Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN106319031A - 反复自然流产相关微小rna及其应用 - Google Patents

反复自然流产相关微小rna及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106319031A
CN106319031A CN201510351082.9A CN201510351082A CN106319031A CN 106319031 A CN106319031 A CN 106319031A CN 201510351082 A CN201510351082 A CN 201510351082A CN 106319031 A CN106319031 A CN 106319031A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mirna
seq
sample
people
recurrent spontaneous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510351082.9A
Other languages
English (en)
Inventor
张璇
顾艳
孙兆贵
王建梅
杨倩
王健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SECOND HOSPITAL OF TIANJIN MEDICAL UNIVERSITY
Shanghai Institute of Planned Parenthood Research
Original Assignee
SECOND HOSPITAL OF TIANJIN MEDICAL UNIVERSITY
Shanghai Institute of Planned Parenthood Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SECOND HOSPITAL OF TIANJIN MEDICAL UNIVERSITY, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research filed Critical SECOND HOSPITAL OF TIANJIN MEDICAL UNIVERSITY
Priority to CN201510351082.9A priority Critical patent/CN106319031A/zh
Publication of CN106319031A publication Critical patent/CN106319031A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于诊断自然反复流产的microRNA标志物。具体地，本发明涉及可用于区分自然反复流产组织及正常组织的microRNA标志物hsa‑miR‑3074。经检验证明，该特异性的microRNA标志物可非常有效地诊断和/或预测自然反复流产。本发明还涉及标志物microRNA hsa‑miR‑3074的应用及用于检测自然反复流产的试剂盒。

Description

反复自然流产相关微小RNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域。具体地说，本发明涉及hsa-miR-3074-5p基因在鉴别RM病理妊娠的方法和应用。
背景技术
人类正常妊娠的建立和维持需要经历胚胎植入、胎盘形成、胚胎发育等一系列重要环节，受到多层面不同系统的协同调控，其中任一环节障碍均会导致自然流产等不良妊娠结局。2005年，人类生殖和胚胎学协会(ESHRE，EuropeanSociety of Human Reproduction and Embryology)将“流产”定义为：(1)尿妊娠试验阳性或者血HCG水平升高，但超声或组织学未能确认妊娠的情况为“生化流失”，一般发生于妊娠6周之前；(2)当超声或组织学能够确认为宫内妊娠时，称之为“临床流产”，又可细分为早期流产(妊娠12周之前)与晚期流产(妊娠12周到22周之间)。据估计，人类妊娠中生化流失率达60％；早期临床妊娠流产率达15％，并且与年龄显著相关，在20-24岁时临床流产率为10％，而40-44岁时，流产率达51％；晚期流产率一般在4％。
反复自然流产(recurrent spontaneous miscarriages，RSM)又称为RM(recurrent miscarriages)或者是RPL(recurrent pregnancy loss)，是指与同一性伴侣连续发生2次及2次以上的妊娠第20周之前的自然流产，在妊娠期妇女中的发病率约为1-2％。RSM病因复杂，涉及遗传、生殖内分泌、生殖道解剖、感染及女性自身免疫等诸多方面，虽然已有大量研究聚焦于这个领域，但仍有半数以上原因不明。而临床上对于如何鉴定以及预测RM的发生的研究，仍是空白。
miRNA是一类在真核生物体内广泛表达的非编码RNA分子，多由21-25个核苷酸组成，通过与靶基因转录产物mRNA的3′-UTR互补结合，抑制其翻译过程而调控靶基因的表达。目前人类成熟miRNAs的统计量已达2578个(miRBase20.0)，调控着近50％的蛋白编码基因。miRNA的表达具有组织特异性及时序性(即只在特定的组织和发育阶段表达)，这就意味着其在细胞生长和发育过程中起多种调节作用，包括：细胞增殖、凋亡、代谢、维持干细胞多能性及分化等。已有研究发现，miRNA可能参与调控胚胎的发育和选择、子宫内膜容受性的形成、母胎界面的血管重铸和免疫功能调节等，而上述的这些生物过程均与人妊娠的建立有密切关系，因此有理由相信miRNA在妊娠建立过程中具有重要作用。虽然其确切的作用机制有待阐明，但miRNA作为鉴别RM的候选分子在临床应用上具有广阔前景意见显露出来。
综上所述，从现有的研究可以看出，目前人们对RM的鉴别以及预测方法知之甚少。因此，本领域急需能够用于RM鉴别和预测的分子，为RM发病机制的研究及其生物标志分子的筛选鉴定提供新的途径。
发明内容
