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CN106662591B - 定量肽或蛋白质分析 - Google Patents

定量肽或蛋白质分析 Download PDF

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CN106662591B CN201580030382.5A CN201580030382A CN106662591B CN 106662591 B CN106662591 B CN 106662591B CN 201580030382 A CN201580030382 A CN 201580030382A CN 106662591 B CN106662591 B CN 106662591B
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S.侯
E.拉加
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Abstract

本发明根据基于浴铜灵的组合物复合物，如浴铜灵二磺酸二钠盐水合物复合物，提供尤其适用于质谱分析的肽和/或蛋白质定量方法、套组和组合物。所述方法是使用较小样品体积的单步快速吸光度方法。其产生具有高信背比的稳固信号并且精确定量具有低可变性和高灵敏度的甚至复杂的肽混合物。

Description

定量肽或蛋白质分析
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年6月11日申请的美国临时专利申请第62/010,594号的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
适用于在分析之前通过质谱分析(MS)和其它类型的分析测定小体积样品的浓度的肽和/或蛋白质分析方法、组合物以及套组。
背景技术
质谱分析(MS)是用于在多个样品之间进行数千种蛋白质的同时鉴别和相对定量的灵敏方法。MS仪器的持续进展不断推动科学界能够在极大程度上表征复杂的生物学 系统中的蛋白质动力学。尽管MS功能，在无显著预注入特征化或标准化的情况下分析 大多数MS样品，因为当前监测和测量蛋白质的方法，如UV吸收或二喹啉甲酸(BCA) 分析在无肽的情况下效果较差，消耗过多的有价值的样品，并且不具有所需灵敏度。此 样品特征化和标准化缺乏导致MS实验标准化和再现性的困难和显著的低生产率仪器时 间。
可商购的比色蛋白质和肽溶液定量方法包括缩二脲(Gornall等人《生物化学杂志(J. Biol.Chem.)》177(1949)751)、Lowry(Lowry等人《生物化学杂志》193(1951)265、 二喹啉甲酸(BCA)(Smith等人《分析生物化学(Anal.Biochem.)》150(1985)76)、考 马斯蓝G-250染料结合(Bradford,《分析生物化学》72(1976)248)以及胶态金(Stoscheck, 《分析生物化学》160(1987)301)。
缩二脲方法是基于形成与铜离子的复合物的蛋白质。肽氮在碱性条件下与铜(II)离子结合，产生紫色颜色。产物的吸收最大值是550nm。灵敏度是1mg蛋白质/ml到6 mg蛋白质/ml。缩二脲方法是相比于比色蛋白质测定的其它商购方法相对不灵敏的蛋白 质测定方法。
另一方法组合缩二脲反应和铜(1)-浴铜灵螯合反应(通过与铜-浴铜灵螯合反应组 合的逆缩二脲方法测定蛋白质。《临床化学学报(Clinica Chimica Acta.)》,216(1993)103-111)。在此方法中，样品蛋白质在第一步骤期间形成Cu2+-蛋白质螯合复合物(缩二 脲反应)。通过抗坏血酸将过量Cu2+还原成Cu+，使得Cu+在第二步骤期间形成Cu+-浴铜 灵螯合复合物。所形成的Cu+-浴铜灵螯合复合物的量与蛋白质浓度成反比。此为使用浴 铜灵螯合剂测定蛋白质浓度的阴性或间接分析。
劳里法(Lowry method)是经修改的缩二脲反应。其在两个步骤中进行：首先，肽键在碱性条件下与铜(II)离子反应，接着通过芳香族氨基酸的铜催化氧化使福林-乔卡 梯奥磷钼酸-磷钨酸还原成杂多钼蓝。产物的吸收最大值是750nm。劳里法比缩二脲方 法更灵敏，对于牛血清白蛋白(BSA)，线性灵敏度为0.1mg蛋白质/ml到1.5mg蛋白 质/ml。某些氨基酸、清洁剂、脂质、糖和核酸干扰反应。反应是pH依赖性的并且pH 应保持在pH 10与pH 10.5之间。
BCA方法与劳里法有关，因为蛋白质中的肽键首先还原铜离子(Cu2+)以在碱性介质中产生四齿亚铜离子(Cu1+)复合物。接着使亚铜离子复合物与BCA(每个Cu1+2个 分子BCA)反应以形成可以在562nm处测量到的深紫色。下文显示BCA-铜反应：
Figure BDA0001173155740000021
因为BCA在碱性介质中是稳定的，所以相比于劳里法中所需的两个步骤，BCA方 法可以在一个步骤中进行。BCA方法较佳包容相比于劳里法的样品中的潜在抑制性或干 扰化合物。举例来说，相比于可以存在并且不会干扰劳里法的仅1％SDS、0.03％Triton X-100和0.062％Tween-20，至多5％的十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X-100和Tween-20 中的每一个可以存在并且不会干扰BCA方法。相比于劳里法，BCA方法也提高灵敏度 和扩展的线性工作范围。
MICRO BCATM蛋白质分析套组(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))准许 通过使用较大样品体积定量稀样品溶液(0.5μg/ml到20μg/ml)以获得更高灵敏度。尽管灵敏度提高，样品体积要求限制或预防其定量多种肽样品的用途。
定量肽的经修改的BCA分析(Kapoor等人《分析型生物化学(AnalyticalBiochemistry)》,393(2009)138-140)确认测量肽浓度的困难，因为高肽间变化，主要 因为肽疏水性。通过在95℃下在SDS存在下处理五分钟，之后与BCA工作试剂一起孵 育来使肽变性，经修改的BCA方法评估肽浓度。然而，低于500μg/ml的数据极接近噪 声水平并且因此为不可靠的。
美国专利第4,839,295号公开使用二喹啉甲酸作为检测蛋白质的螯合剂，测量在562 nm处的吸光度。
