CN107075487A - 突变的猪流行性腹泻病毒用于在疫苗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及突变的猪流行性腹泻病毒(PEDVdN)，生产所述PEDVdN的方法和包含PEDVdN的组合物。本发明还涉及包括给药PEDVdN刺激猪的免疫应答的方法，包含PEDVdN的疫苗以及预防或改善猪的猪流行性腹泻的方法。

Description

突变的猪流行性腹泻病毒用于在疫苗中的用途

技术领域

本发明涉及病毒介导的动物疾病，更具体地涉及病毒介导的动物疾病的预防。具体而言，本发明涉及猪流行性腹泻(PED)的预防。本发明涉及用于动物的疫苗接种的病原体，突变的猪流行性腹泻病毒。本发明的突变的病毒导致针对猪流行性腹泻病毒的野生分离株感染的改进性保护。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(PEDV，Porcine Epidemic Diarrhea Virus)是一种致死性病毒，在猪中，尤其是仔猪中会引起称为猪流行性腹泻(PED)的疾病。PED是一种急性的且高度传染性的肠道疾病，其特征在于严重肠炎，呕吐和水性腹泻。该疾病在新生仔猪中最严重，因为它们更容易脱水。在不到1周龄的猪中，新生猪的死亡率可高达100％。PEDV在英国于1971年首次被发现，且它在1970年代和1980年代的欧洲造成大规模流行。它自那时以来已经扩散到亚洲，自1982年以来在亚洲已经认为是流性行的，对猪肉生产者造成巨大的经济损失。PED在2013年5月首次在美国被诊断出，且在2014年1月在加拿大首次被诊断出。该病毒能够通过粪-口途径(faecal-oral route)快速扩散并感染整个兽群。

PEDV是冠状病毒科的网巢病毒目(order Nidovirales)的成员。网巢病毒目采用正极性的单链多顺反子RNA基因组，其指导包括RNA依赖性RNA聚合酶和解旋酶的复制复合物的亚单位的合成。复制酶基因表达是在核糖体移码信号和糜蛋白酶样蛋白酶的主要控制之下，其由一种或多种木瓜蛋白酶样蛋白酶辅助。合成一套嵌套的亚基因组RNA以表达3'-近端ORF。

3'-近端ORF编码结构和非结构的蛋白。它们通过一套3'-端嵌套的亚基因组信使RNA进行表达。这些亚基因组mRNA编码至少四个结构蛋白，包括称为刺突(S)，膜(M)和包膜(E)蛋白的三个膜锚定蛋白，和包裹基因组RNA的核衣壳(N)蛋白。从亚基因组mRNA表达的非结构蛋白编码对于每个冠状病毒属特异性的辅助蛋白。位于S和E基因之间的一种辅助基因ORF3在不同的α-冠状病毒之间共享，并编码具有三至四个推定跨膜结构域的224个氨基酸(aa)长的蛋白(Wang et al.,2012.FEBS Lett 586:384-391)。

已经开发了作为候选的减毒活疫苗的PEDV的Vero细胞适应株。然而，所得的疫苗株与最近的野生型PEDV分离株在遗传学上完全不同，因此或许不是通用的(Park et al.,2011.Arch Virol 156:577-585；Pan et al.,2012.Virology Journal 9:195)。另一个缺点是其潜在的毒性恢复和有毒病毒的随后扩散(Chen et al.,2010.Arch Virol 155,1471-1476)。另外，常规的灭活疫苗被广泛使用，但是这些疫苗具有一些缺点，如高成本和有时较弱的保护效果(Suo et al.,2012.Virus Research 167:259–266；Lee et al.,2012.Clin Exp Vaccine Res 1:18-34)。

使用RNA平台式疫苗技术(Harrisvaccines)生产的疫苗最近已获得美国农业部(USDA)的条件许可。RNA平台使用了用于表达PEDV的刺突蛋白的α刺病毒基的表达系统。该疫苗的有效性可能有限，因为其仅表达已知是异质的刺突蛋白(Chen et al.,2013.Viruses 5:2601-2613)。

因此，迫切需要开发用于控制PED的新型且有效的疫苗。

发明内容

因此，本发明提供了突变的猪流行性腹泻病毒(PEDVdN)，其包含刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的功能性失活。

