CN106754826B - 活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及活性提高的α‑淀粉酶AmyL突变体及其编码基因和应用。突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的经过改良的α‑淀粉酶菌株在180小时的发酵酶活达到36900U/mL，比改造前的α‑淀粉酶生产菌提高41.5％。因此，本发明的突变α‑淀粉酶BsaAmy6及重组工程菌，大大降低了发酵生产成本，为其进一步工业化应用奠定基础。

Description

活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体及其编码基因和应用。

背景技术

α-淀粉酶，系统名称为1,4-α-D-葡聚糖水解酶，别名为液化型淀粉酶、液化酶、α-1，4-糊精酶。α-淀粉酶是一种内切水解酶，其主要作用是催化淀粉的1,4-α-D-葡聚糖生成还原性糊精和糖类，在淀粉、清洁剂、饮料和纺织等领域具有重要作用。

由于从自然界筛选得到的野生菌产的α-淀粉酶的活力一般都比较低，不能直接运用于工业化的发酵生产。现有技术一般是通过对野生菌株进行诱变、杂交育种等技术手段来提高菌株的产酶能力。随着分子生物学的迅速发展，基因工程育种技术越来越受到国内外研究者的青睐。

好盐芽孢杆菌Bacillus salsusα-淀粉酶AmyL是一种中温淀粉酶，本课题组通过一系列应用评价实验发现AmyL在许多工业领域具有应用潜力。在造纸工业中，α-淀粉酶AmyL可以很好的改良纸张涂层淀粉的黏度和浓度，提高纸张的质量。饲料工业中，α-淀粉酶AmyL可以帮助幼龄动物消化利用淀粉，对其生长性能与饲料转化率十分有益。虽然α-淀粉酶AmyL具有很大的应用潜力，但目前α-淀粉酶AmyL的生产活力低，发酵成本高。为了使好盐芽孢杆菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL广泛应用到众多工业领域中，提高其比活力及表达水平，降低生产成本是急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是通过对来源于好盐芽孢杆菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL进行分子改造，改造后的α-淀粉酶具有更高的比活，降低生产成本，符合工业化大生产的要求。

本发明的目的是提供活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体。

本发明的再一目的是提供编码上述α-淀粉酶AmyL突变体的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述的活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述的活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体基因的重组菌株。

好盐芽孢杆菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明采用易错PCR及定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶AmyL进行分子改造，经过高通量筛选得到高比活α-淀粉酶BsaAmy6，本发明的高比活α-淀粉酶BsaAmy6和原有的Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL相比，有7个氨基酸的差异，突变位点由+18N,+39S,+159Y,+220T,+281N,+363S,+474Y突变成+18D,+39N,+159D,+220K,+281D,+363C,+474K。突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本发明还提供了上述突变α-淀粉酶BsaAmy6的基因序列，其碱基序列如SEQ IDNO.3所示：

本发明还提供了包含上述活性提高α-淀粉酶的重组载体，将本发明的活性提高α-淀粉酶基因BsaAmy6连接到酵母表达载体pPICzαA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-BsaAmy6。

本发明还提供了包含上述活性提高α-淀粉酶基因BsaAmy6的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。

本发明还提供了表达上述活性提高的α-淀粉酶基因BsaAmy6的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)重组菌株进行发酵，诱导重组α-淀粉酶的表达；

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的α-淀粉酶BsaAmy6。

具体地，将重组表达质粒pPICzαA-BsaAmy6线性化后，转化到毕赤酵母X33中，用高浓度的抗生素平板筛选转化子，将筛选到的转化子，首先在摇瓶培养条件下进行比较分析。将摇瓶培养筛选出来的的高酶活转化子，再在50L的发酵罐中进行发酵，发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行α-淀粉酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到36900U/mL，比出发菌的酶活提高41.5％，实现了重组α-淀粉酶BsaAmy6的高效表达。

本发明通过结合易错PCR技术和高通量筛选技术对好盐芽孢杆菌Bacillussalsus的α-淀粉酶AmyL进行分子改造。含有突变基因BsaAmy6的重组工程菌在50L发酵罐培养条件下的平均发酵酶活为36900U/mL，突变后的α-淀粉酶BsaAmy6的发酵酶活比AmyL提高41.5％。因此，本发明的突变α-淀粉酶BsaAmy6及重组工程菌，大大降低了发酵生产成本，使其在众多工业领域中显示出巨大的应用潜力。

