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CN107243012B - 一种exosomes装载的miR-93-5p在治疗类风湿性关节炎中的应用 - Google Patents

一种exosomes装载的miR-93-5p在治疗类风湿性关节炎中的应用 Download PDF

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CN107243012B CN201710379029.9A CN201710379029A CN107243012B CN 107243012 B CN107243012 B CN 107243012B CN 201710379029 A CN201710379029 A CN 201710379029A CN 107243012 B CN107243012 B CN 107243012B
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Abstract

本发明提供了一种exosomes装载的miR‑93‑5p在治疗类风湿性关节炎中的应用，属于生物医学技术领域；本发明首先制备过表达或阻断miR‑93‑5p的G‑exosomes，并通过体外实验证明，过表达miR‑93‑5p的G‑exosomes更加明显的抑制了Th17细胞的分化；并通过研究过表达和阻断miR‑93‑5p的G‑exosomes对于CIA模型小鼠发病的作用，发现过表达miR‑93‑5p的G‑exosomes对CIA小鼠的保护作用更强了；而阻断miR‑93‑5p的G‑exosomes则没有上述作用；结果表明过表达miR‑93‑5p的G‑exosomes可用于类风湿性关节炎的治疗。

Description

一种exosomes装载的miR-93-5p在治疗类风湿性关节炎中的 应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种exosomes装载的miR-93-5p在治疗类风湿性关节炎中的应用，具体涉及粒细胞样髓源性抑制细胞来源exosomes装载的miR-93-5p在治疗类风湿性关节炎中的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因不明的慢性进行性并累及全身多系统的自身免疫性疾病，病理特征表现多为手、足小关节对称性的滑膜慢性炎症，其造成的身体危害，严重影响人类生产和生活。RA的确切发病机制不明，免疫学与流行病上的研究认为与遗传、激素、环境、病毒感染等因素有关。目前对其治疗的主要目的在于减轻关节的炎症，抑制疾病的发展，尽可能保护关节和降低疾病的活动度。临床上对于RA的治疗主要包括药物治疗和免疫学治疗。药物治疗主要包括非甾体类药物、抗风湿类药物、糖皮质激素等，但药物带来的毒副作用较多，影响肝肾代谢功能，容易产生药物依赖，此外激素类药物可导致患者胃肠不良反应、向心性肥胖、免疫力低下、骨质疏松等。免疫学治疗主要包括免疫净化和生物靶向药物治疗，其中免疫净化可以去除类风湿性关节炎患者血中自身抗体、免疫复合物和免疫球蛋白等，但治疗成本高、操作复杂，创伤较大。生物靶向药物主要包括TNF-α拮抗剂和针对RA炎症分子的生物制剂，这些药物具有快速抑制炎症反应，修复已损伤关节的作用，但价格十分昂贵，并且存在导致潜伏结核感染的患者结核病复燃，肝损伤，罹患肿瘤等风险。另外针对RA炎症分子的生物制剂包括IL-1受体拮抗剂和IL-6受体拮抗剂等。传统药物治疗带来极大的毒副作用，目前免疫学治疗方法相对单一且价格昂贵，对于RA的治疗仍然有很多需要研究和改进之处。
已有研究者发现一类新的CD4+辅助性T细胞，由此细胞亚群特异性分泌IL-17而被称为辅助T细胞17型(helper T cell type 17,Th17)，它还可以分泌IL-6、TNF-α等细胞因子，I L-17和Th17细胞在RA及其动物模型的发病中发挥重要作用。
近年来相关研究表明MDSCs在自身免疫性疾病的治疗方面有巨大的潜能，已有实验利用MDSCs治疗小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)，并取得一定疗效；但是，由于MDSCs来源不足、储存不便及成分复杂等缺点限制了其应用。髓源性抑制细胞 (myeloid derived suppressor cells,MDSC)是骨髓来源的异质性细胞群体，在小鼠中，MD SC是Gr-1(由Ly6G和Ly6C组成)和CD11b双阳性的细胞，根据细胞形态及Ly6G、Ly 6C的表达量的高低，又将MDSC分为两个亚型：CD11b+Ly6G+Ly6Clow粒细胞样MDSC(G- MDSC)和CD11b+Ly6G-Ly6Chi单核细胞样MDSC(M-MDSC)，其中G-MDSCs主要通过精氨酸酶1(Arginine1，Arg-1)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)来抑制T细胞的活化和增殖，M-MDSC则主要通过Arg-1和一氧化氮来发挥抑制作用。
有研究表明G-MDSC来源的exosomes(G-exosomes)对于炎症性肠病模型小鼠和CIA模型小鼠均有保护作用，exosomes是由细胞内吞系统产生的具有生物活性的囊泡，exosomes 内包裹各种脂质、蛋白质、核酸，并能将其携带的物质运输至受体细胞而发挥生物学作用。目前exosomes的应用主要包括药物载体和疾病诊断，以exosomes作为药物转运载体，相对于目前的脂质体载体和聚合物载体具有免疫原性低、运输效率高、稳定性好、靶向性强及跨越血脑屏障的优点，目前以exosomes作为载体的药物主要有基因类药物(siRNA、mRNA、 miRNA)和抗癌类药物(阿霉素、紫杉醇等)以及增强免疫的抗原等。由于不同疾病下不同细胞分泌的exosomes含有不同的核酸、蛋白成分，所以分析从病人体液中分离的exosomes 所包含的成分可以作为疾病诊断的依据。越来越多的研究表明exosomes在自身免疫性疾病的炎症发生过程中起到重要作用，但是G-MDSC来源的exosomes成分复杂，其具体作用机制仍不清楚。
较多研究表明exosomes携带的miRNA具有抑制T细胞增殖分化的作用，例如Treg细胞来源exosomes携带的Let-7d可以抑制Th1细胞介导的炎症反应，并且在体内减轻炎症性肠病小鼠模型的疾病严重程度(Okoye IS,Coomes SM,Pelly VS,Czieso S,Papayannopoulos V,Tolmachova T,et al.MicroRNA-containing T-regulatory-cell-derived exosomes suppress pat hogenic T helper 1cells[J].Immunity.2014,41(1):89-103.)。微小RNA(microRNA，miRNA)是一系列长度为18～22核苷酸的非编码小RNA，它们主要是通过与靶基因的3’非翻译区(3’- UTR)特异性结合，抑制其靶基因的翻译或诱导其mRNA的降解，从而抑制靶标蛋白的表达。
