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CN107438436A - 用于治疗淋巴瘤的组蛋白脱乙酰酶抑制剂和苯达莫司汀的组合 - Google Patents

用于治疗淋巴瘤的组蛋白脱乙酰酶抑制剂和苯达莫司汀的组合 Download PDF

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CN107438436A
CN107438436A CN201580075457.1A CN201580075457A CN107438436A CN 107438436 A CN107438436 A CN 107438436A CN 201580075457 A CN201580075457 A CN 201580075457A CN 107438436 A CN107438436 A CN 107438436A
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M·科森扎
S·波兹
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Universita Degli Studi di Modena e Reggio Emilia
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Universita Degli Studi di Modena e Reggio Emilia
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Abstract

本发明涉及包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的药物组合；包含所述HDAC抑制剂和苯达莫司汀的药物组合物；以及使用此类组合和组合物以治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法。

Description

用于治疗淋巴瘤的组蛋白脱乙酰酶抑制剂和苯达莫司汀的 组合
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月5日提交的美国临时申请序列号62/087,868的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文。
背景
B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤仍然是不可治愈和进行性疾病，其继续列为患有这些疾病的患者死亡的主要原因。
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)是癌症疗法的有希望的靶标。它们是使组蛋白和非组蛋白上的赖氨酸残基脱乙酰化的酶家族，其在调控细胞周期进程和存活方面起作用。遗憾的是，非选择性HDAC抑制剂已在患者中导致剂量限制性毒性。Ricolinostat是新型选择性组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)抑制剂。HDAC6是在细胞对环境应激的应答方面起重要作用的IIB类组蛋白脱乙酰酶。
苯达莫司汀是设计来组合嘌呤类似物和烷化剂的性质的抗肿瘤药。
由于以上疗法的剂量限制性毒性，本领域持续需要更有效和较少毒性的组合物以及用于治疗淋巴瘤的方法。为了满足这些需要，本文提供包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的药物组合，以及用于治疗淋巴瘤的方法。本发明的组合和方法是良好耐受的，并且未展现先前疗法的剂量限制性毒性。
发明概述
本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的药物组合。本文还提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法。
在一些实施方案中提供包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂和苯达莫司汀的组合，以治疗有需要的受试者的淋巴瘤。例如，本发明的一个实施方案提供用于治疗淋巴瘤的药物组合，所述药物组合包含治疗有效量的组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)特异性抑制剂或其药学上可接受的盐，以及苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。本发明的另一个实施方案提供用于治疗淋巴瘤的药物组合，所述药物组合包含治疗有效量的组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)特异性抑制剂或其药学上可接受的盐，以及苯达莫司汀或其药学上可接受的盐，其中所述组合以展现协同作用的剂量施用。
在其他实施方案中提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂和苯达莫司汀的组合。例如，本发明的一个实施方案提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合，所述药物组合包含组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)特异性抑制剂或其药学上可接受的盐，以及苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。本发明的另一个实施方案提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合，所述药物组合包含组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)特异性抑制剂或其药学上可接受的盐，以及苯达莫司汀或其药学上可接受的盐，其中所述组合以展现协同作用的剂量施用。
在具体实施方案中，HDAC6特异性抑制剂为式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
环B为芳基或杂芳基；
R1为芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基中的每一者可任选地被OH、卤代或C1-6烷基取代；并且
R为H或C1-6烷基。
在优选的实施方案中，式I化合物为：
或其药学上可接受的盐。
在另一些实施方案中，式I化合物为：
或其药学上可接受的盐。
在其他具体实施方案中，HDAC6特异性抑制剂为式II化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
Rx和Ry与各自附接的碳一起形成环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基；
每个RA独立地为C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代、OH、-NO2、-CN或-NH2；并且
m为0、1或2。
在优选的实施方案中，式II化合物为：
或其药学上可接受的盐。
在其他优选的实施方案中，式II化合物为：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀与药学上可接受的载体一起施用。
在一些实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀以分开的剂型施用。在其他实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀以单一剂型施用。
在一些实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀在不同时间施用。在其他实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀在基本上相同的时间施用。
在一些实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合在有需要的受试者的治疗中实现协同作用。
本发明的另一个实施方案包括用于诱导癌细胞凋亡的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。在一些实施方案中，凋亡的诱导与活性氧物质的增加相关。在一些实施方案中，凋亡与半胱天冬酶3、半胱天冬酶9、半胱天冬酶8和/或PARP的活化相关。
本发明的又一个实施方案包括用于降低癌细胞的活力的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
本发明的再一个实施方案包括用于降低癌细胞的克隆形成性存活的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于抑制癌细胞的细胞增殖的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于降低癌细胞中Bcl-2的表达的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于在癌细胞中增加细胞周期蛋白p21和p27的表达并且减少细胞周期蛋白细胞周期蛋白D的表达的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于诱导癌细胞中PI3K/Akt信号传导途径的脱磷酸化的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
通过以下详述，其他目的、特征和优势将变得显而易见。详述和具体实例仅是为了说明而给出，这是因为本领域技术人员从这一详述中将会明了在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。此外，所述实例证实本发明的原则。
附图简述