胶态金方法是比色蛋白质测定方法中最灵敏的方法。其灵敏度是约2μg/ml到20 μg/ml蛋白质。然而，存在显著的蛋白质到蛋白质变化。与胶态金结合的蛋白质造成与 溶液中蛋白质的量成正比的胶态金吸光度转变。除硫醇和十二烷基硫酸钠(SDS)外最 常见的试剂与胶态金方法相容。
考马斯蓝G-250染料结合方法是基于当考马斯蓝G-250结合酸性介质中的蛋白质时 发生的470nm到595nm的即时吸光度转变。显色快速并且分析可以在十分钟内进行。 考马斯蓝G-250染料结合方法通过除清洁剂外的常见试剂相对无干扰。存在适度蛋白质 到蛋白质变化并且方法不会与肽一起良好作用。
总蛋白质分析(Sozgen等人,Talanta,68(2006)1601-1609在碱性介质中利用铜(II) 新亚铜试剂的分光光度总蛋白质分析)在具有氢氧化物-碳酸盐-酒石酸盐溶液的碱性介 质中使用铜(II)新亚铜试剂(Nc)试剂，其中新亚铜试剂作为螯合剂。在40℃下培育30分钟之后，在450nm处相对于试剂空白读取Cu(I)-Nc复合物的还原产物的吸光度。 此分析具有有限的灵敏度，因为碱性水溶液中的新亚铜试剂的有限溶解度。
美国专利第5,693,291号公开定量蛋白质方法。所述方法是间接两步法。其使用两种试剂：试剂A(酒石酸盐溶液和硫酸铜)和试剂B(还原剂，例如抗坏血酸和浴铜灵 螯合剂)。试剂A含有0.7到2mmol/l Cu2+离子和2到4mmol/l含酒石酸盐的碱性溶液。 试剂B含有1到1.5mmol/l抗坏血酸和0.5到0.8mmol/l浴铜灵。试剂A与试剂B的比 例是1:8到1:12，即，1份试剂A与8-12份试剂B。试剂A和试剂B的组合体积在750 μl与3000μl之间，其相对较大。方法的步骤一混合100μl试剂A与50μl样品，继而 在室温下培育5分钟到60分钟。方法的步骤二将1ml试剂B添加到步骤一混合物中， 继而简单混合并且在485nm处读取。此阴性或间接分析通过浴铜灵螯合样品之前与之 后的吸光度差异对蛋白质进行定量。因此，与直接定量蛋白质的阳性或直接分析相比不 太准确。其也使用较大的标准蛋白质体积比试剂(体积标准蛋白质比试剂A是1:1.6到 1:2.4)。
本文所提供的方法克服此类缺点并且提供额外益处。
发明内容
本文所提供的方法的一种非限制性用途为用于肽或肽混合物的MS定量。根据本发明的方法使用较小样品体积并且产生相比于其它方法信噪比(S/N)较高的稳固信号。 本文中提供的方法精确定量复杂的肽样品，如通过变化率较低的蛋白质、细胞裂解物、 血浆或血清样品的胰蛋白酶消化产生的那些。
本文所提供的一个实施例为用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述方 法包含
(a)将样品与包含复合物的定量分析试剂组合物组合以形成混合物，其中复合物包 含以下通式：
Figure BDA0001173155740000041
其中
R1和R2中的每一个独立地是烷基，包括(但不限于)C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、 丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3和R4中的每一个独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)、钾(K+) 或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的膦酸根(-PO3 -) 盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；以及
R5和R6中的每一个是
Figure BDA0001173155740000042
其中R7独立地选自由以下组成的群组：氢(H)； 钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+) 的膦酸根(-PO3 -)盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；
其限制条件为R3、R4和R7中的至少一个不为H；
(b)在足以形成彩色复合物的条件下培育混合物；以及
(c)在450nm到500nm处测量彩色复合物的吸光度作为样品中的肽或蛋白质浓度的直接指示物。
所述方法可以进一步包含在(c)之后通过比较直接测量到的吸光度与含有已知浓度 的标准物的至少一种样品的吸光度来测定样品中的肽或蛋白质浓度。样品可以是生物样 品。样品可以是血浆或血清。标准物可以是肽、肽混合物或蛋白质消化物。所述方法可以在样品的质谱分析之前进行。(a)中的试剂组合物可以进一步包含酒石酸盐和硫酸铜。(b)中的培育温度可以在室温到约45℃或约19℃到约22℃范围内，或可以是约37℃或可以是约45℃。所述样品可以是多种肽。样品体积可以是约5μl，可以不超过约200μl，可以在 约5μl到约20μl，约10μl到约20μl，或约15μl到约20μl范围内。吸光度可以通过自 动化微量培养板读取器测定。标准物可以是已知浓度的肽、肽混合物或肽消化物。样品可 以在溶剂中，所述溶剂为水性溶剂、有机溶剂或水性并且有机溶剂。所述方法可以进一步 包含在(c)之后通过质谱分析来分析肽。分析组分可以含有有机溶剂或清洁剂中的至少 一种以改进肽或蛋白质溶解度。在一个实施例中，试剂组合物是具有约50％乙腈的浴铜 灵二磺酸二钠盐水合物。吸光度可以在约480nm处读取。
本文所提供的另一个实施例为用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述 方法包含：
(a)将样品与定量分析试剂组合物组合，所述组合物包含
具有50％乙腈的复合物以形成混合物，其中所述复合物包含以下通式：
Figure BDA0001173155740000051
其中
R1和R2中的每一个独立地是烷基，包括(但不限于)C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、 丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3和R4中的每一个独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)、钾(K+) 或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的膦酸根(-PO3 -) 盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；以及