α的冠状病毒如PEDV的刺突(S)蛋白是锚定于病毒包膜中的约1255个氨基酸的大糖蛋白。S蛋白介导病毒颗粒与细胞的结合，以及细胞-病毒膜融合(Rota et al.,2003.Science 300:1394-1399)。S蛋白被宿主衍生的蛋白酶切割成两个亚单位：N-端S1亚单位和C-端膜锚定的S2亚单位，其中每个亚单位的大小约为150kDa。S1亚单位提供用于氨基肽酶N的结合域，氨肽酶N是许多α许冠状病毒的细胞表面受体(Belouzard et al.,2012.Viruses 4,1011-1033)。

α冠状病毒的刺突蛋白的长度范围为人HCoV229E(SwissProt登录号P15423)中的1173个氨基酸残基至猫科动物冠状病毒UU23(基因库(GenBank)登录号ADC35472.1)的1466个氨基酸残基。序列同一性不是很保守，显示出在整个刺突蛋白上仅22.94％的总体序列同一性。S1亚单位的N-端区域(“区域结构域”)包括PEDV的毒性菌株的S蛋白的公布序列的约氨基酸残基19至氨基酸残基233的区域，如GenBank中提供的参考编号JQ023161，其是不同α不冠状病毒之间的较不保守的区域，与S1亚单位的其余C-端部分的约38％的总序列同一性相比，具有约22％的总体序列同一性。

已经鉴定的是传染性胃肠炎病毒(TGEV)和I型猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的天然变体都是α的冠状病毒，其中发现S1亚单位的N-结构域并不存在。

猪呼吸道冠状病毒(PRCV)是TGEV的天然变体，并具有S1亚单位的N-结构域的缺失。PRCV不感染肠细胞，并因此不会引起腹泻。PRCV主要在肺中增殖，这表示S1亚单位的N结构域在与宿主细胞受体的相互作用中起作用。据认为PRCV已经天然地接种了猪群，因为PRCV感染可以导致与TGEV交叉反应的抗体的诱导。TGEV和PRCV都能够结合氨基肽酶N，并且已经发现氨基肽酶N结合结构域存在于TGEV S蛋白的氨基酸位置481至650处的S1亚单位的C-端部分中(Reguera et al.,2012.PLoS Pathogens 8,e1002859)。

此外，在刺突蛋白的N-端区域内具有735bp的较大缺失的I型FIPV已被观察为FIPV的自发突变体。值得注意的是，在这种情况下，突变的病毒保持其毒性并且发现在感染的猫中诱导了猫感染性腹膜炎(Terada et al.,2012.J Gen Virol 93:1930-4)。已知I型猫冠状病毒不能将氨基肽酶N识别为猫细胞系上的功能性受体(Dye et al.,2007.J Gen Virol88:1753-60)。这不仅表明受体结合域存在于S1亚单位的C-端部分，而且表明刺突蛋白的N-端区域的缺失不影响该冠状病毒的感染性和毒性。

已经发现，PEDV的氨基肽酶N-结合结构域存在于S1亚单位的N-端部分中，包括氨基酸残基25-88(Lee et al.,2011.Korean J Microbiol Biotechnol 39:140-145)。因此，令人惊讶的是，包含刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域(包括PEDV的推定的氨基肽酶N-结合结构域)的功能性失活的突变的PEDV能够感染细胞并在靶生物体中扩散。此外，已经发现所述突变的PEDV发生了减毒，从而影响该冠状病毒的毒性。

冠状病毒的S1刺突亚单位的N-端区域是较不保守的，这能够反映了不同冠状病毒可以与氨基肽酶N(APN)蛋白的不同部分相互作用的事实。例如，据报道，HCV 229E与APN蛋白的氨基-端部分相互作用，而TGEV和犬冠状病毒与APN蛋白的羧基端部分发生相互作用(Kolb et al.,1997.J Gen Virol 78:2795-2802)。此外，已经发现原型β现冠状病毒鼠肝炎病毒的受体结合结构域位于S1亚单位的N-端部分(Mou et al.,2013.J Virol 87:9379-9383)。因此，PEDV的S1亚单位的N-端部分可以与APN蛋白上与HCV 229E、TGEV和/或犬冠状病毒的相互作用结构域不同或仅部分重叠的结构域发生相互作用。

如本文使用的术语“功能性失活”和“功能性失活的”是指由于，例如，通过在基因的编码区内改变或缺失一个或多个核苷酸不被转录和/或未被翻译而不被表达的基因或部分基因。术语“功能性失活的”优选指至少部分或全部编码序列缺失的基因。