图1A示出HDAC6在所检测的所有细胞系中高度表达
图1B示出ricolinostat对细胞活力的作用。Ricolinostat在用连续剂量的ricolinostat(0.1–100μM)处理24–72h的六种淋巴瘤细胞系(WSU-NHL、RL、Granta-519、Jeko-1、Hut-78和Karpas-299)的组中诱导剂量和时间依赖性方式生长抑制。数据代表至少三个独立实验，并且代表平均值±SD。
图1C示出苯达莫司汀的抗增殖活性。WSU-NHL、Jeko-1和Hut-78细胞用苯达莫司汀(25-300μM)处理24h。苯达莫司汀证实细胞活力的剂量依赖性抑制以及127μM至168μM的IC50范围。值表示三个独立实验。
图2A示出药物组合对WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1细胞的细胞活力的协同作用。细胞用与苯达莫司汀(0、10、20、25、40、50和100μM)组合的不同浓度的ricolinostat(0、2、2.5、4、5、8和10μM)处理，并且在24h时通过MTT来测定。
图2B示出通过等效线图分析(相互作用指数<1)证实图2A所示的协同作用。
图2C示出来自用ricolinostat(4μM)和苯达莫司汀(20μM)单独和组合培养24h的三名健康受试者的新鲜分离的PBMC的细胞活力。
图2D和图2E示出单独的ricolinostat以及与苯达莫司汀组合的ricolinostat对克隆形成性存活的作用。WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1细胞在液体培养中首先用单独的ricolinostat(1、5、10μM)(C)孵育，随后用与苯达莫司汀组合的ricolinostat(D)孵育24h。处理的细胞在甲基纤维素中孵育，并且在10天后对由更多50个细胞组成的集落进行计数。示出相对于对照细胞的相对百分比，并且表示三个单独实验的平均值±SD。
图3A示出ricolinostat和苯达莫司汀克服了BM-MSC的保护作用。与或不与BM-MSC共培养并且暴露于单独和组合的ricolinostat(R)和苯达莫司汀(B)持续24h的WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1细胞的细胞活力。当与BM-MSC共培养时，药物组合抑制淋巴瘤细胞系的细胞活力。所有数据表达为一式三份培养物的未处理对照的百分比±SD。
图3B示出药物组合对用ricolinostat(4μM)和苯达莫司汀(20μM)单独和组合处理的WSU-NHL、Hut-78以及用ricolinostat(5μM)和苯达莫司汀(50μM)单独和组合处理的Jeko-1细胞的细胞周期曲线的作用。M1、M2、M3和M4的条分别指示亚G0/G1、G0/G1、S和G2/M时期。
图3C示出24小时的处理后不同时期的淋巴瘤细胞系的细胞周期分布百分比。所有值代表三个独立实验的平均值±SD。
图4示出ricolinostat/苯达莫司汀对细胞周期调控蛋白的作用。WSU-NHL、Hut-78用4μM ricolinostat和20μM苯达莫司汀单独和组合处理；Jeko-1用5μM ricolinostat和50μM苯达莫司汀单独和组合处理。蛋白质印迹在处理24h后进行。微管蛋白用于使蛋白质负载归一化。
图5A-5E示出单独的ricolinostat以及与苯达莫司汀组合的ricolinostat对凋亡的作用。
图5A示出WSU-NHL细胞在用ricolinostat(1、2、5、10μM)单独处理24h并且由膜联蛋白V/碘化丙啶染色时的代表性点图。
图5B示出在暴露于单独的ricolinostat(1、2、5和10μM)持续24-48h后的WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1细胞系中凋亡细胞的百分比。
图5C示出用与苯达莫司汀(20μM)组合的ricolinostat(4μM)处理24h的WSU-NHL和Hut-78以及用5μM ricolinostat和50μM苯达莫司汀的组合处理的Jeko-1细胞的点图。流式细胞术显示由组合治疗诱导的凋亡增加。
图5D示出WSU-NHL和Hut-78的用4μM ricolinostat(R)和20μM苯达莫司汀(B)的组合处理的凋亡细胞(早期和晚期凋亡)以及Jeko-1细胞的用5μM ricolinostat和50μM苯达莫司汀的组合处理的凋亡细胞(早期和晚期凋亡)的百分比。
图5E示出来自用ricolinostat(1、5、10μM)单独处理24小时的WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1的ROS产生的代表性数据(％)。所有数据表达为一式三份培养物的平均值±SD。
图6A-6D示出药物组合在24h时引起具有强烈作用的ROS产生。
图6A示出来自用ricolinostat(R)和苯达莫司汀(B)处理24后的WSU-NHL的ROS产生的代表性数据。
图6B示出来自药物组合的具有增加的ROS水平的细胞百分比。抗氧化剂NAC的共同施用阻断ROS产生的增加。H2O2用作阳性对照。
图6C示出由药物组合诱导的ROS产生与硫氧还蛋白-1(Trx1)表达的减少相关。来自用针对Trx-1的抗体探测的WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1细胞的细胞提取物的蛋白质印迹。
图6D示出药物组合介导的ER应激和UPR信号传导。来自以指定剂量用药物单独或组合处理24h的WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1的细胞提取物的代表性蛋白质印迹。微管蛋白用于使蛋白质负载归一化。
图7A示出对Bcl-2蛋白质表达的作用。Ricolinostat(R)和苯达莫司汀(B)减少Bcl-2的表达。由流式细胞术评估的WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1细胞中Bcl-2水平的代表性数据(％)。
图7B示出Bcl-2家族蛋白的参与。药物组合介导的抗凋亡蛋白下调和促凋亡蛋白磷酸化。全细胞裂解物使用指定Ab来进行蛋白质印迹。
图7C示出半胱天冬酶途径的参与。来自WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1细胞的细胞提取物中具有或不具有ZVAD-fmk的半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3和PARP的代表性蛋白质印迹。微管蛋白显示为负载对照
图8A示出药物组合控制PI3K/AKT信号传导途径。用4μMricolinostat和20μM苯达莫司汀处理的WSU-NHL和Hut-78细胞；用5μM ricolinostat和50μM苯达莫司汀处理的Jeko-1细胞。全细胞裂解物使用指定Ab来进行蛋白质印迹。
图8B示出单独的ricolinostat以及与苯达莫司汀组合的ricolinostat对α-微管蛋白的HDAC6乙酰化的作用。ricolinostat的暴露降低HDAC6表达，并且诱导淋巴瘤细胞中α-微管蛋白的乙酰化水平，所述乙酰化水平的程度未被苯达莫司汀进一步修饰。来自用药物单独或组合处理24h的WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1的细胞提取物的蛋白质印迹。微管蛋白用于使蛋白质负载归一化。
图9A示出单独的ricolinostat以及与苯达莫司汀组合的ricolinostat使微管稳定。ricolinostat单独诱导荧光强度的增加，所述荧光强度的增加用药物组合而进一步增加。来自由抗α-微管蛋白染色和流式细胞术评估的微管蛋白聚合分析的代表性数据。用ricolinostat(R)4μM和苯达莫司汀(B)20μM单独和组合处理24小时的WSU-NHL和Hut-78；用ricolinostat 5μM和苯达莫司汀50μM处理以及用微管去稳定剂诺考达唑(阴性对照)(1μM)和微管稳定剂紫杉醇(阳性对照)(100nM)处理的Jeko-1细胞。数据表达为平均值±SD，并且获自一式三份进行的三个独立实验。
图9B示出单独的ricolinostat以及与苯达莫司汀组合的ricolinostat下调IL-10表达。药物组合对WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1细胞中IL-10分泌的作用。ricolinostat单独诱导IL-10的下调。与任一单独的化合物相比，药物组合还降低此细胞因子的水平。IL-10分泌通过ELISA来分析。所有数据均为各自一式两份进行的至少三个单独实验的平均值(±SD)。
详述
本申请总体涉及包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂和苯达莫司汀的组合，以及用于治疗淋巴瘤的方法。
定义
以下列出用于描述本发明的各种术语的定义。除非在具体情况下单独地或作为较大组的一部分另有限制，否则这些定义适用于整个本说明书和权利要求书中使用的术语。
术语“约”通常指示不多于值的10％、5％或1％的可能变化。例如，“约25mg/kg”通常在最广泛意义上指示值为22.5-27.5mg/kg，即25±2.5mg/kg。
术语“烷基”是指在某些实施方案中分别含有1个与6个或1个与8个之间的碳原子的饱和的直链或支链烃部分。C1-6烷基部分的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、正己基部分；C1-8烷基部分的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、正己基、庚基和辛基部分。
烷基取代基中的碳原子数可由前缀“Cx-y”指示，其中x为最小值，y为取代基中的最大碳原子数。同样，Cx链意指含有x个碳原子的烷基链。
术语“烷氧基”是指-O-烷基部分。
