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CN105189488B - 用作溴区结构域抑制剂的咔唑化合物 - Google Patents

用作溴区结构域抑制剂的咔唑化合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及咔唑化合物、包含本发明化合物的药用组合物，及使用所述组合物治疗多种病症的方法。

Description

用作溴区结构域抑制剂的咔唑化合物
技术领域
本发明涉及化合物、包含所述化合物的药物组合物及其在治疗中的用途。
背景技术
真核生物的基因组高度组织于细胞核内。双螺旋DNA的长链包裹在组蛋白的八聚体周围形成核小体。接着此基本单元通过核小体聚集及折叠得以进一步压缩以形成高度凝聚的染色质结构。可能发生一系列不同状态的凝集，且在细胞周期中此结构的紧密性变化，在细胞分裂过程中最为致密。近来已了解，染色质模板形成一组根本上重要的称为后生调节(epigenetic regulation)的基因控制机制。通过赋予组蛋白及DNA多种特定化学修饰(诸如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化)，后生调节剂会调节人类基因组的结构、功能及可接近性，从而对基因表达产生巨大影响。
组蛋白乙酰化通常与基因转录的活化最为相关，这是因为该修饰通过改变静电学而使DNA与组蛋白八聚体的相互作用减弱。除此物理变化之外，特异性蛋白会结合于组蛋白内的乙酰化赖氨酸残基上以读取后生编码。溴区结构域(bromodomain)为在组蛋白的情形下通常而非独占地结合于乙酰化赖氨酸残基的蛋白内的小的(约110个氨基酸)独特结构域。存在已知含有溴区结构域的大约50个蛋白的家族，且其在细胞内具有一系列功能。含有溴区结构域的蛋白的BET家族包含4种蛋白(BRD2、BRD3、BRD4及BRD-T)，所述蛋白含有能够极靠近地结合于两个乙酰化赖氨酸残基的串联溴区结构域，从而增加相互作用的平铺特异性(tile specificity)。
据报导BRD2及BRD3与组蛋白沿积极转录基因相关，且可能涉及促进转录延长(Leroy等人,Mol.Cell.2008 30(1):51-60)，而BRD4似乎涉及将pTEF-I3复合物募集至诱导性基因中，从而造成RNA聚合酶磷酸化及转录输出增加(Hargreaves等人,Cell,2009 138(1):1294145)。已报导所有家族成员具有某种控制或执行细胞周期方面的功能，且已显示在细胞分裂期间仍保持与染色体的复合物形式，从而表明维持后生记忆的作用。另外，一些病毒使用这些蛋白将其基因组连接至宿主细胞染色质作为病毒复制过程的一部分(You等人Cell,2004 117(3):349-60)。
近来与此目标有关的论文包括Prinjha等人,Trends in PharmacalogicalSciences,2012年3月,第33卷,第3期,第146-153页；Conway,ACS Med.Chem.Lett.,2012,3,691-694；及Hewings等人,J.Med.Chem.,2012,55,9393-9413。
据报导正研发的小分子BET抑制剂包括GSK-525762A、OTX-015以及来自University of Oxford及Constellation Pharmaceuticals Inc.的其他抑制剂。
已鉴别出数百种后生效应子，其中许多为染色质结合蛋白或染色质修饰酶。这些蛋白与多种病症相关，诸如神经退化性病症、代谢疾病、炎症及癌症。因此，抑制溴区结构域与其同源乙酰化蛋白结合的这些化合物预示治疗一系列自身免疫及炎性疾病或病症及治疗各种类型的癌症的新颖方法。
发明内容
在本发明的第一方面，提供式(I)化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体
其中：
A为任选取代的杂芳基，其中所述取代基为一个或多个R14、R15或R16；
R为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-CO-、任选取代的芳基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的杂芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-OCO-或任选取代的(C3-C8)环烷基-OCO-；
R1为卤素、-CN、OH、-NR3R4、-CONR3R4、-COOH、-OCONR3R4、-NHOCOR7、-NHCONR7R8、-NHSO2NR7R8、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的芳基(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、-NHSO2-任选取代的(C1-C6)烷基、-NHSO2-任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-NHSO2-或任选取代的杂环基-NHSO2-；
R2为H、卤素、-CN、-COOH、-CONR7R8、-OCONR3R4、-NHSO2R7、-NHCOR7、-NHCOOR7、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
R15为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
R16为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一个方面，提供药物组合物，其包含本发明化合物或其药用盐及一种或多种药用载体、稀释剂或赋形剂。
在另一个方面，提供用于治疗的本发明化合物或其药用盐。具体地，用于治疗溴区结构域抑制剂所针对的疾病或病症。
在另一个方面，提供治疗自身免疫及炎性疾病或病症的方法，其包括向有需要受试者给予治疗有效量的溴区结构域抑制剂。
在本发明的另一个方面，提供治疗有需要患者的含有溴区结构域的蛋白介导的病症的方法，其包括向该患者给予本发明化合物的步骤。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供式(I)化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体：
其中：
A为任选取代的杂芳基，其中所述取代基为一个或多个R14、R15或R16；
R为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-CO-、任选取代的芳基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的杂芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-OCO-或任选取代的(C3-C8)环烷基-OCO-；
R1为卤素、-CN、OH、-NR3R4、-CONR3R4、-COOH、-OCONR3R4、-NHOCOR7、-NHCONR7R8、-NHSO2NR7R8、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的芳基(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、-NHSO2-任选取代的(C1-C6)烷基、-NHSO2-任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-NHSO2-或任选取代的杂环基-NHSO2-；
R2为H、卤素、-CN、-COOH、-CONR7R8、-OCONR3R4、-NHSO2R7、-NHCOR7、-NHCOOR7、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
R15为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
R16为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一方面，提供式(II)化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体
其中：
A为任选取代的杂芳基，其中所述取代基为一个或多个R14、R15或R16；
R为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-CO-、任选取代的芳基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的杂芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-OCO-或任选取代的(C3-C8)环烷基-OCO-；
R1为卤素、-CN、OH、-NR3R4、-CONR3R4、-COOH、-OCONR3R4、-NHOCOR7、-NHCONR7R8、-NHSO2NR7R8、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的芳基(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、-NHSO2-任选取代的(C1-C6)烷基、-NHSO2-任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-NHSO2-或任选取代的杂环基-NHSO2-；
R2为H、卤素、-CN、-COOH、-CONR7R8、-OCONR3R4、-NHSO2R7、-NHCOR7、-NHCOOR7、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
R15为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
R16为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一方面，提供式(III)化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体
其中
A为任选取代的杂芳基，其中所述取代基为一个或多个R14、R15或R16；
R为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-CO-、任选取代的芳基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的杂芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-OCO-或任选取代的(C3-C8)环烷基-OCO-；
R1为卤素、-CN、OH、-NR3R4、-CONR3R4、-COOH、-OCONR3R4、-NHOCOR7、-NHCONR7R8、-NHSO2NR7R8、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的芳基(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、-NHSO2-任选取代的(C1-C6)烷基、-NHSO2-任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-NHSO2-或任选取代的杂环基-NHSO2-；
R2为H、卤素、-CN、-COOH、-CONR7R8、-OCONR3R4、-NHSO2R7、-NHCOR7、-NHCOOR7、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
R15为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