本发明提供了miRNA-3074与反复自然流产之间的相关性及其应用。
本发明第一方面，提供了miRNA-3074或其检测试剂的用途，用于制备判断反复自然流产(recurrent spontaneous miscarriages，RSM)的试剂盒。
在另一优选例中，所述miRNA-3074来源于哺乳动物，优选为小鼠、大鼠或人。
在另一优选例中，所述miRNA-3074包括miRNA-3074-3p或miRNA-3074-5P，优选为miRNA-3074-5p。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有miRNA-3074作为阳性对照。
在另一优选例中，所述的判断包括预先判断。
在另一优选例中，所述检测试剂盒的检测样本包括血液或组织。
在另一优选例中，所述的组织包括绒毛组织或蜕膜组织。
在另一优选例中，所述miRNA-3074的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括引物、反义核酸、探针或芯片。
本发明第二方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于miRNA-3074。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：
互补结合区；和/或
与固相载体相连的连接区。
本发明第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有miRNA-3074或其检测试剂，和说明书，所述的说明书中注明所述的试剂盒用于判断反复自然流产。
在另一优选例中，所述的使用说明书注明以下内容：
当所检测的样本中，miRNA-3074的表达量E1与对照基因表达量E0之比E1/E0≥2，则提示该检测样本为反复自然流产样本。
本发明第四方面，提供了一种体外非诊断性的判断样本是否为反复自然流产样本的方法，包括步骤：
测定所述样本中，miRNA-3074的表达量E1，并将其与与对照基因表达量E0进行比较，若E1/E0≥2，则提示该检测样本为反复自然流产样本。
本发明第五方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：
(i)miRNA-3074家族的miRNA，或
(ii)与miRNA-3074互补的miRNA。
在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。
在另一优选例中，所述miRNA-3074包括miRNA-3074-3p或miRNA-3074-5P，优选为miRNA-3074-5p。
本发明第六方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第五方面所述的miRNA。
本发明第七方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第五方面所述的miRNA。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II，
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
本发明第八方面，提供了一种判断检测对象是否患有反复自然流产的方法，包括步骤：
测定所述检测对象的样本中miRNA-3074的表达量E1，并将其与与对照基因表达量E0进行比较，若E1/E0≥2，则提示所述检测对象患有反复自然流产。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了hsa-miR-3074-5p的成熟体碱基序列；
图2显示了采用Real-time PCR鉴定RM绒毛中hsa-miR-3074-5p的表达变化；
图3显示了采用Real-time PCR鉴定RM血液中hsa-miR-3074-5p的表达。
具体实施方式
本发明人经过长期而广泛的研究，通过检测反复自然流产样本血清和正常样本血清的microRNA表达谱水平，首次从中筛选出特异性的microRNA：hsa-miR-3074。经检验证明，hsa-miR-3074作为microRNA标志物可非常有效地区分反复自然流产组织样本和正常样本。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人利用实时PCR系统，采用△Ct方法(CtmiR-3074—CtU6)比较反复自然流产和正常人群血清中miR-3074表达差异。该microRNA可预测样本是来自反复自然流产样本还是正常样本，其预测准确度高。基于本发明的microRNA，可以开发成试剂盒，用于鉴别反复自然流产。
miRNA及其前体
本发明提供了一类新的从人中发现的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:1(GUUCCUGCUGAACUGAGCCAG)所示的序列。为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。
本专利中所述miRNA-3074包括miRNA-3074-3p或miRNA-3074-5P，因为miRNA-3074-3p和miRNA-3074-5P分别是由miRNA-3074前体的5’端臂和3’端臂加工而来的，而且产生的两种miRNA在表达上没有明显的表达差异。
反义寡核苷酸
根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了其反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。
将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正 向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
芯片
microRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种microRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种microRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的microRNA的转录水平进行检测。