根据G-exosomes的结构和功能特性，利用其装载的miRNA应用于RA的治疗，可达到“安全性高、靶向性强”的目的，具有良好的临床应用前景，有望在维持机体免疫平衡方面发挥积极作用，为RA的治疗提供一种全新的治疗途径。本发明对G-exosomes中miRNA进行人工干预，过表达后能显著提高应用效果，以获得具有更佳治疗效果的G-exosomes。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种过表达miR-93-5p的G-exosomes的制备方法及其在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采取的技术手段如下：
本发明首先提供一种miR-93-5p在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
本发明还提供一种miR-93-5p的筛选方法。
本发明还提供一种过表达miR-93-5p的G-exosomes的制备方法。
本发明还提供一种治疗类风湿性关节炎的药物，所述药物包含过表达miR-93-5p的 G-exosomes。
具体的，采用的技术方案如下：
本发明首先分离提取M-MDSC和G-MDSC，然后提取鉴定这两种细胞所分泌的exosomes (G-exosomes和M-exosomes)，通过实验验证G-exosomes和M-exosomes对于CIA模型小鼠发病的影响，结果表明，G-exosomes具有抑制CIA模型小鼠的发病的作用，通过G-exosomes 和M-exosomes对Th17细胞进行处理，进一步表明，G-exosomes可以抑制Th17细胞的分化，进而减轻小鼠发病，而M-exosomes没有明显的抑制作用。
对G-exosomes和M-exosomes进行miRNA的提取测序分析，筛选出在G-exosomes和M-exosomes中含量相差的差值绝对值较大的前二十个miRNA；进一步根据miRNA的结构和功能特性进行筛选，筛选出9个可能对RA产生作用的miRNA，分别为：miR-16-5p、 miR-29a-3p、miR-93-5p、miR-22-3p、miR-26b-5p、Let-7f-5p、Let7g-5p、miR-221-3p、miR-92a-3p。
根据筛选出的9个miRNA序列设计引物，通过qRT-PCR检测9个miRNA在G-exosomes处理后的Th17细胞中表达量的变化，结果筛选出G-exosomes处理后的Th17细胞中表达量增加最大3个miRNA为miR-16-5p、miR-29a-3p、miR-93-5p。
将筛选出的3个miRNA(miR-16-5p、miR-29a-3p、miR-93-5p)相对应的mimics和mimics- 阴性对照转染初始T细胞，并诱导分化Th17细胞，通过qRT-PCR检测，结果显示miR-93-5p 可以抑制初始T细胞向Th17细胞的分化，也表明G-exosomes可能是通过其装载携带的 miR-93-5p抑制Th17细胞的分化。
进一步通过转染mimics和inhibors的G-MDSC，制备过表达或阻断miR-93-5p的 G-exosomes，并通过体外实验证明，过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于原有G-exosomes更加明显的抑制了Th17细胞的分化；而阻断miR-93-5p的G-exosomes则失去了原有G-exosomes对Th17细胞分化的抑制作用。结果表明G-exosomes携带的miR-93-5p体外抑制Th17的分化，本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于原有的G-exosomes对Th17 细胞分化的抑制能力更强。
本发明通过研究过表达和阻断miR-93-5p的G-exosomes对于CIA模型小鼠发病的作用，发现过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于原有G-exosomes对CIA小鼠的保护作用更强了，而阻断miR-93-5p的G-exosomes则失去了原有G-exosomes对CIA小鼠发病的抑制作用。结果表明G-exosomes携带的miR-93-5p减轻CIA模型小鼠的发病，本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于原有的G-exosomes对CIA模型小鼠的保护作用更强。
本发明发现G-exosomes装载的miR-93-5p可以在体内外抑制相应受体细胞靶标蛋白STAT3的表达，以此发挥对Th17细胞分化的抑制作用。
本发明的优点
(1)本发明首次发现G-exosomes携带的miR-93-5p可以通过抑制Th17细胞的分化减轻 CIA模型小鼠的发病，为RA的治疗提供了新的方法。
(2)本发明制备过表达miR-93-5p的G-exosomes的方法耗时短，操作方便，所含成分活性稳定，-80℃保存时间达1年以上；室温下结构及活性成分也稳定，有利于临床上的应用。
(3)本发明中制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于普通G-exosomes具有更强的抑制Th17细胞分化以及缓解CIA模型小鼠疾病严重程度的作用。
(4)本发明中G-exosomes装载的miR-93-5p可以在体内外抑制相应受体细胞靶标蛋白 STAT3的表达，作用靶点明确。
(5)以exosomes作为药物转运载体具有免疫原性低、运输效率高、稳定性好、吸收快、靶向性强的优点，本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于现有治疗RA药物，具有无毒副作用，不影响正常肝肾代谢功能，制备过程简便，所需成本低的优势，此外本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes，药物作用机制明确，利于药物疗效的监测。
附图说明
图1为本发明分选制备的G-MDSC和M-MDSC的纯度鉴定结果，其中A为G-MDSC， B为M-MDSC。
图2为本发明分选制备的G-exosomes和M-exosomes的透射电镜图，其中A为 G-exosomes，B为M-exosomes。