R16为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、-CN、-NR3R4、OH、-NHOCOR7、-OCONR7R8、-NHCONR7R8或-CF3；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一方面，提供下式化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体
其中
A为任选取代的杂芳基，其中所述取代基为一个或多个R14、R15或R16；
R为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-CO-、任选取代的芳基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的杂芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-OCO-或任选取代的(C3-C8)环烷基-OCO-；
R1为卤素、-CN、OH、-NR3R4、-CONR3R4、-COOH、-OCONR3R4、-NHOCOR7、-NHCONR7R8、-NHSO2NR7R8、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的芳基(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、-NHSO2-任选取代的(C1-C6)烷基、-NHSO2-任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-NHSO2-或任选取代的杂环基-NHSO2-；
R2为H、卤素、-CN、-COOH、-CONR7R8、-OCONR3R4、-NHSO2R7、-NHCOR7、-NHCOOR7、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R15为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R16为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一方面，提供下式化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体
其中
A为任选取代的杂芳基，其中所述取代基为一个或多个R14、R15或R16；
R为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-CO-、任选取代的芳基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的杂芳基-SO2-、任选取代的(C1-C6)烷基-OCO-或任选取代的(C3-C8)环烷基-OCO-；
R1为卤素、-CN、OH、-NR3R4、-CONR3R4、-COOH、-OCONR3R4、-NHOCOR7、-NHCONR7R8、-NHSO2NR7R8、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的芳基(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、-NHSO2-任选取代的(C1-C6)烷基、-NHSO2-任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-NHSO2-或任选取代的杂环基-NHSO2-；
R2为-CN、-COOH或-CONR7R8；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R15为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R16为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一方面，提供下式化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体
其中：
A为任选取代的杂芳基，其中所述取代基为一个或多个R14、R15或R16；
R为任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-或任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2；
R1为卤素、-CN、OH、-NR3R4、-CONR3R4、-COOH、-OCONR3R4、-NHOCOR7、-NHCONR7R8、-NHSO2NR7R8、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-、任选取代的芳基(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷氧基、任选取代的杂环基-CO-、任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、-NHSO2-任选取代的(C1-C6)烷基、-NHSO2-任选取代的杂环基、任选取代的(C1-C6)烷基-NHSO2-或任选取代的杂环基-NHSO2-；
R2为-CN、-COOH或-CONR7R8；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R15为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R16为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一方面，提供下式化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体
其中：
A为任选取代的杂芳基，其中所述取代基为一个或多个R14、R15或R16；
R为任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-或任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2；
R1为任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-或任选取代的杂环基-CO-；
R2为-CN、-COOH或-CONR7R8；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R15为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R16为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一方面，提供下式化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体
其中
A为
R为任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-或任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2；
R1为任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-、任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-或任选取代的杂环基-CO-；
R2为-CN、-COOH或-CONR7R8；
R3为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
R4为氢、任选取代的(C1-C6)烷基或任选取代的(C3-C8)环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C2-C8)杂芳基或(C2-C8)杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C2-C6)烯基、任选取代的(C2-C6)炔基、氰基(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基(C1-C6)烷基、任选取代的芳基氧基(C1-C6)烷基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基(C1-C6)烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基(C1-C6)烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的(C4-C8)杂芳基或(C4-C8)杂环；
R12和R13独立地为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的(C1-C6)烷基、任选取代的(C3-C8)环烷基、任选取代的(C1-C6)烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的(C1-C6)烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R15为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
R16为氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢。
在另一个方面，提供选自第一方面的范围内的示例的实例的化合物、或其药用盐、互变异构体或立体异构体。
在另一方面，提供选自任一以上方面的范围内的任何化合物子集所列的化合物。
本发明的一个实施方案提供如下化合物，其中A为任选取代的异噁唑，优选经一个或多个C1-C6烷基取代的异噁唑。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中A为
且R14、R15及R16如上文所定义。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R1为任选取代的杂环基-CO-。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R1为任选取代的(C3-C8)环烷基-CO-。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R1为任选取代的(C3-C8)环烷基-SO2-。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R1为任选取代的C1-C6烷基-SO2-。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R1为任选取代的C1-C6烷基。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R为任选取代的C1-C6烷基。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R为任选取代的(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R为任选取代的苄基。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R为–SO2-任选取代的C1-C6烷基。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R为–SO2-任选取代的(C3-C8)环烷基。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R2为–CONR7R8，其中R7和R8优选为氢或C1-C6烷基。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R2为COOH。
本发明的另一实施方案提供如下化合物，其中R2为-CN。
在另一实施方案中，本发明化合物的IC50值≤5μM。
在另一实施方案中，本发明化合物的IC50值≤0.5μM。
在另一实施方案中，本发明化合物的IC50值≤0.05μM。