利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。
在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分自然反复流产样本和正常样本。
本发明的所述的miRNA芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针包括SEQ ID NO:1所示的序列。
具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
另一方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：
(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；
(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；
(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。
从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。
更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。
对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。
将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。
然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray 3000等)获取待测信息。
检测试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于诊断自然反复流产病理妊娠，优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
本发明的主要优点
(a)本发明提供了一种可用于鉴别诊断自然反复流产的microRNA标志物。
(b)由本发明microRNA标志物可非常有效地对自然反复流产病理妊娠进行诊断和/或预测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1血清标志物的筛选
方法:
选择于医院计划生育门诊就诊的反复流产患者,按下列纳入标准招募研究对象，再经研究对象知情同意后，收集反复流产15例。
1.hsa-miR-3074-5p表达水平的实时荧光定量PCR检测
1)实验试剂及其配制
(1)RT引物：由锐博生物公司提供(RN：R10031.2)，按说明书进行操作，冻干粉配用Rnase-free的水配制成5μM的引物储存液后，分装存储；使用前，稀释10倍(45μl水+5μl储存液)，配制成500nM的RT引物工作液。
(2)RT酶：MulV Reverse Transcriptase，为Roche公司产品。
(3)10×PCR Buffer：为AB公司产品。
(4)实时荧光定量PCR仪：美国ABI公司的7300Real-Time PCR System
2)绒毛组织RNA的提取
(1)将预先收集在TRIZOL试剂中组织从-80℃冰箱取出，放研钵中，用研棒将组织在液氮中研碎，待组织研成液体状时，室温放置5min；
(2)吸取液体，4℃，12000rpm离心5min；
(3)收集上清，按TRIZOL/ml加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2-3min；
(4)4℃，12000rpm离心15min；
(5)吸取上层水相，按TRIZOL/ml加入500μl异丙醇，室温放置10min；
(6)4℃，12000rpm离心10min；弃上清，RNA沉于管底；
(7)按TRIZOL/ml加入1ml 75％乙醇，Vortex悬浮沉淀；
(8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
(9)室温干燥5-10min；
(10)用DEPC水溶解RNA(20μl体积)；
(11)测OD值(按1:200稀释)，对RNA进行定量。
3)全血RNA的提取
(1)将预先收集在TRIZOL试剂中组织从-80℃冰箱取出，放研钵中，用研棒将组织在液氮中研碎，待组织研成液体状时，室温放置5min；
(2)吸取液体，4℃，12000rpm离心5min；
(3)收集上清，按TRIZOL/ml加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2-3min；
(4)4℃，12000rpm离心15min；
(5)吸取上层水相，按TRIZOL/ml加入500μl异丙醇，室温放置10min；
(6)4℃，12000rpm离心10min；弃上清，RNA沉于管底；
(7)按TRIZOL/ml加入1ml 75％乙醇，Vortex悬浮沉淀；
(8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
(9)室温干燥5-10min；
(10)用DEPC水溶解RNA(20μl体积)；
(11)测OD值(按1:200稀释)，对RNA进行定量。
4)RT反应：引物浓度按说明书设定，按下表配制RT反应溶液，所有操作均在冰浴中进行：
混匀后瞬时离心，70℃中放置10分钟后在冰浴中放置2分钟，在上述引物反应液中，按下表加入试剂，建立50ul的RT反应体系：
RT反应溶液 19μl
10×RT Buffer 5μl
dNTP Mix(10mM) 1μl
RNase inhibitor(40U/μl) 1μl
RT酶 0.5μl
RNase-free H2O 23.5μl
总体积 50μl
为了避免加样误差，实际操作中，将上述反应体系中相同的部分合并混匀后再分别上样，其中设立一个阴性对照反应管(不加RT酶)。RT反应条件：42℃，60分钟；70℃，10分钟。