图3为本发明分选制备的G-exosomes和M-exosomes的粒径大小频数分布图，其中A为 G-exosomes，B为M-exosomes。
图4为Westem blot检测G-exosomes和M-exosomes的标志性蛋白表达结果。
图5为G-exosomes和M-exosomes对CIA模型小鼠发病过程中平均关节炎指数的影响结果。
图6为G-exosomes和M-exosomes对CIA模型小鼠足趾肿胀程度的影响结果。
图7为G-exosomes和M-exosomes体外对于Th17细胞分化的影响结果，图中A为磷酸盐缓冲液对照组Th17细胞比例；B为N-exosomes处理组Th17细胞比例；C为M-exosomes 处理组Th17细胞比例；D为G-exosomes处理组Th17细胞比例。
图8为G-exosomes和M-exosomes装载的miRNA含量差值的绝对值排前20位的miRNA。
图9为G-exosomes处理的Th17细胞中miRNA表达量的变化结果。
图10为转染了相应mimics到初始T细胞后，诱导分化的Th17细胞中miR-93-5p、miR-16-5p、miR-29a-3p的表达量变化结果。
图11为转染了miR-93-5p、miR-16-5p、miR-29a-3p相应mimics到初始T细胞后，对诱导分化Th17细胞的影响结果，图中A为mimics-阴性对照组Th17细胞比例；B为 miR-16-5p-mimics处理组Th17细胞比例；C为miR-29a-3p-mimics处理组Th17细胞比例；D 为miR-93-5p-mimics处理组Th17细胞比例。
图12为将miR-93-5p的mimics或者inhibitors转染到G-MDSC后对其表达miR-93-5p的影响。
图13为将miR-93-5p的mimics或者inhibitors转染到G-MDSC后，G-exosomes表达miR-93-5p的表达量结果图。
图14为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes对Th17细胞分化的影响结果,图中A为阴性对照组Th17细胞比例，B为磷酸盐缓冲液对照组Th17细胞比例，C为G-exosomes处理组Th17细胞比例，D为mimics-NC处理组Th17细胞比例，E为mimic处理组Th17细胞比例，F为inhibitors-NC处理组Th17细胞比例,G为inhibitors处理组Th17细胞比例。
图15为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes对Th17诱导体系中细胞中miR-93-5p的表达量。
图16为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes对CIA模型小鼠关节炎指数的影响程度。
图17为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes对CIA模型小鼠足趾肿胀的影响程度直观图片。
图18为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes处理CIA模型小鼠后足趾的HE染色切片结果，其中A为PBS缓冲液组，B为G-exosomes组，C为mimics-NC-exosomes组，D为mimics-exosomes组，E为inhibors-NC-exosomes组，F为inhibors-exosomes组。
图19为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes处理CIA模型小鼠后腘窝淋巴结细胞中 Th17细胞比例的流式结果。
图20为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes对CIA模型小鼠引流淋巴结CD4+T细胞中miR-93-5p表达量的结果。
图21为miR-93-5p与STAT3的可能结合位点。
图22为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes对Th17诱导体系中细胞总STAT3的表达量，其中，A为Western blot检测结果，B为统计分析图。
图23为过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes对CIA模型小鼠引流淋巴结CD4+T细胞总STAT3的表达量，其中，A为Western blot检测结果，B为统计分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：G-MDSC和M-MDSC的提取及鉴定
(1)构建荷瘤小鼠模型：使用含有10％小牛血清(购于美国Gibco公司)、pH 7.3的DMEM培养液培养(购于美国Gibco公司)，37℃、5％CO2条件下培养小鼠Lewis肺腺癌细胞系(购于上海生命科学院)。在培养过程中密切观察细胞的形态、贴壁情况、密度、培养液颜色变化，待细胞生长至密度达到培养皿底部的85％左右时，用0.25％的胰酶(购于博士德生物工程有限公司)消化并传代。取对数生长期Lewis细胞，按每只小鼠右腹部皮下注射 3.0×106个细胞的方法，对6-8周龄雄性C57BL/6小鼠(购于江苏大学实验动物中心)进行移植瘤的构建，模型构建过程中密切观察小鼠生活状态和肿瘤大小。
(2)分离荷瘤小鼠脾细胞：在Lewis细胞注射给小鼠后的第30天，眼球取血并颈部脱臼处死小鼠，在用75％酒精浸泡小鼠5min后，超净台中解剖小鼠获取脾脏；使用0.22μm孔径的筛网过滤研磨后的脾脏，用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗，收集悬液在4℃、 500g条件下离心5min，弃上清；在沉淀的细胞中加入5mL ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer，ACK)(上海锐谷生物科技有限公司)，混匀后，裂解红细胞5min；加含有10％小牛血清的RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)至10mL，混匀后在4℃、500g条件下离心5min，弃上清；在细胞重悬至10mL时留取少量细胞显微镜下计数。
