCas9-sg1/5。

所述重组载体表达单元包括：ITR(adeno-associated virus 2invertedterminal repeat sequence)、CMV promoter(the cytomegalovirus promoter)、SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)、BGH(Bostaurus growth hormone)、polyA(多聚腺苷酸)、U6 promoter、SOD1 sgRNA(SOD1 small guide RNA)和ITR(adeno-associated virus2inverted terminal repeat sequence)。

其中，ITR sequence(Patent WO0220748)的序列如SEQ ID No.2所示；CMVpromoter的序列如SEQ ID No.3所示；SaCas9的序列如SEQ ID No.4所示；BGH poly(A)signal的序列如SEQ ID No.5所示；U6 promoter的序列如SEQ ID No.6所示；SOD1 sgRNA的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述组合物、所述重组表达载体在制备治疗ALS的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述ALS为神经退行性疾病。

本发明的实验证明，所设计的SOD1 sgRNA能够在体外有效介导SaCas9对其进行基因编辑(图1)。在SOD1 cDNA的G93A突变位点上游人工设计5条sgRNA(图1A)，根据移码突变，SOD1G93A突变位点即可在RNA的带领下被SaCas9切割掉。用荧光素酶报告基因系统对sgRNA的切割效率进行检测。将SOD1的cDNA插入到荧光素酶基因之中破坏其编码，若Cas9介导的基因编辑能将SOD1的cDNA切割掉，则有荧光素酶的表达，因此可以通过检测荧光素酶的活性确定sgRNA的编辑效率。将荧光素酶报告基因载体和SaCas9-sgRNAs载体共转染进293T细胞中，检测结果显示各个sgRNA均有不同程度的作用，而sgRNA1和sgRNA5较其它sgRNAs有更高的效率(图1B)。向稳定表达SOD1-GFP的细胞系中转染SaCas9-LacZ，SaCas9-sgRNA1或SaCas9-sgRNA5的DNA，48h后用流式细胞术检测GFP的荧光强度以确定sgRNA对SOD1基因编辑的介导效率。和对照组sgLacZ相比，在转染SOD1的sgRNA1或sgRNA5以后，荧光强度明显下降(图1C)。用蛋白印迹法对转染后细胞内SOD1的蛋白表达水平进行检测，和对照组sgLacZ相比，转染SOD1的sgRNA1或sgRNA5后，SOD1蛋白水平显著下降(图1D)，表明所设计sgRNA1和sgRNA5能够在体外有效介导SaCas9对SOD1进行基因编辑。用腺相关病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病毒及纳米材料几种不同的载体携带sgRNA5进入293T细胞，检测sgRNA5在细胞内的活性，结果显示各个载体均具有不同程度的递送作用，其中以腺相关病毒载体的效果最显著(图1E)。

进一步采用三质粒共转染法对该重组载体进行AAV病毒包装，纯化，浓缩，Real-time PCR确定其最终滴度。选取对神经元细胞有更好亲和性的9型AAV病毒。以脑室注射的方式向新生SOD1G93A转基因小鼠中分别注射3*10¹³vg/ml AAV9-SaCas9-LacZ，AAV9-SaCas9-sgRNA1，AAV9-SaCas9-sgRNA5或AAV9-SaCas9-sgRNA1+sgRNA5病毒，可以看到，和对照组AAV9-SaCas9-LacZ相比，AAV9-SaCas9-sgRNA1，AAV9-SaCas9-sgRNA5和AAV9-SaCas9-sgRNA1+sgRNA5组SOD1G93A转基因小鼠的发病呈现明显延迟(LacZ:105±5.2d(n＝5),sg1:122±9.7d(n＝5),sg5:149±9d(n＝5),sg1+sg5:125±6.6d(n＝5),*P<0.05)，尤其以AAV9-SaCas9-sgRNA5组最为明显(图2A和图5)。治疗组转基因小鼠的生存率也较对照组明显延长(LacZ:132±1.1d(n＝5),sg1:143±11.6d(n＝5),sg5:161±6.8d(n＝5),sg1+sg5:137±6.2d(n＝5),*P<0.05)，尤其以AAV9-SaCas9-sgRNA5组最为明显(图2B和图5)。表明AAV9-SaCas9-sgRNAs可以在体内有效防止运动神经元变性。