5)PCR反应：用ddH2O将RT产物稀释5倍，即：50μl RT产物+200μl ddH2O；按下表建立10μl的PCR反应体系：
稀释后的RT产物 2.0μl
SYBR Green Mix 5.0μl
Bulge-loopTM F(5uM) 0.4μl
Bulge-loopTMR(5uM) 0.4μl
RNase-free H2O 2.2μl
总体积 10μl
同理，为了减少避免加样误差，实际操作中同样先准备混合物后再分别加入不同引物。设立1个对照反应(NE)，不加RT产物(用H2O代替)，将PCR反应液加到384孔PCR板(ABI公司)，设3个复孔。按下表设置热循环参数：
6)数据处理
ΔCt＝(目的基因Ct-内参Ct)的平均值；ΔΔCt＝(待测样品中目的基因ΔCt-参照样品中目的基因ΔCt)的平均值，若无参照样品则默认参照样品ΔCt＝10进行计算，本实验以CDA/VA样品为参照样品，相对样品初始模板量＝(2-ΔΔCt)的平均值。
结果：在反复流产患者外周血样本中利用qPCR研究发现，miR-3074-5p的表达的平均Ct值为26.14，标准差为0.35；而在同样的反应条件下，内参U6表达的的平均Ct值为17.7，标准差为0.54，说明在反复流产的外周血中，miR-3074-5p具有较高水平的表达，而且在不同病例之间的个体差异不显著。
实施例2制备miRNA芯片
将本发明提供的miRNA序列(SEQ ID NO:1)转换成互补序列，根据产生序列的GC比等特征在序列两端加上10-20nt的连接序列；核心序列不同，连接序列也不同。连接序列可以由程序随机产生，连接序列和核心序列形成的探针满足以下条件：
1)探针序列中，同一种核苷酸(A、C、G、T)的数量不能超过序列总数的50％；
2)任何连续的A、T或C、G的数量不能超过序列总数的25％；
3)G、C含量占序列总数的40％-60％；
4)探针序列不能自杂交，即探针序列中互补片段的长度不能超过探针长度的30％。
为使合成的探针稳定的结合在玻片上，采用常规的方法在合成后探针的5’端进行糖基修饰。
芯片的点制：先将玻片的表面进行烷基化修饰，以提高结合能力。采用常规的芯片点样方法进行点样，为了检测杂交试验的可重复性，每个探针在玻片上点3-6个杂交点。
实施例3试剂盒制备
将实施例3中制备的芯片封装好，与使用说明书一起置于一盒中，构成试剂盒。
实施例4芯片的检测验证
对从医院获得多个自然反复流产样本(包括20例自然反复流产绒毛样本、20例血清样本样本和30例正常样本)，按实施例1-2的方法制备和标记microRNA，按实施例3的方法制备的芯片，用双盲法进行检测。根据本发明所示的microRNA标志物的存在与否以及上调和下调情况来判断样本。其中，阳性对照和阴性对照分别为已知的自然反复流产样本和正常样本。
结果表明，包括本发明的种特异性microRNA的芯片，其正确性以及重复性稳定性很好(灵敏度可达88.5％，特异性达71.73％.)，可以有效区分自然反复流产样本和正常样本。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.miRNA-3074或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备判断反复自然流产(recurrent spontaneous miscarriages，RSM)的试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA-3074的序列如SEQ IDNO.:1所示。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂包括引物、反义核酸、探针或芯片。
4.一种miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于miRNA-3074。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有miRNA-3074或其检测试剂，和说明书，所述的说明书中注明所述的试剂盒用于判断反复自然流产。
6.一种体外非诊断性的判断样本是否为反复自然流产样本的方法，其特征在于，包括步骤：
测定所述样本中，miRNA-3074的表达量E1，并将其与与对照基因表达量E0进行比较，若E1/E0≥2，则提示该检测样本为反复自然流产样本。
7.一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：
(i)miRNA-3074家族的miRNA，或
(ii)与miRNA-3074互补的miRNA。
8.一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成如权利要求7所述的miRNA。
9.一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成如权利要求7所述的miRNA。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
11.一种判断检测对象是否患有反复自然流产的方法，其特征在于，包括步骤：
测定所述检测对象的样本中miRNA-3074的表达量E1，并将其与与对照基因表达量E0进行比较，若E1/E0≥2，则提示所述检测对象患有反复自然流产。
CN201510351082.9A 2015-06-23 2015-06-23 反复自然流产相关微小rna及其应用 Pending CN106319031A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510351082.9A CN106319031A (zh) 2015-06-23 2015-06-23 反复自然流产相关微小rna及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510351082.9A CN106319031A (zh) 2015-06-23 2015-06-23 反复自然流产相关微小rna及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106319031A true CN106319031A (zh) 2017-01-11