II.本发明的其他实施方案
在另一实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含药用载体及治疗有效量的至少一种本发明化合物或其立体异构体、互变异构体、药用盐或溶剂化物。
在另一实施方案中，本发明提供制备本发明化合物或其立体异构体、互变异构体、药用盐或溶剂化物的方法。
在另一实施方案中，本发明提供抑制有需要患者的含有溴区结构域的蛋白介导的病症的活性的方法，其包括向该患者给予至少一种本发明化合物的步骤。
在另一实施方案中，本发明提供治疗和/或预防各种类型的癌症的方法，其包括向需要该治疗和/或预防的患者单独给予治疗有效量的一种或多种本发明化合物，或任选其与另一本发明化合物和/或至少一种其他类型的治疗剂的组合。
在另一实施方案中，本发明提供用于治疗的本发明化合物。
在另一实施方案中，本发明提供在治疗中同时、分别或先后使用的本发明化合物与其他治疗剂的组合制剂。
在另一实施方案中，本发明提供抑制含有溴区结构域的蛋白的方法，其包括使该蛋白与任何例示化合物或其药用盐或组合物接触。
III.治疗应用
本发明的式(I)化合物为溴区结构域抑制剂且对治疗溴区结构域抑制剂所针对的疾病及病症具有潜在效用。
在一个实施方案中，提供治疗有需要受试者的溴区结构域抑制剂所针对的疾病或病症的方法，其包括给予治疗有效量的式(I)化合物或其药用盐。
在另一实施方案中，提供治疗有需要受试者的慢性自身免疫和/或炎性病症的方法，其包括给予治疗有效量的一种或多种式(I)化合物或其药用盐。
在另一实施方案中，提供治疗有需要受试者的癌症的方法，其包括给予治疗有效量的一种或多种式(I)化合物或其药用盐。
在一个实施方案中，有需要受试者为哺乳动物，尤其为人类。
认为溴区结构域抑制剂适用于治疗与全身性或组织炎症、对感染或缺氧的炎症反应、细胞活化及增殖、脂质代谢、纤维变性相关的多种疾病或病症，及预防及治疗病毒感染。
溴区结构域抑制剂可适用于治疗多种慢性自身免疫及炎性病症，诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、急性痛风、银屑病、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、炎性肠病(克罗恩病及溃疡性结肠炎)、哮喘、慢性阻塞性气道疾病、肺炎、心肌炎、心包炎、肌炎、湿疹、皮炎、秃发症、白斑病、水泡性皮肤病、肾炎、血管炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、抑郁症、视网膜炎、葡萄膜炎、巩膜炎、肝炎、胰腺炎、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、阿狄森病、垂体炎、甲状腺炎、I型糖尿病及移植器官的急性排斥反应。
溴区结构域抑制剂可适用于治疗多种急性炎性病症，诸如急性痛风、巨细胞性动脉炎、肾炎(包括狼疮肾炎)、伴有器官受侵的血管炎(诸如肾小球肾炎)、血管炎(包括巨细胞性动脉炎)、韦格纳氏肉芽肿(Wegener's granulomatosis)、结节性多动脉炎、贝切特病(Behcet's disease)、川崎病(Kawasaki disease)、高安动脉炎(Takayasu's Arteritis)及移植器官的急性排斥反应。
溴区结构域抑制剂可适用于预防或治疗涉及对细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它毒素感染的炎症反应的疾病或病症，诸如败血病、败血症综合征、败血性休克、内毒素血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能障碍综合征、中毒性休克综合征、急性肺损伤、ARDS(成人呼吸窘迫综合征)、急性肾衰竭、暴发型肝炎、灼伤、急性胰腺炎、手术后综合征、结节病、赫克斯海默反应(Herxheimer reaction)、脑炎、脊髓炎、脑膜炎、疟疾、与病毒感染相关的SIRS(诸如流行性感冒、带状疱疹、单纯疱疹及冠状病毒)。
溴区结构域抑制剂可适用于预防或治疗与局部缺血再灌注损伤相关的病症，诸如心肌梗塞、脑血管局部缺血(中风)、急性冠状动脉综合征、肾脏再灌注损伤、器官移植、冠状动脉旁路移植术、心肺旁路手术及肺部、肾脏、肝脏、胃肠或四肢外周栓塞。
溴区结构域抑制剂可适用于经由调节APO-A1治疗脂质代谢的病症，诸如高胆固醇血症、动脉粥样硬化及阿尔茨海默病。
溴区结构域抑制剂可适用于治疗纤维变性病症，诸如特发性肺纤维化、肾脏纤维变性、手术后狭窄、瘢痕瘤形成、硬皮病及心脏纤维变性。
溴区结构域抑制剂可适用于预防及治疗病毒感染，诸如疱疹病毒、人类乳头状瘤病毒、腺病毒、痘病毒及其他DNA病毒。
溴区结构域抑制剂亦可适用于治疗癌症，包括血液癌瘤、上皮癌瘤(包括肺、乳腺及结肠癌瘤)、中线癌瘤、间叶细胞肿瘤、肝脏肿瘤、肾脏肿瘤及神经系统肿瘤。
在一个实施方案中，溴区结构域抑制剂所针对的疾病或病症选自与全身性炎症反应综合征相关的疾病，诸如败血症、灼伤、胰腺炎、严重创伤、出血及缺血。在此实施方案中，在诊断点给予溴区结构域抑制剂以降低SIRS的发生、休克的发作、多器官功能障碍综合征的发作(其包括急性肺损伤、ARDS、急性肾脏、肝脏、心脏及胃肠损伤的发作)及死亡。在另一实施方案中，在与败血症、出血、大面积组织损伤、SIRS或MODS(多器官功能障碍综合征)的高风险有关的手术或其他操作之前，给予溴区结构域抑制剂。在具体实施方案中，溴区结构域抑制剂所针对的疾病或病症为败血症、败血症综合征、败血性休克及内毒素血。在另一实施方案中，溴区结构域抑制剂针对治疗急性或慢加急性胰腺炎。在另一实施方案中，溴区结构域抑制剂针对治疗灼伤。
在一个实施方案中，溴区结构域抑制剂所针对的疾病或病症选自单纯疱疹感染及再活化、唇疱疹、带状疱疹(herpes zoster)感染及再活化、水痘、带状疱疹(shingles)、人类乳头状瘤病毒、子宫颈肿瘤形成、腺病毒感染(包括急性呼吸道疾病)及痘病毒感染(诸如牛痘及天花及非洲猪瘟病毒)。
术语“溴区结构域抑制剂所针对的疾病或病症”意欲包括任一或所有以上疾病病况。
在一个实施方案中，提供抑制溴区结构域的方法，其包括使溴区结构域与式(1)化合物或其药用盐接触。
尽管对于用于治疗，式(I)化合物以及其药用盐可以化合物本身的形式给予，但更通常以药物组合物形式呈现。
药物组合物可以每单位剂量含有预定量的活性成分的单位剂型形式呈现。优选单位剂量组合物为含有日剂量或亚剂量的活性成分或其适当部分的那些组合物。因此可每天给予所述单位剂量多于一次。优选单位剂量组合物为包含如本文上述的日剂量或亚剂量(每天给药多于一次)的活性成分或其适当部分的那些组合物。
可用本发明化合物治疗的癌症的类型包括(但不限于)脑癌、皮肤癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、血癌、肺癌及骨癌。所述癌症类型的实例包括神经母细胞瘤、肠癌(诸如直肠癌、结肠癌、家族性腺瘤性息肉癌及遗传性非息肉结肠直肠癌)、食道癌、唇癌、喉癌、咽下癌、舌癌(tong carcinoma)、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、肾癌、肾脏实质性癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、泌尿癌、黑素瘤、脑肿瘤(诸如神经胶母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤及外周神经外胚层肿瘤)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、成人T细胞白血病淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、肝细胞癌、胆囊癌、支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤、畸胎瘤、视网膜胚细胞瘤、脉络膜黑素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肉瘤、纤维肉瘤、尤文肉瘤(Ewing sarcoma)及浆细胞瘤。
除肿瘤中可见的细胞凋亡缺陷之外，认为由于细胞凋亡抗性而产生的清除免疫系统的自身反应性细胞的能力的缺陷在自身免疫疾病的发病机理中起关键作用。自身免疫疾病的特征在于免疫系统的细胞产生针对其自身器官及分子的抗体或直接攻击组织从而导致后者破坏。其自身反应性细胞不能进行细胞凋亡会导致疾病显现。在诸如全身性红斑性狼疮或类风湿性关节炎的自身免疫疾病中已鉴别出细胞凋亡调节的缺陷。
因此，根据另一实施方案，本发明提供通过向有需要患者提供本发明化合物或组合物来治疗自身免疫疾病的方法。所述自身免疫疾病的实例包括(但不限于)胶原病，诸如类风湿性关节炎、全身性红斑性狼疮症、夏普综合征(Sharp's syndrome)、CREST综合征(钙质沉着、雷诺综合征(Raynaud's syndrome)、食道运动功能障碍、毛细血管扩张症)、皮肤肌炎、血管炎(韦格纳病(Morbus Wegener's))及斯耶格伦综合征(Sjogren's syndrome)、肾脏疾病(诸如古德帕斯彻综合征(Goodpasture's syndrome)、急进型肾小球肾炎及II型膜增殖型肾小球肾炎)、内分泌障碍性疾病(诸如I型糖尿病、自身免疫多内分泌病变念珠菌外胚层营养不良(APECED)、自身免疫甲状旁腺病、恶性贫血、性腺功能不全、特发性艾迪生病(idiopathic Morbus Addison's)、甲状腺机能亢进、桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)及原发性粘液水肿)、皮肤病(诸如寻常天疱疮、水泡性类天疱疮、妊娠疱疹、大疱性表皮松解及严重多形性红斑)、肝脏疾病(诸如原发性胆汁性肝硬化、自身免疫胆管炎、1型自身免疫肝炎、2型自身免疫肝炎、原发性硬化性胆管炎)、神经元疾病(诸如多发性硬化症、重症肌无力、重症肌无力性兰伯特-伊顿综合征(myasthenic Lambert-Eatonsyndrome)、获得性肌神经切断、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)(穆勒-费舍尔综合征(Muller Fischer syndrome))、强直人综合征、小脑退化、运动失调、眼阵挛、感觉神经病变及弛缓不能)、血液病(诸如自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜(韦尔霍夫病(Morbus Werlhof)))、与自身免疫反应相关的传染病(诸如AIDS、疟疾及查加斯病(Chagas disease))。
本发明化合物适用于独立地或与其他治疗剂或辐射疗法组合或共同给予来治疗某些类型的癌症。因此，在一个实施方案中，使本发明化合物与辐射疗法或具有细胞抑制或抗肿瘤活性的第二治疗剂共同给予。适合细胞抑制化学疗法化合物包括(但不限于)(i)抗代谢物；(ii)DNA分段剂；(iii)DNA交联剂；(iv)插入剂；(v)蛋白合成抑制剂；(vi)拓扑异构酶I毒物，诸如喜树碱或托泊替康；(vii)拓扑异构酶II毒物；(viii)微管导向剂；(ix)激酶抑制剂；(x)各种试验药；(xi)激素；及(xii)激素拮抗剂。本发明化合物意欲可适用于与属于以上12类的任何已知药物以及目前正研发的任何未来药物组合。具体地，本发明化合物意欲可适用于与当前护理标准物以及可预见的未来发展的任何者组合。特定剂量及给药方案是基于医师的逐渐发展的知识及本领域中通用技术。
组合疗法意欲包括以先后方式给予这些治疗剂，亦即，其中各治疗剂在不同时间给予，以及这些治疗剂或所述治疗剂中的至少两者以实质上同时的方式给予。实质上同时给予可例如通过向受试者给予具有固定比率的各治疗剂的单一剂型或多个每一治疗剂的单一剂型来实现。先后或实质上同时给予各治疗剂可通过任何适当途径来实现，所述途径包括(但不限于)口服途径、静脉内途径、肌内途径及经由粘膜组织的直接吸收。所述治疗剂可通过相同途径或通过不同途径给予。举例而言，所选组合中的第一治疗剂可通过静脉内注射给予，而该组合中的其他治疗剂可口服给予。或者，举例而言，所有治疗剂均可口服给予或所有治疗剂均可通过静脉内注射给予。组合疗法亦可包括使如上所述的治疗剂进一步与其他生物活性成分及非药物疗法(例如手术或放射治疗)组合给予。当组合疗法进一步包括非药物治疗时，该非药物治疗可在任何合适的时间进行，只要可由治疗剂与非药物治疗的组合的共同作用达成有益效果即可。举例而言，在适当情况下，当将非药物治疗暂时由治疗剂给药中移除时，或许历经数日或甚至数周后仍将达成有益效果。