术语“芳基”是指具有一个或多个稠合或非稠合的芳族环的单环或多环碳环体系，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基(idenyl)等。在一些实施方案中，芳基具有6个碳原子。在一些实施方案中，芳基具有6至10个碳原子。在一些实施方案中，芳基具有6至16个碳原子。
术语“杂芳基”是指具有至少一个芳族环的单环或多环(例如，二环或三环或更多)稠合或非稠合部分或环系，其中一个或多个形成环的原子为杂原子，诸如氧、硫或氮。在一些实施方案中，杂芳基具有约1至6个碳原子，在另一些实施方案中为1至15个碳原子。在一些实施方案中，杂芳基含有5至16个环原子，其中一个环原子选自氧、硫和氮；0、1、2或3个环原子为独立地选自氧、硫和氮的另外杂原子；并且剩余的环原子为碳。杂芳基包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基、吖啶基等。
术语“卤代”是指卤素，诸如氟、氯、溴和碘。
术语“组合”是指治疗本公开中描述的治疗性病状或病症的两种或更多种治疗剂。治疗剂(therapeutic agenst)的此类组合可为单一药丸、胶囊或静脉内溶液的形式。然而，术语“组合”还涵盖两种或更多种治疗剂处于独立药丸、胶囊或静脉内溶液中的情况。同样，术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂来治疗本公开中描述的治疗性病状或病症。此类施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，诸如以含有固定比率的活性成分的单一胶囊，或以每种活性成分的单独容器(例如，胶囊)。此外，此类施用还涵盖在大约相同的时间或在不同时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将在治疗本文所述病状或病症方面提供药物组合的有益作用。
术语“HDAC”是指组蛋白脱乙酰酶，其为将乙酰基从核心组蛋白中的赖氨酸残基中去除的酶，从而导致形成凝聚和转录沉默的染色质。目前存在18种已知的组蛋白脱乙酰酶，其分为四组。包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8的I类HDAC与酵母RPD3基因有关。包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10的II类HDAC与酵母Hda1基因有关。也被称为去乙酰化酶(sirtuins)的III类HDAC与Sir2基因有关，并且包括SIRT1-7。仅含有HDAC11的IV类HDAC具有I类和II类HDAC的特征。除非另有说明，否则术语“HDAC”是指18种已知的组蛋白脱乙酰酶中的任何一种或多种。
术语“HDAC6特异性”意指与结合至任何其他类型的HDAC酶诸如HDAC1或HDAC2相比，化合物在基本上更大程度上(诸如大约5X、10X、15X、20X或更多)结合至HDAC6。也就是说，化合物对HDAC6的选择性优于对任何其他类型的HDAC酶的选择性。例如，以10nM的IC50结合至HDAC6并且以50nM的IC50结合至HDAC1的化合物是HDAC6特异性的。另一方面，以50nM的IC50结合至HDAC6并且以60nM的IC50结合至HDAC1的化合物不是HDAC6特异性的。
术语“抑制剂”与术语拮抗剂同义。
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂
本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的药物组合。本文还提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法。
本发明的组合和方法包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。HDAC抑制剂可为任何HDAC抑制剂。因此，HDAC抑制剂对特定类型的组蛋白脱乙酰酶可以是选择性或非选择性的。优选地，HDAC抑制剂为选择性HDAC抑制剂。更优选地，HDAC抑制剂为HDAC6抑制剂。
在一些实施方案中，HDAC6特异性抑制剂为式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
环B为芳基或杂芳基；
R1为芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基中的每一者可任选地被OH、卤代或C1-6烷基取代；并且
R为H或C1-6烷基。
代表性式I化合物包括但不限于：
或其药学上可接受的盐。
根据式I的选择性HDAC6抑制剂的制备和性质在国际专利申请号PCT/US2011/021982(WO/2011/091213)中有所提供，所述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
在其他实施方案中，HDAC6特异性抑制剂为式II化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
Rx和Ry与各自附接的碳一起形成环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基；
每个RA独立地为C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代、OH、-NO2、-CN或-NH2；并且
m为0、1或2。
代表性式II化合物包括但不限于：
或其药学上可接受的盐。
根据式II的选择性HDAC6抑制剂的制备和性质在国际专利申请号PCT/US2011/060791(WO/2012/068109)中有所提供，所述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的化合物是非溶剂化的。在其他实施方案中，一种或多种化合物为溶剂化形式。如本领域所知，溶剂化物可为任何药学上可接受的溶剂，诸如水、乙醇等。
苯达莫司汀
本发明的组合和方法包括苯达莫司汀或其药学上可接受的盐：
苯达莫司汀，4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸是1963年合成的氮芥。其合成在德国专利号34727和159877中有所描述，并且更最近地在国际公开号WO2010/042568中有所描述。苯达莫司汀一直用于治疗例如慢性淋巴细胞性白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤和乳腺癌。苯达莫司汀通常通过注射来施用。包含苯达莫司汀的药物组合物在例如美国专利号8,436,190、8,609,863、8,791,270和8,895,756中有所描述。苯达莫司汀的固体形式在例如美国专利号8,445,524中有所描述。8,669,279和8,883,836。这些专利文件中的每个的内容特此以引用的方式整体并入。
在本文提供的任何组合或方法的实施方案中，苯达莫司汀为盐酸苯达莫司汀。
在一些实施方案中，本文所述的化合物是非溶剂化的。在其他实施方案中，一种或多种化合物为溶剂化形式。如本领域所知，溶剂化物可为任何药学上可接受的溶剂，诸如水、乙醇等。
虽然苯达莫司汀以及式I和II的化合物以其中性形式描绘，但在一些实施方案中，这些化合物以药学上可接受的盐形式使用。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机酸或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱盐或有机盐等。本发明的药学上可接受的盐包括母体化合物的例如由无毒无机酸或有机酸形成的常规无毒盐。本发明的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可通过使游离酸或游离碱形式的这些化合物与化学计量的量的适当碱或酸在水或在有机溶剂中或者在水与有机溶剂的混合物中反应来制备；通常，像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈的非水性介质为优选的。合适盐的清单见于Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页及Journal of Pharmaceutical Science,66,2(1977)中，所述文献中的每个均以引用的方式整体并入本文。
另一个实施方案是本文描绘的任何化合物的同位素标记化合物。此类化合物具有一种或多种可能是或可能不是引入化合物中的放射性的同位素原子(例如，3H、2H、14C、13C、35S、32P、125I和131I)。此类化合物用于药品代谢研究和诊断以及治疗应用。
组合/药物组合
本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的组合。在一些实施方案中提供包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合，以治疗有需要的受试者的淋巴瘤。HDAC抑制剂和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合在本文中也将被称为“本发明的组合”。
在组合的一些实施方案中，HDAC抑制剂为HDAC6抑制剂或HDAC6特异性抑制剂。
在某些实施方案中，HDAC6特异性抑制剂为式I化合物：
或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，式I化合物为：
或其药学上可接受的盐。
在另一些实施方案中，式I化合物为：
或其药学上可接受的盐。
在其他具体实施方案中，HDAC6特异性抑制剂为式II化合物：
或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，式II化合物为：
或其药学上可接受的盐。
