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CN105906720A - 靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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CN105906720A
CN105906720A CN201610321208.2A CN201610321208A CN105906720A CN 105906720 A CN105906720 A CN 105906720A CN 201610321208 A CN201610321208 A CN 201610321208A CN 105906720 A CN105906720 A CN 105906720A
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chimeric antigen
cell
immunocyte
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姚惟琦
武栋成
袁冰
熊威
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HAMITON BIOLOGICAL TECHNOLOGY CORP Ltd
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Abstract

本发明提供了一种靶向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、CD19ScFv、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域、41BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，并进一步提供了该靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其制备方法，和其在制备抗肿瘤相关药物中的应用。本发明的靶向性嵌合抗原受体结构中加入了促进T细胞增殖与活化的基因序列，能保证T细胞进入体内后还可以增殖，使杀瘤效果更持久、治疗更精准、靶向更精准、杀瘤范围更广，同时成本更低廉，易于推广。

Description

靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其制备方法和应用。
背景技术
CAR-T细胞治疗是突破了主要组织相容性抗原复合体(majorhistocompatibility complex)限制，克服了肿瘤细胞由于缺失MHC分子而逃逸的机制。该技术主要是应用分子克隆技术手段，以病毒转染方式将一段带有胞外肿瘤抗原结合区域(直接靶向性识别肿瘤细胞)、T细胞胞内信号传递(传递肿瘤细胞信号给T细胞)及激活区域(活化T细胞，使其具有增长且抗衰老凋亡能力)的载体质粒转染到患者自体分离得到的T细胞内，通过在T淋巴细胞外源表达识别靶标抗原的单链抗体、间隔区、跨膜区以及T细胞活化基序，赋予T淋巴细胞特异性靶向杀伤肿瘤的能力。在2013年底的第55届美国血液学会年会上，CAR-T细胞治疗获得了特别关注。来自斯隆凯特琳癌症中心、宾夕法尼亚大学癌症中心和国立癌症研究院的3个课题组，分别报道了抗CD19的CAR-T细胞在儿童和成人B细胞恶性肿瘤(包括慢性、急性淋巴细胞性白血病和B细胞淋巴瘤)的早期临床试验。他们报道的治疗结果非常令人振奋，在这些患者已做过多次化疗并且已经产生复发或耐药的背景下，CAR-T细胞治疗反应的效率仍能达到60％-80％。
CAR-T技术虽然万众瞩目，寄予厚望，从现有数据来看，大部分患者在接受CAR-T细胞治疗后完全缓解，故CAR结构的肿瘤杀伤细胞具有极大的潜力成为“唯一可以治愈癌症的‘活的药物’”。
但该技术依旧存在许多地方需要改进与优化，如：1)效应细胞的选择，T细胞是否是最优的杀伤细胞；2)肿瘤靶点的筛选，优良的CAR细胞靶点可以提高其肿瘤杀伤的特异性，且可以避免T细胞进行CAR改造之后出现早衰的现象；3)转导系统的安全性，病毒转染的基因改造是否对患者绝对安全，且表达元件的优化以及副反应的抑制等；4)缓解副反应，由于CAR-T细胞展现出强大的杀伤肿瘤的效力，故杀伤过程中强大的细胞因子风暴，以及一时之间数以亿计的肿瘤细胞破碎所产生的高浓度毒性物质造成对人体机体的副反应，严重者或将致命；5)技术成本的高昂，由于CAR-T细胞现阶段操作步骤十分繁琐，故技术成本高，在后期大规模临床应用中患者承担的治疗费用十分高昂，故建立在降低成本基础上的技术研究对于CAR技术的后期临床应用十分有意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种靶向性嵌合抗原受体以及一种靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，旨在使嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的靶向性高、效应细胞杀伤温和且技术成本低。
本发明第一方面提供了一种靶向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、CD19ScFv、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域、41BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
本发明第二方面提供了上述靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
本发明的第三个方面提供了一种表达靶向性嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，所述慢病毒载体的启动子与终止子之间依次连有CD8α信号肽、CD19ScFv、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域、41BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。
本发明的第四个方面提供了制备如上所述的靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的方法，包括如下步骤：
a.获取免疫细胞；
b.构建嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ慢病毒表达载体；
c.制备嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的免疫细胞。