进一步对小鼠行为学能力进行测试来评估SOD1 sgRNAs对ALS的治疗效果。在117天时对转基因小鼠进行后腿拉伸测试，在第115天125天分别用足迹法测试。AAV9-SaCas9-LacZ对照组小鼠在疾病发作后，呈现震颤、走路不平衡、后腿肌肉萎缩、体重下降和呼气性呼吸困难，并在4周内迅速恶化。和对照组相比，AAV9-SaCas9-sgRNA1和AAV9-SaCas9-sgRNA5组小鼠的后腿拉伸宽度明显提高(LacZ:1.58±0.99cm(n＝5),sg1:6.09±0.75cm(n＝4),sg5:11.74±0.75cm(n＝5),sg1+sg5:4.74±1.26cm(n＝5),*P<0.05)(图3A)。足迹法测AAV9-SaCas9-LacZ，AAV9-SaCas9-sgRNA1，AAV9-SaCas9-sgRNA5和AAV9-SaCas9-sgRNA1+sgRNA5各组小鼠两后肢脚印之间的最长距离，在第115天时分别是LacZ:3.18±0.7cm(n＝5),sg1:5.7±0.32cm(n＝4),sg5:5.98±0.29cm(n＝5),sg1+sg5:4.16±1.22cm(n＝5)，在第125天时分别是LacZ:2.1±1cm(n＝5),sg1:5.23±1.2cm(n＝4),sg5:6.4±0.53cm(n＝5)，和对照组比治疗组行为学特征都有显著改善(图3B)，表明脑室注射AAV9 SOD1 sgRNAs，尤其是AAV9-SaCas9-sgRNA5可有效改善ALS转基因小鼠的运动性能。

选取治疗效果最显著的AAV9-SaCas9-sgRNA5，进一步用荧光显微镜观察其对运动神经元的保护作用。用Neu N和IBA1作为标志物对运动神经元和小神经胶质细胞进行染色标记，可以看到，对照组Neu N阳性的运动神经元细胞直径超过20μm，细胞已发生变性，而AAV9-SaCas9-sgRNA5组则保留了相当数量的正常运动神经元细胞(LacZ:1.5±0.31(n＝14),sg5:4.4±0.28(n＝12),*P<0.05)，IBA1阳性的小神经胶质细胞则没有这种变化(图4A)。经AAV9-SaCas9-sgRNA5治疗后，胫骨前肌的萎缩状况也较AAV9-SaCas9-sgLacZ对照组发生了明显改善(LacZ:1242±667μm²(n＝605),sg5:1679±665μm²(n＝421),*P<0.05)(图4B)。为进一步验证对运动神经元的保护是由AAV9-SaCas9-sgRNA5介导的SOD1基因敲除引起的，对小鼠运动神经元细胞内的SaCas9和SOD1突变体表达水平进行染色观察。在AAV9-SaCas9-LacZ对照组，SaCas9和SOD1突变体表达水平均很高，而在AAV9-SaCas9-sgRNA5治疗组，SaCas9阳性细胞内的SOD1突变体表达水平则非常低(LacZ:2722±210(n＝10),sg5:216±52(n＝17),*P<0.05)(图4C)，表明得到的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为ALS基因治疗的候选病毒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示SOD1 sgRNAs在体外的基因编辑分析；图1(A)：根据SaCas9设计原则，在SOD1cDNA上游的G93A突变处设计五个目标sgRNA；图1(B)：用荧光素酶报告基因系统检测不同sgRNAs的编辑效率，与LacZ-sgRNA对照组进行比较(mean±SE,n＝3,*P<0.05)；图1(C)：在稳定表达SOD1-GFP的293T细胞中分别转染sg-LacZ，SOD1-sgRNA1和SOD1-sgRNA5，流式细胞术检测GFP表达强度(sg-LacZ:3784±678.9,sg1:3784±32.1,sg5:1619±489,mean±SE,n＝3,*P<0.05)；图1(D)：免疫印迹法检测293T细胞中转染sg-LacZ，SOD1-sgRNA1或SOD1-sgRNA5后SOD1的蛋白表达水平(sg-LacZ:0.95±0.06,sg-1:0.72±0.12,sg-5:0.67±0.14,mean±SE,n＝3,*P<0.05)；图1(E)：用荧光素酶报告基因系统检测不同载体携带sgRNA5的编辑效率，与转染对照组进行比较(mean±SE,n＝3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