(3)磁珠分选G-MDSC：每108个脾细胞用350μL PBE重悬，加入50μL的FcR BlockingReagent(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育10min；每108个脾细胞加入40μL的 anti-Ly-6G Biotin(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育30min，每10min混匀一次；加入10mL PBE，混匀后将悬液在4℃、500g离心5min，弃上清；每108个脾细胞加入50μL anti-Ly-6G-Biotin Beads(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育30min，每10min混匀一次；加入10mL PBE，混匀后将悬液在4℃、500g条件下离心5min，弃上清；加入500μL PBE，混匀；将MACS分选柱装在VarioMACS分选器(德国美天旎公司)上，加3mL PBE润洗1 次后加入脾细胞悬液，待最后一滴细胞悬液流出后，再用3mL PBE洗涤分选柱，重复3次；从分选器上撤出分选柱，将分选柱置于10mL离心管上，加入5mL预冷的PBE，推动活塞，压出分离柱中的细胞，重复1次，得到10mL的细胞悬液，即为G-MDSC，留取少量显微镜下计数。
(4)磁珠分选M-MDSC：收集分选G-MDSC时分选柱流出的细胞悬液，4℃、500g条件下离心5min，弃上清；每108个脾细胞加入40μL的anti-Gr-1Biotin(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育30min，每10min混匀一次；加入10mL的PBE，混匀后4℃、500g离心5min，弃上清；每108个脾细胞加入50μL的anti-Gr-1-Biotin Beads(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育30min，每10min混匀一次；加入10mL的PBE，混匀后4℃、500g条件下离心5min，弃上清；加入500μL的PBE，混匀；将MACS分选柱装在分选器(德国美天旎公司)上，加3mL的PBE润洗1次，然后加入上述待分选细胞悬液，待最后一滴流尽，再加入3mL的PBE洗涤分选柱，重复3次；撤出分选柱置于10mL离心管上，加入5mL的 PBE，推动活塞，压出柱中细胞，重复1次，得到10mL的细胞悬液，即为M-MDSC，留取少量显微镜下计数。
(5)G-MDSC和M-MDSC的纯度鉴定：分别取步骤(4)和步骤(5)得到的G-MDSC 1×106个和M-MDSC 1×106个于EP管中，1mL的PBS重悬，在4℃、500g条件下离心5min，弃上清后剩余约100μL的PBS；混匀后在G-MDSC的EP管中加0.5μL的抗Ly-6G抗体(美国 eBioscience公司)和0.5μL的抗CD11b抗体(美国eBioscience公司)，M-MDSC的EP管加 0.5μL的抗Ly-6C抗体(美国eBioscience公司)和0.5μL的抗CD11b抗体(美国eBioscience 公司)；分别在4℃孵育30min；1mL的PBS重悬后4℃、500g条件下离心5min，弃上清，加200μL的PBS重悬，流式细胞仪(美国BD公司)检测。结果如图1所示，本发明中得到的G-MDSC纯度为97.6％，M-MDSC纯度为95.3％。
实施例2：G-exosomes和M-exosomes的提取及蛋白浓度测定
(1)将分选的G-MDSC和M-MDSC分别重悬于含10％小牛血清(美国Gibco公司，血清经过4℃、100000g离心16h处理后，留取血清上层2/3，去除血清中外泌体)的RPMI-1640 培养液(美国Gibco公司)中，以每孔1.5×106个细胞，以及每孔1mL的体积种于24孔板；在37℃、5％CO2的条件下培养24小时后，收集培养上清。
(2)将收集的G-MDSC和M-MDSC的培养上清在4℃、300g条件下离心20min，收集上清；再将上清4℃、1000g离心30min，收取上清；再将上清4℃、10000g离心30min，收取上清；将上清加入到100kDa超滤管(德国Milipore公司)中，4℃、1000g离心30min，收取管中浓缩液。
(3)通过ExoQuick-TCTM Exosome试剂盒(美国SBI公司)提取exosomes：将浓缩液与ExoQuick-TCTM Exosome试剂按体积比5:1混合，轻微混匀，4℃冰箱内静置16h以上；在 4℃、1000g条件下离心30min，弃去上清，收集沉淀物，即为G-exosomes或M-exosomes。将制备获得的exosomes用PBS溶解，分装至EP管中，-80℃保存。
(4)exosomes的溶解液与等体积的裂解液(RIPA:PMSF＝250:1)混匀后，冰上放置1小时，期间每10min在震荡器上震荡1min；4℃、12000g离心15min，收集上清。按BCA微量蛋白定量试剂盒(北京康为世纪有限公司)说明书的方法检测exosomes裂解上清中的蛋白浓度，以确定提取exosomes的含量。结果显示，本发明中得到的每个G-MDSC或M-MDSC 在培养24h后可以提取约3×10-6μg的exosomes。
实施例3：G-exosomes和M-exosomes的鉴定
(1)透射电镜观察G-exosomes的形态：取20μL G-exosomes或M-exosomes悬液滴加于直径3mm的载样铜网上，室温静置2min；用滤纸轻轻吸干液体，滴加pH 6.8的2％磷钨酸溶液(上海君瑞科技有限公司)于铜网上，复染lmin；滤纸吸干染液，白炽灯下烤干，透射电镜(荷兰飞利浦公司)下观察，结果如图2所示，透射电子显微镜下观察到G-exosomes 和M-exosomes为圆形或椭圆形的微囊结构，有完整包膜，腔内为低电子密度成分；图3分别为G-exosomes和M-exosomes的粒径大小频数分布，结果显示G-exosomes和M-exosomes 的粒径主要分布在20-120nm之间。
(2)Western blot检测G-exosomes和M-exosomes包含的蛋白分子CD9、CD63和线粒体包含的钙联蛋白分子Calnexin：配制5％的浓缩胶和12％分离胶，用RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)裂解G-exosomes和M-exosomes，将裂解后的G-exosomes按250μg 蛋白总量上样，经100V恒压电泳后；再经350mA恒流电转90min后，5％脱脂牛奶封闭PVDF膜lh；用抗CD63单克隆抗体(美国eBioscience公司)和抗Calnexin单克隆抗体(美国eBioscience公司)4℃孵育过夜；取出后用TBS/T(上海经科化学科技有限公司)洗膜，10min×3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗(美国eBioscience公司)37℃孵育30min；取出后用TBS/T(上海经科化学科技有限公司)洗膜，10min×3次；ImageQuant LAS 4000凝胶成像系统(美国GE公司)曝光显色，结果如图4所示，G-exosomes、M-exosomes特异性高表达 CD9、CD63分子，但G-exosomes和M-exosomes不包含定位在细胞内质网膜上的钙联蛋白。鉴于提取的G-exosomes和M-exosomes的形态、大小、蛋白分子表达结果，证明本实施例成功提取了G-exosomes和M-exosomes。