在其他优选的实施方案中，式II化合物为：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本文提供包含HDAC6特异性抑制剂和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合疗法，其中HDAC6特异性抑制剂为式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
环B为芳基或杂芳基；
R1为芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基中的每一者可任选地被OH、卤代或C1-6烷基取代；并且
R为H或C1-6烷基。
在组合的具体实施方案中，HDAC6特异性抑制剂为：
或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本文提供包含HDAC6特异性抑制剂和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合疗法，其中HDAC6特异性抑制剂为式II化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
Rx和Ry与各自附接的碳一起形成环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基；
每个RA独立地为C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代、OH、-NO2、-CN或-NH2；并且
m为0、1或2。
在组合的具体实施方案中，HDAC6特异性抑制剂为：
或其药学上可接受的盐。
药物组合物
在另一方面，本文提供药物组合物(诸如组合制剂)，其包含本发明的组合，即HDAC抑制剂(例如式I或II化合物或其药学上可接受的盐)和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，药物组合物还包含一种或多种赋形剂。在一个实施方案中，药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”或“药学可接受载体”包括如将为本领域技术人员所知的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合(参见，例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990,第1289至1329页)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在治疗或药物组合物中的用途。
在药物组合物的一个实施方案中，HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐与苯达莫司汀或其药学上的盐的摩尔比为约1:100至约1:1。例如，摩尔比可为约1:100、约1:95、约1:90、约1:85、约1:80、约1:75、约1:70、约1:65、约1:60、约1:55、约1:50、约1:45、约1:40、约1:35、约1:30、约1:25、约1:20、约1:15、约1:10、约1:8、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2或约1:1。在某些实施方案中，摩尔比为约1:50至约1:2。在其他实施方案中，摩尔比为约1:20至约1:2。在另一些实施方案中，摩尔比为约1:10至约1:2。在另一些实施方案中，摩尔比为约1:5。
施用/剂量
在组合疗法的一些实施方案中，HDAC抑制剂(式I或II化合物)与苯达莫司汀同时施用。同时施用通常意指两种化合物在恰好相同的时间进入患者。然而，同时施用还包括以下可能性：HDAC抑制剂和苯达莫司汀在不同时间进入患者，但是时间的差异足够微小，即第一施用的化合物未在第二施用的化合物进入之前对患者生效的时间提供。此类延迟时间通常对应于小于2分钟，并且更典型地小于1分钟或小于30秒。在化合物处于溶液中的一个实例中，同时施用可通过施用含有化合物组合的溶液来实现。在另一个实例中，可采用单独溶液的同时施用，所述单独溶液中的一种含有HDAC抑制剂，并且所述单独溶液中的另一种溶液含有苯达莫司汀。在化合物为固体形式的一个实例中，同时施用可通过施用含有化合物组合的组合物来实现。可替代地，同时施用可通过施用两种单独组合物来实现，一种包含HDAC抑制剂，并且另一种包含苯达莫司汀。
在其他实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀未同时施用。在一些实施方案中，HDAC抑制剂在苯达莫司汀之前施用。在其他实施方案中，苯达莫司汀在HDAC抑制剂之前施用。非同时施用的时间差异可大于2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、36小时或48小时。在其他实施方案中，第一施用的化合物在第二施用的化合物施用之前对患者生效的时间提供。通常，时间的差异不延伸超过第一次施用的化合物完成其在患者中的作用的时间，或超过第一次施用的化合物在患者中完全或基本上消除或失活的时间。
在一些实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀中的一种或两种以治疗有效量或剂量施用。“治疗有效量”为在独自地向患者施用时有效治疗淋巴瘤的HDAC6抑制剂(式I或II化合物)或苯达莫司汀的量。对于特定受试者而言，在给定情况下被证明是“治疗有效量”的量对于对考虑中的疾病或病状进行类似治疗的100％的受试者而言可能不是有效的，即使所述剂量被技术人员视为“治疗有效量”。对应于治疗有效量的化合物的量强烈依赖于癌症类型、癌症阶段、被治疗患者的年龄以及其他事实。通常，这些化合物的治疗有效量在本领域中周所周知，诸如在以上引用的支持性参考文献中有所提供。
在其他实施方案中，HDAC抑制剂和苯达莫司汀中的一种或两种以亚治疗有效量或剂量施用。亚治疗有效量为在独自地向患者施用时未随着时间推移而完全抑制预期靶标的生物活性的HDAC抑制剂(式I或II化合物)或苯达莫司汀的量。
无论是以治疗量还是亚治疗量施用，HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合应该有效治疗淋巴瘤。例如，如果当与式I或II化合物(HDAC抑制剂)组合时，组合有效治疗淋巴瘤，则苯达莫司汀的亚治疗量可为有效量。
在一些实施方案中，化合物的组合在淋巴瘤的治疗方面展现协同作用(即，大于相加作用)。术语“协同作用”是指两种药剂(例如像HDAC抑制剂和苯达莫司汀)的作用，产生例如减缓癌症或其症状进展，这大于独自施用的每种药剂的作用的简单相加。协同作用可例如使用合适方法来计算，所述合适方法诸如Sigmoid-Emax方程(Holford,N.H.G.和Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6:429-453(1981))、Loewe相加性的方程(Loewe,S.和Muischnek,H.,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114:313-326(1926))以及中值作用方程(Chou,T.C.和Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.22:27-55(1984))。可将以上提及的各方程应用到实验数据，以得到有助于评估药物组合作用的相应图表。与以上提及的方程相关的相应图表分别是浓度-作用曲线、等效线图曲线和组合指数曲线。
在确定一种或多种组分之间的协同相互作用时，可通过在不同的w/w比范围和剂量下向需要治疗的患者施用组分来决定性地测量最适范围的作用以及每种组分的绝对剂量范围的作用。对于人来说，对患者进行临床研究的复杂性和成本可能使使用这种形式的测试作为协同作用的主要模型变得不切实际。然而，在某些实验中(参见，例如实例5)中的协同作用的观察可预测其他物质的作用，并且存在的动物模型可用于进一步定量协同作用。此类研究的结果还可用于预测有效剂量比范围和绝对剂量以及血浆浓度。
在本文提供的组合的一个实施方案中，向患者施用的HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐与苯达莫司汀或其药学上的盐的摩尔比为约1:100至约1:1。例如，摩尔比可为约1:100、约1:95、约1:90、约1:85、约1:80、约1:75、约1:70、约1:65、约1:60、约1:55、约1:50、约1:45、约1:40、约1:35、约1:30、约1:25、约1:20、约1:15、约1:10、约1:8、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2或约1:1。在某些实施方案中，摩尔比为约1:50至约1:2。在其他实施方案中，摩尔比为约1:20至约1:2。在另一些实施方案中，摩尔比为约1:10至约1:2。在另一些实施方案中，摩尔比为约1:5。
在不同的实施方案中，根据所用的组合和有效量，化合物的组合可抑制癌症生长，实现癌症停滞，或者甚至实现显著或完全的癌症消退。虽然HDAC抑制剂和苯达莫司汀的量应致使有效治疗淋巴瘤，但是当合并时，所述量对患者优选不是过度毒性的(即，所述量优选处于如医学指南所确立的毒性极限之内)。在一些实施方案中，为了防止过度毒性或提供对淋巴瘤的更有效治疗，提供了对总施用剂量的限制。通常，本文考虑的量为每天；然而，本文还考虑半天和两天或三天的周期。本发明组合的组合伴侣(HDAC抑制剂，诸如化合物A和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐)的产生功效而无毒性的最佳比率、单独剂量和组合剂量以及浓度是基于靶位点的治疗剂可用性的动力学，并且使用本领域技术人员已知的方法来测定。
不同的剂量方案可用于治疗淋巴瘤。在一些实施方案中，每日剂量(诸如上述任何示例性剂量)每天施用一次、两次、三次或四次，持续三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天或十天。根据癌症的阶段和严重性，可连同高剂量采用更短的治疗时间(例如，高达五天)，或者可连同低剂量采用更长的治疗时间(例如，十天或更多天，或数周，或一个月或更长时间)。在一些实施方案中，每隔一天施用每日一次或每日两次剂量。在一些实施方案中，每个剂量均含有待作为单一剂量递送的HDAC抑制剂和苯达莫司汀，而在其他实施方案中，每个剂量均含有待作为单独剂量递送的HDAC抑制剂和苯达莫司汀。