图2示在SOD1G93A转基因小鼠中SaCas9-sgRNAs的治疗效果；以脑室注射方式分别给SOD1G93A转基因小鼠3*10¹³vg/ml AAV9-SaCas9-sgLacZ，AAV9-SaCas9-sg1，AAV9-SaCas9-sg5或AAV9-SaCas9-sg1+sg5病毒，小鼠发病率图2(A)和存活率图2(B)；图3示SOD1G93A转基因小鼠接受不同AAV9-SaCas9-sgRNAs治疗后的行为学变化；图3(A)：经AAV9-SaCas9-sgLacZ，AAV9-SaCas9-sg1，AAV9-SaCas9-sg5与AAV9-SaCas9-sg1+sg5治疗后，117天时对转基因小鼠进行后腿拉伸测试；图3(B)：足迹法检测115天和125天年龄的小鼠两后肢脚印间的最长距离(mean±SE,n＝4-5,*P<0.05)；

图4示SOD1 sgRNAs对运动神经元的保护作用；图4(A)：SOD1G93A转基因小鼠经AAV9-SaCas9-sgLacZ或AAV9-SaCas9-sg5进行治疗后，免疫荧光法检测Neu N阳性运动神经元和IBA1阳性小神经胶质细胞形态学变化(mean±SE,n＝12-14,*P<0.05)；图4(B)：SOD1G93A转基因小鼠经AAV9-SaCas9-sgLacZ或AAV9-SaCas9-sg5治疗后，小鼠胫骨前肌萎缩变化情况(mean±SD,n＝～500,*P<0.05)；图4(C)：双染SaCas9和SOD1突变体后，荧光共聚焦显微镜观察终末时小鼠运动神经元中SaCas9与SOD1表达情况(mean±SE,n＝10-17,*P<0.05)；

图5示SOD1G93A转基因小鼠经AAV9-SaCas9-sgLacZ或AAV9-SaCas9-sg5进行治疗后，小鼠的基因拷贝数、性别、发病和生存期。

具体实施方式

本发明公开了一种AAV9病毒载体介导的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA及其用途，包含与该sgRNA的组合物、重组表达载体和基因治疗方式，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的第一个目的在于提供能有效介导SOD1突变体基因编辑的sgRNA。

所述不同sgRNA为sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4，sgRNA5，尤其是sgRNA5。

本发明的第二个目的在于提供一种载体，所述载体表达AAV9复制所需蛋白和SaCas9蛋白。

本发明的第三个目的在于提供一种AAV9和SaCas9蛋白和SOD1 sgRNAs重组载体表达单元的制备方法，此重组载体表达单元结构为ITR-CMV promoter-SaCas9-BGH poly(A)signal-U6 promoter-SOD1 sgRNA-ITR的AAV9重组表达载体，简称AAV9-SaCas9-sg1/5。

所述重组载体表达单元包括：ITR(adeno-associated virus 2invertedterminal repeat sequence)、CMV promoter(the cytomegalovirus promoter)、SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)、BGH(Bostaurus growth hormone)、polyA(多聚腺苷酸)、U6 promoter、SOD1 sgRNA(SOD1 small guide RNA)和ITR(adeno-associated virus2inverted terminal repeat sequence)。

其中，ITR sequence(Patent WO0220748)的序列如SEQ ID No.2所示；CMVpromoter的序列如SEQ ID No.3所示；SaCas9的序列如SEQ ID No.4所示；BGH poly(A)signal的序列如SEQ ID No.5所示；U6 promoter的序列如SEQ ID No.6所示；SOD1 sgRNA的序列如SEQ ID No.1所示。

所述载体为质粒或病毒，所述病毒包括但不限于腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病毒及相关衍生物。

本发明的第四个目的在于提供一种组合物，包括AAV9复制所需蛋白和SaCas9蛋白和所设计SOD1突变体的sgRNA。

所述组合物中，所述SOD1突变体的sgRNA为sgRNA5，其序列如SEQ ID NO.1所示。SaCas9的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第五个目的在于提供上述任一项的载体、组合物或病毒在治疗ALS中的用途。