如本文所用的术语“刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域”是指对应于SEQ ID NO:1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域的区域。编码刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的基因组区域在不同的公布的PEDV基因组序列之间是保守的，具有约22％的总体同一性。如本文所用的术语“对应于”是指来自其它PEDV的氨基酸区域不需要在序列和/或编号上与SEQ ID NO:1的所指示区域相同。然而，本领域技术人员将能够基于，例如，来自多个PEDV基因组序列的序列的排列而确定其他PEDV中的相应区域。因此，本领域技术人员将会理解，如本文所应用的氨基酸残基同一性和/或编号对于本发明并非限制性的，而所应用仅是为了清楚之目的。

根据本发明的PEDVdN优选功能性表达刺突蛋白的S1亚单位的C-端结构域。所述C-端结构域起始于SEQ ID NO:1的位置234处的氨基酸序列X-X-N-V-F，或其他PEDV序列中的相应位置。保守残基N-V-F将有助于本领域技术人员确定PEDV的不同菌株的刺突蛋白的S1亚单位中的相应位置。

所述PEDVdN优选包含编码构成推定信号肽的10个最N-端氨基酸，优选14个最N-端氨基酸，优选18个最N-端氨基酸的基因组序列。

所述PEDVdN优选包含编码刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域之中或之内的至少三个氨基酸的基因组区的缺失。所述至少三个氨基酸优选是构成在用PEDV感染猪后针对其产生抗体的抗原区的三个连续氨基酸残基。所述至少三个氨基酸优选包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基194-196(氨基酸序列NKR)，或其它PEDV序列中的相应氨基酸残基。

因此，本发明提供了突变的猪流行性腹泻病毒(PEDVdN)，其包含在对应于SEQ IDNO:1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域内的三个或更多个氨基酸残基的缺失。

如本文所用的术语“缺失”是指基因组区域，优选在刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域内，优选在对应于SEQ ID NO:1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域的区域内编码至少三个氨基酸的基因组区域的去除。所述缺失导致在对应于SEQ ID NO:1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域的区域内氨基酸残基数目的减少。

优选的PEDVdN包含编码刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的氨基酸(aa)19-aa233的基因组区域的缺失。所述缺失是框内的，是指基因组区域编码一种刺突S1亚单位的18个最N-端氨基酸融合到刺突S1亚单位的C-端部分的蛋白质。所述融合可以是直接的，是指刺突S1亚单位的18个最N-端氨基酸直接将N-端结合到刺突S1亚单位的C-端部分而没有任何插入的氨基酸。可替换地，所述融合是间接的，是指一个或多个氨基酸残基位于刺突S1亚单位的18个最N-端氨基酸和刺突S1亚单位的C-端部分之间。位于刺突S1亚单位的18个最N-端氨基酸和C-端部分之间的一个或多个氨基酸残基的编码序列可以是至少一个氨基酸残基的任何编码序列。

据报道，疫苗菌株可以与最近分离的野生型PEDV菌株不同(Park et al.,2011.Arch Virol 156:577-585；Pan et al.,2012.Virology Journal 9:195)。它们可以在它们的递送模式、它们的功效和它们的基因组序列方面进一步不同。因此，为了提供有效的保护而防止随后的强毒性PEDV感染，PEDVdN的病毒基因组序列，特别是编码最免疫显性的蛋白质(most immunodominant protein)，即刺突蛋白的那些病毒基因组序列，优选是当代的强毒性PEDV。特别是编码刺突蛋白的S1亚单位的C-端部分的序列是当代强毒性的当代PEDV的序列，因为该部分最强烈地刺激中和抗体的诱导作用，而因此是开发有效疫苗中的重要靶标。

根据本发明的PEDVdN通过提供具有优选在一个或多个不是指定聚合酶功能的基因(ORF1a/1b)或结构蛋白N、M、E和S的基因内的缺失的PEDVdN而优选地减毒。所述基因优选是ORF3，优选的所述减毒病毒包含ORF3的缺失。尽管没有证明，但已经表明的是，产生自细胞培养适应的ORF3基因中的突变可以有助于这些病毒的减毒(Song et al.,2007.Res VetSci 82:134-140)。此外，在PEDV感染的细胞中ORF3基因的siRNA介导的敲低(敲除，knockdown)减少了从细胞释放的颗粒的数量(Wang et al.,2012.FEBS Lett 586:384-391)。完整的224个氨基酸长的ORF3开放阅读框(open reading frame)的缺失(Li et al.,2013.PlosOne 8:e6997)表明了这种缺失可以阻碍病毒在体内的增殖和/或脱落，从而使病毒减毒。

