CN106434806B - 蛹虫草多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛹虫草多肽及其制备方法和应用，属于生物活性多肽技术领域。该蛹虫草多肽的制备方法包括以下步骤：(1)脱脂：取蛹虫草，加入脱脂液，在50‑80℃下加热回流1‑4h进行脱脂处理，随后过滤，滤渣烘干，备用；(2)酶解：分别取上述滤渣，按照每克滤渣8‑25mL的量加入水，调节溶液pH值后，再加入胃蛋白酶或胰蛋白酶或中性蛋白酶，30‑40℃下酶解2‑6h；随后加热酶解液使酶灭活，冷却，过滤，即得。以上述方法制备得到的蛹虫草多肽组份具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的作用，可用于胰岛素抵抗，糖尿病等病症的治疗中；且蛹虫草药食同源，按照上述方法制备的酶解活性多肽从蛹虫草中直接提取，具有毒性低、安全性高、可长期服用的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性多肽技术领域，特别是涉及一种蛹虫草多肽及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。近年来，社会不断进步，人民生活水平不断提高，糖尿病的发病率也不断升高，糖尿病已经成为严重危害人类生命健康的恶性疾病之一，临床上以高血糖为主要特点。我国目前糖尿病的总体患病率已达9.7％，同期，糖尿病前期的患病率高达15.5％。根据调查结果所做出的推算显示我国总糖尿病患病人数达9千2百万以上，糖尿病前期人数达1亿4千8百万以上。
近年来很多研究显示：蛋白酪氨酸磷酸酶1B(Protein Tyrosine Phosphatase-1B，PTP-1B)可能在胰岛素抵抗中发挥了重要的作用。它是胰岛素信号转导中一个十分关键的分子。通过去磷酸化信号分子，从而终止胰岛素信号转导。许多研究也进一步证实PTP1B可以负性调节胰岛素和瘦素的信号转导。近十年来研究发现，PTP与2型糖尿病的胰岛素信号传导、高血脂、肥胖密切相关。PTPs家族还可以分为8个亚族：①酪氨酸特异性PTPs；②双特异性PTPs；③细胞分裂周期蛋白25(cdc25)亚族；④第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)亚族；⑤myotubularins；(PTPs第五亚族)⑥再生肝磷酸酶(PRL)亚族；⑦低分子量PTPs；⑧新发现的cdc14亚族。其中，与胰岛素信号调节紧密相关的是酪氨酸特异性PTPs，它又可以分为受体型和非受体型两类。PTP1B是胞内PTPs的代表，是第一个被鉴定并纯化的哺乳动物PTP，由435个氨基酸残基组成，分子量约50kD。人类的PTP-1B基因全长约74kb，共10个外显子，位于20q13.1-13.2。PTP1B广泛表达于肌肉、心、肝、肾、脑等各种组织中。
PTP-1B与胰岛素信号传导过程的关系：胰岛素信号传导首先需要胰岛素与胰岛素受体结合。胰岛素受体是由α2β2亚单位组成的四聚体，α亚单位与胰岛素结合后β亚单位的酪氨酸及胰岛素受体底物发生磷酸化而被激活。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kianse，PI3K)等下游蛋白也被活化，葡萄糖转运蛋白4由细胞内转至细胞膜，最终葡萄糖进入细胞。在上述过程中的磷酸化反应可以被PTP-1B等因子逆转，从而阻止胰岛素信号的传导。因此，PTP-1B是胰岛素信号传导的一个重要负性调节物质。如果PTP-1B结构或活性改变，将改变其对胰岛素信号传导的抑制作用。
外周组织胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病发病机制的两个基本条件，而胰岛素信号传导被抑制又是胰岛素抵抗的重要环节。资料表明，PTP-1B表达升高可引起胰岛素抵抗，从而引发2型糖尿病。PTP-1B的表达水平在糖尿病或发生胰岛素抵抗时明显升高。有关使转基因鼠表达人PTP-1B的研究发现，与对照组相比，实验组鼠肌肉中胰岛素刺激引起的胰岛素受体酪氨酸磷酸化水平降低35％，PI3K活性降低40％～60％，葡萄糖转运所需的蛋白激酶c活性也减弱；表达PTP-1B的小鼠全身葡萄糖清除和肌肉的葡萄糖摄取减少了40％～50％。有研究表明体重指数正常的初诊2型糖尿病较正常对照者存在明显的胰岛素抵抗，而PTP-1B在前者内脏脂肪组织中的表达较后者显著增高，几乎是后者的4倍。可见内脏脂肪组织PTP-1B的表达升高在胰岛素抵抗中也有重要作用。另有研究报道采用PTP-1B反义寡核苷酸处理糖尿病模型小鼠(ob/ob小鼠)，抑制其PTP-1B表达，发现在肝、脂肪和骨骼肌内PTP-1B的表达下调时，ob/ob小鼠血糖恹复正常，与糖代谢有关的各个指标也都趋于正常。