IV.药物组合物及给药
本发明亦提供药用组合物，其包含治疗有效量的一种或多种式I化合物与一种或多种药用载体(添加剂)和/或稀释剂及任选地一种或多种上文所述其他治疗剂一起配制。如下详细描述，本发明的药物组合物可经特定配制用于以固体或液体形式给药，其包括那些适合于以下的形式：(1)口服给药，例如灌服(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如靶向颊、舌下及全身性吸收的那些片剂)、大丸剂、粉末剂、颗粒剂、施用于舌的糊剂；(2)肠胃外给药，例如由皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，例如无菌溶液或悬浮液，或持续释放制剂；(3)局部施用，例如施用于皮肤的乳膏、软膏或控制释放贴剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内给药，例如阴道栓、乳膏或发泡体；(5)舌下给药；(6)经眼给药；(7)经皮给药；或(8)经鼻给药。
本文所用的短语“可药用的”是指在可靠医学判断的范围内适用于接触人类及动物组织而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理益处/风险比率相当的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药用载体”意指参与将本发明化合物由身体的一个器官或一部分载运或运送至身体的另一器官或另一部分的药用物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂包囊物质。各载体在与制剂的其他成分相容的意义上必须为“可接受的”且对患者无害。可充当药用载体的物质的一些实例包括：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉及马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素及乙酸纤维素；(4)粉末西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂及栓剂蜡；(9)油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油及豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇类，诸如丙三醇、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂类，诸如氢氧化镁及氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等渗生理盐水；(18)林格溶液(Ringer's solution)；(19)乙醇；(20)pH值缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；及(22)用于药物制剂的其他无毒相容物质。
湿润剂、乳化剂及润滑剂(诸如月桂基硫酸钠及硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂及芳香剂、防腐剂及抗氧化剂亦可存在于组合物中。
药用抗氧化剂的实例包括：(1)可溶于水的抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)可溶于油的抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的制剂包括适于口服、经鼻、局部(包括经颊及舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外给药的制剂。制剂可便利地以单位剂型呈现且可通过药学领域中熟知的任何方法来制备。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的患者及特定给药模式而变化。可与载体物质组合以制备单一剂型的活性成分的量一般为产生治疗效果的化合物的量。此量通常(以百分率计)在约0.1％至约99％，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％活性成分的范围内。
在某些实施方案中，本发明的制剂包含选自环糊精、纤维素、脂质体、胶束成型剂(例如胆汁酸)及聚合载体(例如聚酯及聚酸酐)的赋形剂；及本发明化合物。在某些实施方案中，前述制剂口服提供生物可用的本发明化合物。
制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明化合物与载体及任选地一种或多种配合剂缔合的步骤。一般而言，制剂通过使本发明化合物与液体载体或细粉状固体载体或两者均匀且精细地缔合且接着(若需要)使产物成形来制备。
适于口服给予的本发明制剂可呈胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常为蔗糖及阿拉伯胶或西黄耆胶)、粉末剂、颗粒剂的形式，或呈于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液的形式，或呈水包油或油包水的液体乳液的形式，或呈酏剂或糖浆的形式，或呈软锭剂(使用惰性基质，诸如明胶及丙三醇，或蔗糖及阿拉伯胶)和/或呈漱口剂的形式等，各含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明化合物亦可作以大丸剂、药糖剂或糊剂的形式给予。
在用于口服给药的本发明的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖锭剂、粉末剂、颗粒剂、锭剂等)中，使活性成分与一种或多种药用载体(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下任一者混合：(1)填充剂或膨胀剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如丙三醇；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐及碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物，及表面活性剂，诸如泊洛沙姆(poloxamer)及月桂基硫酸钠；(7)湿润剂，诸如十六烷醇、单硬脂酸甘油酯及非离子型表面活性剂；(8)吸收剂，诸如高岭土及膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；及(11)控制释放剂，诸如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊、片剂及丸剂的情况下，药物组合物亦可包含缓冲剂。亦可使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量的聚乙二醇等的赋形剂将类似类型的固体组合物用作软壳及硬壳明胶胶囊中的填充剂。
片剂可通过任选与一种或多种配合剂压缩或模制来制备。压缩片剂可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可通过在合适机器中模制经惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物来制备。
本发明药物组合物的片剂及其他固体剂型(诸如糖锭剂、胶囊、丸剂及颗粒剂)可任选获得或制备有涂层及外壳，诸如肠溶衣及医药配制领域中熟知的其他涂层。其亦可使用例如羟丙基甲基纤维素(以不同比例提供所需释放分布)、其他聚合物基质、脂质体和/或微球进行配制以便使其中活性成分的缓慢或控制释放。其可经配制用于快速释放，例如冷冻干燥。其可由例如经由细菌截留过滤器过滤或通过并入有呈在即将使用之前可溶解于无菌水或一些其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌。这些组合物亦任选含有遮光剂且可为任选地以延迟方式仅仅或优选将活性成分释放于胃肠道某一部分中的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质及蜡。活性成分亦可为微囊封形式，适当时，与一种或多种上述赋形剂一起微囊封。
用于口服给予的本发明化合物的液体剂型包括药用乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆及酏剂。除活性成分外，液体剂型可含有通常用于此领域中的惰性稀释剂(诸如水或其他溶剂)、增溶剂及乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(尤其为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油及麻油)、丙三醇、四氢呋喃醇、聚乙二醇及脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。
除惰性稀释剂外，口服组合物亦可包含辅料，诸如湿润剂、乳化剂及助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂及防腐剂。
除活性化合物外，悬浮液可含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂酰基醇、聚氧乙烯山梨醇及脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂及西黄蓍胶及其混合物。
用于直肠或阴道给药的本发明药物组合物的制剂可以栓剂形式呈现，其可通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种适合无刺激性赋形剂或载体(包含例如可可油、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)混合来制备，且其在室温为固体，而在体温为液体，且因此融解于直肠或阴道腔中且释放活性化合物。
适于阴道给药的本发明制剂亦包含含有诸如本领域中已知的适合载体的阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、发泡体或喷雾剂制剂。
用于局部或经皮给予本发明化合物的剂型包括粉末剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂及吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与药用载体及与任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
软膏、糊剂、乳膏及凝胶除本发明的活性化合物外亦可含有赋形剂，诸如动物及植物脂肪、油类、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石及氧化锌或其混合物。
粉末剂及喷雾剂除本发明化合物外可含有赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常用推进剂，诸如氯氟烃及挥发性未经取代的烃，诸如丁烷及丙烷。
经皮贴片具有为身体提供本发明化合物的控制递送的额外优点。所述剂型可通过将化合物溶于或分散于适当介质中来制备。也可使用吸收增强剂来增加化合物的透皮量。该通量的速率可通过提供速率控制膜或使化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
在本发明的范围内亦涵盖眼用制剂、眼用软膏、粉末剂、溶液等。