在本发明的第五个方面提供了如上所述的嵌合抗原受体的免疫细胞在制备抗肿瘤相关药物中的应用。
本发明的有益效果为：
治疗更精准：由于CAR-CD19免疫细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁。
靶向更精准：本发明提供的CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围，CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制。
杀瘤范围更广：鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用。正如我们选取的CD19靶点，在许多B细胞淋巴瘤中都有高表达，如急性B细胞淋巴瘤ALL，慢性B细胞淋巴瘤CLL，急性髓系淋巴瘤AML等，这些都是本发明免疫疗法的适应症。
杀瘤效果更持久：本发明新一代CAR结构中加入了促进T细胞增殖与活化的基因序列，如CD28，41BB等，能保证T细胞进入体内后还可以增殖，CAR-CD19免疫细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活，从而在治愈癌症的同时预防癌症的复发。
成本更低廉：本发明的病毒制备和浓缩，免疫细胞纯化和培养，病毒转导等技术流程都经过优化和改良，在不降低质量和疗效的前提下，极大的压缩了成本，为CAR项目在中国的推广创造了一定的基础。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为流式细胞术对分离培养的T细胞表型分析的结果，其中CD3CD56：2.4％；CD3：93.8％。
图2为流式细胞术对分离培养的T细胞表型分析的结果，其中CD3CD4：77.1％。
图3为流式细胞术对分离培养的T细胞表型分析的结果，其中CD3CD8：13.4％。
图4为质粒pCDH-CD8-CD28-41BB-CD3ζ的酶切片段的电泳鉴定图。
图5为质粒pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ的酶切片段的电泳鉴定图。
图6为重组质粒pCDH-CD19-ScFv-CD28-41BB-CD3ζ结构示意图。
图7为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体CD19scFv-CD28-41BB-CD3ζ的病毒浓缩液对T细胞的感染效率。
图8为流式细胞术检测嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的T细胞表型鉴定的结果，其中CD3CD56：25.7％；CD3：94.5％。
图9为流式细胞术检测嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的T细胞表型鉴定的结果，其中CD3CD56：24.7％。
图10为流式细胞术检测嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的T细胞表型鉴定的结果，其中CD3CD8：52.3％。
图11为荧光定量RT-qPCR检测嵌合抗原受体CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ在T细胞内的表达结果。
图12为未加CAR19-T的肿瘤细胞与加入CAR19-T的肿瘤细胞的细胞凋亡对比结果。
图13为T细胞、CAR-T细胞，T加K562-CD19共培养细胞和CAR-T加K562-CD19共培养细胞释放TNF-α、IL-2、IFN-γ和Perforin等细胞因子的对比图。
具体实施方式
本发明第一方面提供了一种靶向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、CD19ScFv、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域、41BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域依次串联构成。
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.1所示。
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体的基因编码序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
本发明第二方面提供了上述靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
另外，根据本发明实施例提供的一种靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述免疫细胞选自T细胞或者CIK细胞，其中CIK细胞是自体、同种异体或异种CIK细胞。
本发明的第三个方面提供了一种表达靶向性嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，所述慢病毒载体的启动子与终止子之间依次连有CD8α信号肽、CD19ScFv、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域、41BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。
本发明的第四个方面提供了制备如上所述的靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.获取免疫细胞；
b.构建嵌合抗原受体pCDH-mCD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ慢病毒表达载体；
c.制备嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的免疫细胞。
根据本发明的实施例，所述步骤a包括如下步骤：
1)获取单核细胞；
2)培养基培养。
根据本发明的实施例，所述步骤b包括如下步骤：
1)制备免疫细胞cDNA；
2)制备慢病毒质粒pCDH-CD8-CD28-41BB-CD3ζ；
3)制备慢病毒质粒pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ。
根据本发明的实施例，所述步骤c包括如下步骤：
1)包装和浓缩慢病毒；
2)扩增培养慢病毒载体感染免疫细胞及感染后细胞；
3)体外诱导扩增成富含CD3CD56双阳性的CAR-CD19-免疫细胞群；
4)流式细胞术检测嵌合抗原受体CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ在免疫细胞内的表达。