所述ALS为神经退行性疾病。

在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和方法，提供了编码SOD1 sgRNA5、SaCas9的重组AAV9共表达载体和病毒的制备、包装、及其应用。

本发明提供了sgRNA及其用途，包含与该sgRNA的组合物、重组表达载体和基因治疗方式。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 AAV9-SaCas9-SOD1 sgRNA克隆及病毒包装

根据SaCas9 PAM序列(NNGRRT)以及最优21-nt长度的设计原则，设计五条SOD1sgRNAs，分别用Bsa I酶切后，克隆入AAV-SaCas9-sgRNA载体(Addgene,px61591)中。用三质粒共转染法包装AAV-SaCas9-SOD1 sgRNAs病毒，纯化浓缩，用qPCR测定其滴度。

SOD1 sgRNA设计及编辑效率结果：

图1(A)示五条SOD1 sgRNAs的序列设计；

图1(B)示五条SOD1 sgRNA可以不同程度介导saCas9对SOD1的切割，其中以sgRNA1和sgRNA5效果最好；

图1(E)示六种载体对sgRNA5有不同程度的递送效率，其中以腺相关病毒的效果最好。

实施例2流式细胞术检测SOD1 sgRNA的基因编辑效率向293T细胞中转染SOD1-GFP质粒，48h后收细胞，用0.25％的胰酶消化细胞，离心得沉淀。用培养基将细胞重悬为1×10⁷cells/ml细胞悬液，用流式细胞仪(FACSAria,BD)分选出GFP阳性细胞，即得到SOD1-GFP稳定细胞株。按照Lipofectamine 2000操作手册，向稳定表达SOD1-GFP的细胞株中转染SaCas9-LacZ，SaCas9-sgRNA1或SaCas9-sgRNA5的DNA，48h后用流式细胞仪检测GFP的荧光强度以确定sgRNA对SOD1基因编辑的介导效率。可以看到，和对照组sgLacZ相比，在转染SOD1的sgRNA1或sgRNA5以后，荧光强度明显下降。

流式细胞术检测SOD1 sgRNA的基因编辑效率结果：

图1(C)示在稳定表达SOD1-GFP的293T细胞中转染SOD1-sgRNA1和SOD1-sgRNA5后，GFP表达强度明显下降。

实施例3 Western Blot检测SOD1 sgRNA的基因编辑效率

使用总蛋白提取试剂盒(Applygen Technologies Inc.,P1250)提取脊髓中的总蛋白。测定浓度后每个样品上样50μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜后封闭，经beta-actin抗体(1:500,Proteintech)和hSOD1抗体(1:1,Abcam)4℃孵育过夜后，彻底洗涤，用荧光标记的二抗在室温孵育1小时，然后利用Odyssey红外成像系统对相应条带进行检测。可以看到，在转染SOD1-sgRNA1或SOD1-sgRNA5后SOD1的蛋白表达水平明显下降。

sgRNA1和sgRNA5能够在体外介导SaCas9对SOD1进行基因编辑结果：

图1(D)示在293T细胞中转染SOD1-sgRNA1或SOD1-sgRNA5后，SOD1的蛋白表达水平明显下降。

实施例4小鼠动物模型的建立

SOD1G93A转基因小鼠(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)从Jackson实验室获得，在昼夜12h周期交替，相对湿度60±10％，温度22±1℃条件下饲养。

实施例5脑室注射AAV病毒

将AAV稀释为4μl含0.05％台盼蓝的病毒液，以人字缝和矢状缝连接处为零点，向前1.5mm，在矢状缝侧面0.8-1mm处，注射深度约3mm，针保留1分钟，然后慢慢地抽回[21]。

实施例6小鼠行为学分析

每周一次用转棒实验来测试小鼠的运动机能，截止时间为180s，测量三次，选取最长的时间记录。根据小鼠每周转棒性能的下降程度来确定发病时间。足迹法根据小鼠的连续运动来记录，选取三个步长之间的最大值来进行计算。

可以看到，在以脑室注射方式分别给SOD1G93A转基因小鼠3*10¹³vg/ml AAV9-SaCas9-sgLacZ，AAV9-SaCas9-sg1，AAV9-SaCas9-sg5或AAV9-SaCas9-sg1+sg5病毒后，小鼠的发病率在sgRNAs治疗组呈现明显延迟，运动能力明显提高。