R5和R6中的每一个是
Figure BDA0001173155740000052
其中R7独立地选自由以下组成的群组：氢(H)；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+) 的膦酸根(-PO3 -)盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；
其限制条件为R3、R4和R7中的至少一个不为H；
(b)在足以形成彩色复合物的条件下培育混合物；以及
(c)在450nm到500nm处测量彩色复合物的吸光度作为样品中的肽或蛋白质浓度的直接指示物。
所述方法可以进一步包含在(c)之后通过比较直接测量到的吸光度与含有已知浓度的标准物的至少一种样品的吸光度来测定样品中的肽或蛋白质浓度。标准物可以是 肽、肽混合物或蛋白质消化物。所述方法可以在样品的质谱分析之前进行。
(a)中的试剂组合物可以进一步包含酒石酸盐和硫酸铜。(b)中的培育温度可以在室温到约45℃或约19℃到约22℃范围内，或可以是约37℃或可以是约45℃。所述样品 体积可以在约5μl到约20μl范围内。所述样品可以是多种肽。所述样品体积可以是约 5μl，或可以在约10μl到约20μl或约15μl到约20μl范围内，或可以不超过约200μl。 吸光度可以通过自动化微量培养板读取器测定。标准物可以是已知浓度的肽、肽混合物 或肽消化物。在所述方法中，在(c)之后，可以通过质谱分析来分析肽。在一个实施 例中，试剂组合物是浴铜灵二磺酸二钠盐水合物。吸光度可以在约480nm处读取。样 品可以是生物样品。样品可以是血清或血浆样品。
本文所提供的另一个实施例为肽定量试剂组合物，其包含至少一种赋形剂和
(a)浓度在约0.04M到约0.1M范围内的复合物，其中所述复合物包含以下通式：
Figure BDA0001173155740000061
其中
R1和R2中的每一个独立地是烷基，包括(但不限于)C1-C6直链或支链烷基，或 R1和R2中的每一个独立地是烷基，包括(但不限于)C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、 丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3和R4中的每一个独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)、钾(K+) 或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的膦酸根(-PO3 -) 盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；以及
R5和R6中的每一个是
Figure BDA0001173155740000071
其中R7独立地选自由以下组成的群组：氢(H)； 钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+) 的膦酸根(-PO3 -)盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；
其限制条件为R3、R4和R7中的至少一个不为H；
(b)浓度在约5.7mM到约22.7mM范围内的酒石酸盐，以及
(c)浓度在约0.25mM到约0.5mM范围内的硫酸铜，
产生肽定量试剂组合物。
本文所提供的另一个实施例为肽定量试剂组合物，其包含至少一种赋形剂和
(a)浓度在约0.04M到约0.1M范围内的50％乙腈中的复合物，其中所述复合物包含以下通式：
Figure BDA0001173155740000072
其中
R1和R2中的每一个独立地是烷基，包括(但不限于)C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、 丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3和R4中的每一个独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)、钾(K+) 或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的膦酸根(-PO3 -) 盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；以及
R5和R6中的每一个是
Figure BDA0001173155740000073
其中R7独立地选自由以下组成的群组：氢(H)； 钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+) 的膦酸根(-PO3 -)盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；
其限制条件为R3、R4和R7中的至少一个不为H；
(b)浓度在约5.7mM到约22.7mM范围内的酒石酸盐，以及
(c)浓度在约0.25mM到约0.5mM范围内的硫酸铜，
产生肽定量试剂组合物。
本文所提供的另一个实施例为肽定量试剂套组，其包含使用所述套组进行肽的质谱 分析定量的说明书，并且试剂包含
(a)包含以下通式的复合物：
Figure BDA0001173155740000081
其中
R1和R2中的每一个独立地是烷基，包括(但不限于)C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、 丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3和R4中的每一个独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)、钾(K+) 或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的膦酸根(-PO3 -) 盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；以及