在本发明的第五个方面提供了如上所述的嵌合抗原受体的免疫细胞在制备抗肿瘤相关药物中的用途。
根据本发明的实施例，所述肿瘤为CD19阳性的难治性白血病或淋巴瘤。
下面将结合具体实施例对本发明提供的靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其制备方法和应用予以进一步说明。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
本发明的实施例中所用的试剂如下：
X-VIVO 15无血清培养基细胞培养基，购自LONZA公司
淋巴细胞分离液，购自深圳达科为公司
CD3单克隆抗体、retronoctin，重组人蛋白干扰素-γ、重组人白介素2(IL-2)，Takara公司，总RNA提取试剂Trizol(Invitrogen)、高保真DNA聚合酶(KOD-Plus-Neo)、T4DNA连接酶，均购自TaKaRa公司
RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit，购自Fermentas公司
BgI II、EcoRI、Mlu I、BamHl，均购自Fermentas公司
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒，均购自OMEGA公司
pCMV-G、pRSV-Rev和pMDLg-pRRE，均购自Addgene公司
Trans1-TIPhageResistant化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司
HEPES和氯化钙粉剂，购自Sigma公司
羟基荧光素琥珀酞亚胺酯，购自圣地亚哥，CA，USA
PI试剂，购自碧云天生物
实施例1T细胞的制备
(1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。
(2)PBMCs洗三次，采用含有5％自体血清的T细胞培养基(X-VIVO 15无血清培养基)调整细胞终浓度为2x106cell/mL；将细胞接种于预先经过终浓度为5ug/mLCD3单克隆抗体及终浓度为10ug/mL的retronectin(购自TAKORA公司)包被的75厘米细胞培养瓶。培养基里加入终浓度为1000U/mL的重组人蛋白干扰素-γ和1000U/mL的重组人白介素2，在37℃、饱和湿度为5％的CO2培养箱中培养。
(3)第四天，向瓶中补加100ml含有体积比0.6％自体血清的T细胞培养基，加入终浓度为1000U/mL的重组人白介素2。于37℃、饱和湿度为5％的CO2培养箱中培养，得到T细胞，流式细胞术对T细胞表型进行分析。结果见图1-3，其中CD3：93.8％；CD3CD4：77.1％；CD3CD8：13.4％；CD3CD56：2.4％。
实施例2：嵌合抗原受体(pCDH-mCD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ)慢病毒表达载体的构建
(1)从美国国立医学图书馆l刊站(htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entroz)GennBank数据库中搜索到人CD8α信号肽基因、人CD8α铰链区基因、人CD28跨膜区和胞内区基因、人41BB胞内区以及人CD3ζ胞内区基因序列。鼠源抗CD19单链抗体(抗CD19ScFv)基因序列来自专利(专利号：ZL200610015650.9)，将其进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。CD19scFV的DNA序列见SEQ ID NO.3，其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.4；CD8的DNA序列见SEQ ID NO.5，其编码的氨基酸序列见SEQID NO.6；CD28的DNA序列见SEQ ID NO.7，其编码的氨基酸序列见SEQ IDNO.8；41BB的DNA序列见SEQ ID NO.9，其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.10；CD3的DNA序列见SEQ ID NO.11，其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.12。
将上述基因序列依次按人CD8α信号肽基因、抗CD19scFv、人CD8α铰链区基因、人CD28跨膜区和胞内区基因、人41BB胞内区以及人CD3胞内区基因序列进行连接，并在头端引入Kozak序列，在各序列连接处引入不同的酶切位点，形成最终完整的mCD19-CAR基因序列信息，所述mCD19-CAR的氨基酸序列见SEQ ID NO.1，基因编码序列如序列表中SEQ ID NO.2。
(2)T细胞cDNA的制备
离心沉淀实施例1培养的人源T细胞，用Trizol提取细胞的总RNA，-80℃保存备用。用M-MLV(Promega)逆转录得T细胞的cDNA链，-20℃分装保存备用。
(3)慢病毒质粒pCDH-CD8-CD28-41BB-CD3ζ的制备
所用引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成，引物序列如下：
P1(SEQID NO.13)：5'-TTCGTGCCGGTCTTCCTGC-3'
P2(SEQID NO.14)：5'-GTTCCTGTGGTTGCAGTAAAGGG-3'
P3(SEQID NO.15)：5'-AGGAGTAAGAGGAGCAGGC-3'
P4(SEQID NO.16)：5'-GGAGCGATAGGCTGCGAAG-3'
P5(SEQID NO.17)：5'-CGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGC-3'
P6(SEQID NO.18)：5'-CAGTTCACATCCTCCTTCTTC-3'
P7(SEQID NO.19)：5'-AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC-3'
P8(SEQID NO.20)：5'-GCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG-3'