适用于肠胃外给予的本发明药物组合物包含一种或多种本发明化合物与一种或多种药用无菌等张水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液、或可恰在使用之前复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末组合，所述组合物可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与所欲接受者的血液等张的溶质或助悬剂或增稠剂。
可用于本发明的药物组合物中的适合水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。可例如通过使用涂层物质(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所要粒度及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物亦可含有辅料，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂及分散剂。防止微生物作用于本发明化合物可通过包含多种抗细菌剂及抗真菌剂来确保，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。亦可能需要在组合物中包括等张剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的药物(诸如单硬脂酸铝及明胶)来达成。
在一些情况下，为延长药物效果需要减缓皮下或肌内注射的药物的吸收。此可通过使用具有不良水溶性的结晶或无定形物质的液体悬浮液来达成。药物的吸收速率则视其溶出度而定，而溶出度又可视晶体大小及结晶形式而定。或者，肠胃外给予的药物形式的延迟吸收通过在油媒介物中溶解或悬浮药物来实现。
可注射储药(depot)形式通过形成本发明化合物于诸如聚丙交酯-聚乙交酯的生物可降解聚合物中的微囊封基质来制备。视药物与聚合物的比率及所用特定聚合物的性质而定，可控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。储药可注射制剂亦通过将药物截留于与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。
当本发明化合物作为药物向人及动物给予时，其可本身给与或作为含有例如0.1至99％(更优选10至30％)的活性成分与药用载体的组合的药物组合物来给与。
不管选择何种给药途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明化合物(其可以适合水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药用剂型。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量浓度可变化以获得有效达成特定患者所要治疗反应、组合物及给药模式而对患者无毒性的活性成分的量。
所选剂量浓度将视多种因素而定，包括所用的具体本发明化合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所用的具体化合物的排泄或代谢速率、吸收的速率及程度、治疗持续时间、与所用的具体化合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、重量、身体状况、总体健康状况及先前病史、及医药领域中熟知的类似因素。
具有本领域常规技术的医师或兽医可容易地确定及开具所需药物组合物的有效量。举例而言，医师或兽医开始可给药含量低于所需量的药物组合物中所用的本发明化合物，以便达成所要治疗效果且逐渐增加剂量直至达成所要效果。
一般而言，本发明化合物的适合日剂量为作为有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。所述有效剂量一般视上文所述因素而定。一般而言，用于患者的本发明化合物的口服、静脉内、脑室内及皮下剂量将在每天每公斤体重约0.01至约50mg的范围内。
必要时，有效日剂量的活性化合物可以全天内以适当时间间隔任选以单位剂型分次给予2、3、4、5、6个或更多的亚剂量来给予。在本发明的某些方面，给药为每天给药。
虽然有可能单独给予本发明的化合物，但优选以药物制剂(组合物)形式来给予化合物。
定义
本领域的普通技术人员在阅读了下述详细描述后，可更容易地理解本发明的特征和优点。应当理解的是，本发明的一些特征，为清楚起见，分开的实施方案上下文中描述的一些特征也可以组合形成单个的实施方案。相反地，本发明的各特征，为简洁起见，单个实施方案中描述的特征，也可组合形成亚组合。示例或优选的本申请所述的实施方案意在实例说明而非限制。
除非本文另外明确规定，否则提及单数形式时，也可包括复数形式。举例而言，“一个”和“一种”可指一个或一种，也可指一个或多个，或一种或多种。
除非另外指出，否则假定任何具有不饱和价数的杂原子均具有足以满足所述价数的氢原子。
下列各个术语的定义用于描述本发明。这些定义应用于在说明书通篇单独使用或作为较大基团的一部分使用时的术语(除非其以其他方式在具体实例中限定)。
在说明书通篇，基团及其取代基可由本领域技术人员进行选择以提供稳定的部分和化合物。
在整个说明书及随附权利要求中，既定化学式或名称应涵盖所有立体异构体及光学异构体及存在所述异构体的其外消旋体。除非另外指出，否则所有手性的(对映异构及非对映异构的)及外消旋形式均在本发明的范围内。化合物中亦可存在C＝C双键、C＝N双键、环系统等的许多几何异构体，且本发明涵盖所有所述稳定异构体。对本发明化合物的顺式及反式(或E-及Z-)几何异构体加以描述且可以异构体的混合物或以分离的异构形式分离。本发明化合物可以光学活性或外消旋形式分离。光学活性形式可通过拆分外消旋形式或通过由光学活性起始物质合成来制备。认为制备本发明化合物所使用的所有方法及其中所制备的中间体为本发明的一部分。当制备对映异构或非对映异构产物时，其可由例如色谱或分步结晶的常规方法分离。取决于方法条件，获得游离(中性)或盐形式的本发明的最终产物。这些最终产物的游离形式与盐皆在本发明的范围内。需要时，可将一种形式的化合物转化成另一形式。可将游离碱或酸转化成盐；可将盐转化成游离化合物或另一种盐；可将本发明的异构化合物的混合物分离成单个异构体。游离形式的本发明化合物及其盐可以多种互变异构形式存在，其中氢原子换位至分子的其他部分且分子的原子的间的化学键因此发生重排。应了解，所有互变异构形式只要其可存在即包括于本发明内。
当取代基指示为“任选取代”时，取代基选自例如诸如以下的取代基：烷基、环烷基、芳基、杂环基、卤素、羟基、烷氧基、氧代、烷酰基、芳基氧基、烷酰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基、二取代的胺(其中2个氨基取代基选自烷基、芳基或芳基烷基)；烷酰基氨基、芳酰基氨基、芳烷酰基氨基、经取代的烷酰基氨基、经取代的芳基氨基、经取代的芳烷酰基氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、芳基烷基硫基、烷基硫羰基、芳基硫羰基、芳基烷基硫羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基烷基磺酰基、氨磺酰基(例如-SO2NH2)、经取代的氨磺酰基、硝基、氰基、羧基、氨甲酰基(例如-CONH2)、经取代的氨甲酰基(例如-CONH烷基、-CONH芳基、-CONH芳基烷基或氮上有两个选自烷基、芳基或芳基烷基的取代基的情况)；烷氧基羰基、芳基、经取代的芳基、胍基、杂环基(例如吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯烷基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基等)及经取代的杂环基。
出于清晰的目的且根据在本领域中的标准约定，符号用于式及表中以显示作为部分或取代基与结构的核心/核的连接点的键。
另外，出于清晰的目的，当取代基具有不处于两个字母或符号之间的虚线(-)时；此用以指示取代基的连接点。举例而言，-CONH2经由碳原子连接。
如本文所用，术语“烷基”或“亚烷基”意欲包括具有指定数目的碳原子的支链与直链饱和脂族烃基。举例而言，“C1-C6烷基”表示具有1至6个碳原子的烷基。实例烷基包括(但不限于)甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如正丙基及异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、叔丁基)及戊基(例如正戊基、异戊基、新戊基)。
术语“烯基”表示含有一个或多个双键且长度通常为2至20个碳原子的直链或支链烃基。举例而言，“C2-C8烯基”含有2至8个碳原子。烯基包括(但不限于)例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、庚烯基、辛烯基等。
术语“炔基”表示含有一个或多个叁键且长度通常为2至20个碳原子的直链或支链烃基。举例而言，“C2-C8炔基”含有2至8个碳原子。代表性炔基包括(但不限于)例如乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、庚炔基、辛炔基等。
术语“烷氧基”或“烷基氧基”是指-O-烷基。“C1-6烷氧基”(或烷基氧基)意欲包括C1、C2、C3、C4、C5及C6烷氧基。实例烷氧基包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基及异丙氧基)及叔丁氧基。类似地，“烷基硫基”或“硫基烷氧基”表示经由硫桥连接的具有指定数目的碳原子的如上文所定义的烷基；例如甲基-S-及乙基-S-。
术语“芳基”单独或作为较大部分(诸如“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳基氧基烷基”)的一部分是指具有总计5至15个环成员的单环、二环及三环系统，其中该系统中的至少一个环为芳族环且其中该系统中的各环含有3至7个环成员。在本发明的某些实施方案中，“芳基”是指芳族环系，其包括(但不限于)苯基、联苯基、茚满基、1-萘基、2-萘基及四氢萘基。术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指连接于芳基环的烷基。非限制性实例包括苄基、苯乙基等。稠合芳基可在环烷基环或芳环上的适合位置连接于另一基团。举例而言：
由环系统中绘制的标有箭头的线指示键可连接于任一适合环原子。
术语“环烷基”是指环化烷基。C3-6环烷基意欲包括C3、C4、C5及C6环烷基。实例环烷基包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基及降冰片烷基。支链环烷基(诸如1-甲基环丙基及2-甲基环丙基)包括于“环烷基”的定义中。术语“环烯基”是指环化烯基。C4-6环烯基意欲包括C4、C5及C6环烯基。实例环烯基包括(但不限于)环丁烯基、环戊烯基及环己烯基。
术语“环烷基烷基”是指键结于与化合物的咔唑核心连接的烷基的环烷基或经取代的环烷基。
“卤代”或“卤素”包括氟、氯、溴及碘。“卤代烷基”意欲包括经一个或多个卤素取代的具有指定数目的碳原子的支链与直链饱和脂族烃基。卤代烷基的实例包括(但不限于)氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氯甲基、五氟乙基、五氯乙基、2,2,2-三氟乙基、七氟丙基及七氯丙基。卤代烷基的实例亦包括“氟烷基”，其意欲包括经一个或多个氟原子取代的具有指定数目的碳原子的支链与直链饱和脂族烃基。
“卤代烷氧基”或“卤代烷基氧基”表示经由氧桥连接的具有指定数目的碳原子的如以上所定义的卤代烷基。举例而言，“C1-6卤代烷氧基”意欲包括C1、C2、C3、C4、C5及C6卤代烷氧基。卤代烷氧基的实例包括(但不限于)三氟甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基及五氟乙氧基。类似地，“卤代烷基硫基”或“硫基卤代烷氧基”表示经由硫桥连接的具有指定数目的碳原子的如上文所定义的卤代烷基；例如三氟甲基-S-及五氟乙基-S-。
