CN106526047A - R‑琥珀酸曲格列汀光学纯度的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种二肽基肽酶‑Ⅳ（DPP‑Ⅳ）抑制剂，即R‑琥珀酸曲格列汀光学纯度的检测方法。本发明采用添加二乙胺的流动相的手性色谱法测定R‑琥珀酸曲格列汀汀光学纯度的方法。该方法是利用在流动相中添加二乙胺，调节流动相pH，稳定手性填料的空间构型，改变了手性填料对R‑琥珀酸曲格列汀与S‑琥珀酸曲格列汀的键合作用，从而提高了R‑琥珀酸曲格列汀与S‑琥珀酸曲格列汀之间的分离效能，实现了用手性色谱法进行光学纯度的测定，首次创新性地解决了R‑琥珀酸曲格列汀光学纯度测定这一技术难题。

Description

R-琥珀酸曲格列汀光学纯度的测定方法

技术领域

本发明涉及一种二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂即R-琥珀酸曲格列汀光学纯度的检测方法。

背景技术

琥珀酸曲格列汀（Trelagliptin Succinate）是一种二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂，其化学名为2-〔〔6-〔(3R)-3-氨基-1-哌啶基〕-3,4-二氢-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基〕甲基〕-4-氟苯甲腈琥珀酸盐。其主要成分为曲格列汀。该化合物结构中有一个手性中心，但真正具有药理作用的为R构型，其结构式见式1：

式1：琥珀酸曲格列汀结构式

琥珀酸曲格列汀是由日本武田制药开发的二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂，通过选择性、持续性抑制DPP-Ⅳ，从而控制血糖水平。肠促胰岛素（GLP-Ⅰ）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）在血糖调节中发挥着重要的作用，而DPP-Ⅳ是能够引发肠促胰岛素（GLP-Ⅰ）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）的失活。通过抑制DPP-Ⅳ，就能够增加血糖水平依赖性胰岛素分泌，从而达到控制血糖的目的。琥珀酸曲格列汀是可通过提高机体自身能力控制血糖水平的新型的Ⅱ型糖尿病药物，用作单药，每周服用一次。其作用机制独特，具有不产生低血糖、不引起体重增加，以及副作用小等独特优势，引起胃肠道不良反应的发生率也很低。2015年3月获得日本厚生劳动省（MHLW）的上市批准，主要用于治疗Ⅱ型糖尿病，耐受性良好。

R-琥珀酸曲格列汀的合成是以3-甲基-6-氯尿嘧啶与2-氰基-5-氟溴苄反应生成2-〔(6-氯-3,4-二氢-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基)甲基〕-4-氟苯甲腈，2-〔(6-氯-3,4-二氢-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基)甲基〕-4-氟苯甲腈再与R-3-氨基哌啶双盐酸盐反应生成R-曲格列汀，R-曲格列汀再与琥珀酸成盐得到的R-琥珀酸曲格列汀。

随着手性液相分离技术的发展，高效液相色谱法已经成为能够准确检测物质光学纯度的可靠的方法。但是R-琥珀酸曲格列汀的手性分离方法至今尚未见报道。究其原因，一是对映异构体杂质的色谱行为与主药行为比较相似，必须选用特定的手性填料才能将二者彻底分离，需要进行大量的手性柱筛选实验；二是由于其手性中心能够与手性色谱柱填料产生氢键、偶极-偶极或空间作用的作用力较小，常规手性色谱柱的分离效能较低，无法实现有效的分离。为了有效的控制产品质量，迫切的需要一种快速、准确的检测方法。

本发明的目的：为了解决分离效能较低这一问题，我们开发了采用添加二乙胺的流动相的手性色谱法测定R-琥珀酸曲格列汀汀光学纯度的方法。该方法是利用在流动相中添加二乙胺，调节流动相pH，稳定手性填料的空间构型，改变了手性填料对R-琥珀酸曲格列汀与S-琥珀酸曲格列汀的键合作用，从而提高了R-琥珀酸曲格列汀与S-琥珀酸曲格列汀之间的分离效能，实现了用手性色谱法进行光学纯度的测定，首次创新性地解决了R-琥珀酸曲格列汀光学纯度测定这一技术难题。