以步骤(1)中T细胞cDNA为模板，用引物P1、P2进行PCR扩增，得到长249bp的CD8的hinGe区和跨膜区，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.5所示；用引物P3、P4进行PCR反应，扩增长123bp的CD28胞内信号结构域，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.7所示；用引物P5、P6进行PCR反应，扩增长141bp的41BB胞内信号结构域，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.9所示；用引物P7、P8进行PCR反应，扩增长236bp的CD3ζ胞内信号结构域，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.11所示，各步PCR扩增反应体系相同，以扩增41BB胞内信号结构域为例，进行PCR扩增，PCR反应条件参照TOYOBA KOD-plus-Neo的说明书，反应体系(50μL)如下：
双蒸水：31.5μL
5X反应buffer：10μL
dNTPs Mixture(2.5mM each)：1μL
MGSO4：1μL
P3(10mM)：1μL
P4(10mM)：1μL
T细胞cDNA(200nG/μL)：1μL
KOD-plus Neo DNA polymerase：0.5μL
将上述PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收。得到片段分别进行双酶切反应，酶切产物普通DNA产物纯化试剂盒回收备用。慢病毒表达载体pCDH-GFP(购自美国SBI公司)用Not I/BamH I双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的CD8、CD28、41BB、CD3ζ片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，220rpm培养12h后质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶Not I和BamH I双酶切鉴定，鉴定电泳图见图4，其中，1泳道：质粒pCDH-CD8-CD28-41BB-CD3ζ的酶切片段(749bp；3泳道：DNA分子量标记Dl15000。将鉴定正确的质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为pCDH-CD8-CD28-41BB-CD3ζ。
(4)慢病毒质粒pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ的制备
全基因合成编码鼠源抗CD19scFv的基因编码序列，序列如序列表中
SEQID NO.6所示，由天一辉远科技有限公司合成，其5’端含有EcoR I、kozak序列，3’端含有Not I酶切位点，克隆在质粒pGSI(购自美国SBI公司)中，命名为pGSI-CD19ScFv。质粒经EcoR I/Not I双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段备用。
pCDH-CD8-CD28-41BB-CD3ζ质粒经限制性内切酶EcoR I/Not I进行酶切。酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段备用。然后与回收的含有一大鼠生长激素信号肽和CD19ScFv的DNA片段通过T4DNA连接酶进行连接，具体方法见说明书。将连接产物转化Trans1-TI PhaGe Resistant化学感受态细胞：37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶EcoR I/BamH I双酶切鉴定，鉴定结果如图5所示，其中，1泳道：DNA分子量标记D15000；2泳道：质粒pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ的酶切片段(1625bp)。将鉴定正确的质粒送北京大一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序〕将测序结果正确的重组质粒命名为pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ，亦称为CAR-CD19，其结构示意图如图6所示，其中包括信号肽、抗CD19单链抗体、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域、41BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。
实施例3嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的T细胞的制备
(1)慢病毒的包装和浓缩
用质粒大提试剂盒分别提取慢病毒表达质粒pCDH-CD19scFv-CD28-41BB-CD3ζ和辅助质pCMV-G、pRSV-Rev和pMDLG-pRRE分光光度计测定质粒浓度，四种质粒以3：1：2：2的质量比用磷酸钙转染试剂共转染293T细胞。分别在转染72h时收集病毒上清于15ml管中，4℃，500G离心10min，转移上清至新15ml管中，用0.45um滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5×PEG6000-NaCI按照4：1的体积比混匀，4℃摇匀过夜，然后4℃，10000G离心60min，弃上清，沉淀用4℃预冷的X-VIVO 15无血清培养基溶解，即得病毒浓缩液，进行分装，-80℃保存备用。
(2)慢病毒载体感染T细胞及感染后细胞的扩增培养
感染前，用Retronectin 15μg/mL包被24孔板，取实施例1在25cm2培养瓶的培养的1x107T细胞，弃掉旧的培养液，加入1mL新鲜X-VIVO 15无血清培养基加庆大霉素，200μL病毒液，IL-2终浓度为100U/ml，1800rpm，32℃，离心60min，然后置于37℃，5％CO2孵箱中感染，12小时后，弃培养液，重复上述步骤一次。最后利用流式细胞术检测并计算该病毒的感染效率，采用FITC标记羊抗鼠IGG-Fab进行免疫孵育，结果如图7所示，感染效率为43.7％。
(3)体外诱导扩增成富含CD3CD56双阳性的CAR-CD19-T细胞群
将感染后的T细胞应用含有终浓度为500U/ml IL-2的X-VIVO 15无血清培养基培养液对CART细胞进行体外诱导、待细胞量占培养瓶8-90％时将细胞转入细胞培养袋中，隔2天加入终浓度500U/ml的X-VIVO 15无血清培养基培养液扩增培养，待细胞扩增到1x109左右后，采用流式细胞仪对感染的细胞群体进行鉴定，细胞表型一般达到：CD3阳性细胞比例＞90％；CD3CD8阳性细胞比例＞50％；CD3CD56双阳性细胞比例＞20％，测试结果见图8-10，CD3：94.5％；CD3CD4：24.7％；CD3CD8：52.3％；CD3CD56：25.7％。