Family

ID=57729009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510351082.9A Pending CN106319031A (zh) 2015-06-23 2015-06-23 反复自然流产相关微小rna及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106319031A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107338324A (zh) * 2017-09-08 2017-11-10 南京医科大学 用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
CN107447008A (zh) * 2017-08-24 2017-12-08 南京医科大学 用于诊断不明原因复发性流产的增强子rna组合、引物组及应用和试剂盒
CN107937512A (zh) * 2017-11-23 2018-04-20 南京医科大学 用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
CN108048559A (zh) * 2018-01-24 2018-05-18 上海市第妇婴保健院 miR-184在自然流产预警作用中的应用
CN109423514A (zh) * 2017-08-24 2019-03-05 上海市计划生育科学研究所 反复自然流产相关微小rna及其应用
WO2019071902A1 (zh) * 2017-10-09 2019-04-18 南京鼓楼医院 miR-21在制备治疗宫腔粘连和/或薄型内膜的药物中的应用
WO2021174620A1 (zh) * 2020-03-04 2021-09-10 四川大学华西第二医院 一种对绒毛组织中Siglecs家族的检测方法及其试剂盒和应用
CZ310025B6 (cs) * 2022-12-02 2024-05-15 GeneSpector s.r.o. Způsob predikce těhotenských komplikací spojených s vysokým rizikem těhotenské ztráty dle expresního profilu kardiovaskulárních miRNA

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2181332A1 (en) * 2007-07-25 2010-05-05 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microrna as a diagnostic marker
KR101169653B1 (ko) * 2011-12-09 2012-08-03 의료법인 성광의료재단 마이크로 알엔에이 염기서열 다형을 이용한 원인불명 반복 자연 유산 진단에 필요한 정보제공 방법 및 진단용 조성물
CN103667516A (zh) * 2014-01-07 2014-03-26 山东大学齐鲁医院 早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱及诊断模型

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2181332A1 (en) * 2007-07-25 2010-05-05 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microrna as a diagnostic marker
KR101169653B1 (ko) * 2011-12-09 2012-08-03 의료법인 성광의료재단 마이크로 알엔에이 염기서열 다형을 이용한 원인불명 반복 자연 유산 진단에 필요한 정보제공 방법 및 진단용 조성물
CN103667516A (zh) * 2014-01-07 2014-03-26 山东大学齐鲁医院 早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱及诊断模型

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FULU DONG等: "Genome-wide miRNA profiling of villus and decidua of recurrent spontaneous abortion patients", 《REPRODUCTION》 *
STARK MS等: "Accession:MI0014181", 《MIRBASE》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109423514A (zh) * 2017-08-24 2019-03-05 上海市计划生育科学研究所 反复自然流产相关微小rna及其应用
CN107447008A (zh) * 2017-08-24 2017-12-08 南京医科大学 用于诊断不明原因复发性流产的增强子rna组合、引物组及应用和试剂盒
CN107338324B (zh) * 2017-09-08 2021-10-22 南京医科大学 用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
CN107338324A (zh) * 2017-09-08 2017-11-10 南京医科大学 用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
GB2578975A (en) * 2017-10-09 2020-06-03 Nanjing Drum Tower Hospital Use of miR-21 in preparation of drugs for treating intrauterine adhesion and/or thin endometrium