以上结果说明，PTP-1B在拮抗胰岛素信号传导中具有重要作用。糖尿病患者体内PTP(尤其是PTP-1B)含量及活性的异常可能存在多方面的原因，基因变异被认为是主要因素。PTP-1B的基因变异与糖尿病有密切关系。有报道，在对653个样本的研究中，先用限速酶AVAI对样本的一种单核苷酸多肽链消化后，再利用外显子PCR放大技术对其编码发现，带有PTP981T/981C基因型的人群患患2型糖尿病的概率大大增加。
目前，PTP1B抑制剂很多，但是大多都是人工合成得到的，具有很大的副作用，临床上成药性很差，到目前为止，还没有一个PTP1B抑制剂在临床上进行应用。而中草药具有天然，多效，毒性小等特点。从中药和天然药物中寻找能够抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的有效成分是迫切需要解决的课题。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种蛹虫草多肽及其制备方法和应用，采用该制备方法得到的蛹虫草多肽，对蛋白酪氨酸磷酸酶1B具有较好的抑制作用，为临床上开发降血糖、防治胰岛素抵抗、糖尿病的药物提供一个新的途径
一种蛹虫草多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)脱脂：
取蛹虫草，加入脱脂液，在50-80℃下加热回流1-4h进行脱脂处理，随后过滤，滤渣烘干，备用；
所述脱脂液为体积百分浓度为90-100％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、石油醚中的至少一种；
(2)酶解：取上述滤渣分别进行以下酶解：
胃蛋白酶酶解：按照每克滤渣8-25mL的量加入水，调节溶液pH值为1.0-3.0，再按照每克滤渣50-150活力单位的量加入胃蛋白酶，30-40℃下酶解2-6h；随后加热酶解液使酶灭活，冷却，过滤，得含有胃蛋白酶酶解多肽的滤液，干燥，得胃蛋白酶酶解多肽；
和/或
胰蛋白酶酶解：按照每克滤渣8-25mL的量加入水，调节溶液pH值为6.5-9.5，再按照每克滤渣600-1800活力单位的量加入胰蛋白酶，30-40℃下酶解2-6h；随后加热酶解液使酶灭活，冷却，过滤，得含有胰蛋白酶酶解多肽的滤液，干燥，得胰蛋白酶酶解多肽；
和/或
中性蛋白酶酶解：按照每克滤渣8-25mL的量加入水，调节溶液pH值为6-7，再按照每克滤渣750-2250活力单位的量加入中性蛋白酶，30-40℃下酶解2-6h；随后加热酶解液使酶灭活，冷却，过滤，得含有中性蛋白酶酶解多肽的滤液，干燥，得中性蛋白酶酶解多肽；
取所述胃蛋白酶酶解多肽、所述胰蛋白酶酶解多肽和所述中性蛋白酶酶解多肽中的至少一种，即为蛹虫草多肽。
蛹虫草Cordyceps militaris L.Link，又名北冬虫夏草、北虫草，属子囊菌门Ascomycota，粪壳菌纲Sordariomycetes，肉座菌目Hypocreales，虫草菌科Cordycipitaceae，虫草属Cordyceps。《新华本草纲要》记载其“性平，味甘，有益肺肾，补精髓，止血化痰”，用于肺结核、老人虚弱和贫血等疾病的治疗。
本发明人经过长期的实验研究后发现，以上述方法制备得到的蛹虫草多肽组份具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的作用，可用于胰岛素抵抗，糖尿病等病症的治疗中；且蛹虫草药食同源，按照上述方法制备的酶解活性多肽从蛹虫草中直接提取，具有毒性低、安全性高、可长期服用的优点。
在其中一个实施例中，所述(2)酶解：胃蛋白酶酶解多肽的制备中，还将胃蛋白酶酶解多肽滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤；
所述(2)酶解：胰蛋白酶酶解多肽的制备中，还将胰蛋白酶酶解多肽滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤；
所述(2)酶解：中性蛋白酶酶解多肽的制备中，还将中性蛋白酶酶解多肽滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤。
以上述特定截留分子量的超滤柱进行过滤，进一步纯化了滤液中的活性成分。
在其中一个实施例中，所述(1)脱脂步骤中，所述脱脂液的加入量为5-20mL/克蛹虫草。
在其中一个实施例中，所述(2)酶解：胃蛋白酶酶解多肽的制备中，65-100℃下加热酶解液30-60min使胃蛋白酶灭活；
所述(2)酶解：胰蛋白酶酶解多肽的制备中，65-100℃下加热酶解液30-60min使胰蛋白酶灭活；
所述(2)酶解：中性蛋白酶酶解多肽的制备中，65-100℃下加热酶解液30-60min使中性蛋白酶灭活。
以上述温度加热使酶失活，既能达到较好的灭活效果，又可避免过高的温度对得到的多肽产生不利影响。
本发明还公开了上述的蛹虫草多肽的制备方法制备得到的蛹虫草多肽。
上述蛹虫草多肽，具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的作用，可用于胰岛素抵抗，糖尿病等病症的治疗中。
