CN106554419A - 重组抗her2双特异性抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种重组抗HER2双特异性抗体、其制备方法和应用。本发明的抗HER2双特异性抗体既能与HER2上的Trastuzumab识别位点结合，又能与HER2上的Pertuzumab识别位点结合，具有良好的抗肿瘤效果。

Description

重组抗HER2双特异性抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种重组双特异性抗体、其制备方法和其在抗肿瘤上的作用。

背景技术

约20％～25％的乳腺癌患者存在人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor 2,HER2)基因扩增或蛋白过量表达[Jahanzeb M等，ClinicalBreast Cancer.2008,8:324-333]。抗HER2单克隆抗体Trastuzumab(商品名：Herceptin，赫赛汀)从1998年上市至今，一直高居单抗药物销量前五。通过直接杀伤HER2高表达的乳腺癌细胞，Trastuzumab显著改善肿瘤患者的预后[WhiteC等，Annual Review Medicine.2001,52:125-145]。然而，很多病人对Herceptin并不应答，在应答病人中，大部分病人在一年后发展出耐药性。因此，开发新的可突破病人耐药性的HER2靶向药物是本领域的技术人员急待解决的问题。

Pertuzumab(商品名：Perjeta，帕妥珠)是另一个特异性靶向HER2的抗体药物，其识别的表位不同于赫赛汀。与赫赛汀不同的是，帕妥珠能有效抑制HER2与其家族中另一成员ErbB3的二聚化。研究表明，共同应用赫赛汀和帕妥珠可协同抑制肿瘤细胞的生长[Nahta R等，Cancer Research.2004,64:2343-2346]。临床试验也证实，赫赛汀和帕妥珠联合治疗是安全的，同时临床受益指数可达50％[Baselga J等，J Clin Oncol.2010,28:1138-1144]。

双特异抗体是将靶向两个不同靶点的抗体整合到同一抗体中，一方面极大降低了开发和临床应用的成本，更重要的是，双特异抗体通过同一抗体上不同位点同时识别同一抗原，增强了抗体对肿瘤抗原的亲和力，也增进了抗体对肿瘤抗原的特异性靶向与识别。因此，构建开发赫赛汀和帕妥珠的双特异抗体将能为肿瘤患者提供更好的治疗选择。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个可以同时阻断HER2两个不同表位的双特异性抗体，即本发明所述的“重组抗HER2双特异性抗体”，从而完成了本发明。

本发明公开了：

1、一种重组抗HER2双特异性抗体，所述重组抗HER2双特异性抗体既能与HER2上的Trastuzumab识别位点结合，又能与HER2上的Pertuzumab识别位点结合。

2、上述重组抗HER2双特异性抗体的可变区氨基酸序列包含抗HER2单克隆抗体Trastuzumab的可变区氨基酸序列和抗HER2单克隆抗体Pertuzumab可变区氨基酸序列。

3、上述重组抗HER2双特异性抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

4、上述重组抗HER2双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5、一种分离的核酸分子，其编码上述1-4任一所述重组抗HER2双特异性抗体，所述核酸分子可以是其重链核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

6、一种载体，其含有上述的核酸分子，所述载体可以为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF或pCHO 1.0。

7、一种宿主细胞，其含有上述的载体，所述细胞可以为COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1之一。

8、一种制备上述1-4任一所述重组抗HER2双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达重组抗HER2双特异性抗体；

b)分离或纯化a)所述的重组抗HER2双特异性抗体。

9、一种组合物，含有上述1-4任一所述的重组抗HER2双特异性抗体和药学上可接受的载体。

10、上述1-4任一所述的重组抗HER2双特异性抗体或上述组合物制备抗肿瘤药物中的用途；所述用途还可以包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明的有益效果：