根据本发明的PEDVdN通过产生根据本发明的具有重排基因顺序的突变的病毒而优选地减毒，如在WO2002/092827中针对FIPV的描述。例如，病毒基因组上的M和/或E基因的位置能够例如通过将M和/或E基因的开放阅读框置于ORF3基因的前面，优选在S基因的前面进行改变。为此，优选在插入了M和/或E基因的编码序列的ORF3基因的上游设计限制位点。该方法的原理详述于WO2002/092827中，其以参考的形式结合于本文中。用于引入限制位点和用于M和/或E基因的扩增的合适方法是已知的，例如，如在Green and Sambrook,mbrookdSambrook详述于病A Laboratory Manual”,CSHL Press,2012中的描述。优选的是所获得的构建体在通过转录载体失控转录物和PEDV基因组之间的RNA-RNA重组产生重组病毒之前，通过限制和/或序列分析进行确定。根据本发明的PEDVdN通过优选一个或多个不是指定聚合酶功能(ORF1a/1b)或结构蛋白N、M、E和S的基因内的缺失，优选ORF3基因的缺失，与重排的基因序列组合而进行优选地减毒，如WO2002/092827中对于FIPV的描述。

根据本发明的PEDVdN优选包含标记基因。所述标记基因包括但不限于荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶(beta-glucuronidase)、海肾荧光素酶(Renillaluciferase)和β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)。所述标记基因将允许识别被PEDVdN感染的细胞和/或动物(animal)。

根据本发明的包含刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的功能性失活的PEDVdN优选是活的感染性病毒。一般而言，通过活的减毒疫苗的免疫作用通常比通过死的或失活的疫苗更有效。例如，活的感染性病毒提供强的持久免疫应答，这以较少的剂量就能实现，且不需要佐剂，可以通过干扰素的产生而快速刺激非特异性的抗病毒保护，并使用病毒的致病形式相同的递送模式。然而，失活的PEDVdN在储存方面可以更稳定，并由于残余的致病特性而不可能引起疾病。

本发明进一步提供了包含根据本发明的PEDVdN的细胞。所述细胞优选用于病毒的繁殖。优选的细胞是真核细胞，优选能够使用本领域技术人员已知的标准方法容易感染的细胞。所述细胞优选是哺乳动物细胞。合适的细胞包括，例如，幼仓鼠肾细胞如BHK-21、人胚胎肾细胞如HEK293、VERO细胞(CCL-81^TM)、MDCK细胞、CHO细胞、Huh-7、Huh7.5(Sumpter 2005.J Virol 79:2689-2699)、HeLa和L细胞(CRL-2648^TM)。优选的细胞是VERO细胞和/或L-细胞。

PEDV在细胞培养物中的繁殖可能需要添加胰蛋白酶，据信其在病毒细胞进入和合胞体形成期间引发或激活用于膜融合的S蛋白(Hofmann and Wyler,1988.J ClinMicrobiol 26:2235-2239)。然而，据报道，细胞培养适应的菌株能够在不存在胰蛋白酶的情况下进行复制(Kweon et al.,1999.Vaccine 17:2546-2553)。

本发明还提供了根据本发明的产生PEDVdN的方法，包括向细胞提供编码PEDVdN的RNA分子。为此，优选使用的RNA重组系统，其中携带编码来自感染非猪动物的冠状病毒，例如来自小鼠肝炎病毒(MHV)的刺突蛋白的基因组序列的重组杂交PEDV病毒如所描述的进行构建(Li et al.,2013.PlosOne 8,e69996)。在第一阶段中，重组子代杂交PEDV病毒基于获得的在鼠细胞单层中形成斑块的能力而在非猪，例如，小鼠的细胞上进行选择。包含刺突蛋白的S1亚位的N-端结构域的功能性失活的重组子代PEDV病毒随后在第二阶段中基于其感染VERO细胞的能力和伴随丧失的感染鼠细胞的能力进行选择。

本发明进一步提供了包含根据本发明的PEDVdN和药物学和/或兽医学可接受的载体的组合物。所述药物学和/或兽医学可接受的载体可以包括维生素；糖如蔗糖、乳糖、D-甘露糖、D-果糖和/或葡萄糖；氨基酸如例如甘油(glycerin)和天冬酰胺；无机盐如例如碳酸氢钠、氢氧化铝、苄索氯铵、硫酸铵、硫酸镁、磷酸钾、磷酸钠、磷酸铝和硫酸铝钾；微晶纤维素，硬脂酸镁，乙酸邻苯二甲酸纤维素，人血清白蛋白，胎牛血清，柠檬酸，柠檬酸铁铵，蛋白胨，牛提取物和/或明胶。