呈纯形式或呈适当药物组合物的苯达莫司汀和式I和II化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物形式可通过本领域已知的任何可接受的施用方式或药剂来施用。化合物可例如经口服、经鼻、经肠胃外(静脉内、肌内或皮下)、经局部、经皮、经阴道内、经膀胱内、经脑池内或经直肠施用。剂型可为例如固体、半固体、冻干粉末或液体剂型，诸如片剂、丸剂、软弹性或硬明胶胶囊、散剂、溶液、悬浮液、栓剂、气雾剂等，优选地呈适于简单施用精确剂量的单位剂型。特定的施用途径为口服途径，特别是可根据待治疗的疾病的严重性程度调节的便利日剂量方案的施用途径。
如上所述，药物组合的HDAC抑制剂和苯达莫司汀可以单一单位剂量或分开的剂型施用。因此，短语“药物组合”包括呈单一剂型或分开的剂型的两种药物的组合，即整个应用中描述的药学上可接受的载体和赋形剂可与单一的剂量的HDAC抑制剂和苯达莫司汀组合，以及在单独施用这些化合物时与HDAC抑制剂和苯达莫司汀单独组合。
辅助剂和助剂可包括例如防腐剂、湿润剂、混悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、乳化剂和分散剂。对微生物作用的防止通常通过各种抗菌剂和抗真菌剂(诸如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚和山梨酸等)来提供。还可包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，使可注射药物形式的吸收延长。辅助剂还可包括湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂和抗氧化剂，例如像柠檬酸、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、丁羟甲苯等。
固体剂型可制备有包衣和外壳，诸如肠溶衣和本领域中众所周知的其他包衣和外壳。它们可含有抚慰剂并且可具有在肠道某个部分以延迟的方式释放一种或多种活性化合物的那些组合物。可使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。适当时，活性化合物还可为具有一种或多种上述赋形剂的微囊化形式。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。此类剂型是例如通过将HDAC抑制剂或苯达莫司汀或其药学上可接受的盐和任选的药物佐剂溶解、分散(等等)于以下中由此形成溶液或混悬液来制备：载体，例如像水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯；或这些物质的混合物等。
一般来说，根据预期的施用模式，药学上可接受的组合物将含有约1重量％至约99重量％的本文所述化合物或其药学上可接受的盐，和99重量％至1重量％的药学上可接受的赋形剂。在一个实例中，组成为约5％重量与约75％重量之间的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐，其余为合适药用赋形剂。
对本领域技术人员来说，制备此类剂型的实际方法是已知的或者将是显而易见的。例如对Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,(Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990)进行参考。
治疗方法
本发明涉及用于治疗有需要的受试者的治疗淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的药物组合。因此，本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
本文考虑的受试者通常为人。然而，受试者可为需要治疗的任何哺乳动物。因此，本文描述的方法可应用于人和兽医应用。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指示所述方法至少已减轻异常细胞增殖。例如，所述方法可降低患者的淋巴瘤生长速率，或可防止淋巴瘤的继续生长或扩散，或甚至降低淋巴瘤的总范围。在本公开的含义内，术语“治疗”还表示停止、延缓发作(即疾病的临床表现之前的时期)和/或降低疾病发展或恶化的风险。如本文所用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”包括预防与所预防的状态、疾病或病症相关或由其引起的至少一种症状。
在一个实施方案中，本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐，以及治疗有效量的苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的化合物A或其药学上可接受的盐，以及治疗有效量的苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，为用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的化合物B或其药学上可接受的盐，以及治疗有效量的苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的式II化合物或其药学上可接受的盐，以及治疗有效量的苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的化合物C或其药学上可接受的盐，以及治疗有效量的苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的化合物D或其药学上可接受的盐，以及治疗有效量的苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合在有需要的受试者的治疗中实现协同作用。
在另一个实施方案中，治疗有效量的组合疗法(即，HDAC抑制剂和苯达莫司汀)以组合指数(CI)小于1的协同比包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
因此，在一个实施方案中，本文提供用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的化合物A或其药学上可接受的盐，以及治疗有效量的苯达莫司汀或其药学上可接受的盐，其中化合物A或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐以组合指数小于1的协同比施用。
本发明的另一个实施方案包括用于诱导癌细胞凋亡的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。在一些实施方案中，凋亡的诱导与活性氧物质的增加相关。在一些实施方案中，凋亡与半胱天冬酶3、半胱天冬酶9、半胱天冬酶8和/或PARP的活化相关。
本发明的又一个实施方案包括用于降低癌细胞的活力的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。
本发明的再一个实施方案包括用于降低癌细胞的克隆形成性存活的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于抑制癌细胞的细胞增殖的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于降低癌细胞中Bcl-2的表达的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于在癌细胞中增加细胞周期蛋白p21和p27的表达并且减少细胞周期蛋白细胞周期蛋白D的表达的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于诱导癌细胞中PI3K/Akt信号传导途径的脱磷酸化的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于增强癌细胞中微管稳定性的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。
本发明的另一个实施方案包括用于下调癌细胞中IL-10表达的方法，所述方法包括向细胞施用包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。
在另一方面，本文提供用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐和苯达莫司汀或其药学上可接受的盐的组合。在一个实施方案中，肿瘤类型响应于用苯达莫司汀作为单一药剂进行的治疗。这些肿瘤的非限制性实例包括转移性乳腺癌、小细胞肺癌、难治性软组织肉瘤和复发性或难治性生殖细胞癌。
试剂盒
在其他实施方案中，提供试剂盒。根据本发明的试剂盒包括包含本发明化合物或组合物的包装。在一些实施方案中，试剂盒包含HDAC抑制剂或其药学上可接受的盐，以及苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
短语“包装”意指含有本文呈现的化合物或组合物的任何容器。在一些实施例中，包装可为盒子或包装物。用于包装药物产品的包装材料是本领域技术人员众所周知的。药物包装材料的实例包括但不限于瓶子、管、吸入器、泵、袋子、小瓶、容器、注射器、瓶以及适于所选制剂和预期施用和治疗方式的任何包装材料。
试剂盒还可含有未包含在包装内但附接至包装外部的物品，例如移液管。