(4)荧光定量RT-qPCR检测嵌合抗原受体CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ在T细胞内的表达
分别收集1×106感染pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζT细胞(即CAR19-T细胞)及末感染病毒对照组细胞(T)，用2％多聚甲醛固定，进行逆转录-qPCR检测基因的表达，检测结果如图11，图中阳性参照物(Positive Control)指转染pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ重组质粒的T细胞，T为未转染质粒也未转导病毒的T细胞；CAR19-T为转导pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ病毒的T细胞。结果表明，嵌合抗原受体在T细胞内表达，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.1所示。
实施例4CAR19-T细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的细胞毒性分析
分别取实施例3中制备的CAR19-T细胞和实施例1中培养的T细胞用羧基荧光素琥珀酞亚胺酰(CFSE)进行预染色，次日与K562，K562-CD19和Raji细胞以5：1，10：1，20：1比率进行共培养，经过4小时的共培养后，PI进行染色。流式细胞术对细胞凋亡进行检测，细胞死亡的量根据下面的公式计算：死亡率＝(对照－样品)/对照×100％)，对照为未加CAR19-T的肿瘤细胞：样本为加入CAR19-T的肿瘤细胞，测试结果见图12。从图12中可以看出嵌合抗原受体CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的T细胞对高表达CD19的肿瘤细胞具有特异杀伤活性，杀瘤率显著高于对照组。
实施例5CAR19-T细胞体外释放细胞因子的检测
ELlSA法测定细胞因子的水平：
ELlSA试剂盒(购自R&D公司)，按试剂盒说明操作。
l)待检测样品来自于T细胞上清、CAR-T细胞上清，T加K562-CD19共培养细胞上清和CAR-T加K562-CD19共培养细胞上清从-20℃取出，室温融化。
2)将浓缩洗涤液、浓缩稀释液、标准品、密封板条从冰箱中取出室温预温。
3)分别将浓缩洗涤液(25X)和浓缩稀释液(5X)用双蒸水稀释至工作浓度(lX)。
4)制备标准品：加入稀释液至冻干标准品中，轻轻震荡至少15m in至彻底溶解，混匀，稀释至2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6和0pG/mL。
5)制备样品：将步骤1)所述待检样品用稀释液做5倍稀释。
6)分别将稀释后的样品或不同浓度的标准品加入相应孔中100uL/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h。
7)洗板吐次，200uL/孔。
8)将检测抗体平衡至室温，加入200uL/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h。
9)洗板4次，200uL/孔。。
10)将显色底物A液和B液平衡至室温，避光，等体积混合后15min内加到各孔200uL/孔，室温避光孵育30min(视显色深浅灵活掌握)。
11)将终止液平衡至室温，加入终止液50uL/孔，混匀后30min内酶标仪450nm(检测波长和570nm(校正波长)波长测量吸收值(OD450和OD570)。
12)绘出线性标准曲线，通过样品的OD值计算出其浓度。
如图13所示，CAR-T细胞与K562-CD19共培养时，可靶向性的释放大量的TNF-α、IL-2、IFN-γ和Perforin等细胞因子，促进自身的增值并杀伤肿瘤细胞。
实施例6取5x105个CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的T淋巴细胞，连续三天静脉回输到CD19阳性的肿瘤患者体内，治疗一个月后进行分析。
初步检测免疫组化检测工程化CD19靶向性的T细胞回输到患者体内的归巢情况，淋巴结活检出现在肿瘤组织中的CD3CD19阳性免疫细胞，初步表明CD19靶向性的T细胞能够归巢到病灶部位发挥杀伤作用。
CT检测工程化CD19靶向性的T细胞对CD19恶性肿瘤患者的初步治疗效果，肿大淋巴结缩小。初步表明工程化CD19靶向性的T细胞治疗后患者病变淋巴结增速较前明显减慢，并于治疗3周后，肿大淋巴结开始自行消退。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种靶向性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、CD19ScFv、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域、41BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
2.根据权利要求1所述的靶向性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的靶向性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的基因编码序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
4.一种靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述嵌合抗原受体为权利要求1至3任一项权利要求所述的靶向性嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述的一种靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞选自T细胞或者CIK细胞，所述CIK细胞是自体、同种异体或异种CIK细胞。
6.表达靶向性嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，其特征在于：所述慢病毒载体的启动子与终止子之间依次连有CD8α信号肽、CD19ScFv、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域、41BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。
7.制备如权利要求4所述的靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a.获取免疫细胞；