如本文所用，术语“杂芳基”或“芳族杂环基”意欲意指包含至少一个杂原子环成员(诸如硫、氧或氮)的稳定的单环及多环芳族烃。杂芳基包括(但不限于)吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、吡咯基、噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吲唑基、1,2,4-噻二唑基、异噻唑基、嘌呤基、咔唑基、苯并咪唑基、吲哚啉基、苯并二氧杂环戊烷基及苯并二噁烷。杂芳基可经取代或未经取代。氮原子经取代或未经取代(亦即N或NR，其中R为H或另一取代基(若经定义))。氮及硫杂原子可任选被氧化(亦即N→O及S(O)p，其中p为0、1或2)。
术语“杂芳基烷基”是指键结于与化合物的咔唑核心连接的烷基的杂芳基或经取代的杂芳基。
如本文所用，术语“杂环”、“杂环的”或“杂环基”可互换使用并意指饱和或部分饱和的且具有除了碳原子之外的一个或多个、优选一至四个如上定义的杂原子的3-7-元单环或7-10-元二环杂环部分。杂环基的实例包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吡咯啉基、哌嗪基、咪唑啉基、吗啉基、咪唑烷基、吡唑烷基和吡唑啉基。
术语“杂环基烷基”是指键结于与化合物的咔唑核心连接的烷基的杂环基或经取代的杂环基。
术语“抗衡离子”用以表示带负电荷的物质，诸如氯离子、溴离子、氢氧根、乙酸根及硫酸根，或带正电荷的物质，诸如钠(Na+)、钾(K+)、铵(RnNHm+，其中n＝0-4且m＝0-4)等。
术语“吸电子基团”(EWG)是指使键极化，从而将电子密度拉向本身且远离其他键结原子的取代基。EWG的实例包括(但不限于)CF3、CF2CF3、CN、卤素、卤代烷基、NO2、砜、亚砜、酯、磺酰胺、甲酰胺、烷氧基、烷氧基醚、烯基、炔基、OH、C(O)烷基、CO2H、苯基、杂芳基、-O-苯基及-O-杂芳基。EWG的优选实例包括(但不限于)CF3、CF2CF3、CN、卤素、SO2(C1-4烷基)、CONH(C1-4烷基)、CON(C1-4烷基)2及杂芳基。EWG的更优选实例包括(但不限于)CF3及CN。
如本文所用，术语“胺保护基”意指有机合成领域中已知用于保护氨基的任何基团，其对于酯还原剂、双取代肼、R4-M及R7-M、亲核基团、肼还原剂、活化剂、强碱、位阻胺碱及环化剂稳定。符合这些准则的所述胺保护基包括以下文献中所列的那些胺保护基：Greene和Wuts,"Protective Groups in Organic Synthesis"John Wiley&Sons,New York(1991)以及"The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,Vol.3,Academic Press,NewYork(1981)，其披露内容以引用的方式并入本文中。胺保护基的实例包括(但不限于)以下：(1)酰基类，诸如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基及对甲苯磺酰基；(2)芳族氨基甲酸酯类，诸如苄基氧基羰基(Cbz)及经取代的苄基氧基羰基、1-(对联苯)-1-甲基乙氧基羰基及9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)；(3)脂族氨基甲酸酯类，诸如叔丁基氧基羰基(Boc)、乙氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基及烯丙基氧基羰基；(4)环状氨基甲酸烷基酯类，诸如环戊基氧基羰基及金刚烷基氧基羰基；(5)烷基类，诸如三苯基甲基及苄基；(6)三烷基硅烷，诸如三甲基硅烷；(7)含有巯基的类，诸如苯基硫羰基及二硫杂丁二酰基；及(8)烷基类，诸如三苯基甲基、甲基及苄基；及经取代的烷基类，诸如2,2,2-三氯乙基、2-苯基乙基和叔丁基；及三烷基硅烷类，诸如三甲基硅烷。
如本文所提及，术语“经取代的”意指至少一个氢原子经非氢基团替换，其条件是维持正常原子价且取代产生稳定化合物。如本文所用，环双键为在两个相邻环原子之间所形成的双键(例如C＝C、C＝N或N＝N)。
在本发明化合物上存在氮原子(例如胺)的情况下，其可通过用氧化剂(例如mCPBA和/或过氧化氢)处理而转化成N-氧化物以得到本发明的其他化合物。因此，认为所显示及主张的氮原子包括所显示的氮与其N-氧化物(N→O)衍生物。
当任何变量在化合物的任何组分或式中出现一次以上时，其定义在每次出现时独立于其在所有其他情况下出现时的定义。因此，举例而言，若显示基团经0-3个R取代，则该基团可任选经至多三个R基团取代，且R在每次出现时独立地选自R的定义。此外，只有当所述组合产生稳定化合物时才可允许取代基和/或变量组合。
当显示环中键结于取代基的键横跨连接两个原子的键时，则该取代基可键结于该环上的任何原子。当列出取代基而未指明该取代基结合于给定式的化合物的其余部分所经由的原子时，则该取代基可经由该取代基中的任何原子键结。只有当所述组合产生稳定化合物时才可允许取代基和/或变量组合。
本文采用的短语“可药用的”是指在可靠医学判断的范围内，适用于接触人类及动物的组织而无过量毒性、刺激、过敏性反应和/或其他相当的问题或并发症、与合理益处/风险比率相当的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，“药用盐”是指所披露化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸式或碱式盐而改性。药用盐的实例包括(但不限于)：碱性基团(诸如胺)的无机或有机酸盐，及酸性基团(诸如羧酸)的碱金属盐或有机盐。药用盐包括例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。举例而言，所述常规无毒盐包括衍生自无机酸的那些盐，所述无机酸为诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸及硝酸；及由有机酸所制备的盐，所述有机酸为诸如乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸(pamoic)、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸及羟乙基磺酸，等。
本发明的药用盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般而言，所述盐可通过使游离酸或游离碱形式的这些化合物与化学计量的适当碱或酸于水或有机溶剂中或于两者的混合物中反应来制备；一般而言，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈的非水性介质为优选的。适合盐的清单见于Remington’s PharmaceuticalSciences,18th Edition,Mack Publishing Company,Easton,PA(1990)中，其披露内容以引用的方式并入本文中。
另外，式I的化合物可具有前药形式。将体内转化以提供生物活性剂(亦即式I的化合物)的任何化合物为本发明的范畴及精神内的前药。各种形式的前药在本领域为熟知的。对于所述前药衍生物的实例，参见：
a)Design of Prodrugs,Bundgaard,H.,ed.,Elsevier(1985),and Methods inEnzymology,112:309-396,Widder,K.et al.,eds.,Academic Press(1985)；
b)Bundgaard,H.,Chapter 5,“Design and Application of Prodrugs,”ATextbook of Drug Design and Development,pp.113-191,Krosgaard-Larsen,P.et al.,eds.,Harwood Academic Publishers(1991)；
c)Bundgaard,H.,Adv.Drug Deliv.Rev.,8:1-38(1992)；
d)Bundgaard,H.et al.,J.Pharm.Sci.,77:285(1988)；和
e)Kakeya,N.et al.,Chem.Pharm.Bull.,32:692(1984)。
含有羧基的化合物可形成充当在体内被水解以产生式I的化合物本身的前药的生理学上可水解的酯。由于水解在许多情况下主要在消化酶的影响下发生，因此所述前药优选口服给予。当酯本身有活性时，或在水解在血液中发生的那些情况下，可使用肠胃外给药。式I化合物的生理学上可水解的酯的实例包括C1-6烷基，C1-6烷基苄基、4-甲氧基苄基、茚满基、邻苯二甲酰基、甲氧基甲基、C1-6烷酰基氧基-C1-6烷基(例如乙酰氧基甲基、特戊酰基氧基甲基或丙酰基氧基甲基)、C1-6烷氧基羰基氧基-C1-6烷基(例如甲氧基羰基氧基甲基或乙氧基羰基氧基甲基、甘氨酰基氧基甲基、苯基甘氨酰基氧基甲基、(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基)及用于例如青霉素及头孢菌素领域中的其他熟知生理学上可水解的酯。所述酯可由本领域中已知的常规技术来制备。
前药的制备在本领域中为熟知的且描述于例如Medicinal Chemistry:Principles and Practice,King,F.D.,ed.,The Royal Society of Chemistry,Cambridge,UK(1994)；Testa,B.et al.,Hydrolysis in Drug and ProdrugMetabolism.Chemistry,Biochemistry and Enzymology,VCHA and Wiley-VCH,Zurich,Switzerland(2003)；The Practice of Medicinal Chemistry,Wermuth,C.G.,ed.,Academic Press,San Diego,CA(1999)。
本发明意欲包括存在于本发明化合物中的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子数、但不同质量数的那些原子。举一般实例且不加以限制，氢同位素包括氘及氚。碳同位素包括13C及14C。经同位素标记的本发明化合物一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本文所述的方法使用适当经同位素标记的试剂替代另外使用的未经标记的试剂来制备。
术语“溶剂化物”意指本发明化合物与一个或多个溶剂分子(有机或无机)的物理缔合。此物理缔合包括氢键结。在某些情况下，例如当将一个或多个溶剂分子并入结晶固体的晶格中时，溶剂化物将能够分离。溶剂化物中的溶剂分子可以有序排列和/或无序排列而存在。溶剂化物可包含化学计量或非化学计量的溶剂分子。“溶剂化物”涵盖溶液相与可分离溶剂化物。溶剂化物的实例包括(但不限于)水合物、乙醇化物(ethanolate)、甲醇化物(methanolate)、与异丙醇化物(isopropanolate)。溶剂化方法一般在本领域中为已知的。
如本文所用，术语“患者”是指待通过本发明方法治疗的生物体。所述生物体优选包括(但不限于)哺乳动物(例如鼠类、猴类、马类、牛类、猪类、犬类、猫类等)，且最优选指人类。
如本文所用，术语“有效量”意指在例如研究者或临床医师所探讨的组织、系统、动物或人类中引发生物或医学反应的药物或药剂(亦即本发明化合物)的量。此外，术语“治疗有效量”意指与并未接受该量的相应受试者相比致使疾病、病症或副作用的治疗、治愈、预防或改善有所改良或疾病或病症的发展速度降低的任何量。有效量可以一或多次给药、施用或剂量给予，且其并不意欲受限于特定制剂或给药途径。该术语在其范围内亦包括可有效增强正常生理功能的量。
如本文所用，术语“治疗”包括致使病症、疾病、障碍等改良或改善其症状的任何效果，例如减轻、降低、调节、改善或清除。
如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与载体(惰性或活性)组合从而使组合物尤其适用于体内或离体诊断或治疗用途。