实施例4：实验证明G-exosomes和M-exosomes的免疫抑制功能
(1)构建CIA模型小鼠：
第一次免疫：用2mg/mL的牛二型胶原(美国sigma公司)与2mg/mL的弗氏完全佐剂(美国赛默飞公司)等体积混合，冰上研磨至油包水状态；对每只DBA/1小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)尾根部皮下注射0.1mL的上述混合液；
第二次免疫：用2mg/mL的牛二型胶原(美国sigma公司)与2mg/mL的弗氏不完全佐剂(美国赛默飞公司)等体积混合，冰上研磨至油包水状态，在第一次免疫后的第21天对每只DBA/1小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)尾根部皮下注射0.1mL的上述混合液。
(2)制备小鼠成熟中性粒细胞来源的exosomes(N-exosomes)：
对6-8周龄雄性C57BL/6小鼠(江苏大学实验动物中心)摘除眼球取血，滴加到含有EDTA-Na2的抗凝采血管(苏州灵岩医疗器械有限公司)中，1000rpm离心眼球血10min，吸出血浆，用500μL的PBS重悬血细胞。将1mL的单个核淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)加到10mL容量的玻璃试管中，将血细胞悬液沿管壁缓缓滴加到玻璃试管中，使用水平离心机，4℃、2000rpm离心15min。用吸管自上而下缓缓吸取除红细胞层外的其他细胞层并弃去，加入5mL ACK(上海锐谷生物科技有限公司)，吹打混匀,室温静置5min，加入5mL的含有10％小牛血清的RPMI 1640培养液(美国Gibico公司)终止裂解，混匀后4℃， 500g离心5min。弃上清，用10mLPBE洗涤2次，得到中性粒细胞。然后按照实施例2中方法提取N-exosomes。
(3)实验分组：
PBS对照组：分别在第一次免疫后的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射 PBS100μL；
N-exosomes组：分别在第一次免疫后的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μL PBS 溶解的N-exosomes，其中100μLPBS溶解100μgN-exosomes；
G-exosomes组：分别在第一次免疫后的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μL PBS 溶解的G-exosomes，其中100μLPBS溶解100μgG-exosomes；
M-exosomes组：分别在第一次免疫后的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注100μLPBS 溶解的M-exosomes，其中100μLPBS溶解100μgM-exosomes。
(4)在第二次免疫后每3天对各组小鼠的足趾情况进行监测，记录每只小鼠的关节炎分数(arthritic score,AS),AS代表每只小鼠所有病变关节分数的总和，而各关节病变分数采用 5级评分法，无红肿得0分，关节红而不肿得1分，关节轻度红肿得2分，关节中度红肿得3 分，关节重度红肿并伴有功能障碍得4分。计算各组小鼠的平均关节炎指数(meanarthritic index,MAI)，MAI由各组小鼠AS的总和除以各组小鼠的个数。如图5所示，G-exosomes处理组小鼠的平均关节炎指数相对N-exosomes处理组降低了，而PBS缓冲液、N-exosomes、 M-exosomes处理组之间无明显差异；图6表示G-exosomes处理组小鼠的足趾只有轻度的红肿，关节活动正常；然而PBS缓冲液、N-exosomes、M-exosomes处理组小鼠的足趾大多红肿明显，关节活动受限，这些结果表明G-exosomes具有抑制CIA模型小鼠发病的作用，而 M-exosomes没有明显抑制CIA模型小鼠发病的作用。
(5)建立Th17细胞诱导分化体系：用含有2μg/mL抗小鼠CD3单克隆抗体(美国eBioscience公司)的包被液200μL包被24孔圆底培养板，4℃过夜；吸出各孔中的包被液，PBS洗涤1次，通过德国美天旎公司的初始T细胞分选试剂盒分选出初始T细胞，按每孔1.5×106个细胞的密度将初始T细胞接种于24孔板，每孔总体积为1mL；各孔加入终浓度为 2μg/mL的抗小鼠CD28单克隆抗体(美国eBioscience公司)、终浓度为5ng/mL的小鼠重组 TGF-β(美国eBioscience公司)、终浓度为30ng/mL的IL-6(美国eBioscience公司)、终浓度为30ng/mL的IL-23(美国eBioscience公司)、终浓度为5μg/mL的anti-IL-4(美国eBioscience公司)、终浓度为5μg/mL的anti-IFN-γ(美国eBioscience公司)；用含15％胎牛血清(美国gibico公司，经过100000g离心16h处理)、pH 7.2-7.4的RPMI-1640细胞培养液(美国gibico公司)，37℃、5％CO2条件下培养72h。
(6)实验分组：对照组：加入100μL的PBS作为对照；其余组各孔加入终浓度为60μg/mL 的N-exosomes、G-exosomes和M-exosomes，如图7所示，G-exosomes处理组Th17细胞的比例相对N-exosomes处理组降低了，而PBS缓冲液、N-exosomes、M-exosomes处理组之间无明显差异。这些结果表明G-exosomes相比M-exosomes在CIA模型小鼠中起到减轻小鼠发病的作用，体外抑制Th17细胞的分化，G-exosomes相对M-exosomes而言展现出更强大的免疫抑制功能。
实施例5：G-exosomes和M-exosomes中miRNA的测序结果及分析