在其中一个实施例中，该蛹虫草多肽的活性成分由所述胃蛋白酶酶解多肽、所述胰蛋白酶酶解多肽和所述中性蛋白酶酶解多肽组成。以上述三种不同酶制备得到的多肽混合，具有较好的抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B活性。
在其中一个实施例中，所述胃蛋白酶酶解多肽、所述胰蛋白酶酶解多肽和所述中性蛋白酶酶解多肽的重量份比为3-5∶0.5-1.5∶2-4，优选4∶1∶3。将三种不同的多肽按照上述比例混合，具有最佳的抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B活性。
本发明还公开了上述的蛹虫草多肽在作为抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制剂和/或作为胰岛素增敏剂中的应用。
在其中一个实施例中，所述蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制剂，和/或所述胰岛素增敏剂在制备用于预防和治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的保健食品或药物中应用。
在其中一个实施例中，所述药物或保健食品的剂型为片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、口服液、丸剂或滴丸。
上述剂型可以采用本领域技术人员熟知的方法来进行药剂的制备。根据需要，可以加入各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。本发明的药剂在制备时，可选择的填充剂包括但不限于：淀粉、糖粉、磷酸钙、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；可选择的粘合剂包括但不限于：羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶化淀粉等；可选择的崩解剂包括但不限于：干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；可选择的润滑剂包括但不限于：硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种蛹虫草多肽的制备方法，先对蛹虫草原料进行脱脂，随后以蛋白酶进行酶解，得到的蛹虫草多肽具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的作用，可用于胰岛素抵抗，糖尿病等病症的治疗中；且蛹虫草药食同源，按照上述方法制备的酶解活性多肽从蛹虫草中直接提取，具有毒性低、安全性高、可长期服用的优点，临床上应用其开发预防或治疗胰岛素抵抗、糖尿病等药物或者保健品，具有非常广阔的应用前景。
并且，将胃蛋白酶酶解多肽、胰蛋白酶酶解多肽和中性蛋白酶酶解多肽以一定的比例配合，具有非常好的抑制效果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下使用的原料来源如下：
蛹虫草子实体，沈阳聚鑫北虫草菌业有限公司；
胃蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司，活力为3500u/g；
胰蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司，活力为40000u/g；
中性蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司，活力为50000u/g；
PTP1B，购自Prospec公司；
Tris，购自有限责任公司背景鼎国生物技术有限责任公司；
HCl，购自西陇化工股份有限公司；
p-NPP(对硝基苯磷酸二钠盐)，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；
熊果酸、科罗索酸，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；
其余试剂均为国产试剂分析纯。
实施例1
一种蛹虫草多肽，通过以下制备方法得到：
一、脱脂。
取蛹虫草子实体粗粉，按照每克蛹虫草加入10mL的量，加入体积百分浓度为95％的乙醇水溶液作为脱脂液，80℃水浴加热回流2h，过滤，滤渣55℃下烘干，即得到蛹虫草脱脂后残渣，备用。
二、酶解。
取上述滤渣分别进行以下酶解：
1、胃蛋白酶酶解多肽的制备。
将上述蛹虫草脱脂后的滤渣按照每克滤渣(干重)10mL水的量加入水，调节溶液pH值1.5，按照蛹虫草脱脂后的滤渣干重的3％的量加入胃蛋白酶(即每克滤渣加入了105unit活力单位的胃蛋白酶)，37℃下震荡酶解4h；80℃下加热酶解液30min，使酶灭活，冷却，过滤，滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，经真空冷冻干燥，即得到蛹虫草胃蛋白酶酶解多肽。