SOD1G93A转基因小鼠接受不同AAV9-SaCas9-sgRNAs治疗后的发病情况及行为学变化结果：

(1)SOD1G93A转基因小鼠在治疗组的发病率呈现明显延迟，见图2(A)；

(2)SOD1G93A转基因小鼠在治疗组的生存率明显提高，见图2(B)；

(3)117天时对转基因小鼠进行后腿拉伸测试，治疗组的小鼠后腿拉伸宽度明显提高，见图3(A)；

(4)足迹法检测115天和125天时小鼠两后肢脚印间的最长距离，治疗组明显提高，见图3(B)。

实施例7肌肉形态学观察

将10μm冰冻的肌肉横截面用HE染色后在奥林巴斯显微镜(BX53)下观察染色结果并拍照，图像用DP73软件分析。大约记录500纤维的胫骨前肌，纤维区域用软件image J计算。可以看到，经AAV9-SaCas9-sgRNA5治疗后，小鼠胫骨前肌萎缩状况较AAV9-SaCas9-sgLacZ对照组发生了明显改善。

经AAV9-SaCas9-sgRNA5治疗后，小鼠胫骨前肌萎缩状况检测结果：

图4(B)示SOD1G93A转基因小鼠经AAV9-SaCas9-sg5治疗后，较AAV9-SaCas9-sgLacZ对照组，小鼠的胫骨前肌萎缩状况明显改善。

实施例8免疫荧光法检测运动神经元细胞变性情况

将细胞用含0.3％Triton X-100的PBS洗三次，用10％的马血清在室温封闭30分钟。按相应的比例稀释并孵育一抗：IBA1(1:400,Wako,Richmond)、Neu N(1:100,Millipore)、hSOD1(1:200,Abcam)、HA(1:300,Sigma)，室温孵育2h后洗涤三次，用荧光标记二抗在室温下孵育1h。使用荧光共聚焦显微镜(奥林巴斯FV1000)观察细胞染色状况。可以看到，经AAV9-SaCas9-sgRNA5治疗后，小鼠运动神经元细胞变性情况较AAV9-SaCas9-sgLacZ对照组发生了明显改善。

经AAV9-SaCas9-sgRNA5治疗后，小鼠运动神经元细胞变性情况检测结果：

(1)SOD1G93A转基因小鼠经AAV9-SaCas9-sg5进行治疗后，免疫荧光法检测Neu N阳性运动神经元和IBA1阳性小神经胶质细胞形态学变性情况，运动神经元细胞的变性状况得到明显改善，见图4(A)；

(2)双染SaCas9和SOD1突变体，荧光共聚焦显微镜观察终末时小鼠运动神经元中SaCas9与SOD1表达情况，SaCas9阳性细胞内的SOD1突变体表达水平非常低，见图4(C)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

参考文献

[1]乔雷,李晓光,刘明生,崔丽英.肌萎缩侧索硬化自然病程的临床观察.中华医学杂志.2014,94(9):674-677.

[2]Bucchia M,Ramirez A,Parente V,Simone C,Nizzardo M,Magri F,etal.Therapeutic Development in Amyotrophic Lateral Sclerosis.ClinTher.2015；37(3):668-680.

[3]Cirulli ET,Lasseigne BN,Petrovski S,Sapp PC,Dion PA,Leblond CS,etal.Exome sequencing in amyotrophic lateral sclerosis identifies risk genesand pathways.Science.2015；347(6229):1436-1441.

[4]Platt RJ,Chen S,Zhou Y,Yim MJ,Swiech L,Kempton HR,et al.CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.Cell.2014；159(2):440-455.

[5]Hsu PD,Lander ES,Zhang F.Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.Cell.2014；157(6):1262-1278.

[6]Zhang F,Wen Y,Guo X.CRISPR/Cas9 for genome editing:progress,implications and challenges.Hum Mol Genet.2014；23(R1):R40-R46.

[7]Shalem O,Sanjana NE,Hartenian E,Shi X,Scott DA,Mikkelsen TS,etal.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.Science.2014；343(6166):84-87.

[8]Ran FA,Hsu PD,Wright J,Agarwala V,Scott DA,Zhang F.Genomeengineering using the CRISPR-Cas9 system.Nat Protoc.2013；8(11):2281-2308.