b.构建嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ慢病毒表达载体；
c.制备嵌合抗原受体pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ修饰的免疫细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤b包括如下步骤：
1)制备免疫细胞cDNA；
2)制备慢病毒质粒pCDH-CD8-CD28-41BB-CD3ζ；
3)制备慢病毒质粒pCDH-CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤c包括如下步骤：
1)包装和浓缩慢病毒；
2)扩增培养慢病毒载体感染免疫细胞及感染后细胞；
3)体外诱导扩增成富含CD3CD56双阳性的CAR-CD19-免疫细胞群；
4)流式细胞术检测嵌合抗原受体CD19ScFv-CD28-41BB-CD3ζ在免疫细胞内的表达。
10.权利要求4所述的靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备抗肿瘤相关药物中的应用。
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Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520806A (zh) * 2016-11-03 2017-03-22 山东维真生物科技有限公司 一种重组car基因及其载体、car‑t细胞和应用
CN106520837A (zh) * 2016-11-30 2017-03-22 河南省华隆生物技术有限公司 一种重组载体及其应用
CN106544365A (zh) * 2016-10-25 2017-03-29 山东兴瑞生物科技有限公司 一种人抗cd19嵌合抗原受体修饰的cik的制备方法及应用
CN106636155A (zh) * 2016-12-23 2017-05-10 郑州大学第附属医院 Cd19‑car基因序列在恶性b细胞肿瘤中的应用
CN106754725A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 北京普瑞金科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法与应用
CN106749681A (zh) * 2017-02-10 2017-05-31 河南大学淮河医院 靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用
CN106755088A (zh) * 2016-11-11 2017-05-31 广东万海细胞生物科技有限公司 一种自体car‑t细胞制备方法及应用
CN107098981A (zh) * 2017-06-29 2017-08-29 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞
CN107384870A (zh) * 2017-07-31 2017-11-24 时力生物科技（北京）有限公司 一种靶向pd‑l1嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN108277205A (zh) * 2016-12-30 2018-07-13 四川大学 表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途
CN108314739A (zh) * 2018-02-05 2018-07-24 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108330133A (zh) * 2017-01-20 2018-07-27 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向cd19嵌合抗原受体并对其双重修饰的方法及其用途
CN108341881A (zh) * 2018-01-31 2018-07-31 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108424927A (zh) * 2018-02-10 2018-08-21 武汉波睿达生物科技有限公司 一种能同时表达cd19 car和敲低t细胞表面pd-1表达的质粒结构及其构建方法
CN109385402A (zh) * 2017-08-11 2019-02-26 上海恒润达生生物科技有限公司 一种等比例混合两种靶点cart细胞的制备方法及应用
CN110669144A (zh) * 2019-10-12 2020-01-10 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN112469734A (zh) * 2018-08-03 2021-03-09 南京驯鹿医疗技术有限公司 表达嵌合抗原受体的t细胞、该嵌合抗原相关表达载体以及它们的应用
WO2022179563A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Hangzhou Qihan Biotechnology Co., Ltd. Systems and compositions for enhanced immunotherapies and methods thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1299410A (zh) * 1998-04-21 2001-06-13 麦克美特(显微医学)生物医学研究有限公司 CD19xCD3特异性多肽及其用途
CN1919871A (zh) * 2006-09-14 2007-02-28 中国医学科学院血液学研究所 用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1－CD19scFv融合基因工程蛋白及其用途
WO2015187528A1 (en) * 2014-06-02 2015-12-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting cd-19
CN105153315A (zh) * 2015-10-09 2015-12-16 重庆倍思益生物科技有限公司 免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1299410A (zh) * 1998-04-21 2001-06-13 麦克美特(显微医学)生物医学研究有限公司 CD19xCD3特异性多肽及其用途