R5和R6中的每一个是
Figure BDA0001173155740000082
其中R7独立地选自由以下组成的群组：氢(H)； 钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+) 的膦酸根(-PO3 -)盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；
其限制条件为R3、R4和R7中的至少一个不为H；
(b)酒石酸盐，以及
(c)硫酸铜，
所述组合物的pH在约pH 12到约pH 13范围内。
本文所提供的另一个实施例为肽定量试剂套组，其包含使用所述套组进行肽的质谱 分析定量的说明书，并且试剂包含
(a)50％乙腈中的复合物，其中所述复合物含有以下通式：
Figure BDA0001173155740000091
其中
R1和R2中的每一个独立地是烷基，包括(但不限于)C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、 丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3和R4中的每一个独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)、钾(K+) 或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的膦酸根(-PO3 -) 盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；以及
R5和R6中的每一个是
Figure BDA0001173155740000092
其中R7独立地选自由以下组成的群组：氢(H)； 钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+) 的膦酸根(-PO3 -)盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；
其限制条件为R3、R4和R7中的至少一个不为H；
(b)酒石酸盐，以及
(c)硫酸铜，
所述组合物的pH在约pH 12到约pH 13范围内。
本文所提供的另一个实施例为用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述 方法包含：
(a)将样品与包含复合物的定量分析试剂组合物组合以形成混合物，其中所述复合 物是
Figure BDA0001173155740000093
(b)在足以形成彩色复合物的条件下培育混合物；以及
(c)在450nm到500nm处测量彩色复合物的吸光度作为样品中的肽或蛋白质浓度的直接指示物。
所述方法可以进一步包含在(c)之后通过比较直接测量到的吸光度与含有已知浓度 的标准物的至少一种样品的吸光度来测定样品中的肽或蛋白质浓度。样品可以是生物样 品。样品可以是血浆或血清。标准物可以是肽、肽混合物或蛋白质消化物。所述方法可以在样品的质谱分析之前进行。(a)中的试剂组合物可以进一步包含酒石酸盐和硫酸铜。(b)中的培育温度可以在室温到约45℃或约19℃到约22℃范围内，或可以是约37℃或可以是约45℃。所述样品可以是多种肽。样品体积可以是约5μl，可以不超过约200μl，可以在 约5μl到约20μl，约10μl到约20μl，或约15μl到约20μl范围内。吸光度可以通过自 动化微量培养板读取器测定。标准物可以是已知浓度的肽、肽混合物或肽消化物。样品可 以在溶剂中，所述溶剂为水性溶剂、有机溶剂或水性并且有机溶剂。所述方法可以进一步 包含在(c)之后通过质谱分析来分析肽。分析组分可以含有有机溶剂或清洁剂中的至少 一种以改进肽或蛋白质溶解度。在一个实施例中，试剂组合物是具有约50％乙腈的浴铜 灵二磺酸二钠盐水合物。吸光度可以在约480nm处读取。
本文所提供的另一个实施例为用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述 方法包含：
(a)将样品与定量分析试剂组合物组合，所述组合物包含
具有50％乙腈的复合物以形成混合物，其中所述复合物含有
Figure BDA0001173155740000101
(b)在足以形成彩色复合物的条件下培育混合物；以及
(c)在450nm到500nm处测量彩色复合物的吸光度作为样品中的肽或蛋白质浓度的直接指示物。
所述方法可以进一步包含在(c)之后通过比较直接测量到的吸光度与含有已知浓度的标准物的至少一种样品的吸光度来测定样品中的肽或蛋白质浓度。标准物可以是 肽、肽混合物或蛋白质消化物。所述方法可以在样品的质谱分析之前进行。
(a)中的试剂组合物可以进一步包含酒石酸盐和硫酸铜。(b)中的培育温度可以在室温到约45℃或约19℃到约22℃范围内，或可以是约37℃或可以是约45℃。所述样品 体积可以在约5μl到约20μl范围内。所述样品可以是多种肽。所述样品体积可以是约 5μl，或可以在约10μl到约20μl或约15μl到约20μl范围内，或可以不超过约200μl。 吸光度可以通过自动化微量培养板读取器测定。标准物可以是已知浓度的肽、肽混合物 或肽消化物。在所述方法中，在(c)之后，可以通过质谱分析来分析肽。在一个实施 例中，试剂组合物是浴铜灵二磺酸二钠盐水合物。吸光度可以在约480nm处读取。样 品可以是生物样品。样品可以是血清或血浆样品。
本文所提供的另一个实施例为肽定量试剂组合物，其包含至少一种赋形剂和
(a)浓度在约0.04M到约0.1M范围内的复合物，其中所述复合物含有
Figure BDA0001173155740000111
(b)浓度在约5.7mM到约22.7mM范围内的酒石酸盐，以及
(c)浓度在约0.25mM到约0.5mM范围内的硫酸铜，
产生肽定量试剂组合物。
本文所提供的另一个实施例为肽定量试剂组合物，其包含至少一种赋形剂和
(a)浓度在约0.04M到约0.1M范围内的50％乙腈中的复合物，其中所述复合物含有
Figure BDA0001173155740000112
(b)浓度在约5.7mM到约22.7mM范围内的酒石酸盐，以及
(c)浓度在约0.25mM到约0.5mM范围内的硫酸铜，
产生肽定量试剂组合物。
本文所提供的另一个实施例为肽定量试剂套组，其包含使用所述套组进行肽的质谱 分析定量的说明书，并且试剂包含
(a)复合物，其含有