[9]Lu Y.Recombinant adeno-associated virus as delivery vector forgene therapy-a review.Stem Cells Dev.2004；13:133-45.

[10]Daly TM.Overview of adeno-associated viral vectors.Methods MolBiol.2004,246:157-65.

[11]Long C,McAnally JR,Shelton JM,Mireault AA,Bassel-Duby R,OlsonEN.Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editingof germline DNA.Science.2014；345(6201):1184-1188.

[12]Swiech L,Heidenreich M,Banerjee A,Habib N,Li Y,Trombetta J,etal.In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain usingCRISPR-Cas9.Nat Biotechnol.2015；33(1):102-106.[13]Ran FA,Cong L,Yan WX,ScottDA,Gootenberg JS,Kriz AJ,et al.In vivo genome editing using Staphylococcusaureus Cas9.Nature.2015；520(7546):186-191.

[14]Platt RJ,Chen S,Zhou Y,Yim MJ,Swiech L,Kempton HR,et al.CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.Cell.2014；159(2):440-455.

[15]Dirren E,Aebischer J,Rochat C,Towne C,Schneider BL,AebischerP.SOD1 silencing in motoneurons or glia rescues neuromuscular function in ALSmice.AnnClinTransl Neurol.2015；2(2):167-184.

[16]Benkhelifa-Ziyyat S,Besse A,Roda M,Duque S,Astord S,Carcenac R,etal.Intramuscular scAAV9-SMN injection mediates widespread gene delivery tothe spinal cord and decreases disease severity in SMA mice.Mol Ther.2013；21(2):282-290.

[17]Duque S,Joussemet B,Riviere C,Marais T,Dubreil L,DouarAM,etal.Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgenedelivery to adult motor neurons.Mol Ther.2009；17(7):1187-1196.

[18]Samaranch L,Salegio EA,San SW,Kells AP,Bringas JR,Forsayeth J,etal.Strong cortical and spinal cord transduction after AAV7 and AAV9 deliveryinto the cerebrospinal fluid of nonhuman primates.Hum Gene Ther.2013；24(5):526-532.

[19]Maclaren RE,Groppe M,Barnard AR,Cottriall CL,Tolmachova T,SeymourL,et al.Retinal gene therapy in patients with choroideremia:initial findingsfrom a phase 1/2 clinical trial.Lancet.2014,383(9923):1129-1137.

[20]Nathwani AC,Tuddenham EG,Rangarajan S,Rosales C,McIntosh J,LinchDC,et al.Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer inhemophilia B.N Engl J Med.2011；365(25):2357-2365.

[21]Kim JY,Grunke SD,Levites Y,Golde TE,JankowskyJL.Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain forpersistent and widespread neuronal transduction.J Vis Exp.2014 Sep 15；(91):51863.doi:10.3791/51863.

SEQ ID

No.1

5'-GGCCCACCGTGTTTTCTGGATA-3'

No.2

5'-GACGGCGCTAGGATCATCAACGAAACCCAGCATCTACACAATGTAGCTCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACGAAACCCAGCATCTACACAATGTAGCTCAAGATGATCCTAGCGCCGTCTT-3'

No.3

5'-CTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTACCGGTGCCACCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCA-3'