发明内容

目前，琥珀酸曲格列汀按式2所示流程制备。

式2 琥珀酸曲格列汀的工艺流程

本发明的技术方案：

一种R-琥珀酸曲格列汀光学纯度的测定方法，其特征在于，

色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯），即AD-H手性色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相A为正己烷，流动相B为二乙胺的乙醇溶液，且所述的正己烷与0.1%二乙胺的乙醇溶液的体积比为55:45~65:35，二乙胺的浓度为0.05%~0.15%，流动相在0.8~1.2mL·min-1，检测波长：278nm。

本发明技术方案中二乙胺的乙醇溶液中，二乙胺的作用是改性剂，通常加在正相的流动相中，主要的作用是调节流动相pH，稳定手性填料的空间构型，改变手性填料对R，S对映异构体的键合作用。

所述流动相中二乙胺的乙醇溶液中，二乙胺的浓度为0.1%。

所述流动相中正己烷与0.1%二乙胺的乙醇溶液的体积比是60:40。

本发明的光学纯度的检测方法，其特征在于，含有以下步骤：

取R-琥珀酸曲格列汀对照品、S-琥珀酸曲格列汀对照品各适量，分别置于25ml量瓶中，分别加无水乙醇溶解并定量稀释制成各约为0.5mg·ml-1的溶液，作为R-琥珀酸曲格列汀对照品贮备液；

（1） R,S-琥珀酸曲格列汀对照品溶液：精密量取上述贮备液各0.25ml，置同一100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，作为系统适应性试验溶液；

（2）S-琥珀酸曲格列汀对照品溶液：精密量取上述S-琥珀酸曲格列汀对照品贮备液0.25ml，置于100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，作为S-琥珀酸曲格列汀对照品定位溶液；

（3）R-琥珀酸曲格列汀对照品溶液：精密量取上述R-琥珀酸曲格列汀对照品贮备液0.25ml，置于100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，作为R-琥珀酸曲格列汀对照品定位溶液；

（4）R-琥珀酸曲格列汀供试品溶液：精密称取R-琥珀酸曲格列汀供试品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；

（5）精密量取供试品溶液0.5ml，置200ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（6）取对照溶液20µl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%～20%。精密量取供试品溶液与对照溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，按峰面积归一化法计算光学纯度；

色谱条件：以CHIRALPAK AD-H手性柱为色谱柱；以正己烷-无水乙醇（60：40）（含0.1%二乙胺）为流动相；检测波长为278nm；柱温为25℃；流速为每分钟1.0mL，进样量20µL。

首先分别对R,S-琥珀酸曲格列汀对照品溶液与S-琥珀酸曲格列汀对照品溶液进样，进行系统适应性分析，再对R-琥珀酸曲格列汀供试品溶液进行光学纯度测定，按面积归一化法计算样品的光学纯度。

系统适应性试验：R,S-琥珀酸曲格列汀达到了基线分离，分离度大于2.0，见说明书附图3，与R-琥珀酸曲格列汀、S-琥珀酸曲格列汀对照品色谱图（说明书附图4与5）对比，确定RT=14.113为S构型，RT=15.773为R构型。