Figure BDA0001173155740000121
(b)酒石酸盐，以及
(c)硫酸铜，
所述组合物的pH在约pH 12到约pH 13范围内。
本文所提供的另一个实施例为肽定量试剂套组，其包含使用所述套组进行肽的质谱 分析定量的说明书，并且试剂包含
(a)50％乙腈中的复合物，其中所述复合物含有
Figure BDA0001173155740000122
(b)酒石酸盐，以及
(c)硫酸铜，
所述组合物的pH在约pH 12到约pH 13范围内。
这些和其它实施例将进一步描述如下。
附图说明
图1显示相比于商购MICRO BCATM方法，使用本文所提供的根据某些实施例的方 法的肽定量。
图2显示相比于商购MICRO BCATM方法，使用本文所提供的根据某些实施例的方 法的消化定量。
图3显示相比于商购MICRO BCATM方法，使用本文所提供的根据某些实施例的方 法的另一肽定量。
图4显示使用本文中提供的方法的实施例的肽定量和变化。
图5A-B显示使用本文中提供的方法的其它实施例的肽定量和变化。
图6A-B显示在BSA消化物和HeLa消化物的情况下使用本文中提供的方法的一个实施例的不同乙腈浓度的作用。
图7A-B显示使用本文中提供的方法的某些实施例测量肽浓度的乙腈的作用。
图8显示使用本文中提供的方法的实施例和基于荧光胺的分析的肽定量。
图9A-B比较使用本文中提供的方法的实施例和间接两步法的肽定量(Matsushita等人,通过与铜-浴铜灵螯合反应组合的逆缩二脲方法测定蛋白质(Determination ofProteins by a Reverse Biuret Method Combined with the Copper-BathocuproineChelate Reaction)。《临床化学学报》216(1993)103-111)。
图10表明本文中提供的方法的一个实施例由胰蛋白酶蛋白质消化物定量标记肽的 能力。
图11A-B表明可以用于帮助MS分析之前样品的评估和标准化的单独肽或复合物消化物的定量。
具体实施方式
相比于浴铜灵或新亚铜试剂，浴铜灵二磺酸二钠盐水合物在水中的溶解度高500％。 提高的溶解度允许在溶液中更高浓度的螯合剂，其最终提供较佳灵敏度。
本文所描述的方法提供提高的肽浓度测定灵敏度。在一个实施例中，灵敏度低到25 μg/ml。在一个实施例中，灵敏度低到15μg/ml肽。在一个实施例中，灵敏度范围为12.5 μg/ml-1000μg/ml。本文所提供的方法并不需要在进行分析之前进行肽变性。极小样品 体积的肽变性是高度可变并且费时的。去除变性需要使得分析持续时间缩短并且分析可 变性降低。
根据本发明的方法是阳性或直接分析。其需要约200μl的体积，由10μl到20μl 的样品体积和180μl的试剂体积构成。相比于其它商购分析，本文所提供的方法允许在 较小样品体积下实现更高水平的灵敏度。相对于典型地需要几毫升，0.5ml到2ml样品 的比色管中的读取，较小体积使得本文所提供的方法能够在多孔板中进行并且通过自动 读取器读取。本文所描述的方法准许使用相比于MICRO BCATM方法小得多的样品体积 和小得多的总体积。MICRO BCATM分析需要150μl样品体积和300μl总体积。先前描 述的“阴性”浴铜灵分析需要50μl样品体积和1.15ml总体积。在有利对比下，根据本 发明的方法需要20μl最大样品体积和200μl总体积。
如其它基于铜的蛋白质分析，肽中的某些氨基酸可以提高或降低方法的灵敏度。肽 溶解度和结构也可以对结果产生影响。本文所提供的方法最佳用于对含有肽混合物的复 杂样品中的肽进行定量，其中在分析中肽长度和顺序的差异达到平均。此在针对定量蛋白质组分析，测量肽分级分离方法回收或标准化HPLC负荷量方面尤其重要。本文所公 开的方法也可以用于分析含有单一肽的样品，然而，由于相比于标准物，不同肽中的分 析响应的较大变化，此可能导致误差增加。此可以通过使用对相关肽更具有特异性的标 准物来进行补偿。
本文所提供的方法是单步的(混合和读取)，并且在450nm到500nm处，在一个 实施例中在480nm处读取吸光度。
本文所描述的方法提供多个肽分析，其允许在约30分钟内在标准MS分析之前检测和定量复杂的肽混合物。
本文所描述的方法提供在相同样品体积下与MICRO BCATM分析相比信背比(S/B)增强2-3倍。
本文所提供的方法展现肽到肽可变性降低，这由于通过添加有机共溶剂，如乙腈；清洁剂，如SDS和尿素以及其它水可混溶有机溶剂来使疏水性肽溶解。
在某些实施例中，本文所提供的方法肽定量使用化合物作为螯合剂，其具有以下通 式
Figure BDA0001173155740000141
其中
R1和R2中的每一个独立地是烷基，包括(但不限于)C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、 丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3和R4中的每一个独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)、钾(K+) 或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的膦酸根(-PO3 -) 盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；
R5和R6中的每一个是
Figure RE-GDA0002284247260000011
其中R7独立地选自由以下组成的群组：氢(H)； 钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的磺酸根(-SO3 -)盐；钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+) 的膦酸根(-PO3 -)盐；以及钠(Na+)、钾(K+)或锂(Li+)的羧酸根(-CO2)盐；
其限制条件为R3、R4和R7中的至少一个不为H。
在一个实施例中，本文所提供的肽定量方法使用下文所示的浴铜灵二磺酸二钠盐水 合物作为螯合剂：
Figure RE-GDA0002284247260000012
不限于单一理论，复合物提高浴铜灵的溶解度，相比于前述方法，在本文所提供的方法中产生增强的性能。