附图说明

图1为α-淀粉酶AmyL和其突变体BsaAmy6的酵母菌株在50升发酵罐中酶活比较图。

图2突变体BsaAmy6和原始AmyL的最适反应pH

图3突变体BsaAmy6和原始AmyL的pH稳定性

图4突变体BsaAmy6和原始AmyL的最适反应温度

图5突变体BsaAmy6和原始AmyL的热稳定性

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzαA，pGAPzαA,Zeocin购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

PCR酶，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB，配方为：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0。LBZ为LB培养基加25ug/mL Zeocin。

酵母培养基为YPD，配方为1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。酵母筛选培养基为YPDZ，配方为：YPD+100mg/L zeocin。

酵母诱导培养基BMGY，配方为1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))，BMMY，除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同。

重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35毫升PTM1。

PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。

实施例1、好盐芽孢杆菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL基因合成及克隆

将已公布的好盐芽孢杆菌Bacillus salsusα-淀粉酶AmyL氨基酸序列(Genebank：SDP85898)，根据毕赤酵母密码子优化后进行合成。

根据合成的基因分别在5’端和3’端设计PCR引物含EcoRI和NotI酶切酶位点，起引物序列如下：

5’端引物amyl-F1：5'-GTAGAATTC ATGAGACAGGTTAGAATTGCTTTTG-3'

3’端引物amyl-R1：5'-ACTGCGGCCGCTTATTTTTGTACATAAACTGAAACT-3'

以合成基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pGAPzαA上，得到重组载体pGAPzαA-AMYL。

实施例2、基因易错PCR随机突变

以上述pGAPzαA-AMYL为模板，进行易错PCR随机突变扩增，具体地扩增方法是：

第一轮扩增：以载体启动子引物amyl-F1和amyl-R1为引物进行PCR扩增，反应体系如下：

反应程序如下：

回收第一轮PCR产物，去1uL稀释50-100倍用作第二轮PCR的模板。第二轮易错PCR同样以特异性引物amyl-F1及amyl-R1进行PCR反应。

取第二轮的产物用EcoRI和NotI进行双酶切，连接至pGAPzαA载体上的。连接产物转化毕赤酵母X33，在YPDZ琼脂糖平板培养筛选突变菌株。

实施例3、高通量筛选高酶活突变菌株

从实施例2易错PCR平板上挑取突变单菌落，将重组转化子用牙签逐个挑至24孔板，每个孔中加入1mL含有YPD培养基，30℃，220rpm培养48左右，离心取上清。将上述上清液分别取出200μL至96孔板，进行α-淀粉酶酶活测定。α-淀粉酶酶活检测参照中华人民共和国国家标准《GB/T 24401-2009》进行测定。将酶活提高的8个阳性突变克隆，逐一提取基因组DNA，进行目的基因PCR扩增，确定突变位点。

测序结果确定氨基酸突变位点，克隆1的突变位点为+18N替换为+18D；克隆2的突变位点为+39S替换为+39N；克隆3的突变点为+141G替换为+141K；克隆4的突变点为+159Y替换为+159D；克隆5的突变点为+220T替换为+220K；克隆6的突变点为+363S替换为+363C；克隆7的突变点为+474Y替换为+474K。通过定点突变将这些突变位点一一进行结合，通过筛选最终得到一条高比活的α-淀粉酶突变基因BsaAmy6。本发明的高比活α-淀粉酶BsaAmy6和原有的Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL相比，有7个氨基酸的差异，突变位点由+18N,+39S,+159Y,+220T,+281N,+363S,+474Y突变成+18D,+39N,+159D,+220K,+281D,+363C,+474K。

实施例4、α-淀粉酶BsaAmy6表达载体的构建及工程菌株的筛选

用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切纯化含有BsaAmy6基因的DNA片段，连接到pPICzaA载体得到表达载体pPICzaA-BsaAmy6。将表达载体pPICzaA-BsaAmy6线性化，电击转入酵母X33，将转化产物分别涂布固体培养平板，30℃培养2-3d。

实施例6、摇瓶及50L发酵罐培养

将平板上的酵母转化子，接种于含有50mL BMGY培养基的500mL三角瓶中，30℃，250r/min振荡过夜培养至OD600达到2～6。离心收集菌体，再将其重悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD600为1.0，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度为0.75％进行诱导表达，同时测定酶活。