(1)委托广州锐博公司对G-exosomes和M-exosomes中携带的miRNA进行提取测序分析，本领域技术人员公知G-exosomes和M-exosomes包含许多特定的miRNA，并且在表达量上存在一定差异。根据测序结果分析，结合TargetScan网站上相关miRNA的信息，确定miRNA的类别；如图8所示，G-exosomes和M-exosomes包含的相关miRNA含量差值的绝对值前二十位为miR-148a-3p(MIMAT0000516)、miR-340-5p(MIMAT0004651)、miR-16-5p(MIMAT0000527)、miR-22-3p(MIMAT0000531)、miR-27a-3p(MIMAT0000537)、miR-92a-3p(MIMAT0000539)、miR-140-3p(MIMAT0000152)、miR-27b-3p(MIMAT0000126)、miR-24-3p(MIMAT0000219)、miR-26b-5p(MIMAT0000534)、miR-423-3p(MIMAT0000516)、Let-7f-5p(MIMAT0000525)、miR-29a-3p(MIMAT0000535)、miR-7a-5p(MIMAT0000677)、miR-140-5p(MIMAT0000151)、Let7g-5p(MIMAT0000121)、miR-26a-5p(MIMAT0000533)、miR-221-3p(MIMAT0000669)、miR-93-5p(MIMAT0000540)、miR-148b-3p(MIMAT0000580)，括号内编号为根据MIRBASE网站分析对应的编号信息，并以它们作为待筛选miRNA。
(2)本发明对待筛选miRNA进一步筛选，由于miR-16-5p、miR-29a-3p、miR-93-5p、Let7g-5p与骨关节炎的发展和成骨细胞的增殖、分化、迁移相关；miR-22-3p和miR-26b-5p参与RA的发病；miR-29a-3p、miR-93-5p、miR-221-3p与T细胞增殖、分化、免疫应答等有关；miR-16-5p、miR-29a-3p、Let-7f-5p、miR-92a-3p的潜在靶标Smad7、Smad6、FOS、PIK3R1、STAT3、EMOS、PIK3R1等与T细胞的增殖分化密切相关。由此本发明进一步筛选出miR-16-5p、miR-29a-3p、miR-93-5p、miR-22-3p、miR-26b-5p、Let-7f-5p、Let7g-5p、miR-221-3p、 miR-92a-3p作为候选miRNA。
(3)检测候选miRNA在G-exosomes处理后Th17诱导细胞中表达量的倍数变化：收集实施例4步骤(6)中对照组与加G-exosomes处理的Th17诱导细胞，用1mL的Trizol(美国Invitrogen公司)将1×106个Th17诱导细胞溶解，用移液器充分吹打混匀，加入预冷氯仿(上海化学试剂公司)200μL，立即震荡15～30s，常温静置10min；在4℃条件下，12000g 离心15min；EP管中液体出现分层，吸取上层水相层(含有RNA)至新的干净EP管中，加入500μL的异丙醇，使用移液器轻轻混匀，常温静置5～10min；在4℃条件下，12000g离心 15min，此时RNA沉于管底，呈半透明状；弃去上清，加1mL的75％乙醇(上海化学试剂公司)洗涤；在4℃条件下，7800g离心5min；室温置于超净台中吹干至RNA呈半透明状；加5μL 的DEPC(上海碧云天有限公司)水溶解；用美国赛默飞检测仪检测RNA的浓度。
(4)按照日本Takara逆转录试剂盒要求对步骤(3)中提取的RNA进行逆转录，根据miRNA序列设计引物，然后委托广州锐博公司合成miR-16-5p、miR-29a-3p、miR-93-5p、miR-22-3p、miR-26b-5p、Let-7f-5p、Let7g-5p、miR-221-3p、miR-92a-3p的前后向引物，通过上海BIO-RAD公司购买的qRT-PCR试剂盒检测候选miRNA在G-exosomes处理后Th17 诱导细胞中的表达量变化，结果如图9所示，G-exosomes处理后Th17诱导分化细胞中，候选miRNA的表达量增加最大的是miR-16-5p、miR-29a-3p和miR-93-5p。
(5)通过EntranceTM-R转染试剂(北京Engreen公司)将miR-16-5p、miR-29a-3p和miR-93-5p的mimics和mimics-阴性对照(广州锐博生物科技有限公司)分别转染到实施例4步骤(5)分选出的初始T细胞，然后按照实施例4中方法诱导分化为Th17细胞，通过qRT-PCR检测，结果如图10，转染mimics的Th17细胞中miR-16-5p、miR-29a-3p和miR-93-5p表达量相应提高；如图11，转染了miR-93-5p的mimics的初始T细胞向Th17细胞分化的比例明显低于转染了mimics-阴性对照的初始T细胞，而转染了miR-16-5p对应mimics和miR-29a-3p 对应mimics的初始T细胞则没有明显变化。这些结果表明，外源性的miR-93-5p可以抑制初始T细胞向Th17细胞的分化，这提示G-exosomes可能通过其携带的miR-93-5p抑制Th17 细胞的分化。
实施例6：制备过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes
(1)将miR-93-5p的mimics、mimics-阴性对照(mimics-negitive control,mimics-NC)以及inhibitors、inhibitors-阴性对照(inhibitors-negitive control,inhibitors-NC)的冻干粉(广州锐博生物科技有限公司)离心后，用无菌DEPC水溶解，吹打混匀成终浓度为20μM的储存液，分装保存于-80℃冰箱；
(2)接种细胞，在24孔板中每孔接种1×106个G-MDSC，用10％小牛血清的RPMI1640 培养液(美国Gibico公司)补足体系为450μL；
(3)mimics、mimics-NC以及inhibitors、inhibitors-NC稀释液的制备：取干净的EP管，分别加入mimics和mimics-NC 50nM，再分别加入1.25μL的mimics或mimics-NC的储存液，然后用无血清的RPMI 1640培养液(美国Gibico公司)补足至25μL；再取干净的EP管，分别加入inhibitors和inhibitors-NC100nM，再分别加入2.5μL的inhibitors、inhibitors-NC的储存液，然后用无血清的RPMI 1640培养液(美国Gibico公司)补足至25μL；
(4)EntranceTM-R转染试剂稀释液的制备：取一个干净EP管，加入相应量的EntranceTM-R转染试剂(北京Engreen公司)，根据mimics、mimics-NC、inhibitors、inhibitors-NC 的量控制转染试剂的用量，每50nM加入1μL转染试剂，然后用无血清的1640培养基(美国 Gibico公司)补足至25μL，室温静置5min；