本文所提供的方法含有更高量的Cu+2(80mg/ml)。本文所提供的方法如BCA方法 一般将Cu+2还原成Cu+，但在本发明方法中，浴铜灵离子接着与Cu+组合，形成吸光度 在450nm到500nm范围内，在一个实施例中在480nm处的绿色/橙色复合物。
用不同肽和蛋白质消化物评估本文所提供的根据某些实施例的基于吸光度的方法。 使如肽浓度、检测试剂浓度、pH、培育时间、温度和不同组分比率的分析条件最佳化。在多孔板(例如96孔板)上分析肽并且使用分光光度计进行测量以在480nm处测量吸 光度。
实例
在一个实施例中，将20μl样品添加到所制备或预先制得的工作试剂中，所述试剂通过混合5.7mM酒石酸盐、0.04M浴铜灵二磺酸二钠盐和0.5M硫酸铜制得。溶液混 合一分钟，在37℃下培育30分钟并且在480nm处测量吸光度。
通过组合三种溶液制备工作溶液。通过将酒石酸钠、碳酸钠、氢氧化钠和碳酸氢钠水混合于水中来制备溶液1。通过将浴铜灵二磺酸二钠盐水合物混合于任选地含有乙腈 的水中来制备溶液2。通过将五水硫酸铜混合于水中来制备溶液3。通过组合溶液1、2 和3形成工作溶液。具体来说，通过将80mg酒石酸钠(5.7mM)、3.42g碳酸钠(0.65 M)、0.525ml氢氧化钠和0.89g碳酸氢钠(0.22M)混合于50ml水中来制备溶液1。通过将1.13 g浴铜灵二磺酸二钠盐水合物(0.04M)混合于50ml 50％乙腈(25ml乙腈，25ml水) 中来制备溶液2。通过将160mg五水硫酸铜(0.5M)混合于2ml水中来制备溶液3。
通过组合50份溶液1、48份溶液2和2份溶液3形成工作溶液。
将5μl到20μl，典型地20μl体积对标准物或含有肽或蛋白质的样品与工作溶液组合，摇晃一分钟，并且从约22℃到约45℃，优选37℃下培育30分钟。在一个实施例中， 将20μl标准物或样品与180μl工作溶液组合，摇晃一分钟并且在45℃下培育30分钟。 在一个实施例中，在37℃下培育。在培育之后，在480nm处测量吸光度。最终分析混 合物的pH范围是约pH 12到13。
尽管为自动化吸光度读取，但出于速度和便利性，使用自动化板读取器是合乎需要 的，还可以使用比色管中测量到的反应混合物的吸光度测量。
在一个实施例中，本文所提供的方法对即将进行MS分析的肽进行定量。肽可以包括质量标记，如TMT或MS中所用的其它共价修饰。待定量的肽可以包括一个或多个 重同位素标记的氨基酸。
在一个实施例中，本文所提供的方法使用单一肽或消化的蛋白质标准物以产生肽和 /或蛋白质定量的标准曲线。在另一个实施例中，蛋白质标准物用于产生蛋白质定量的标 准曲线。标准曲线产生的准确度和精确度对于准确和精确的样品测量来说是关键的。在一个实施例中，标准曲线包含使用本领域中已知的方法，由牛血清白蛋白(BSA)或蛋 白质A/G的胰蛋白酶消化物产生的肽的混合物。产生接近待分析样品类型的平均值的分 析响应的标准物的选择产生最准确的结果。
另一个实施例提供含有试剂的套组和用于进行本文所描述的方法的说明书。举例来 说，套组可以含有制备工作溶液所需的试剂和说明书中的一些或全部；制备标准物的一种或多种标准物或说明书；进行分析的说明书；微孔板等。
评估超过30种与标准MS分析一致的不同肽、肽混合物、消化物和样品并且概述 在表1中。大多数(超过70％)样品显示可再现和线性结果。
表1：
Figure BDA0001173155740000161
Figure BDA0001173155740000171
使用浴铜灵二磺酸二钠盐水合物方法的本文所描述的方法灵敏低至25μg/ml肽。此 灵敏度基本上超过比标准BCA方法更灵敏的MICRO BCATM分析的灵敏度。灵敏度分别 显示于图1-3定量肽W1(图1)、BSA消化物(图2)和胰岛素(图3)中。使用方程 式(10×(空白的标准差+空白的平均值))计算定量下限(LOQ)，并且本文所描述的方 法和MICRO BCATM分析的LOQ分别为21.58μg/ml和77.40μg/ml。
以20μl/孔将标准溶液、肽样品或蛋白质消化物装载到微量培养板中。以180μl/孔工作溶液添加分析工作试剂。密封培养板，在22℃-45℃下迅速混合并且培育30分钟。 在480nm处使用SPECTRAMAXTM Plus384或VARIOSKANTM急骤(类型3001)微量 培养板读取器读取吸光度。吸光度分析的确定的工作肽浓度范围为25μg/ml-1000μg/ml。 对于吸光度分析，考虑到针对分析样品待装载的<1μg肽，使用5μl-20μl的样品体积。
本文所描述的方法表明相比于所有所测试的肽的MICRO BCATM分析，S/N增加3-4倍。定量下限(LOQ)的平均浓度为约15μg/ml。
本文所描述的方法提供稳固信号并且因此产生改进的信/背(S/B)比率，其是特定浓度下480nm处的吸光度与空白的480nm处的吸光度的比率。此例如通过以下计算获 得：
Figure BDA0001173155740000181
如肽W1的图1中所示，相比于87的S/B的MICRO BCATM分析，本发明方法产生 311的S/B。类似地，如BSA消化物的图2中所示，相比于55的MICRO BCATM分析， 本发明方法产生201的S/B。对于胰岛素(图3)，相比于81的MICRO BCATM分析，本 发明方法产生269的S/B。本发明方法显示与MICRO BCATM分析相比信号增加3-4倍。 这些肽的肽长度和疏水性不同，产生不同的灵敏度；表1提供准确的序列。
不同肽的信号强度的变化范围为合理的。如使用有机溶剂和/或更高培育温度的最佳 化进一步降低可变性。如SDS的其它有机溶剂和/或清洁剂也可以降低可变性。举例来说，如图4中所示，在37℃下使用0.04M浴铜灵二磺酸二钠盐水合物水溶液对各种肽 范围进行定量，产生39％可变性。如肽W1的图1当在45℃下使用含0.04M浴铜灵二 磺酸二钠盐水合物的乙腈(有机溶剂)对相同肽进行定量时，可变性降低到28％。图5B 中所示的实例显示在37℃下使用含0.04M浴铜灵二磺酸二钠盐水合物的50％乙腈定量 的相同肽。本文所描述的方法提供较小可变性，这可能归因于浴铜灵的较佳溶解和较佳 配制，归因于二钠盐水合物的存在和使用有机溶剂和提高的温度的最佳化培育条件。举 例来说，疏水性肽增加可变性；乙腈可能通过减少二级和三级肽结构和/或提高肽溶解度 来降低可变性。