2、胰蛋白酶酶解多肽的制备。
将上述蛹虫草脱脂后的滤渣按照每克滤渣(干重)10mL水的量加入水，调节溶液pH值7.5，按照蛹虫草脱脂后的滤渣干重的3％的量加入胰蛋白酶(即每克滤渣加入了1200unit活力单位的胰蛋白酶)，37℃下震荡酶解4h；80℃下加热酶解液30min，使酶灭活，冷却，过滤，滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，经真空冷冻干燥，即得到蛹虫草胰蛋白酶酶解多肽。
3、中性蛋白酶酶解多肽的制备。
将上述蛹虫草脱脂后的滤渣按照每克滤渣(干重)10mL水的量加入水，调节溶液pH值6.5，按照蛹虫草脱脂后的滤渣干重的3％的量加入中性蛋白酶(即每克滤渣加入了1500unit活力单位的中性蛋白酶)，37℃下震荡酶解4h；80℃下加热酶解液30min，使酶灭活，冷却，过滤，滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，经真空冷冻干燥，即得到蛹虫草中性蛋白酶酶解多肽。
实施例2
一种蛹虫草多肽，与实施例1的蛹虫草多肽基本相同，其制备方法的区别在于：
一、脱脂。
取蛹虫草子实体粗粉，按照每克蛹虫草加入10mL的量，加入乙酸乙酯作为脱脂液，60℃水浴加热回流2h，过滤，滤渣55℃下烘干，即得到蛹虫草脱脂后残渣，备用。
实施例3
一种蛹虫草多肽，与实施例1的蛹虫草多肽基本相同，其制备方法的区别在于：
一、脱脂。
取蛹虫草子实体粗粉，按照每克蛹虫草加入10mL的量，加入石油醚作为脱脂液，55℃水浴加热回流2h，过滤，滤渣55℃下烘干，即得到蛹虫草脱脂后残渣，备用。
实施例4
一种蛹虫草多肽，与实施例1的蛹虫草多肽基本相同，其制备方法的区别在于：
一、脱脂。
取蛹虫草子实体粗粉，按照每克蛹虫草加入10mL的量，加入体积比为1∶1的乙酸乙酯∶石油醚混合液作为脱脂液，60℃水浴加热回流2h，过滤，滤渣55℃下烘干，即得到蛹虫草脱脂后残渣，备用。
对比例1
一种蛹虫草混合多肽，通过以下制备方法得到：
二、脱脂。
取蛹虫草子实体粗粉，按照每克蛹虫草加入10mL的量，加入95％乙醇作为脱脂液，80℃水浴加热回流2h，过滤，滤渣55℃下烘干，即得到蛹虫草脱脂后残渣，备用。
二、酶解。
将上述蛹虫草脱脂后的滤渣按照每克滤渣(干重)10mL水的量加入水，调节溶液pH值6.5，再按照蛹虫草脱脂后的滤渣干重的3％的量加入胃蛋白酶(即每克滤渣加入了105unit活力单位的胃蛋白酶)，按照蛹虫草脱脂后的滤渣干重的3％的量加入中性蛋白酶(即每克滤渣加入了1500unit活力单位的中性蛋白酶)，按照蛹虫草脱脂后的滤渣干重的3％的量加入胰蛋白酶(即每克滤渣加入了1200unit活力单位的胰蛋白酶)，在上述三种蛋白酶的共同作用下，37℃震荡酶解4h；80℃下加热酶解液30min，使酶灭活，冷却，过滤，滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，经真空冷冻干燥，即得到蛹虫草混合多肽。
实验例
酶解法制备的三种蛹虫草活性多肽对抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用。
一、实验方法。
将上述实施例4中制备得到蛹虫草多肽进行蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性作用实验。
参照文献(Zhang，Y.L.，et al.″Geranylated 2-arylbenzofurans from Morusalba var.tatarica and their alpha-glucosidase and protein tyrosinephosphatase 1B inhibitory activities.″Fitoterapia 92：116-126.(2014))报道的方法测定PTP1B的活性。简述如下：
PTP1B活性测定反应体系，包括：100mM p-NPP(底物)，10μL；0.01μg/μL的PTP1B，20μL；缓冲液(25mM Tris-HCl，1mM EDTA，1mM DTT，2mM β-巯基乙醇；pH 7.5)，65μL；样品5μL，总反应体系100μL。
测定方法：在96孔板中先加入65μL缓冲液，再分别加入5μL样品，后加入20μL 0.01μg/μL的PTP1B酶，30℃孵育5min，后加入10μL 100mM p-NPP启动反应，30℃反应30min，用50μL预冷的3M NaOH终止反应，在405nm处测定吸光度值(OD)。
按照上述酶活性测定方法，将表1所示的不同样品用DMSO溶解，405nm处测定吸光度值，每个浓度设置三个复孔，按照如下公式计算抑制率：
抑制率＝(OD阴性对照组-OD空白对照组)-(OD样品-OD样品空白对照组)/(OD阴性对照组-OD空白对照组)×100％
其中：OD阴性对照组包括：缓冲液+PTP1B酶+底物；