根据本发明的组合物优选是免疫原性组合物，更优选是提供针对随后的野生型PEDV感染的保护的组合物。所述针对野生型病毒的保护的特征在于临床疾病的减少和/或宿主中野生型病毒的复制的减少。

失活的PEDVdN可以通过，通常使用热或化学品如甲醛或福尔马林杀死病毒而产生。失活病毒通常与本领域已知的佐剂和/或载体或其它赋形剂一起给药。如本文所定义的佐剂是加入免疫组合物中以增强个体对体液细胞水平的特定抗原的免疫应答的物质。优选的佐剂包括但不限于StimuneMontanides、MF-59、AS03、QS21、佐剂65、皂素、MDP、Syntex佐剂制剂单磷酰脂质A、佐剂、免疫刺激复合物(ISCOM)和细菌样颗粒(BLPs；van Braeckel-Budimir et al.,Frontiers inImmunology 4,Article 282,2013)。包含失活PEDVdN的免疫组合物优选进一步包含细胞因子如干扰素-γ(Interferon-gamma)，免疫刺激核酸序列如CpG寡核苷酸，脂质体，病毒样颗粒，表面活性剂如十六烷基胺，聚阴离子如吡喃和硫酸葡聚糖。

优选的佐剂是ISCOM，如国际专利申请WO2002026255A1中描述的。ISCOM技术对于其它佐剂具有多个优点。ISCOM同时刺激体液和细胞介导的免疫应答。ISCOM是一种高效的佐剂，能够进一步降低失活的或根据本发明的部分的量。优选的ISCOM是ISCOM Matrix-M。

另一种优选的佐剂是BLP。BLP是来源于失活的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)细菌的自身辅助疫苗递送载体(self-adjuvanting vaccine delivery vehicle)。乳酸乳球菌是通常用于食品工业例如用于生产奶酪和益生菌饮料中的安全细菌。通过简单的热酸处理就会产生BLP，产生主要由肽聚糖表面组成的强健细胞形状的基质。所述肽聚糖优选包含如WO 2010/033031中描述的乳酸乳球菌细胞壁水解酶AcmA的C-端肽聚糖结合结构域LysM。该表面诱导需要针对引起疾病的病原体的保护的长效免疫。BLP颗粒的非生命性质允许在没有传染风险的情况下的精确剂量。

BLP还提供了能够有效负载所选择的特定抗原，例如根据本发明的突变的PEDVdN的安全且通用的主链。BLP与抗原的完全负载通过使用如WO2010/033031中描述的非共价偶联技术而实现。该技术允许抗原融合物与BLP的简单混合，从而导致抗原与颗粒表面的稳健且快速的结合。获得的抗原覆盖的BLP优选通过鼻(喷雾)或口(胶囊)的粘膜层递送至哺乳动物如猪，而不需要进行注射。

本发明进一步提供了刺激猪体内免疫应答的方法，包括以有效诱导免疫应答的量向猪给药包含根据本发明的PEDVdN的组合物。包含失活或未失活的所述PEDVdN的药物组合物可以口服、肠胃外、通过吸入或通过其它途径给药。口服或优选口鼻给药可以以任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、片剂和水性悬浮液和溶液进行施用。在用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还会加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。

优选失活或未失活的PEDVdN，优选通过注射进行肠胃外给药。根据本发明的失活或未失活的病毒优选与常规的无毒药物学可接受的载体、佐剂或媒介物一起配制。如本文所用的术语肠胃外包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或输注技术。最优选的给药途径是皮下注射。作为佐剂包含BLP的失活PEDVdN优选通过鼻的粘膜层，例如通过使用喷雾，和/或口服，例如通过胶囊或通过使用喷雾剂，进行口鼻给药。

失活或未失活的PEDVdN优选是可注射制剂的形式，例如，可注射的水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂(如例如，Tween80)和悬浮剂进行配制。可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的可注射溶液或悬浮液，例如，作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂是甘露醇、水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油(固定油，fixed oil)通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的非挥发油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物都适用于制备注射剂，如天然药物学上可接受的油如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或如在Pharmacopoea Helvetica中描述的类似的醇。