CN1919871A (zh) * 2006-09-14 2007-02-28 中国医学科学院血液学研究所 用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1－CD19scFv融合基因工程蛋白及其用途
WO2015187528A1 (en) * 2014-06-02 2015-12-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting cd-19
CN105153315A (zh) * 2015-10-09 2015-12-16 重庆倍思益生物科技有限公司 免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOMCHILO VUYISICH等: "A Dual-Purpose Protein Ligand for Effective Therapy and Sensitive Diagnosis of Anthrax", 《THE PROTEIN JOURNAL》 *

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544365A (zh) * 2016-10-25 2017-03-29 山东兴瑞生物科技有限公司 一种人抗cd19嵌合抗原受体修饰的cik的制备方法及应用
CN106544365B (zh) * 2016-10-25 2019-11-22 山东兴瑞生物科技有限公司 一种人抗cd19嵌合抗原受体修饰的cik的制备方法及应用
CN106520806A (zh) * 2016-11-03 2017-03-22 山东维真生物科技有限公司 一种重组car基因及其载体、car‑t细胞和应用
CN106755088A (zh) * 2016-11-11 2017-05-31 广东万海细胞生物科技有限公司 一种自体car‑t细胞制备方法及应用
CN106520837A (zh) * 2016-11-30 2017-03-22 河南省华隆生物技术有限公司 一种重组载体及其应用
CN106636155A (zh) * 2016-12-23 2017-05-10 郑州大学第附属医院 Cd19‑car基因序列在恶性b细胞肿瘤中的应用
CN106754725A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 北京普瑞金科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法与应用
CN108277205A (zh) * 2016-12-30 2018-07-13 四川大学 表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途
CN108277205B (zh) * 2016-12-30 2022-12-20 四川大学 表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途
CN108330133A (zh) * 2017-01-20 2018-07-27 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向cd19嵌合抗原受体并对其双重修饰的方法及其用途
CN106749681A (zh) * 2017-02-10 2017-05-31 河南大学淮河医院 靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用
CN107098981A (zh) * 2017-06-29 2017-08-29 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞
CN107098981B (zh) * 2017-06-29 2020-05-01 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞
CN107384870A (zh) * 2017-07-31 2017-11-24 时力生物科技（北京）有限公司 一种靶向pd‑l1嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN109385402A (zh) * 2017-08-11 2019-02-26 上海恒润达生生物科技有限公司 一种等比例混合两种靶点cart细胞的制备方法及应用
CN108341881A (zh) * 2018-01-31 2018-07-31 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108341881B (zh) * 2018-01-31 2020-08-18 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108314739B (zh) * 2018-02-05 2020-07-14 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108314739A (zh) * 2018-02-05 2018-07-24 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108424927A (zh) * 2018-02-10 2018-08-21 武汉波睿达生物科技有限公司 一种能同时表达cd19 car和敲低t细胞表面pd-1表达的质粒结构及其构建方法
CN112469734A (zh) * 2018-08-03 2021-03-09 南京驯鹿医疗技术有限公司 表达嵌合抗原受体的t细胞、该嵌合抗原相关表达载体以及它们的应用
CN110669144A (zh) * 2019-10-12 2020-01-10 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN110669144B (zh) * 2019-10-12 2021-09-17 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用
WO2022179563A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Hangzhou Qihan Biotechnology Co., Ltd. Systems and compositions for enhanced immunotherapies and methods thereof

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