OD空白对照组包括：缓冲液+底物；
OD样品包括：缓冲液+样品+PTP1B酶+底物；
OD样品空白对照组包括：缓冲液+样品+底物；
二、实验结果
如下表所示：
表1蛹虫草活性多肽对PTP1B的抑制作用
*表示与样品4相比，P≤0.05。
从上述结果中可以看出，本发明的胃蛋白酶酶解多肽、胰蛋白酶酶解多肽或中性蛋白酶酶解多肽，均有蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用，且其抑制作用与公知的蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂熊果酸和科罗索酸相比，达到甚至远超过熊果酸和科罗索酸；将胃蛋白酶酶解多肽、胰蛋白酶酶解多肽、中性蛋白酶酶解多肽以4∶1∶3的重量比混合，其对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用要强于任意一种，并且其抑制率远超过熊果酸和科罗索酸；而通过对比例1制备得到的蛹虫草混合多肽其对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用要远不如熊果酸和科罗索酸。
并且，将胃蛋白酶酶解多肽、胰蛋白酶酶解多肽和中性蛋白酶酶解多肽按照4∶1∶3重量比配合后，具有最佳的抑制活性，与熊果酸和科罗索酸相比，具有统计学上的显著性差异。
而将胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶进行混合酶解所得到的混合多肽，其活性反而不佳，不如分别酶解制备得到的蛹虫草多肽，推测可能与其酶解条件有关。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种蛹虫草多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脱脂：
取蛹虫草，加入脱脂液，在50-80℃下加热回流1-4h进行脱脂处理，随后过滤，滤渣烘干，备用；
所述脱脂液为体积百分浓度为90-100％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、石油醚中的至少一种；
(2)酶解：取上述滤渣分别进行以下酶解：
胃蛋白酶酶解：按照每克滤渣8-25mL的量加入水，调节溶液pH值为1.0-3.0，再按照每克滤渣50-150活力单位的量加入胃蛋白酶，30-40℃下酶解2-6h；随后加热酶解液使酶灭活，冷却，过滤，得含有胃蛋白酶酶解多肽的滤液，还将胃蛋白酶酶解多肽滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，干燥，得胃蛋白酶酶解多肽；
胰蛋白酶酶解：按照每克滤渣8-25mL的量加入水，调节溶液pH值为6.5-9.5，再按照每克滤渣600-1800活力单位的量加入胰蛋白酶，30-40℃下酶解2-6h；随后加热酶解液使酶灭活，冷却，过滤，得含有胰蛋白酶酶解多肽的滤液，还将胰蛋白酶酶解多肽滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，干燥，得胰蛋白酶酶解多肽；
中性蛋白酶酶解：按照每克滤渣8-25mL的量加入水，调节溶液pH值为6-7，再按照每克滤渣750-2250活力单位的量加入中性蛋白酶，30-40℃下酶解2-6h；随后加热酶解液使酶灭活，冷却，过滤，得含有中性蛋白酶酶解多肽的滤液，还将中性蛋白酶酶解多肽滤液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，干燥，得中性蛋白酶酶解多肽；
取所述胃蛋白酶酶解多肽、所述胰蛋白酶酶解多肽和所述中性蛋白酶酶解多肽，混合即为蛹虫草多肽；
所述胃蛋白酶酶解多肽、所述胰蛋白酶酶解多肽和所述中性蛋白酶酶解多肽的重量份比为3-5：0.5-1.5：2-4。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述(1)脱脂步骤中，所述脱脂液的加入量为5-20mL/克蛹虫草。
3.根据权利要求1所述的蛹虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述(2)酶解：胃蛋白酶酶解多肽的制备中，65-100℃下加热酶解液30-60min使胃蛋白酶灭活；
所述(2)酶解：胰蛋白酶酶解多肽的制备中，65-100℃下加热酶解液30-60min使胰蛋白酶灭活；
所述(2)酶解：中性蛋白酶酶解多肽的制备中，65-100℃下加热酶解液30-60min使中性蛋白酶灭活。
4.权利要求1-3任一项所述的蛹虫草多肽的制备方法制备得到的蛹虫草多肽。
5.权利要求4所述的蛹虫草多肽在制备抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制剂中的应用。
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