碱的实例包括(但不限于)碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨及式NW4 +的化合物(其中W为C1-4烷基)等。
对于治疗用途而言，预期本发明化合物的盐为可药用的。然而，非药用酸及碱的盐亦可用于例如制备或纯化药用化合物。
制备方法
本发明化合物可以有机合成领域技术人员所熟知的许多方法来制备。本发明化合物可使用下文所述的方法，以及合成有机化学的技术中已知的合成方法，或如本领域技术人员所了解的其变化形式来合成。优选方法包括(但不限于)下文所述的那些方法。本文所引用的所有参考文献均以全文引用的方式并入本文中。
本发明化合物可使用本章节所述的反应及技术来制备。反应在适于所采用的试剂及物质的溶剂中进行且适合于所实施的转化。此外，在下文所述的对合成方法的描述中，应了解所有建议的反应条件，包括溶剂的选择、反应氛围、反应温度、实验持续时间及后处理操作，选择为用于该反应的标准条件，其应易于由本领域技术人员鉴别。有机合成领域技术人员应了解，存在于分子的各个部分上的官能团须与所建议的试剂及反应相容。所述对与反应条件相容的取代基的限制对本领域技术人员而言应显而易见且因而须使用替代方法。此有时将要求以下判断：改变合成步骤的次序或相对于另一方法方案选择一种特定方法方案以获得本发明的所需化合物。亦应认识到此领域中设计任一合成途径的另一主要考虑事项为正确选择用于保护本发明中所述化合物中存在的反应性官能团的保护基。受训从业者的描述许多替代方法的权威报告为Greene and Wuts(Protective Groups In OrganicSynthesis,Third Edition,Wiley and Sons,1999)。
式(I)化合物可通过参考以下方案中所说明的方法来制备。如其中所示，最终产物为与式(I)具有相同结构式的化合物。应了解，任何式(I)化合物均可由所述方案通过适当选择具有适当替代的试剂来制备。溶剂、温度、压力及其他反应条件可易于由本领域技术人员选择。起始物质可购得或容易由本领域技术人员制备。化合物的组分如本文或说明书的别处所定义。
式(I)的化合物的合成可如在方案1-10中概述来完成。
方案1
在方案1的步骤1中，将式i的经取代的苯酚在适当条件下转化为式ii的环己酮。这可通过例如在氢气气氛下用适当的催化剂(诸如铑/氧化铝)在适当溶剂(诸如乙醇)中还原、随后将所得的醇在本领域技术人员已知的各种条件(诸如使用氧化铬(VI)和硫酸)下在溶剂(诸如丙酮)中氧化来完成。
步骤2：方案1的第二步可通过如下来完成：将经取代的苯胺iii在各种条件(诸如与亚硝酸钠在适当的酸(诸如盐酸)的存在下在适当溶剂(诸如水)中反应)下转化为重氮中间体、随后在适当条件(诸如用氯化锡(II)在盐酸的存在下还原)下还原为式iv的肼。
步骤3：中间体ii和iv可在多种条件(诸如在适当溶剂诸如乙酸中加热)下转化为式v的四氢咔唑。任选地，在此时，如果需要可调节中间体iv的官能度。例如，如果中间体iv的基团R2为羧酸时，则其可在此时通过本领域技术人员已知的多种条件(诸如与所需的胺在偶联剂(诸如EDC加热HOBt)的存在下在适当溶剂或溶剂混合物(诸如THF和DCM)中反应)转化为酰胺。
步骤4：中间体v可通过用适当试剂(诸如DDQ)在适当溶剂(诸如甲苯)中氧化而转化为式vi的咔唑。
步骤5：在此时，如果需要，中间体vi的基团可转化为式(I)的基团A。例如，如果X为卤化物且所需基团A为芳基或杂芳基环时，则可在本领域技术人员已知的各种条件(诸如与适当的硼酸或硼酸酯在钯催化剂(诸如PdCl2(dppf))和适当的碱(磷酸三钾)的存在下在适当溶剂(诸如DMF)中反应)下进行中间体vi向中间体vii的转化。
步骤6：在此时，如果需要，式(I)的基团R可在适当条件下引入。本领域技术人员应当认识到适当条件取决于基团R的性质。例如，当R为烷基时，vii向viii的转化可通过如下来实现：使R与适当的烷基卤化物例如烷基溴或烷基碘在适当的碱(诸如碳酸钾)的存在下在适当溶剂(诸如丙酮)中反应。可替代地，当R为磺酰基时，该转化可通过如下来完成：使vii与适当的磺酰氯在适当的碱(诸如叔丁醇钾)的存在下在适当溶剂(诸如THF)中反应。
本领域技术人员应当认识到这些步骤的顺序可以根据完成式(I)化合物的合成所需或预期的来改变，如在方案2中显示。
方案2
步骤1：本领域技术人员应当认识到步骤1的适当条件取决于基团R的性质。例如，当R为烷基时，vi向vi-a的转化可通过如下实现：使R与适当的烷基卤化物例如烷基溴或烷基碘在适当的碱(诸如碳酸钾)的存在下在适当溶剂(诸如丙酮)中反应。可替代地，当R为磺酰基时，该转化可通过如下完成：使vi与适当的磺酰氯在适当的碱(诸如叔丁醇钾)的存在下在适当溶剂(诸如THF)中反应。
步骤2：在此时，如果需要，中间体vi-a的基团X可转化为式(I)的基团A。例如，如果X为卤化物且所需基团A为芳基或杂芳基环时，则中间体vi-a向中间体viii的转化可在本领域技术人员已知的各种条件(诸如与适当的硼酸或硼酸酯在钯催化剂(诸如PdCl2(dppf))和适当的碱(例如磷酸三钾)的存在下在适当溶剂(诸如DMF)中反应)下进行。
在此时，如果需要，取代基R1-R13的进一步修饰可如在方案3-9中所示进行。
方案3
在中间体的基团R1为酯的情况下，其可如在方案3中所示来修饰。
步骤1：方案3的第一步可通过本领域技术人员已知的众多条件来完成。例如当RA为乙基时，酯可通过与碱(诸如氢氧化钠)在溶剂或溶剂混合物(诸如THF、MeOH和水)中反应来水解，得到羧酸中间体x。
步骤2：方案3的第二步可通过本领域技术人员已知的多种方法来完成。例如，中间体x与适当的偶联剂(诸如HCTU)和所需的胺在适当溶剂(诸如DMF)中反应得到酰胺中间体xi，其可根据需要例如在方案1的步骤5或步骤6中使用。
方案4
在中间体ix的基团R1为酯的情况下，其可如在方案4中所示来修饰。
步骤1：方案4的第一步可通过本领域技术人员已知的众多条件来完成。例如，中间体ix的酯可用适当的还原剂(诸如氢化铝锂)在适当溶剂(诸如THF)中还原为醇。然后该醇可通过使用适当的氧化条件(例如使用Dess-Martin高碘烷)在溶剂(诸如DCM)中氧化为醛中间体xii。
步骤2：中间体xii可在各种条件(诸如通过使用过氧化物(诸如过氧化氢)在适当溶剂(诸如甲醇)中)下转化为苯酚中间体xiii。
步骤3：如果需要，中间体xiii可通过引入基团RB来进一步修饰。本领域技术人员应当认识到该转化的适当条件取决于取代基RB的性质。例如，当RB为烷基时，其可通过使中间体xiii与适当的烷基卤化物例如甲基碘在适当的碱(诸如碳酸钾)的存在下在适当溶剂(诸如丙酮)中反应来引入。可替代地，如果RB为氨基甲酸酯，则其可通过使中间体xiii与适当官能化的氨基甲酰氯在适当的碱(诸如吡啶)的存在下反应来引入。中间体xiv可按照需要例如在方案1的步骤5或步骤6中使用。
方案5
在方案5的步骤1中，将醛中间体xii通过还原胺化转化为胺中间体xv。本领域技术人员应当认识到存在多种方式来完成该转化，诸如通过使中间体xii与所需的胺在适当溶剂(诸如DMF)中反应，随后加入适当的还原剂(诸如三乙酰氧基硼氢化钠)。中间体xv可按照需要例如在方案1的步骤5或步骤6中使用。
方案6
在中间体ix的基团R1为酯的情况下，其可如在方案6中所示来修饰。
步骤1：方案6的第一步可通过本领域技术人员已知的众多条件来完成。例如当RA为乙基时，酯可通过与碱(诸如氢氧化钠)在溶剂或溶剂混合物(诸如THF、MeOH和水)中反应来水解，得到羧酸中间体xii。
步骤2：羧酸中间体x可在多种条件(例如与二苯基磷酰基叠氮化物在碱(诸如三乙胺)的存在下在适当溶剂(诸如二噁烷)中反应)下转化为胺中间体xvi。加入醇诸如叔丁醇将产生相应的氨基甲酸酯；如果完成该步，则可任选加入第二步以移去氨基甲酸酯。例如，氨基甲酸叔丁酯可用TFA在溶剂(诸如DCM)中处理得到胺中间体xvi。任选地，如果基团X为卤化物诸如溴化物，则其可转化为基团A，之后移去氨基甲酸酯。例如，如果所需基团A为芳基或杂芳基环，则中间体xii向中间体xvi的转化可在本领域技术人员已知的各种条件(诸如与适当的硼酸或硼酸酯在钯催化剂(诸如PdCl2(dppf))和适当的碱(例如磷酸三钾)的存在下在适当溶剂(诸如DMF)中反应)下进行。
步骤3：任选地，如果胺中间体xvi的另外的官能化通过引入一个或多个基团RB和/或RC来实现，则这可在此时完成。本领域技术人员应当认识到该转化的适当条件将取决于取代基RB和/或RC的性质。例如，当RB和/或RC为烷基时，则其可通过使中间体xvi与适当的烷基卤化物例如甲基碘在适当的碱(诸如碳酸钾)的存在下在适当溶剂(诸如丙酮)中反应来引入。可替代地，如果RB和/或RC为氨基甲酸酯，则其可通过使中间体xvi与适当官能化的氯甲酸酯诸如氯甲酸乙酯在适当的碱(诸如吡啶)的存在下在适当溶剂(诸如DCM)中反应来引入。如果RB和/或RC为酰基，则其可通过使中间体xvi与适当的酰基卤诸如乙酰氯在适当的碱(诸如吡啶)的存在下在适当溶剂(诸如DCM)中反应来引入。如果RB和/或RC为脲，则其可通过使中间体xvi与适当的异氰酸酯在碱(诸如吡啶)和催化剂(诸如DMAP)的存在下在适当溶剂(诸如DCM)中反应来引入。本领域技术人员应当认识到如果需要不相同的基团RB和RC，则它们可在两步中通过连续应用上面所列的适当条件来引入。
中间体xvii可按照需要例如在方案1的步骤5或步骤6中使用。
方案7
步骤1：在方案7的步骤1中，中间体xvi的胺可通过使中间体xvi与亚硝酸烷基酯诸如亚硝酸叔丁酯和铜源(诸如溴化铜(II))在适当溶剂(诸如乙腈)中反应而转化为卤化物Y诸如溴化物。
步骤2：任选地，中间体xviii的卤化物Y可转化为不同的官能团Z。本领域技术人员应当认识到该转化的适当条件将取决于取代基Z的性质。例如，如果所需基团Z为芳基或杂芳基环，则中间体xviii向中间体xix的转化可在本领域技术人员已知的各种条件(诸如与适当的硼酸或硼酸酯在钯催化剂(诸如PdCl2(dppf))和适当的碱(例如磷酸三钾)的存在下在适当溶剂(诸如THF)中反应)下进行。中间体xix可按照需要例如在方案1的步骤5或步骤6中使用。
方案8
步骤1：酯中间体ix可在多种条件(例如通过使中间体ix与适当的有机金属试剂(例如甲基溴化镁)在适当溶剂或溶剂混合物(诸如THF和乙醚)中反应)下转化为二烷基甲醇中间体xx。
步骤2:任选地，中间体xx的醇可在此时转化为不同的官能团Y。本领域技术人员应当认识到该转化的适当条件将取决于取代基Y的性质。例如，如果所需基团Y为胺，则该转化可通过如下完成：使中间体xx与适当的酸(诸如盐酸)在适当溶剂(诸如乙醚)中反应，随后加入所需胺。中间体xxi可按照需要例如在方案1的步骤5或步骤6中使用。
方案9
在任何合适的时间点，如果需要，可调整方案1的中间体v-viii的官能团R2。例如，中间体vi的基团R2可如在方案9中所述改变。
步骤1：在方案9的步骤1中，中间体vi-a的官能团R2可任选转化为中间体xxii的另外的官能团R2。本领域技术人员应当认识到该转化的适当条件将取决于vi-a和xxii的取代基R2的性质。例如，如果中间体vi-a的R2为伯酰胺且中间体xxii的所需基团R2为腈，则该转化可通过使中间体vi-a与适当的脱水剂(诸如Burgess试剂)在适当的溶剂(诸如DCM)中反应来完成。可替代地，如果中间体vi-a的R2为伯酰胺且中间体xxii的所需基团R2为硫代酰胺，则该转化可通过使中间体vi-a与试剂(诸如五硫化二磷)和碱(诸如碳酸氢钠)在适当的溶剂(诸如二甘醇二甲醚)中反应来完成。可替代地，如果中间体vi-a的R2为伯酰胺且中间体xxii的所需基团R2为异噁唑，则该转化可通过使中间体vi-a与试剂(诸如2,3-二溴丙-1-烯)和碱(诸如碳酸铯)在适当溶剂(诸如DMF)中反应来完成。中间体xxii可按照需要例如在方案1的步骤5或步骤6中使用。
可替代地，咔唑中间体viii可如在方案10中所示制备。
方案10
步骤1：任选地，在方案10的步骤1中，式(I)的基团A可由适当的卤化物或类卤化物引入至中间体iii。例如，如果X为溴化物且所需基团A为芳基或杂芳基环，则中间体iii向中间体iii-a的转化可在本领域技术人员已知的各种条件(诸如与适当的硼酸或硼酸酯在钯催化剂(诸如PdCl2(dppf))和适当的碱(例如磷酸三钾)的存在下在适当溶剂(诸如THF)中反应)下进行。