本发明的抗HER2双特异性抗体既能与HER2上的Trastuzumab识别位点结合，又能与HER2上的Pertuzumab识别位点结合，具有良好的抗肿瘤效果。

附图说明

图1为抗HER2双特异性抗体结构示意图。

图2为pCHO 1.0结构示意图。

图3为抗HER2双特异性抗体针对HER2阳性的肿瘤细胞的增殖抑制实验结果。

图4为抗HER2双特异性抗体体内抑制BT-474生长的活性实验结果。

具体实施方式

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF及pCHO 1.0(如图2)之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

本发明中，可用的宿主细胞为含有上述载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，COS，CHO，NS0，sf9及sf21等均可适用于本发明；也可以为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5α，BL21(DE3)，TG1之一。

本发明中公开的抗HER2双特异性抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗HER2双特异性抗体；分离或纯化所述的抗HER2双特异性抗体。利用上述方法，可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

本发明公开的上述抗HER2双特异性抗体是通过以下方法得到的：抗HER2抗体Trastuzumab(IgG1,κ)的V_L序列与V_H序列分别通过不同接头短肽(例如：ASTKGP；TVAAP)与抗HER2抗体Pertuzumab(IgG1,κ)的N端相连接。更具体地，本发明的申请人通过大量实验，首先分别表达了抗HER2抗体Trastuzumab的V_H和V_L片段基因，及抗HER2抗体Pertuzumab的重链和轻链全长基因。在此基础上利用Overlap PCR将Trastuzumab的V_H片段通过连接短肽与Pertuzumab抗体的重链连接，Trastuzumab的V_L片段通过另一连接短肽与Pertuzumab抗体的轻链连接，然后进一步将上述融合后的轻链和重链基因克隆到真核表达载体pCHO 1.0(购自：Life Technology)中，构建成真核表达载体pCHO1.0(anti-HER2Bispecific)。将此表达载体通过脂质体法转染CHO细胞，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离或纯化抗HER2双特异性抗体。

本发明的发明人对上述的抗HER2双特异性抗体进行了体外、体内生物学实验。体外生物学实验结果表明此抗体能很好地与HER2上的两个表位同时结合，其抑制HER2阳性的肿瘤细胞增殖的能力显著强于Trastuzumab和Pertuzumab单抗体。

本发明的发明人对上述的抗HER2双特异性抗体进行亲和力检测、对HER2阳性的肿瘤细胞的增殖抑制实验、体内抑瘤等实验，实验结果表明，本发明公开的抗HER2双特异性抗体可以同时结合细胞膜表面HER2上的两个不同表位，充分阻断HER2的信号传导通路。该抗HER2双特异性抗体通过在阻断HER2介导的信号通路的同时，阻止了HER2与ErbB3二聚化引起的信号传递，充分阻抑了相关促肿瘤细胞生长应答的发生。此外，实验表明，在相等剂量下，本发明的抗HER2双特异性抗体比单独应用赫赛汀或帕妥珠具有更好的抗肿瘤治疗效果。

本发明公开的上述抗HER2双特异性抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗HER2双特异性抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述抗HER2双特异性抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述抗HER2双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使抗HER2双特异性抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液包括但不限于：TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。

上述制剂为包含抗HER2双特异性抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明所指的肿瘤，包括但不限于：腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。优选乳腺癌。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止转移。

本发明中抗HER2双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天。

本发明公开的抗HER2双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)；Cetuximab(C225)；Bevacizumab(Avastin)；5、其他包括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的抗HER2双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd edition，Cold spring HarborLaboratory Press.

实施例1抗HER2双特异性抗体的基因构建与表达

抗人HER2单克隆抗体Trastuzumab(IgG1，κ)的序列来自于KEGG基因库(NO.D03257)，比对人IgG1抗体的恒定区序列分析获得VH和VL基因片段。同时，抗人HER2单克隆抗体Pertuzumab(IgG1，κ)的序列来自Drugbank(NO.DB06366)，按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好经过密码子优化后由生工生物工程有限公司全基因合成核苷酸序列。采用Overlapping PCR的方法将Trastuzumab的VH基因片段通过接头(ASTKGP)与Pertuzumab重链的N端融合；将VL基因片段通过接头(TVAAP)与Pertuzumab轻链的N端融合。接头片段分别来自于人IgG1CH1或Cκ的N端序列。