将摇瓶培养筛选出来的重组工程菌，接种于100mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20h。以1：50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD600＝5，用以接种发酵罐。国产50L发酵罐，加入20L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至5.0，加入PTMl(4.35mL/L)，接入种子菌(1：10)。发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm之间以维持溶氧20％以上。

发酵分为三个阶段：生长期，从加入种子菌，培养约16-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；之后进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTMl，1 2mL/L)，补料速度为18mL/L·h，持续4-6h；最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTMl，12mL/L)，流速从1mL/L·h经15h线性升至4mL/L·h，持续120h。

发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行α-淀粉酶活性检测。含有突变基因BsaAmy6的重组工程菌在50L发酵罐培养条件下的平均发酵酶活为36900U/mL，突变后的α-淀粉酶BsaAmy6的发酵酶活比AmyL提高41.5％，发酵过程曲线如图1所示。

实施例7、突变体BsaAmy6和原始AmyL的最适反应pH和pH稳定性

参照国标方法测定原始AmyL及α-淀粉酶突变体BsaAmy6的最适反应pH。原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突变体BsaAmy6的最适pH如图2所示。由图2可知，突变体BsaAmy6的最适pH并没有发生太大变化，几乎和原始α-淀粉酶一样。

将原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突变体BsaAmy6分别在pH4-8条件下室温处理3小时，然后参照国标的方法测定酶活。原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突变体BsaAmy6的pH稳定性如图3所示。由图3可知，相对于原始α-淀粉酶AmyL，突变体BsaAmy6在酸性条件下的稳定性更好。在pH4和5条件下突变体BsaAmy6的剩余酶活分别为95％和98％，原始α-淀粉酶AmyL则分别为81％和87％。

实施例8、突变体BsaAmy6和原始AmyL的最适反应温度和热稳定性

参照国标方法测定原始AmyL及α-淀粉酶突变体BsaAmy6的最适反应温度。原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突变体BsaAmy6的最适反应温度如图4所示。由图4可知，突变体BsaAmy6的最适反应温度为65℃，原始AmyL的最适反应温度为60℃。

将原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突变体BsaAmy6分别在50℃-90℃条件下水浴处理30分钟，然后参照国标的方法测定酶活。原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突变体BsaAmy6的热稳定性如图5所示。由图5可知，突变体BsaAmy6的热稳定性要好于原始α-淀粉酶AmyL。在80℃和90℃条件下水浴处理30分钟后，突变体BsaAmy6的剩余酶活为80％和70％，而α-淀粉酶AmyL的剩余酶活为50％和40％。

<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司

<120> 活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体及其编码基因和应用

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<211> 486

<212> PRT

<213> 盐地咸海鲜芽胞杆菌

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STPNNGTLMQ YFEWYLPNDG AHWQRLHNDA GNLANKGISA VWIPPAYKGT SQNDVGYGAY 60

DLYDLGEFNQ KGTIRTKYGT KAQLKSAISA LQSQNINVYG DVVMNHKGGA DFTQPVTVVQ 120

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HDYLGEWVSH VRSQTGKNLF TVAEYWQNDI NALNNYLAKT NYNHSIFDAP LHYNFHYASN 300

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 盐地咸海鲜芽胞杆菌

<400> 3

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Claims (7)

1.一种活性提高的α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的α-淀粉酶的发生以下突变而得，第18位N,第39位S,第159位Y,第220位T,第281位N,第363位S，以及第474位Y突变成第18位D,第39位N,第159位D,第220位K,第281位D,第363位C,以及第474位K。

2.一种活性提高的α-淀粉酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的活性提高的α-淀粉酶突变体。

3.如权利要求2所述的活性提高的α-淀粉酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种提高α-淀粉酶酶活的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶的第18位用D替代N，第39位用N替代S，第159位用D替代Y，第220位用K替代T，第281位用D替代N，第363位用C替代S,以及第474位用K替代Y。

5.包含权利要求2或3所述的活性提高的α-淀粉酶突变体基因的重组载体。

6.包含权利要求2或3所述的活性提高的α-淀粉酶突变体基因的重组菌株。

7.一种制备权利要求1所述活性提高的α-淀粉酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求5所述的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)重组菌株进行发酵，诱导重组α-淀粉酶的表达；

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的α-淀粉酶突变体。