试剂盒还可含有用于向患者施用本发明的化合物或组合物的说明书。试剂盒还可包括由管理机构(诸如美国食品和药品管理局)批准的本文化合物用途的说明书。试剂盒还可含有化合物的标签或产品插页。包装和/或任何产品插页本身可能被管理机构批准。试剂盒可在包装中包含呈固相或呈液相(例如所提供的缓冲液)的化合物。试剂盒还可包含用于制备用于进行方法的溶液的缓冲液，以及用于将液体从一个容器转移到另一个容器的移液管。
实施例
以下已出于说明的目的阐述实施例，并且描述本发明的某些具体实施方案。然而，权利要求书的范围不以任何方式受本文所阐述的实施例限制。所公开的实施方案的各种变化和修改将对本领域技术人员显而易见，并且包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、制剂或方法有关的那些变化和修改的此类变化和修改可在不背离本发明的精神和所附权利要求范围的情况下进行。本文方案中的结构变量的定义与本文呈现的式中相应位置的那些定义相当。
式I化合物的合成在PCT/US2011/021982中有所提供，所述专利以引用的方式整体并入本文。式II化合物的合成在PCT/US2011/060791中有所提供，所述专利以引用的方式整体并入本文。
实施例1：2-(二苯基氨基)-N-(7-(羟氨基)-7-氧代庚基)嘧啶-5-甲酰胺(化合物A)
中间体2的合成：将苯胺(3.7g，40mmol)、2-氯嘧啶-5-羧酸乙酯1(7.5g，40mmol)、K2CO3(11g，80mmol)在DMF(100ml)中的混合物脱气，并在120℃下在N2下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，并用EtOAc(200ml)稀释，然后用饱和盐水(200ml x 3)洗涤。将有机层分离，并用Na2SO4干燥，蒸干并通过硅胶色谱(石油醚/EtOAc＝10/1)纯化，以得到呈白色固体状的所需产物(6.2g，64％)。
中间体3的合成：将化合物2(6.2g，25mmol)、碘苯(6.12g，30mmol)、CuI(955mg，5.0mmol)、Cs2CO3(16.3g，50mmol)在TEOS(200ml)中的混合物脱气，并用氮气吹扫。将所得混合物在140℃下搅拌14h。冷却至室温后，将残余物用EtOAc(200ml)和95％EtOH(200ml)稀释，加入于硅胶上的NH4F-H2O[50g，通过将水(1500ml)中的NH4F(100g)加入硅胶(500g，100-200目)中来预先制备]，并将所得混合物在室温下保持2h，将固化的材料过滤并用EtOAc洗涤。将滤液蒸干，并将残余物通过硅胶色谱(石油醚/EtOAc＝10/1)纯化，以得到黄色固体(3g，38％)。
中间体4的合成：将2N NaOH(200ml)加入化合物3(3.0g，9.4mmol)在EtOH(200ml)中的溶液中。将混合物在60℃下搅拌30分钟。在溶剂蒸发后，将溶液用2N HCl中和，以得到白色沉淀物。将悬浮液用EtOAc(2x 200ml)萃取，并将有机层分离，用水(2x 100ml)、盐水(2x 100ml)洗涤，并用Na2SO4干燥。去除溶剂，得到棕色固体(2.5g，92％)。
中间体6的合成：将化合物4(2.5g，8.58mmol)、氨基庚酸酯5(2.52g，12.87mmol)、HATU(3.91g，10.30mmol)、DIPEA(4.43g，34.32mmol)的混合物在室温下搅拌过夜。在将反应混合物过滤后，将滤液蒸干，并将残余物通过硅胶色谱(石油醚/EtOAc＝2/1)纯化，以得到棕色固体(2g，54％)。
2-(二苯基氨基)-N-(7-(羟氨基)-7-氧代庚基)嘧啶-5-甲酰胺(ricolinostat或 化合物A)的合成：将化合物6(2.0g，4.6mmol)、氢氧化钠(2N，20mL)在MeOH(50ml)和DCM(25ml)中的混合物在0℃下搅拌10分钟。将羟胺(50％)(10ml)冷却至0℃并加入混合物中。将所得混合物在室温下搅拌20分钟。在去除溶剂后，将混合物用1MHCl中和，以得到白色沉淀物。将粗产物过滤并通过制备型HPLC纯化，以得到白色固体(950mg，48％)。
实施例2：2-((2-氯苯基)(苯基)氨基)-N-(7-(羟氨基)-7-氧代庚基)嘧啶-5-甲酰胺(化合物B)的合成
中间体2的合成：参见实施例1中的中间体2的合成。
中间体3的合成：将化合物2(69.2g，1当量)、1-氯-2-碘苯(135.7g，2当量)、Li2CO3(42.04g，2当量)、K2CO3(39.32g，1当量)、Cu(1当量45μm)在DMSO(690ml)中的混合物脱气，并用氮气吹扫。将所得混合物在140℃下搅拌。将反应物进行后处理，得到93％产率的化合物3。
中间体4的合成：参见实施例1中的中间体4的合成。
中间体6的合成：参见实施例1中的中间体6的合成。
2-((2-氯苯基)(苯基)氨基)-N-(7-(羟氨基)-7-氧代庚基)嘧啶-5-甲酰胺(化合 物B)的合成：参见实施例1中的化合物A的合成。
实施例3：2-((1-(3-氟苯基)环己基)氨基)-N-羟基嘧啶-5-甲酰胺(化合物C)的合成
1-(3-氟苯基)环己烷甲腈的合成：向2-(3-氟苯基)乙腈(100g，0.74mol)在干燥DMF(1000ml)中的溶液中加入1,5-二溴戊烷(170g，0.74mol)，在冰浴下滴加NaH(65g，2.2当量)。加入后，将所得混合物在50℃剧烈搅拌过夜。将悬浮液通过冰水小心地猝灭，用乙酸乙酯(3*500ml)萃取。将合并的有机溶液浓缩，以得到粗产物，将其在快速柱上纯化，以得到呈浅色固体状的1-(3-氟苯基)环己烷甲腈(100g，67％)。
1-(3-氟苯基)环己烷甲酰胺的合成：将1-(3-氟苯基)环己烷甲腈(100g，0.49mol)在PPA(500ml)中的溶液在110℃下加热约5-6小时。完成后，将所得混合物用饱和NaHCO3溶液小心地碱化直到PH＝8-9。将沉淀物收集并用水(1000ml)洗涤，以得到呈白色固体状的1-(3-氟苯基)环己烷甲酰胺(95g，87％)。
1-(3-氟苯基)环己胺的合成：向1-(3-氟苯基)环己烷甲酰胺(95g，0.43mol)在n-BuOH(800ml)中的溶液中加入NaClO(260ml，1.4当量)，然后在0℃下加入3N NaOH(400ml，2.8当量)，并将反应物在室温下搅拌过夜。将所得混合物用EA(2*500ml)萃取，将合并的有机溶液用盐水洗涤，干燥，以得到粗产物，将其用HCl盐处理进一步纯化为白色粉末(72g，73％)。
2-(1-(3-氟苯基)环己基氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯的合成：向1-(3-氟苯基)环己胺盐酸盐(2.29g 10mmol)在二氧杂环己烷(50ml)中的溶液中加入2-氯嘧啶-5-羧酸乙酯(1.87g，1.0当量)和DIPEA(2.58g，2.0当量)。将混合物在110-120℃下加热过夜。将所得混合物在硅胶柱上直接纯化，以得到呈白色固体状的偶联产物(1.37g，40％)
2-((1-(3-氟苯基)环己基)氨基)-N-羟基嘧啶-5-甲酰胺(化合物C)的合成：向2-(1-(3-氟苯基)环己基氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(100mg，0.29mmol)在MeOH/DCM(10ml，1:1)中的溶液中加入在水中的50％NH2OH(2ml，过量)，然后在0℃下加入在MeOH中的饱和NaOH(2ml，过量)，并将反应物搅拌3-4小时。完成后，将所得混合物浓缩并用2N HCl酸化至PH＝4-5。将沉淀物收集并通过水(10ml)洗涤以去除NH2OH，并干燥，以得到呈白色粉末状的2-((1-(3-氟苯基)环己基)氨基)-N-羟基嘧啶-5-甲酰胺(70mg，73％)。
实施例4：N-羟基-2-((1-苯基环丙基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺(化合物D)的合成
中间体2的合成：将化合物1、苄腈(250g，1.0当量)和Ti(OiPr)4(1330ml，1.5当量)在MBTE(3750ml)中的溶液在氮气气氛下冷却至约-10℃至-5℃。用60分钟滴加EtMgBr(1610ml，3.0M，2.3当量)，在此期间将反应的内部温度保持在5℃以下。将反应混合物温热至15-20℃，持续1h。用60分钟滴加BF3-醚(1300ml，2.0当量)，同时将内部温度维持在15℃以下。将反应混合物在15-20℃下搅拌1-2小时，并且在剩余低水平的苄腈残时停止。滴加1NHCl(2500ml)，同时将内部温度维持在30℃以下。滴加NaOH(20％，3000ml)，以使pH达到约9.0，同时仍将温度维持在30℃以下。将反应混合物用MTBE(3L x 2)和EtOAc(3L x 2)萃取，并将合并的有机层用无水Na2SO4干燥并在减压下(低于45℃)浓缩，以产生红色油状物。将MTBE(2500ml)加入油中，以得到澄清溶液，并在用干燥HCl气体鼓泡时沉淀出固体。将此固体过滤并在真空中干燥，产生143g化合物2。
中间体4的合成：将化合物2(620g，1.0当量)和DIPEA(1080g，2.2当量溶于NMP(3100ml)中并搅拌20分钟。加入化合物3(680g，1.02当量)，并将反应混合物加热至约85-95℃，持续4h。将溶液缓慢冷却至室温。将此溶液倒入H2O(20L)中，并在强烈搅拌下使大部分固体从溶液中沉淀出来。将混合物过滤，并将滤饼在50℃下减压干燥24小时，产生896g化合物4(固体，86.8％)。
N-羟基-2-((1-苯基环丙基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺(化合物D)的合成：将MeOH溶液(1000ml)在搅拌下冷却至约0-5℃。加入NH2OH HCl(1107g，10当量)，随后小心加入NaOCH3(1000g，12.0当量)将所得混合物在0-5℃下搅拌1小时，并过滤以去除固体。将化合物4(450g，1.0当量)一次加入反应混合物中，并在10℃下搅拌2小时，直到化合物4耗尽。通过加入HCl(6N)将反应混合物调节至约8.5-9的pH，导致沉淀。将混合物在减压下浓缩。在激烈搅拌下向残留物中加入水(3000ml)，并将沉淀物通过过滤收集。将产物在45℃的烘箱中干燥过夜(340g，79％产率)。