给药于动物的本发明的疫苗病毒的量通常在每毫升(ml)1,000至1,000,000,000感染性病毒颗粒的范围内。感染性颗粒的量可以使用技术人员已知的标准技术，例如，剂量响应曲线确定。

本发明进一步提供了疫苗，优选区分感染动物和免疫动物(DIVA)疫苗，其包含含有根据本发明的PEDVdN的有效免疫量的组合物。所述疫苗提供了针对随后的野生型强毒性PEDV的感染的保护。保护定义为野生型病毒通过任何传播途径，包括水平和垂直传播的向前传播的降低。开始保护和持久保护的时间是疫苗功效的部分。此外，针对不同病毒种类或血清型的广泛保护也是根据本发明的疫苗的功效的部分。术语DIVA用于与区分诊断测试相结合的疫苗。该系统使得易感性动物群体的大规模接种而不损害恢复期动物的血清学鉴定成为可能。

据发现，被PEDV感染的动物引起针对刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的体液响应。因此，根据本发明的PEDVdN允许基于针对刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的体液响应的在接种和感染的动物之间进行区分。

相关的DIVA相关分析测定包括含有刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域或其相关部分的肽。所述分析测定优选是抗体酶联免疫吸附分析测定(ELISA)，其允许诊断猪的PEDV。优选的ELISA是夹心型ELISA。优选的ELISA是基于刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的竞争ELISA。所述DIVA相关的分析测定优选进一步包含识别刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的一种或多种抗体，如单克隆抗体或抗体样蛋白。

本文进一步考虑的是将感染PEDV的动物，优选猪与未感染的动物或用根据本发明的PEDVdN-基疫苗接种的动物进行区分的方法，包括如本文描述的在相关的DIVA相关分析测定中分析动物的血清。

作为替代或另外的，另一种DIVA相关方法是基于在感染的动物样品中，例如在血液样品或粪便样品中确定刺突S1亚单位的N-结构域或编码所述刺突S1亚单位的N-结构域的核苷酸序列的存在或不存在。

用于确定刺突S1亚单位的N结构域的存在或不存在的方法是已知的，包括抗体介导的检测方法，如酶联免疫吸附分析测定法(ELISA)。

用于确定编码所述刺突S1亚单位的N-结构域或其部分的核苷酸序列的存在或不存在的方法包括核酸分子的扩增，例如使用编码所述刺突S1亚单位的N-结构域或其部分的所述核苷酸序列侧翼的一组引物，通过聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增、核酸序列基扩增、转录介导的扩增和/或线性RNA扩增。扩增产物可以用放射性标记、抗体、发光染料、荧光染料或酶试剂直接染色或标记。直接DNA染色剂包括，例如嵌入染料，如绿(LifeTechnologies Corporation)、吖啶橙、溴化乙锭、单叠氮乙锭或Hoechst染料。引物组优选包括本领域技术人员已知的正向引物和反向引物，其是与侧接于待扩增区域的核酸序列互补的15-50个碱基优选16-30个碱基的单链寡核苷酸或寡核苷酸模拟物。正向引物和反向引物的序列决定扩增反应的特异性。优选的引物优选与靶核酸模板上的区域是约100％相同的，使得仅靶核酸模板中的两个引物之间的区域发生扩增。靶核酸模板上引物结合位点之间的距离将决定扩增产物的大小。

本发明进一步提供了用于预防或改善猪的猪流行性腹泻的方法，包括向猪给药优选配制为免疫原性组合物或疫苗的根据本发明的PEDVdN。

如本文所用的术语猪是指偶蹄类有蹄类动物(even-toed ungulate)的猪科(Suidae family)的动物。术语猪包括家猪及其祖先，常见的欧亚野猪(Sus scrofa)，巴拉望须猪，婆罗洲须猪，大嘴野猪(Heude’s pig)或越南疣猪，印度疣猪(Visayan wartypig)，苏拉威西岛疣猪(Celebes warty pig)，森林疣猪(Flores warty pig)，奥氏疣猪(Mindoro warty pig)，菲律宾疣猪，爪哇猪，东南亚疣猪和非洲疣猪。

在仔猪中，特别是在0-7天龄的仔猪中，对感染病毒产生抗体的能力较弱。主动适应性免疫必须在新生个体(neonate)中快速而合适地发育，因为胎儿从母亲经由胎盘转移初乳和母乳而获得的免疫保护不能赋予对母亲未暴露的抗原的保护。通常在仔猪中在1至2周龄的仔猪中会发育有效的免疫应答。约4周龄的小猪变得对入侵抗原，包括病毒如PEDV的完全响应。