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5分别显示了所得抗HER2双特异性抗体重链核苷酸序列、重链氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列；SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6分别显示了所得抗HER2双特异抗体的轻链核苷酸序列、轻链氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。

附图1展示了抗HER2双特异性抗体结构示意图(其中，VH1为原Trastuzumab重链可变区序列，VH2为原Pertuzumab的重链可变区序列，CH1-CH2-CH3为原Pertuzumab的重链恒定区序列，VL1为原Trastuzumab轻链可变区序列，VL2为原Pertuzumab的轻链可变区序列，CL为原Pertuzumab的轻链恒定区序列)。

将PCR产物克隆到pCHO 1.0表达载体(购自Life technologies公司)，测序验证确认获得了正确的克隆，正确的克隆载体表示为：pCHO 1.0(anti-HER2Bispecific)。另外，人HER2基因来自于Pubmed数据库(NM_001005862.2)常规加上人IgG1Fc序列后由生工生物工程有限公司合成，用同样的方法分别将HER2-Fc，Trastuzumab和Pertuzumab全基因克隆到pCHO 1.0中，正确的克隆载体分别标记为pCHO 1.0(HER2-Fc)，pCHO 1.0(Trastuzumab)与pCHO 1.0(Pertuzumab)。

将上述pCHO 1.0(anti-HER2Bispecific)、pCHO 1.0(HER2-Fc)、pCHO 1.0(Trastuzumab)和pCHO 1.0(Pertuzumab)载体分别瞬时转染至人胚胎肾细胞293细胞系(购自：ATCC公司)，培养数天后，利用Protein A亲和层析柱(购自Pharmacia公司)从细胞培养上清中纯化抗体蛋白。蛋白的定量通过BCA(Bicinchoninic acid)方法进行。纯化得到的抗HER2双特异性抗体、Trastuzumab和Pertuzumab抗体样品用于以下的进一步分析与研究。

实验例2SDS-PAGE和Western-blot检测抗HER2双特异抗体

纯化后的抗HER2双特异抗体、Trastuzumab和Pertuzumab均分别在非还原(6％)和还原(12％)条件下用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其纯度和分子量大小，同时通过Western-blot进一步鉴定其性质和分子量。Western-blot方法如下：将电泳后的胶通过电转移的方法转移至PVDF膜上，封闭后加入HRP标记的羊抗人IgG(H+L)，PBST洗两遍，最后DAB法显色。

聚丙烯酰氨凝胶电泳和Western-blot的结果显示：在还原条件下，Trastuzumab和Pertuzumab均呈现为分子量大小约50KDa和25KDa的重链和轻链，而本发明的抗HER2双特异抗体呈现为分子量大小约63KDa(重链)和36KDa(轻链)。在非还原条件下，所有抗体均呈现一条带，它们的大小分别为149KDa(Trastuzumab)，148KDa(Pertuzumab)和192KDa(抗HER2双特异性抗体)。同时，在非还原条件下，利用抗Fc抗体或者抗κ抗体(均购自：Sigma)，并未检测到有异常分子碎片的存在(如单独重链，单独轻链，或者重链复合物等)。

实施例3抗HER2双特异抗体与HER2结合能力的鉴定

抗HER2双特异抗体与HER2的结合通过Biacore 3000进行检测。将表达纯化的HER2-Fc以不同浓度包被在Biacore 3000的芯片上后，检测其亲和力。抗HER2双特异性抗体对HER2的亲和力显著高于其母抗体Trastuzumab和Pertuzumab，具体见表1。

表1 抗HER2双特异性抗体对HER2的亲和力

抗体	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(nM)
				Trastuzumab	2.8×104	1.5×10-4	5.3
Pertuzumab	0.9×104	7.8×10-4	87
				抗HER2双特异抗体	3.3×104	1.2×10-5	0.36