实施例5：与苯达莫司汀组合的HDAC6抑制剂Ricolinostat(化合物A)在淋巴瘤细胞系中的临床前筛选
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂正在成为用于淋巴恶性肿瘤的令人兴奋的新治疗选项。Ricolinostat(化合物A)是新型选择性组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)抑制剂。HDAC6是在细胞对环境应激的应答方面起重要作用的IIB类组蛋白脱乙酰酶。
此研究的目的是评估单独的HDAC6抑制剂ricolinostat的临床前活性，以及在淋巴瘤细胞系中将ricolinostat与苯达莫司汀(烷化剂)组合的潜力。
以下方法用于此研究中。使用六个淋巴瘤细胞系的组研究ricolinostat的抗肿瘤活性：两个滤泡性淋巴瘤(FL)(WSU-NHL，RL)细胞系、两个套细胞淋巴瘤(MCL)(Granta-519，Jeko-1)细胞系和两个T细胞淋巴瘤(TCL)(HUT-78-皮肤T细胞淋巴瘤和Karpas-299-间变性淋巴瘤细胞)细胞系。在24、48和72小时后，由基于ricolinostat浓度(0.01-100μM)和苯达莫司汀(25-300μM)浓度的曲线计算每种药品的IC50值。通过使用CellTiterAqueousOne Solution Cell Proliferation Assay试剂盒测定细胞增殖，并用MTT测定来测定细胞毒性。通过基于Chou-Talalay方法的等效线图分析来评估药物之间的相互作用，以确定组合是否为相加的或协同的。用甲基纤维素克隆形成性测定研究克隆形成性存活。通过流式细胞术测量凋亡、活性氧物质(ROS)、细胞周期分析和Bcl-2蛋白表达。通过蛋白质印迹分析半胱天冬酶活化和PI3K/AKT途径。
I.Ricolinostat抑制淋巴瘤细胞活力：
使用六个淋巴瘤细胞系的组研究ricolinostat的抗肿瘤活性：两个滤泡性淋巴瘤(FL)(WSU-NHL，RL)细胞系、两个套细胞淋巴瘤(MCL)(Granta-519，Jeko-1)细胞系和两个T细胞淋巴瘤(TCL)(HUT-78-皮肤T细胞淋巴瘤和Karpas-299-间变性淋巴瘤细胞)细胞系。HDAC6蛋白在所检测的所有细胞系中表达(图1A)。以各种浓度(0.01、0.1、1、5和10μM)向每个细胞系施用Ricolinostat，并在24、48和72小时时测量细胞活力。图1B示出两个滤泡性淋巴瘤细胞系、两个套细胞淋巴瘤细胞系和两个T细胞淋巴瘤细胞系的结果。如表1所示，在24和48小时时，在每个细胞系中测量ricolinostat的IC50和CI95％。
表1.淋巴瘤细胞系中ricolinostat的IC50值。将淋巴瘤细胞系用浓度范围为0.01至100μM的ricolinostat处理24小时和48小时。使用MTT测定来计算IC50值。CI95％：置信区间。值表示三个独立实验。
Ricolinostat以时间-剂量依赖性方式抑制细胞活力，IC50值的范围为1.51μM至64μM。在48h处理后，在组中存在的六个淋巴瘤细胞系中的五个中观察到显著的细胞毒性作用。最敏感的细胞系为WSU-NHL和Hut-78(IC50：1.97-1.51μM)，并且较不敏感的为套细胞淋巴瘤细胞系Granta-519(IC50：20-64μM)(图1B和表1)。
II.苯达莫司汀的生长抑制：
使用三个淋巴瘤细胞系的组研究苯达莫司汀的抗肿瘤活性：滤泡性淋巴瘤(FL)(WSU-NHL)细胞系、套细胞淋巴瘤(MCL)(Jeko-1)细胞系和T细胞淋巴瘤(TCL)(HUT-78-皮肤T细胞淋巴瘤)细胞系。以各种浓度(25、50、100、200和300μM)向每个细胞系施用苯达莫司汀，并在24和48小时时测量细胞活力。图1C示出在施用各种浓度的苯达莫司汀(25、50、100、200和300μM)后24小时时WSU-NHL、HUT-78和JEKO-1细胞中的每种的细胞活力。如表2所示，在24小时时在每个细胞系中测量苯达莫司汀的IC50。
表2
细胞系 24小时时的IC50
WSU-NHL 168
HUT-78 144
JEKO-1 127
图1C和表2中的结果显示单独的苯达莫司汀(25-300μM)在淋巴瘤细胞系中诱导对细胞活力的时间和剂量依赖性抑制。
III.Ricolinostat/苯达莫司汀以协同方式抑制细胞活力。
通过基于Chou-Talalay方法的等效线图分析来评估药品(ricolinostat和苯达莫司汀)之间的相互作用，以确定组合是否为相加的或协同的。以增加浓度的与苯达莫司汀(0、10、20、25、40、50、100μM)组合的ricolinostat(0、2、2.5、4、5、8、10μM)处理组(WSU-NHL、Hut-78和Jeko-1)中最敏感的三个淋巴瘤细胞系。药物组合在测试的所有细胞系中诱导显著更强的细胞毒性作用。测定药品对每个细胞系的作用，并测量组合指数(CI)。CI<1意指协同作用；CI＝1意指相加作用；CI>1意指拮抗作用。Ricolinostat(2、4、8μM)和苯达莫司汀(10、20、40μM)在WSU-NHL和Hut-78细胞中分别显示出协同相互作用，所述协同相互作用的组合指数(CI)的范围在0.027与0.553之间。Ricolinostat(5、10μM)与苯达莫司汀(50、100μM)在Jeko-1细胞中显示出0.02和0.04的CI(图2A和2B、表3)。在正常PBMNC中未观察到对细胞活力的干扰(图2C)。在24h时，在WSU-NHL和Hut-78细胞中在4μM ricolinostat和20μM苯达莫司汀的剂量下以及在Jeko-1中在5μM ricolinostat和50μM苯达莫司汀的剂量下观察到协同作用(CI<1)。
重要的是，药物组合未引发正常外周血单核细胞活力的相关降低(图2C)。
表3.Ricolinostat与苯达莫司汀的组合的等效线图分析。
IV.单独和组合的Ricolinostat降低克隆形成性存活并克服BM-MSC的保护作用。
Ricolinostat作为单一药剂以剂量依赖性方式(图2D)降低克隆形成性存活。与单一药剂相比，ricolinostat/苯达莫司汀诱导对集落形成的显著抑制(图2E)。药物组合降低与BM-MSC共培养的淋巴瘤细胞的细胞活力，指示其克服由骨髓微环境赋予的抗凋亡作用，并且组合对BMSC具有最小或无细胞毒性作用(图3A)。
V.Ricolinostat/苯达莫司汀通过调控蛋白p21和p27影响细胞周期。
在所有测试的细胞系中，与未处理对照相比，Ricolinostat诱导G0/G1期细胞的百分比增加，并且诱导细胞周期G2/M期减少，并且药物组合降低G0/G1期和S期细胞的比例，并引起“亚G0/G1”峰的增加(图3B和3C)。用药物组合进行24h的治疗引起淋巴瘤细胞中细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的减少，并且p21蛋白和p27的水平升高(图4)，证实了对细胞周期的观察。
VI.药物组合通过ROS产生来诱导凋亡和活化的ER应激。
如通过流式细胞术所测量的，Ricolinostat(1-10μM)诱导以时间和剂量依赖性方式检测的所有细胞系的凋亡(图5A和5B)。在图5A中，将WSU-NHL细胞用指定浓度的ricolinostat、苯达莫司汀或ricolinostat和苯达莫司汀处理。24小时后，将细胞固定并用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术来分析。图5B示出在施用指定浓度的ricolinostat(R)、苯达莫司汀(B)或ricolinostat(R)和苯达莫司汀(B)后，WSU-NHL、HUT-78和Jeko-1细胞系中的每个在24小时后的凋亡百分比。图5A-E中的结果显示，与苯达莫司汀组合的ricolinostat在24小时时诱导凋亡。通过与苯达莫司汀的组合增强这种作用(图5C和5D)。
单独的Ricolinostat(1、5、10μM)在24h时诱导ROS产生增加，所述ROS产生在48h后进一步增加(图5E)。当与单一药物相比时，Ricolinostat/苯达莫司汀诱导ROS阳性细胞显著增加，并且抗氧化剂NAC(ROS清除剂)的共同施用减少ROS的产生(图6A和6B)。由药物组合诱导的ROS产生与硫氧还蛋白-1(Trx1)表达的降低相关(图6C)。分析了ER应激(诸如BIP和CHOP)的一些标志的蛋白表达水平的可能修饰以及UPR传感蛋白(包括IRE1、ATF6和PERK)的表达。如图6D所示，ER应激和UPR传感蛋白在ricolinostat/苯达莫司汀组合治疗中增加。
VII.Bcl-2家族蛋白和半胱天冬酶途径受ricolinostat/苯达莫司汀组合影响。
药物组合降低Bcl-2表达(图7A)和抗凋亡蛋白Bcl-xL和Mcl-1的表达(图7B)。其还增加Bcl-2家族的促凋亡成员Bax、Bim、Noxa、Bad112和Bad136的水平(图7B)。药物组合在所分析的所有三个细胞系中诱导PARP切割和半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3的活化(图7C)。通过加入ZVAD-fmk来完全消除PARP切割，证实ricolinostat/苯达莫司汀通过活化半胱天冬酶途径来诱导凋亡(图7C)。
VIII.Ricolinostat/苯达莫司汀的共同暴露导致AKT途径失活。
用ricolinostat和苯达莫司汀进行的淋巴瘤细胞的组合治疗诱导p-AKT和多个下游靶标的下调(图8A)。
IX.单独以及组合的ricolinostat对α-微管蛋白的HDAC6乙酰化的作用。
Ricolinostat的暴露降低HDAC6表达，并且诱导淋巴瘤细胞中α-微管蛋白的乙酰化水平，所述乙酰化水平的程度未被苯达莫司汀进一步修饰(图8B)。
X.单独以及组合的Ricolinostat使微管稳定。