在一个实施例中，使分析组合物中的乙腈的量最佳化。图6A-B表明本文所提供的方法中不同量乙腈的作用。使用0％到50％范围内的乙腈浓度来制备0.04M浴铜灵二磺 酸二钠盐水合物溶液。接着在不同浓度的海拉细胞消化物(15.6μg/ml蛋白质到400μg/ml 蛋白质)和BSA消化物上测试调配物，其在45℃下培育。两种消化物都通过用DTT还 原适当的蛋白质，用IAA烷基化，用DTT阻挡过量IAA，用胰蛋白酶消化，接着使用 C18柱净化来制备。如图6A-B中所示，随着调配物中乙腈百分比提高，S/N和分析灵 敏度得到提高。无乙腈的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物调配物与含50％乙腈的浴铜灵二磺 酸二钠盐水合物调配物之间存在68％改进。
评估乙腈在使用本文所提供的方法检测单一肽方面的作用。结果显示于肽E4的图7A和肽E1的图7B中。制备两种溶液(含0.04M浴铜灵二磺酸二钠盐水合物的50％乙 腈溶液和0.04M浴铜灵二磺酸二钠盐水合物水溶液)。在15.6μg/ml到500μg/ml的浓 度的情况下制备十三种肽(肽E4和E1所示数据)。将试剂溶液(180μl)与20μl肽样 品混合并且在37℃下培育30分钟。
如图7A和7B所示，调配物中乙腈的存在提高S/N比率并且提高分析灵敏度。用 并入浴铜灵二磺酸二钠盐水合物调配物中的乙腈获得的信号强度平均增加45％。
图8显示使用蛋白质A/G的三种不同蛋白质消化物的肽浓度以产生标准曲线。结果甚至使用荧光胺分析为极其可再现的，所述荧光胺分析通过标记N端肽测量肽浓度(《赛 默科技纳米滴方案(Thermo Scientific Nano Drop Protocol)》.荧光胺蛋白质分析2008)并且本发明方法使用相同标准物。
将本发明方法(图9A)、直接单步方法的结果与先前描述的间接两步法(图9B)进行比较。
本发明方法使用含0.04M浴铜灵二磺酸二钠盐水合物的50％乙腈-水混合物；工作溶液为0.48浴铜灵二磺酸二钠盐脱水溶液：0.5酒石酸钠溶液：0.02硫酸铜溶液。
间接两步法使用抗坏血酸作为还原剂以将未反应的Cu+2还原成Cu+1，并且接着随后使浴铜灵与Cu+1螯合。间接两步法中的浴铜灵的量为0.8毫摩尔/升，比本发明方法中 的浴铜灵二磺酸二钠盐脱水物的浓度低约500倍。相比于本发明方法中的200μl的分析 总体积，两步间接方法使用3ml的高许多的分析总体积。图9A和9B的比较表明本发 明方法显示与间接两步法相比更线性和更好的灵敏度。
在某些实施例中，本文所提供的方法可以用于对经标记的蛋白质和/或肽进行定量。 举例来说，可以将MS中所使用的标记，如TMT添加到蛋白质或肽中。如肽W1的图1 本发明方法类似地对TMT标记和未标记的海拉消化物进行检测和定量。因为本文所提 供的方法是基于主要取决于肽酰胺主链的铜还原，其不受如胺基的TMT标记的肽修饰 影响。此在图10中得到表明，其显示TMT标记和未标记的样品的相同反应。此允许在 MS分析实验之间使TMT标记样品的负荷/注入量标准化，改进结果和一致性。本发明 方法也可比于质谱分析中典型地所使用的大多数消化和溶解试剂，如三乙胺、尿素、二 硫苏糖醇、乙腈(显示于图5A-B中)、甲酸以及三氟乙酸。
一个实施例提供用于单独肽或复杂消化物的简单、可靠并且灵敏的定量的微量培养 板分析，其可以用于帮助MS分析之前样品的评估和标准化。用十组不同条件处理非小肺癌细胞系，使其裂解、还原、烷基化并且在使用C18柱去盐之前用胰蛋白酶消化。接 着根据本教示内容，使用基于浴铜灵的肽分析测定每种消化物的浓度。使用如图11A中 所表明的基于荧光胺的分析(《赛默科技纳米滴方案》.荧光胺蛋白质分析.2008)产生相 同结果。接着在单独地用赛默科技TMT10PLEXTM同量异位标记试剂中的一种标记之 前，使每个肽样品浓度标准化。组合经标记的样品，之后使用赛默科技ORBITRAP FUSIONTM质谱仪进行肽鉴别和相对定量。在标准化之后，尽管样品操作和制备为复杂 的，但未经调控的肽呈现1:1:1:1:1:1:1:1:1的比率，如图11B中所示。
本文所描述的方法提供相比于当前方法增强的灵敏度和灵活性，使其成为用于测定 和监测肽样品浓度的极佳工具。其需要相对较小的样品体积(10μl-20μl)，但又在25 μg/ml-1000μg/ml的工作肽浓度范围内提供极佳灵敏度。其是常见MS应用监测的适用 的工具，例如考虑到标记和未标记的肽的定量，其为肽酰胺主链依赖性的。
本文所显示和描述的实施例仅为特定实施例并且不以任何方式加以限制。因此，可 以在不脱离本发明精神的情况下在以下权利要求书的范围中对那些实施例作出各种改变、修改或变更。引用的参考文献以全文引用的方式明确并入本文中。
Figure IDA0001173155780000011
Figure IDA0001173155780000021
Figure IDA0001173155780000031
Figure IDA0001173155780000041
Figure IDA0001173155780000051
Figure IDA0001173155780000061

Claims (31)

1.一种用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述方法包含
（a）将所述样品与在含10%至50%量的乙腈的水溶液中包含复合物的定量分析试剂组合物组合以形成混合物，其中所述复合物具有下式：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
（b）在足以形成彩色复合物的条件下培育混合物；以及
（c）在450 nm到500 nm处测量彩色复合物的吸光度作为样品中的肽或蛋白质浓度的直接指示物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括在步骤(a)中将所述样品与包含在50%乙腈/水中的该复合物的定量分析试剂组合物组合以形成混合物。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其进一步包含在（c）之后通过比较直接测量到的吸光度与含有已知浓度的标准物的至少一种样品的吸光度来测定所述样品中的肽或蛋白质浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述标准物选自由以下组成的群组：肽、肽混合物或蛋白质消化物。