本发明的有益成果：

1 在流动相中添加二乙胺，调节流动相pH，稳定手性填料的空间构型，改变手性填料对R，S-琥珀酸曲格列汀的键合作用，从而提高了分离效能。

2 被分析物中R，S-曲格列汀之间达到基线分离，可操作性强，分析方法专属性、灵敏度与准确度高，能为保证药品的安全、有效、质量可控提供强有力的依据。

3 主峰峰型良好，主峰前后杂质峰与主峰分离度良好，色谱条件的系统适应性良好。

4 该方法的平均回收率为101.52%，RSD为1.75%，完全满足要求。

本发明技术方案中，所述 R-琥珀酸曲格列汀对照品与S-琥珀酸曲格列汀对照品的确认：

色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶（250mm ×4.6mm,5μm），流速：1.0ml·min-1，柱温：35℃，检测波长：278nm，进样量20µL，流动相：以乙 腈为流动相A，0.01mol·L-1的磷酸二氢钾（用饱和氢氧化钾溶液调节pH值至6.2）-乙腈（90: 10）为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；^{-1 -1}

时间(分钟)	流动相A (%)	流动相B（%）
			0	1	99
30	20	80
			55	85	15
55.5	1	99
			60	1	99

纯度测定：分别精密称取R-琥珀酸曲格列汀对照品与S-琥珀酸曲格列汀对照品适量，加乙腈定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，进样检测，按峰面积归一化法计算纯度，纯度应大于99.0%；

附图说明：

图1：RS-琥珀酸曲格列汀纯度测定色谱图。

图2：RS-琥珀酸曲格列汀色谱峰光谱图。

图3：RS-琥珀酸曲格列汀光学纯度测定色谱图。

图4：S-琥珀酸曲格列汀光学纯度测定色谱图。

图5：R-琥珀酸曲格列汀光学纯度测定色谱图。

图6：R-琥珀酸曲格列汀样品（PTG141202批次供试品）光学纯度测定色谱图。

图注：EP/JP表示欧洲药典和日本药典高效液相色谱法分离度计算方法。

具体实施方式：

一下实施例用于说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1 R-琥珀酸曲格列汀样品的光学纯度的测定

仪器与试剂：高效液相色谱仪（日本日立公司；赛默飞世尔科技有限公司）；AD-H手性色谱柱（250mm×4.6mm,5μm；大赛璐药物手性技术有限公司）；恒温水浴锅（江苏金坛科兴仪器厂）；BT-25S电子天平（瑞士，梅特勒公司）。DL-1000D超声仪（上海之信仪器有限公司）。

正己烷（色谱纯，天津市彪士奇科技有限公司）；无水乙醇（色谱纯，天津市彪士奇科技有限公司）；二乙胺（分析纯，天津广成化学试剂有限公司）；R-琥珀酸曲格列汀对照品（纯度≧99.9%，迪沙药业集团药物研究院）；S-琥珀酸曲格列汀对照品（纯度≧99.0%，迪沙药业集团药物研究院）；R-琥珀酸曲格列汀样品（PTG141202批次，纯度≧99.0%，迪沙药业集团药物研究院）。

我们通过大量实验进行了流动相色谱条件的筛选：

1.1流动相的选择

琥珀酸曲格列汀为极性较大的化合物，故选择正己烷-无水乙醇体系为流动相。流动相的配比考察发现，适当增加正己烷的比例有利于提高分离度，但是正己烷比例较大会导致保留时间过长，不利于分析检测。流动相中添加二乙胺，会使主峰峰型趋于尖峰，柱效增加，理论板数达到要求。通过对二乙胺添加量（0.05%、0.1%、0.15%）的系统优化显示，1.0 %的添加量使分离效能最佳，因而选择0.1%的二乙胺。流速考察中发现，适当的降低流速也能够提高分离效能，但是会导致分析时间过长，造成不必要的浪费。通过对流速（0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.2mL·min-1）的系统优化显示，1.0 mL·min-1的流速条件使分离效能最佳，因而流速选择1.0 mL·min-1。

1.2 紫外波长的选择：琥珀酸曲格列汀在流动相中的最大紫外吸收波长为278nm。由于琥珀酸曲格列汀与其对映异构体的理化性质基本一致，最大紫外吸收波长也是在278 nm，因而选择278 nm作为对映异构体的检测波长。