(5)转染复合物的制备：将EntranceTM-R转染试剂(北京Engreen公司)稀释液加入到相应mimics、mimics-NC或者inhibitors、inhibitors-NC稀释液中，然后立即充分混匀，室温静置30min；
(6)将50μL的转染复合物滴加到步骤(2)中的接种细胞中，轻轻混匀；
(7)转染6个小时后观察细胞状态，如果细胞状态佳，则离心收集G-MDSC；
(8)按照实施例2中方法利用转染了mimics或者inhibitors的G-MDSC制备过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes。
实施例7：验证过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes
(1)收集实施例6步骤(6)中各处理组1×106个G-MDSC，按照实施例5步骤(3)中的方法提取各处理组G-MDSC的总RNA，并检测其浓度；
(2)按照实施例5中的方法对各处理组G-MDSC的miR-93-5p的含量进行荧光定量检测，结果如图12所示miR-93-5p的mimics或者inhibitors成功转染到了G-MDSC。
(3)收集实施例6步骤(8)中各处理组每3×107个G-MDSC分泌的G-exosomes，用1mL的Trizol(美国Invitrogen公司)溶解。
(4)按照实施例5中操作方法对各组G-exosomes包含的miR-93-5p进行定量分析，如图13所示转染了miR-93-5p的mimics的G-MDSC分泌的G-exosomes中相对于mimics-NC 组miR-93-5p的表达量显著提高(P<0.01)，而转染了miR-93-5p的inhibitors的G-MDSC分泌的G-exosomes中相对于inhibitors-NC组miR-93-5p的表达量降低了(P<0.05)。这些结果说明本实施例成功提取了过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes，本实施例中制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于原有的G-exosomes相比，miR-93-5p的含量大约增加了15倍。
实施例8：G-exosomes装载的miR-93-5p可以体外抑制Th17细胞的分化
(1)在Th17细胞诱导分化体系中加入60μg/mL过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes，如图14所示，过表达miR-93-5p的G-exosomes处理组(转染mimics组)相对于mimics-NC 组Th17细胞的比例明显降低了(P<0.01)，而阻断miR-93-5p的G-exosomes处理组(转染 inhibitors组)相对于inhibitors-NC组Th17细胞的比例增高了(P<0.05)。这些结果表明 G-exosomes携带的miR-93-5p可以体外抑制Th17细胞的分化，并且过表达miR-93-5p的 G-exosomes对于Th17细胞分化的抑制能力更强。本实施例中过表达miR-93-5p的G-exosomes 相对于原有的G-exosomes相比对于Th17细胞分化的抑制能力更强，Th17细胞的比例减少了一倍。
(2)根据实施例5中操作方法检测过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes处理后Th17 诱导体系中细胞的miR-93-5p的表达量，如图15所示，过表达miR-93-5p的G-exosomes处理组与mimics-NC组相比较，可以使诱导细胞miR-93-5p表达水平明显提高(P<0.01)，阻断 miR-93-5p的G-exosomes处理组miR-93-5p表达水平相对于inhibitors-NC组则显著降低了 (P<0.001)。这些结果说明G-exosomes可以将其携带的miR-93-5p传递到受体细胞，从而发挥抑制功能，并且本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes传递miR-93-5p的效率更高。
实施例9：G-exosomes装载的miR-93-5p可以更加有效的抑制CIA模型小鼠的发病，缓解疾病的严重程度
(1)利用实施例4中构建的CIA模型小鼠；
(2)在第一次免疫后第18天和第24天对CIA模型小鼠进行尾静脉注射过表达或阻断 miR-93-5p的G-exosomes。
(3)实验分组：
PBS缓冲液组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射PBS 100μL；
G-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μL的PBS溶解的G-exosomes；
mimics-NC-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μL PBS 溶解的转染mimic-NC后G-MDSC分泌的G-exosomes；
mimics-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μL的PBS 溶解的转染mimic后G-MDSC分泌的G-exosomes；
inhibitors-NC-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μL 的PBS溶解的转染inhibitors-NC后G-MDSC分泌的G-exosomes；
inhibitors-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μL的 PBS溶解的转染inhibitors后G-MDSC分泌的G-exosomes。
上述各组中，100μL PBS中溶解100μg不同处理组的G-exosomes。