乙酰化α-微管蛋白的积累与增加的对微管去稳定的抗性相关，这可能破坏有丝分裂期间染色体的排列，并导致凋亡。将淋巴瘤细胞用单独的ricolinostat以及与苯达莫司汀组合的ricolinostat连同微管去稳定剂诺考达唑(1μM)和微管稳定剂紫杉醇(100nM)来处理24小时。此后使用α-微管蛋白染色对微管蛋白聚合进行基于全细胞的定量测量。如由荧光强度的增加所证实，单独的ricolinostat诱导微管蛋白聚合。通过加入苯达莫司汀进一步增强所述作用(图9A)。
XI.单独以及组合的Ricolinostat下调IL-10表达。
IL-10是在免疫力和耐受性方面起关键作用的多功能细胞因子。与单独的任一化合物相比，Ricoolinostat/苯达莫司汀降低这种细胞因子的水平(图9B)，表明组合治疗导致免疫抑制性微环境较少。
XII.概述
关键结果的概述如下。淋巴瘤细胞系持续24-72小时暴露于化合物A导致对细胞生长的时间和剂量依赖性抑制，IC50值范围为0.17至8.65μmol/L。在48小时的ricolinostat孵育后通过MTT测定来证明显著细胞毒性作用，最敏感的细胞系为WSU-NHL和Hut-78(IC50：1.97–1.5μmol/L)，并且最不敏感的为Granta-519(IC50：20μmol/L)。单独的ricolinostat诱导凋亡的时间和剂量依赖性增加。在用范围为1至20μmol/L的剂量处理48小时后，早期和晚期凋亡的凋亡细胞百分比从11％增加到56％，并且与未处理的对照相比，诱导处于细胞周期的G0/G1期的细胞百分比增加。使用用不同浓度的与苯达莫司汀(0、10、20、40、50和100μmol/L)组合的ricolinostat(0、2、4和8μmol/L)处理的WSU-NHL、HUT-78和GRANTA-519细胞进行协同分析，并且在24和48小时时通过MTT测定淋巴瘤细胞。在使用低浓度的两种药品24小时后观察到由Chou-Talalay方法所证实的明显协同相互作用，所述低浓度低于IC50值。Ricolinostat(4和8μmol/L)和苯达莫司汀(20和40μmol/L)在Hut-78和WSU-NHL细胞中显示出协同相互作用，所述协同相互作用的CI(组合指数)值的范围在0.13与0.34之间。用ricolinostat(20和40μmol/L)与苯达莫司汀(50和100μmol/L)对GRANTA-519细胞进行处理显示CI值分别为0.26和0.21。如通过膜联蛋白V/PI染色所评估的，药物组合增强凋亡。24小时后凋亡百分比的范围为55％至80％。此外，ricolinostat与苯达莫司汀降低G0/G1期和S期细胞的比例，并引起“亚G0/G1”峰的增加。最后，ricolinostat与苯达莫司汀的组合未引发正常外周血单核细胞(PBMNC)活力的相关降低。
总之，这些临床前研究结果指示，ricolinostat与苯达莫司汀组合可在淋巴瘤细胞系中具有显著活性。
以引用的方式并入
在整个本申请中所引用的所有文献(包括参考文献、发布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)的内容特此明确地整体并入本文。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均符合本领域普通技术人员通常已知的含义。
等效方案
本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文描述的本发明具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在涵盖于以下权利要求中。

Claims (28)

1.一种用于治疗淋巴瘤的药物组合，其包含治疗有效量的组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)特异性抑制剂或其药学上可接受的盐，以及苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的组合，其中所述HDAC6特异性抑制剂为式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
环B为芳基或杂芳基；
R1为芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基中的每一者可任选地被OH、卤代或C1-6烷基取代；并且
R为H或C1-6烷基。
3.如权利要求2所述的组合，其中所述式I化合物为：
或其药学上可接受的盐。
4.如权利要求2所述的组合，其中所述式I化合物为：
或其药学上可接受的盐。
5.如权利要求1所述的组合，其中所述HDAC6特异性抑制剂为式II化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
Rx和Ry与各自附接的碳一起形成环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基；
每个RA独立地为C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代、OH、-NO2、-CN或-NH2；并且
m为0、1或2。
6.如权利要求5所述的组合，其中所述式II化合物为：
或其药学上可接受的盐。
7.如权利要求5所述的组合，其中所述式II化合物为：
或其药学上可接受的盐。
8.一种用于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合，所述药物组合包含组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)特异性抑制剂或其药学上可接受的盐，以及苯达莫司汀或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述淋巴瘤选自由以下组成的组：T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、间变性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC6特异性抑制剂为式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
环B为芳基或杂芳基；
R1为芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基中的每一者可任选地被OH、卤代或C1-6烷基取代；并且
R为H或C1-6烷基。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述式I化合物为：
或其药学上可接受的盐。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述式I化合物为：
或其药学上可接受的盐。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC6特异性抑制剂为式II化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中，
Rx和Ry与各自附接的碳一起形成环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基；
每个RA独立地为C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代、OH、-NO2、-CN或-NH2；并且
m为0、1或2。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述式II化合物为：
或其药学上可接受的盐。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述式II化合物为：
或其药学上可接受的盐。
16.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂和苯达莫司汀以分开的剂型施用。
17.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂和苯达莫司汀以单一剂型施用。
18.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂和苯达莫司汀在不同时间施用。
19.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂和苯达莫司汀在基本上相同的时间施用。
20.一种用于诱导癌细胞凋亡的方法，其包括向所述细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中凋亡的诱导与活性氧物质的增加相关。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述凋亡与半胱天冬酶3、半胱天冬酶9、半胱天冬酶8和/或PARP的活化相关。
23.一种用于降低癌细胞的活力的方法，其包括向所述细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
24.一种用于降低癌细胞的克隆形成性存活的方法，其包括向所述细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
25.一种用于抑制癌细胞的细胞增殖的方法，其包括向所述细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
26.一种用于降低癌细胞中Bcl-2的表达的方法，其包括向所述细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
27.一种用于在癌细胞中增加细胞周期蛋白p21和p27的表达并且减少细胞周期蛋白细胞周期蛋白D的表达的方法，其包括向所述细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
28.一种用于诱导癌细胞中PI3K/Akt信号传导途径的脱磷酸化的方法，其包括向所述细胞施用包含HDAC抑制剂和苯达莫司汀的组合。
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