1.3 样品浓度的选择：比较浓度分别为0.3mg·mL^-1、0.5mg·mL^-1、1.0mg·mL^-1的样品的色谱图，实验结果显示，0.3mg·mL^-1的样品峰高较低，含量较小的对映异构体未检出；1.0mg·mL^-1的样品浓度太大，色谱柱有过载的迹象；0.5mg·mL^-1浓度的样品在峰高及峰面积方面均能满足要求，因此确定0.5mg·mL^-1为检出样品的浓度。

1.4 耐用性：通过对流动相比例、流速与柱温的变化对方法进行了耐用性考察，结果发现，乙醇比例在45%-35%之间、流速在0.8-1.2 mL·min-1之间发生微小变化时，对分离效能没有影响，对映异构体均能检出，且其含量没有显著变化。室温在17~23 ℃之间变动时，对保留时间略有影响，对分离效能没有影响。

按技术方案所述检测方法检测R-琥珀酸曲格列汀的光学纯度。

样品测定（PTG141202批次供试品）

精密称取PTG141202批次供试品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液0.5ml，置200ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；取对照溶液20µl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%～20%。精密量取供试品溶液与对照溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，按峰面积归一化法计算光学纯度（见附图6）；

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属技术领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (2)

1.一种R-琥珀酸曲格列汀光学纯度的测定方法，其特征在于，

（1）色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯），即AD-H手性色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相A为正己烷，流动相B为二乙胺的乙醇溶液，且所述的正己烷与0.1%二乙胺的乙醇溶液的体积比为55:45~65:35，二乙胺的浓度为0.05%~0.15%，流动相在0.8~1.2mL·min-1，检测波长：278nm；

所述流动相中二乙胺的乙醇溶液中，二乙胺的浓度为0.1%；

所述流动相中正己烷与0.1%二乙胺的乙醇溶液的体积比是60:40；

（2）检测方法，含有以下步骤：

取R-琥珀酸曲格列汀对照品、S-琥珀酸曲格列汀对照品各适量，分别置于25ml量瓶中，分别加无水乙醇溶解并定量稀释制成各约为0.5mg/ml的溶液，作为R-琥珀酸曲格列汀对照品贮备液；

1） R,S-琥珀酸曲格列汀对照品溶液：精密量取上述贮备液各0.25ml，置同一100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，作为系统适应性试验溶液；

2）S-琥珀酸曲格列汀对照品溶液：精密量取上述S-琥珀酸曲格列汀对照品贮备液0.25ml，置于100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，作为S-琥珀酸曲格列汀对照品定位溶液；

3）R-琥珀酸曲格列汀对照品溶液：精密量取上述R-琥珀酸曲格列汀对照品贮备液0.25ml，置于100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，作为R-琥珀酸曲格列汀对照品定位溶液；

4）R-琥珀酸曲格列汀供试品溶液：精密称取R-琥珀酸曲格列汀供试品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；

5）精密量取供试品溶液0.5ml，置200ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

6）取对照溶液20µl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%～20%，精密量取供试品溶液与对照溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，按峰面积归一化法计算光学纯度；

7）色谱条件：以CHIRALPAK AD-H手性柱为色谱柱；以正己烷-无水乙醇（60：40）（含0.1%二乙胺）为流动相；检测波长为278nm；柱温为25℃；流速为每分钟1.0mL，进样量20µL；

8） 首先分别对R,S-琥珀酸曲格列汀对照品溶液与S-琥珀酸曲格列汀对照品溶液进样，进行系统适应性分析，再对R-琥珀酸曲格列汀供试品溶液进行光学纯度测定，按面积归一化法计算样品的光学纯度。

2.权利要求1所述测定方法，其特征在于，系统适应性试验：R,S-琥珀酸曲格列汀分离度大于2.0，与R-琥珀酸曲格列汀、S-琥珀酸曲格列汀对照品色谱图对比，确定RT=14.113为S构型，RT=15.773为R构型。