(4)如图16所示，mimics-exosomes处理组小鼠的平均关节炎指数相对 mimics-NC-exosomes处理组明显降低(P<0.05)，inhibitors-exosomes处理组小鼠的平均关节炎指数相对inhibitors-NC-exosomes处理组显著升高(P<0.01)。如图17所示，G-exosomes、mimics-NC-exosomes、mimics-exosomes、inhibitors-NC-exosomes组小鼠的足趾只有轻度的红肿，关节活动正常；然而PBS缓冲液组、inhibitors-exosomes组小鼠的足趾大多红肿明显，关节活动受限。如图18所示，G-exosomes、mimics-NC-exosomes、mimics-exosomes、inhibitors-NC-exosomes组小鼠的足趾关节处骨结构相对完整，关节间隙相对正常，少有炎症性细胞浸润；然而PBS缓冲液组、inhibitors-exosomes组小鼠的足趾关节处骨结构遭到严重破坏，关节间隙减小，有大量炎症性细胞浸润。这些结果表明G-exosomes携带的miR-93-5p可以抑制CIA模型小鼠的发病，缓解疾病的严重程度，并且过表达miR-93-5p的G-exosomes 对CIA模型小鼠具有更强的保护作用。
本实施例中过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于原有的G-exosomes相比对于CIA小鼠的保护作用更强，相对于原有的G-exosomes，过表达miR-93-5p的G-exosomes处理小鼠的平均关节炎指数下降了接近一倍，足趾肿胀程度明显减轻，关节结构更加完整。
(5)分离各组小鼠腘窝淋巴结，制备单细胞悬液，如图19所示流式细胞术分析各组小鼠腘窝淋巴结细胞中Th17细胞比例，mimics-exosomes处理组小鼠的腘窝淋巴结细胞中Th17 细胞比例相对于mimics-NC-exosomes处理组显著降低(P<0.01)，inhibitors-exosomes处理组相对于inhibitors-NC-exosomes处理组Th17细胞比例显著升高(P<0.001)，另外PBS处理组与mimics-NC-exosomes处理组或者inhibitors-NC-exosomes处理组相比无明显差异(P>0.05)。如图20所示qRT-PCR检测各组小鼠引流淋巴结CD4+T细胞miR-93-5p的表达量， mimics-exosomes处理组小鼠引流淋巴结CD4+T细胞miR-93-5p的表达量相对于 mimics-NC-exosomes处理组显著升高(P<0.01)，inhibitors-exosomes处理组相对于 inhibitors-NC-exosomes处理组miR-93-5p的表达量明显降低(P<0.01)，另外PBS缓冲液组与 mimics-NC-exosomes处理组或者inhibitors-NC-exosomes处理组相比无明显差异(P>0.05)。这些结果说明G-exosomes可以通过运输miR-93-5p到受体细胞，抑制CIA模型小鼠引流淋巴结致病性Th17细胞的比例，缓解疾病的严重程度，并且本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes具有更高的运输miR-93-5p的效率，对于CIA模型小鼠的保护作用也更强。
本实施例中过表达miR-93-5p的G-exosomes相对于原有的G-exosomes相比对于CIA小鼠的保护作用更强，相对于原有的G-exosomes，过表达miR-93-5p的G-exosomes处理小鼠腘窝淋巴结细胞中Th17细胞的比例下降了一倍，致病性Th17细胞比例的减少对于抑制CIA小鼠的发病至关重要。
实施例10：G-exosomes装载的miR-93-5p可以降低靶标蛋白STAT3的表达
(1)根据Targetscan网站分析，如图21所示，miR-93-5p可以与靶标基因STAT3的3’UTR区域的248-254、495-501两个区域特异性结合。
(2)收集过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes处理后Th17诱导体系中的细胞，Wes tern blot检测各处理组细胞STAT3的表达水平，如图22所示，过表达miR-93-5p的G-exoso mes处理组相对于mimics-NC组STAT3的表达水平降低了(P<0.05)，而阻断miR-93-5p的G -exosomes处理组相对于inhibitors-NC组STAT3的表达水平增高了(P<0.05)。这些结果表明 G-exosomes携带的miR-93-5p可以抑制受体细胞STAT3的表达，从而抑制Th17细胞的分化，本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes具有更强的抑制靶标蛋白STAT3表达的作用，从而发挥更强的免疫抑制功能。本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes具有更强的抑制靶标蛋白STAT3表达的作用，相对于原有G-exosomes相比，STAT3表达水平下降了一倍，从而发挥更强的抑制Th17细胞分化的功能。
(3)收集过表达或阻断miR-93-5p的G-exosomes处理后CIA模型小鼠引流淋巴结CD4+ T细胞，Western blot检测各处理组细胞STAT3的表达水平，如图23所示，过表达miR-93-5p 的G-exosomes处理组相对于mimics-NC组STAT3的表达水平明显降低了(P<0.01)，而阻断 miR-93-5p的G-exosomes处理组相对于inhibitorss-NC组STAT3的表达水平增高了(P<0.05)。这些结果说明G-exosomes携带的miR-93-5p可以在CIA模型小鼠体内外降低受体细胞靶标蛋白STAT3的表达，并且本发明制备的过表达miR-93-5p的G-exosomes具有更强的抑制靶标蛋白STAT3表达的能力，从而对CIA模型小鼠发挥更强的保护作用。本发明制备的过表达 miR-93-5p的G-exosomes具有更强的抑制靶标蛋白STAT3表达的能力，相对于原有 G-exosomes相比，STAT3表达水平下降了近2倍，从而对CIA模型小鼠发挥更强的保护作用。

Claims (5)

1.一种过表达 miR-93-5p 的 G-exosomes 在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
2.一种过表达 miR-93-5p 的 G-exosomes 在制备抑制类风湿性关节炎药物中的应用。
3.根据权利要求 1-2 任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为抑制 Th17 细胞分化。
4.根据权利要求 1-2 任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为抑制相应受体细胞靶标蛋白 STAT3 的表达。
5.一种治疗类风湿性关节炎的药物，其特征在于，所述药物包含过表达 miR-93-5p 的G-exosomes。
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