实施例4抗体基因在CHO细胞中的表达

通过脂质体法将pCHO 1.0(anti-HER2Bispecific)载体转染至CHO-S细胞系(Life technologies公司产品)，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。利用人IgG ELISA检测培养液上清中抗体浓度：5μg/ml的羊抗人IgG Fc抗体(购自Sigma)包被于ELISA板，4℃过夜，2％牛血清白蛋白37℃封闭2小时。加入培养液上清或标准品(人IgG1)37℃孵育2小时，利用HRP-羊抗人IgG(PIERCE)进行检测。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化抗HER2双特异性抗体。

实施例5抗HER2双特异抗体的肿瘤生长抑制作用

抗HER2双特异抗体的肿瘤生长抑制作用通过BT-474细胞系进行测定。1.5×10⁴BT-474细胞(购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库)在96孔板中与不同浓度(7.8ng/ml～64μg/ml)的双特异抗体孵育2小时，母抗体Trastuzumab和Pertuzumab分别作为对照。然后在细胞中加入PBS对照或生长因子EGF(5nM，购自R&D system)。37℃孵育4天后通过CellTiterGlo试剂盒(Promega公司产品)检测细胞增殖情况。结果如图3所示，本发明的抗HER2双特异性抗体较其母抗体Trastuzumab和Pertuzumab的抑制肿瘤细胞生长的活性更强，其细胞增殖抑制能力与单抗体具有显著性差异。

实施例6人乳腺癌细胞系BT-474的异种移植模型

生长状态良好的BT-474细胞(购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库)用0.25％(w/v)胰蛋白酶和0.02％(w/v)EDTA短暂消化，洗涤重悬后以1×10⁶细胞/鼠接种于6-8周雌性裸鼠的右侧皮下。当肿瘤长至≥200mm³时，将30只肿瘤大小比较一致的荷瘤裸鼠随机分成五组，开始给予抗HER2双特异抗体治疗，无关同型抗体IgG1(购自Sigma公司)、Trastuzumab、Pertuzuma作为对照。四种抗体均以10mg/kg，每周一次静脉注射的方式进行给药。小鼠治疗开始后连续观察六周，每周测量肿瘤体积，肿瘤体积大小的计算方式为：V＝0.5ab²，其中，a为肿瘤实体最长直径，b为肿瘤实体最短直径。实验结果如图4所示，本发明的抗HER2双特异性抗体治疗组完全阻断了肿瘤的进一步生长，小鼠肿瘤体积显著小于Trastuzumab或Pertuzumab组。

Claims (10)

1.一种重组抗HER2双特异性抗体，其特征在于，所述重组抗HER2双特异性抗体既能与HER2上的Trastuzumab识别位点结合，又能与HER2上的Pertuzumab识别位点结合。

2.权利要求1所述重组抗HER2双特异性抗体，其特征在于，所述重组抗HER2双特异性抗体的可变区氨基酸序列包含抗HER2单克隆抗体Trastuzumab的可变区氨基酸序列和抗HER2单克隆抗体Pertuzumab可变区氨基酸序列。

3.权利要求2所述重组抗HER2双特异性抗体，其特征在于，所述重组抗HER2双特异性抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

4.权利要求3所述重组抗HER2双特异性抗体，其特征在于，所述重组抗HER2双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一所述重组抗HER2双特异性抗体，所述核酸分子可以是其重链核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

6.一种载体，其含有权利要求5所述的核酸分子，所述载体可以为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF或pCHO 1.0。

7.一种宿主细胞，其含有权利要求6所述的载体，所述细胞可以为COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1之一。

8.一种制备权利要求1-4任一所述重组抗HER2双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达重组抗HER2双特异性抗体；

b)分离或纯化a)所述的重组抗HER2双特异性抗体。

9.一种组合物，含有权利要求1-4任一所述的重组抗HER2双特异性抗体和药学上可接受的载体。

10.权利要求1-4任一所述的重组抗HER2双特异性抗体或权利要求9所述组合物制备抗肿瘤药物中的用途；所述用途还可以包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。