因此，根据本发明的PEDVdN可以给药于猪，例如小猪。所述PEDVdN优选给药于怀孕母猪。特别是免疫球蛋白A由经免疫的母猪经胎盘转移初乳和母乳的被动转移将会有效地提供针对新生小猪中的入侵抗原，包括病毒如PEDV的保护。

附图说明

图1.PEDV-Sca_flag和PEDV-ScaΔN_flag病毒的刺突蛋白序列。

1A：Sca_flag蛋白序列。18个最N-端氨基酸以粗体显示，而S1亚单位的C-端部分的N-端氨基酸A-A-N-V-F为下划线，含Flag标记的序列以斜体显示。

1B：ScaΔNflag蛋白序列。18个最N-端氨基酸以粗体显示，而S1亚单位的C-端部分的N-端氨基酸A-A-N-V-F为下划线，含Flag标记的序列以斜体显示。

图2.PEDV-Sca_flag和PEDV-ScaΔN_flag病毒的刺突核苷酸序列。

2A：Sca_flag_核苷酸_序列。编码18个最N-端氨基酸的序列是粗体，而S1亚单位的C端部分的N-端氨基酸A-A-N-V-F为下划线，含Flag标记的序列以斜体显示。

2B：ScaΔN_flag_核苷酸_序列。编码18个最N-端氨基酸的序列是粗体，而S1亚单位的C端部分的N-端氨基酸A-A-N-V-F为下划线，含Flag标记的序列以斜体显示。

图3.包含刺突N-结构域缺失的部分PEDV-ScaΔN_flag病毒基因组的核苷酸序列。

PEDV-ScaΔca标记核苷酸序列。编码刺突蛋白的18个最N-末端氨基酸的序列以粗体显示，而S1亚单位的C-端部分的N-端氨基酸A-A-N-V-F的序列为下划线表示。

图4.刺突蛋白和N刺突蛋白的略图。指示了潜在的糖基化位点(Ψ)。

图5.携带缺乏N结构域的S的重组PEDV是可行的。

用GFP表达的重组PEDV-Sca_flag和PEDV-ScaΔN_flag病毒感染的细胞的荧光图像。

图6.携带缺乏N-结构域的S的重组PEDV是可行的。

PEDV-Sca_flag和PEDV-ScaΔN_flag病毒的对照生长曲线。Vero细胞用指定的病毒接种。在指定时间于培养基中测定接种的细胞培养物中产生50％的病理变化的组织培养感染剂量(TCID50)。

图7：PEDV-Sca_flag和PEDV-ScaΔN_flag重组病毒上的S蛋白的Western印迹分析。半纯化的病毒体进行Western印迹，并使用针对C-端附加的flag-标记的抗体通过ECL化学发光成像检测S蛋白。蛋白质分子量标记物的位置和大小(以kDa计)显示于左侧。

具体实施方式

实施例

实施例1

重组病毒的构建

PEDV-ScaΔN_flag病毒的转移载体是前文描述的PEDV-Sca_flag转移载体的衍生物，后者含有i)ORF1b和S基因之间的BamHI限制性位点，ii)编码绿色荧光蛋白作为ORF3基因的替换的基因，和iii)FLAG肽(DYKDDDDK)编码的基因片段作为S基因的C-端延伸(Li etal.,2013.PlosOne 8:e6997)。

具有缺少编码S-N-结构域的序列(残基19-233，图1，2，3和4)的S基因的PEDV-ScaΔN_flag转移载体是通过使用引物对8206和8207(分别为5'-GCTGCCAATGTATTTGCC-3'和5'-GCTAAGTGTTAGAAGTACTG-3')，使用PEDV-Sca_flag转移载体作为模板的内融合克隆而构建的。

PEDV-ScaΔN_flag病毒如Li等人(Li et al.,2013.PlosOne 8:e6997)和Wicht等人(Wicht et al.JVI 2014)的描述产生。病毒RNA在斑块选择后的2至3代，由PEDV-ScaΔN_flag病毒提取，而基因型使用引物5109(5'-GACGGCAACACCATGCATGCC-3')通过测序确认。