WO2019071902A1 (zh) * 2017-10-09 2019-04-18 南京鼓楼医院 miR-21在制备治疗宫腔粘连和/或薄型内膜的药物中的应用
JP2020537631A (ja) * 2017-10-09 2020-12-24 南京鼓楼医院Ｎａｎｊｉｎｇ Ｄｒｕｍ Ｔｏｗｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｍｉＲ−２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜治療用薬の製造における応用
JP7043529B2 (ja) 2017-10-09 2022-03-29 南京鼓楼医院 ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜治療用薬の製造における応用
US11471541B2 (en) 2017-10-09 2022-10-18 Nanjing Drum Tower Hospital Use of miR-21 in preparation of drug for treating intrauterine adhesion and/or thin endometrium
GB2578975B (en) * 2017-10-09 2022-11-30 Nanjing Drum Tower Hospital Use of miR-21 in preparation of drugs for treating intrauterine adhesion.
CN107937512A (zh) * 2017-11-23 2018-04-20 南京医科大学 用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒
CN108048559A (zh) * 2018-01-24 2018-05-18 上海市第妇婴保健院 miR-184在自然流产预警作用中的应用
WO2021174620A1 (zh) * 2020-03-04 2021-09-10 四川大学华西第二医院 一种对绒毛组织中Siglecs家族的检测方法及其试剂盒和应用
CZ310025B6 (cs) * 2022-12-02 2024-05-15 GeneSpector s.r.o. Způsob predikce těhotenských komplikací spojených s vysokým rizikem těhotenské ztráty dle expresního profilu kardiovaskulárních miRNA

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106319031A (zh) 反复自然流产相关微小rna及其应用
KR101987358B1 (ko) 신규한 간암 진단용 바이오 마커 및 이의 용도
US20200248269A1 (en) Methods for predicting the outcome of a cancer in a patient by analysing gene expression
KR102089559B1 (ko) 난소의 fsh에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도
EP2759602A1 (en) Non-invasive prenatal genetic diagnostic methods
US20230227914A1 (en) Biomarkers of oral, pharyngeal and laryngeal cancers
CN102002490A (zh) 9个用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物
CN108676872A (zh) 一种与哮喘相关的生物标志物及其应用
CN108026532A (zh) 新型mirna生物标志物及其用途
CN109423514A (zh) 反复自然流产相关微小rna及其应用
CN103555848A (zh) 小RNA的3’-5’-qPCR定量检测技术
CN103757122B (zh) 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-188-5p检测试剂盒及其检测方法
CN102851282B (zh) 用于区分原发性肺癌与癌旁组织的microRNA标志物
CN102851283A (zh) 用于区分转移与非转移肺鳞癌的microRNA标志物
CN105985955A (zh) 小rna组成的指纹图谱在胃癌中的应用
CN107299129A (zh) 循环核酸作为乳腺癌生物标志物的应用
WO2014057279A1 (en) Micro-rna biomarkers for prostate cancer
CN102094070A (zh) HER2过量表达的mRNA原位杂交检测试剂盒
CN109628594A (zh) 一种与肝癌相关的长链非编码rna及其应用
CN105734155B (zh) 软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用
CN108624678A (zh) 一种用于子痫前期诊治的生物标志物
CN111808966B (zh) miRNA在诊断乳腺癌患病风险的应用
Thorson et al. Identification of SYT-SSX transcripts from synovial sarcomas using RT-multiplex PCR and capillary electrophoresis
CN108728439A (zh) 小rna组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用
CN107029238B (zh) Linc01094在诊治缺血性脑卒中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170111