5.根据权利要求1所述的方法，其在所述样品的质谱分析之前进行。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中（a）中的所述试剂组合物进一步包含酒石酸盐和硫酸铜。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酒石酸盐以从5.7 mM至22.7 mM的范围内的浓度存在，所述复合物以从0.04 M至0.1 M的范围内的浓度存在，以及所述硫酸铜以从0.25M至0.5 M的范围内的浓度存在。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述培育温度是在室温到45℃的范围内。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述培育温度是在19℃到22℃的范围内。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述培育温度是约37℃。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述培育温度是约45℃。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品体积在5 µl到20 µl的范围内。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品体积在10 µl到20 µl的范围内。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品体积不超过200 µl。
15.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述样品包含多种肽。
16.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中吸光度通过自动化微量培养板读取器测定。
17.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述样品处于选自水性溶剂和有机溶剂的至少一种溶剂中。
18.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在（c）之后通过质谱分析来分析所述肽或蛋白质。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述定量分析试剂组合物含有除乙腈以外的有机溶剂或清洁剂中的至少一种以提高肽或蛋白质溶解度。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂组合物是在约50%乙腈/水中的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物。
21.一种用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述方法包含
（a）将样品与定量分析试剂组合物组合以形成混合物，其中所述定量分析试剂组合物含有在50%乙腈/水中的复合物，其中所述复合物含有下文所示的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（b）在足以形成彩色复合物的条件下培育混合物；以及
（c）在450 nm到500 nm处测量彩色复合物的吸光度作为样品中的肽或蛋白质浓度的直接指示物；
其中所述方法进一步包含在（c）之后通过质谱分析来分析所述肽或蛋白质。
22.根据权利要求21所述的方法，其中（a）中的所述试剂组合物进一步包含酒石酸盐和硫酸铜。
23.一种用于蛋白质或肽定量的组合物，其包含
（a）具有下式的复合物：
Figure 100735DEST_PATH_IMAGE001
；
（b）硫酸铜，
（c）以从10%至50%范围内的浓度存在的乙腈，和
(d)酒石酸盐。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述复合物以从0.04 M至0.1 M范围内的浓度存在，所述酒石酸盐以从5.7 mM至22.7 mM的范围内的浓度存在，以及所述硫酸铜以从0.25 M至0.5 M的范围内的浓度存在。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述乙腈以从10%至30%范围内的浓度存在。
26.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述组合物具有在12至13的范围内的pH。
27.一种肽定量试剂组合物，其包含至少一种赋形剂和
（a）浓度在0.04 M到0.1 M范围内的50%乙腈/水中的复合物，其中所述复合物含有下文所示的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
（b）浓度在5.7 mM到22.7 mM范围内的酒石酸盐，以及
（c）浓度在0.25 M到0.5 M范围内的硫酸铜，
产生肽定量试剂组合物。
28.一种肽定量试剂套组，其包含使用所述套组的肽的质谱分析定量的说明书以及试剂，所述试剂包含
（a）含有下文所示的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物的复合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
其中所述复合物在50%乙腈/水中，
（b）酒石酸盐，以及
（c）硫酸铜，
得自所述试剂的混合的组合物的pH在pH 12到pH 13范围内。
29.一种用于肽或蛋白质的定量的套组，其包含
（a）具有下式的复合物：
Figure 17875DEST_PATH_IMAGE002
；
（b）硫酸铜，
（c）以从10%至50%范围内的浓度存在的乙腈，
(d)酒石酸盐，以及
(e)关于使用所述套组进行的肽或蛋白质的质谱分析定量的说明书。
30.根据权利要求29所述的套组，其中所述复合物以0.04 M至0.1 M范围内的浓度存在，所述酒石酸盐以从5.7 mM至22.7 mM的范围内的浓度存在，以及所述硫酸铜以从0.25 M至0.5 M的范围内的浓度存在。
31.根据权利要求29所述的套组，其中，所述乙腈以从10%至30%范围内的浓度存在。
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