Vero细胞采用编码PEDV-Sca_flag和PEDV-ScaΔN_flag蛋白的表达质粒短暂转染48小时。细胞用胰蛋白酶或大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)处理1小时，并随后通过针对S蛋白的免疫染色进行检查。如图5中所示，PEDV-ScaΔN_flag蛋白具有在暴露于胰蛋白酶时介导细胞-细胞融合的能力。

实施例2

Vero细胞以0.1的MOI用其中ORF3基因已被GFP基因替代并携带Flag-标记的S蛋白(rPEDV-SDR13_Flag-dORF3/GFP)的重组菌株DR13基PEDV接种1小时(参见Li et al.,2013.PlosOne 8:e6997)。在病毒rPEDV-SDR13-dN_Flag-dORF3/GFP中，S蛋白的N-结构域已经缺失。

每12小时从培养基中取少量等分试样，并通过在Vero细胞上的这些样品中的病毒的滴定(TCID50)测定从细胞释放到培养基中的感染性。如图6所示，rPEDV-SDR13-dN_Flag-dORF3/GFP的生长曲线与rPEDV-SDR13_Flag-dORF3/GFP的生长曲线相当，并且两种病毒都生长至高滴度。

实施例3

物料和方法

Vero细胞以1的MOI用PEDV-Sca_flag和PEDV-ScaΔN_flag接种1小时。在感染后24小时，收集含病毒的细胞培养物上清液，并在4℃下通过100,000×g的HCN缓冲液(50mMHEPES，100mM NaCl，10mM CaCl2)中的20％蔗糖缓冲液(cushion of sucrose)沉淀而浓缩上清液中的病毒颗粒3小时。用来自模拟感染的Vero细胞(Mock)的培养基进行类似的纯化过程。病毒颗粒在冰上进行处理并再悬浮于HCN缓冲液中。将样品在分离凝胶中具有8％丙烯酰胺的不连续凝胶中进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。接着，将样品转移到聚偏二氟乙烯膜(BioRad，162-0176)并用牛血清封闭。使用以猪的抗兔免疫球蛋白G缀合的辣根过氧化物酶(Dako，P0217)作为第二抗体缀合至辣根过氧化物酶(Sigma，A8592)的小鼠单克隆抗-FLAG检测flag-标记的PEDV S蛋白。使用Amersham ECL Western印迹分析系统(GE healthcare，RPN2109)与X-Omat LS膜(Kodak，Sigma F1149)组合，通过化学发光放射自显影法显现蛋白条带。

结果

PEDV-Sca_flag和PEDV-ScaΔN_flag重组病毒的S蛋白使用识别C-端flag-标记的抗体，通过Western印迹法进行生物化学分析。结果表明，与PEDV-Sca_flag病毒的S蛋白相比，PEDV-ScaΔN_flag病毒的S蛋白的凝胶迁移率更快，这与刺突蛋白的大部分N-结构域的缺失是一致的。

Claims (14)

1.一种突变的猪流行性腹泻病毒(PEDVdN)，包含在对应于SEQ ID NO：1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域的区域内的三个或更多个氨基酸残基的缺失。

2.根据权利要求1所述的PEDVdN，其功能性地表达刺突蛋白的S1亚单位的C-端结构域。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的PEDVdN，其中所述缺失包含SEQ ID NO:1的具有氨基酸序列NKR的氨基酸残基194-196，或其他PEDV序列中的相应的氨基酸残基。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的PEDVdN，其中在对应于SEQ ID NO:1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域的区域内缺失所有氨基酸残基。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的PEDVdN，其中病毒基因组序列具有毒性PEDV。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的PEDVdN，其中所述病毒通过ORF3中的缺失，优选ORF3的缺失和/或通过重排的基因顺序减毒。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的PEDVdN，进一步包含标记基因。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的PEDVdN，其是活的感染性病毒。

9.一种包含权利要求1-8中任一项所述的PEDVdN的细胞。

10.一种制备权利要求1-8中任一项所述的PEDVdN的方法，包括向细胞提供编码所述PEDVdN的RNA分子。

11.一种包含权利要求1-8中任一项所述的PEDVdN和药物学和/或兽医学可接受的载体的组合物。

12.一种刺激猪的免疫应答的方法，包括以有效诱导免疫应答的量向所述猪给予权利要求11所述的组合物。

13.一种疫苗，优选DIVA疫苗，包含免疫有效量的权利要求11所述的组合物。

14.一种用于预防或改善猪的猪流行性腹泻的方法，包括向所述猪给予根据权利要求1-8中任一项所述的PEDVdN，优选其中所述猪是怀孕母猪。