No.4

5'-TGGTCTTGCTGATTCTGCCCTTGCCCTTGGCCAGATTCAGGATGTGCTTCTTGAAGGTTTCGTAGCTGATCTTGCTGTCGCTGCTGCTCAGGTACTGGAATGGGGTCCGGTTGCCCTTCTTGCTGTTTTCTTCCTGCTTCACGAGCACCTTGTTGTTGAAGCTGTTGTCGAAGGACACGCTTCTGGGGATGATGTGGTCCACCTCATAGTTGAAGGGGTTGTTCAGCAGATCTTCCAGAGGGATGGCTTCCAGGCTGTACAGGCACTTGCCTTCCTGCATGTCGTGCAGCTTGATCTTCTCGATCAGGTACTTGGCGTTCTCTTTGCCGGTGGTCCGGATGATTTCCTCGATCCGCTCGTTGGTCTGCCGGTTCCGCTTCTGCATCTCGTTGATCATTTTCTGGGCGTCCTTGGAGTTCTTCTCGCGGGCCAGCTCGATAATGATGTCGTTGGGCAGGCCGTACTTCTTGATGATGGCGTTGATCACTTTGATGCTCTGGATGAAGCTTCTCTTCACGACGGGGCTCAGGATGAAGTCGTCCACCAGGGTGGTGGGGATCTCTTTCTGCTGGGACAGGTCCACCTTCTTGGGCACCAGCTTCAGCCGGTTGAAGATAGCGATCTGGTTGTCGTTGGTGTGCCACAGCTCGTCCAGGATCAGGTTGATGGCCTTCAGGCTCAGGTTGTGGGTGCCGGTATAGCCCTTCAGATTAGAGATCTGCTCGATCTCTTCCTGGGTCAGCTCGGAGTTCAGATTGGTCAGTTCTTCCTGGATGTCCTCGCTGCTCTGGTAGATGGTCAGGATCTTGGCAATCTGATCCAGCAGCTCGGCGTTCTCAATAATCTCTTTCCGGGCGGTAATGTCCTTGATGTCGTGGTACACCTTCAGGTTGGTGAACTCGGGCTTGCCGGTGCTGGTCACTCTGTAGCCCTTAATATCCTCTTCGTTCACGAGGAT-3'

No.5

5'-GAATTCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTTTTCGTGGCCGCCGGCCTTTTGCCCTTTTTGATGATCTGAGGGTGCTTCTTAGATTTCACTTCATACAGGTTGCCCAGAATGTCTGTGCTGTACTTCTTAATGCTCTGGGTCTTGGAGGCGATTGTCTTAATGATCCTGGGGGGCCTCTTGTCGTTCATGTTTTCCAGGTACTCGCGGTAGGTGATGTCGATCATGTTCACTTCGATCCGGTTCAGCAGGTCGTTGTTCACGCCGATCACTCTATACAGCTCGCCGTTGATCTTGATCAGATCGTTGTTGTAGAAGGAGGCGATAAACTCGGCCTGGTTGCTGATCTTCTTCAGCTTCTTAGCTTCCTCATAGCACTTGCTATTCACTTCGTAGTAGTTTTCTTTTTTGATCACATCCAGATTCTTCACGGTCACGAACTTGTACACGCCATTGTCCAGGTACACGTCGAATCTGTAGGGCTTCAGGGACAGCTTCACGACCTTGTTTCTGCTGTTGGGGTAGTCGTCGGTGATGTCCAGATGGGCGTTCAGTTTGTTGCCGTAATACTTAATCTTCTTGATCACGGGGCCGTTGTCCTTTTTGGAGTACTTGGTCAGGTAGTTCCCGGTTTCCTCGTAGTACTTGTACAGGGGATTCTTCTCGTCGCCGTACTGTTCCATAATCAGCTTCAGTTTCTGGTAGGTCTGGGGGTCGTGGTGGTACATCAGCAGCTTTTCGGGGCTCTTGTTGATCAGCTTTTTCAGCTTGTCATTGTCCTTGTCGTACAGGCCGTTCAGATTGTTCACGATCAGGGTGTTGCCCTTGTCGTCCTTCCGGGTGGAGTACAGGGTGTCGTT-3'

No.6

5'-CATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGACCACGGCAGGTCTCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACNGAGGCCGGGCGACCAAAGGT-3'

Claims (5)

1.一种编码sgRNA的DNA序列，其特征在于，是如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.一种组合物，其特征在于，包括AAV9和SaCas9和编码如权利要求1所述的sgRNA的DNA序列。

3.一种由AAV9载体介导的编码SaCas9蛋白的重组载体表达单元，其特征在于，包括：

编码如权利要求1所述的sgRNA的DNA。

4.根据权利要求3所述的重组载体表达单元，其特征在于，包括：

ITR-CMV启动子-SaCas9-BGH poly(A)信号-U6启动子-SOD1 sgRNA-ITR，其中所述的SOD1 sgRNA是序列如SEQ ID No.1所示的、编码SOD1 sgRNA的DNA序列。

5.重组表达载体的构建方法，所述重组表达载体包含权利要求3或4所述的重组载体表达单元，所述构建方法的特征在于，将编码如权利要求1所述RNA的DNA连接到包含编码AAV9复制所需蛋白的核苷酸序列与编码SaCas9蛋白的核苷酸序列的载体中，构建重组表达载体。

Images