步骤2：在方案10的步骤2中，通过与芳基卤化物或类卤化物在适当的催化剂(诸如(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]二氯化钯(II))的存在下在适当的碱(诸如碳酸铯)的存在下在适当溶剂(诸如甲苯)中反应，将中间体iii-a转化为中间体xxiii。
步骤3：方案10的第三步可通过使中间体xxiii与适当的催化剂(诸如乙酸钯(II))在适当溶剂(诸如特戊酸)中反应来完成，得到中间体viii。中间体viii可按照需要例如在步骤5或步骤6中使用。
实施例
在以下实施例中进一步限定本发明。应了解，仅为说明而给出所述实施例。本领域技术人员由上述讨论及实施例可确定本发明的基本特征，且在不偏离本发明的精神及范畴下，可作出各种改变及修正以使本发明适用于各种用途及条件。因而，本发明不受下文阐述的说明性实施例限制，而由其随附的权利要求定义。
缩写
ACN 乙腈
AcOH 乙酸
AlMe3 三甲基铝
aq 水性
Bn 苄基
Boc 叔丁氧基羰基
Boc2O 一缩二碳酸二叔丁酯
Burgess试剂 N-(三乙基铵磺酰基)氨基甲酸甲酯
CBz 苄基氧基羰基
DCC 1,3-二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DDQ 2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌
DIEA 二异丙基乙胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DME 二甲氧基乙烷
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
Pd(dppf)2Cl2 [1,1'-二(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)
EDC 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
Et2AlCl 二乙基氯化铝
Et3N 三乙胺
Et2O 乙醚
EtOH 乙醇
EtOAc 乙酸乙酯
equiv. 当量
g 克
h或hr 小时
HCTU O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HOBt 羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
iPrOH 异丙醇
KOtBu 叔丁醇钾
LCMS 液相色谱-质谱
LDA 二异丙基氨基锂
LiHMDS 二(三甲基甲硅烷基)氨基锂
Me 甲基
MeI 甲基碘
MeOH 甲醇
min 分钟
mL 毫升
mmol 毫摩尔
MTBE 甲基叔丁醚
NaHMDS 二(三甲基甲硅烷基)氨基钠
n-BuLi 正丁基锂
NH4OAc 乙酸铵
NMP N-甲基吡咯烷酮
Pd(OAc)2 乙酸钯
RT或Rt 保留时间
r.t. 室温
sat 饱和
t-Bu 叔丁基
t-BuLi 叔丁基锂
tBuOH 叔丁醇
tBuOMe 叔丁基甲基醚
TBTU O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
Tf2O 三氟甲基磺酸酐
THF 四氢呋喃
18-冠-6 [C2H4O]6IUPAC名称-1,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷
实施例1
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1-哌啶基羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤1a:3-羟基环己烷羧酸乙酯
将3-羟基苯甲酸乙酯(50g,301mmol)在乙醇(700mL)中的溶液与5％铑/氧化铝(5g,2.429mmol)在2升帕尔压力瓶中混合并在氢气气氛(60psi)下在室温振摇。在接下来的8小时内将瓶用氢气再次加压三次，然后振摇三天。将混合物经硅藻土滤过，将固体用乙醇淋洗并经滤液真空浓缩得到无色液体(53.3g)。HPLC保留时间＝1.05min,柱：Luna,3.0x55mm；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后1分钟保持在100％B；流速：4mL/min。MS(ES):m/z＝173[M+H]+.
步骤1b:3-氧代环己烷羧酸乙酯
将3-羟基环己烷羧酸乙酯(53.3g,294mmol)在丙酮(700mL)中的溶液在冰水浴中搅拌(内部温度10-15℃)并用Jones试剂(120mL,320mmol)逐滴处理。在加入全部Jones试剂后，仍保持黄色。将反应混合物在10-15℃搅拌25分钟，然后加入40ml异丙醇并将反应混合物在10-15℃搅拌15分钟。
溶液变为蓝绿色。将上清液由淤浆倾出，将其搅拌并用新鲜的丙酮研磨三次并经硅藻土填料倾出。将合并的上清液真空浓缩并将残留物吸收于乙醚中，用饱和NaHCO3溶液和盐水的1:1混合物洗涤，经MgSO4干燥并真空浓缩得到预期产物(52.2g,95％)，其为无色油状物。
HPLC保留时间＝1.07min,柱：Luna,3.0x 55mm；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后1分钟保持在100％B；流速：4mL/min。MS(ES):m/z＝171[M+H]+.
步骤1c:5-溴-2-肼基苯甲酸二盐酸盐
将亚硝酸钠(7.00g,101mmol)在H2O(34mL)中的溶液以使得温度不超过0℃的速率逐滴加入至2-氨基-5-溴苯甲酸(20.87g,97mmol)在浓HCl(96mL)中的冷却的(-14℃,冰盐浴)、乳白色混悬液中(历时12分钟)。将浅棕色溶液在0℃搅拌6min，然后以使得温度保持在-20℃和-5℃之间的速率分批加入至氯化锡(II)(55.0g,290mmol)在浓HCl(34.0mL)中的冷却的(-20℃,异丙醇/干冰)并快速搅拌的溶液中(历时30分钟)。在加入之间，将含有重氮中间体的烧瓶保持在冰/盐浴中。加入完成后，将反应混合物在-10℃搅拌45分钟，然后移去冷却浴。将所得的乳白色混悬液温热至室温并在室温搅拌1h。将固体经滤过收集，用水和乙醚洗涤，通过使气体吸入通过滤饼来干燥得到预期产物(21.98g)，其为灰色固体。
HPLC保留时间＝0.56min,柱：Luna,3.0x 55mm；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后1分钟保持在100％B；流速：4mL/min。MS(ES):m/z＝231[M+H]+.
步骤1d:6-溴-2-(乙氧基羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-8-羧酸
将5-溴-2-肼基苯甲酸二盐酸盐(21.9g,69.9mmol)和3-氧代环己烷羧酸乙酯(15.0g,80mmol)在AcOH(175mL)中的乳白色混悬液回流加热4h(油浴温度130℃)。停止加热并将反应混合物冷却至室温并滤过。将固体用乙酸洗涤并在氮气流中干燥得到预期产物(19.9g)。
HPLC保留时间＝1.45min,柱：Luna,3.0x 55mm；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后1分钟保持在100％B；流速：4mL/min。MS(ES):m/z＝366[M+H]+.
步骤1e:6-溴-8-氨基甲酰基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-2-羧酸乙酯
向6-溴-2-(乙氧基羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-8-羧酸(18.5g,42.4mmol)、EDC(10.58g,55.2mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(8.45g,55.2mmol)在THF/CH2Cl2(5/1)(480mL)中的浅的混悬液中加入氢氧化铵(9.91mL,76mmol)。将反应混合物在室温搅拌一个周末。将反应混合物浓缩，然后用500ml水研磨(超声2分钟)，然后经中性多孔玻璃料滤过。将固体用水洗涤并在氮气流中干燥得到预期产物(15.1g)。
HPLC保留时间＝1.94min,柱：Luna,3.0x 55mm；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后1分钟保持在100％B；流速：4mL/min。MS(ES):m/z＝365[M+H]+.
步骤1f:6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸乙酯
将6-溴-8-氨基甲酰基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-2-羧酸乙酯(15.1g,39.7mmol)、DDQ(23.5g,101mmol)和甲苯(500ml)在配备有回流冷凝器的1升圆底烧瓶中混合并加热回流45分钟。将反应混合物冷却至室温并经中性多孔玻璃料滤过。将固体用甲苯洗涤并在氮气流下干燥。将结晶产物溶于乙酸乙酯和1M Na2CO3水溶液的混合物中。分离各层，将水层再用1M Na2CO3水溶液萃取两次，然后用饱和NH4Cl水溶液萃取一次，然后用盐水萃取。将全部水层用乙酸乙酯反萃取一次。将有机相经MgSO4干燥，滤过并浓缩。
将滤过后的母液真空浓缩，然后溶于乙酸乙酯中并用1M Na2CO3溶液萃取3x，然后用饱和NH4Cl水溶液萃取一次，然后用盐水萃取。将有机层经MgSO4干燥，滤过并真空浓缩。将该物质与来自前次萃取的物质混合得到预期产物(17.0g,83％)，其无需进一步纯化即可使用。
HPLC保留时间＝1.96min,柱：Luna,3.0x 55mm；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后1分钟保持在100％B；流速：4mL/min。MS(ES):m/z＝361[M+H]+.
步骤1g:6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸
将6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(13.60g,26.4mmol)混悬于THF(240ml)/MeOH(50ml)(290mL)中。加入NaOH(1M)(79mL,79mmol)。将所得的混合物在室温搅拌过夜。加入另外的30ml 1N NaOH并将混合物在室温搅拌另外的3小时。将混合物浓缩至几乎干燥。加入1L水并将混合物超声30分钟。在搅拌的同时将110ml 1N HCl加入至上述混合物中。将棕色析出物滤过并用H2O洗涤并经空气抽吸干燥过夜。得到预期产物(12.1g)并无需进一步纯化即可使用。
HPLC保留时间＝0.97min,柱：Luna,3.0x 55mm；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后1分钟保持在100％B；流速：4mL/min。MS(ES):m/z＝333[M+H]+.
步骤1h:8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸
向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸(1050mg,3.15mmol)、3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑-(1055mg,4.73mmol)中加入DMF(12mL)。将反应混合物脱气，然后加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(129mg,0.158mmol)和磷酸三钾水溶液(3.15mL,9.46mmol)。将反应混合物脱气并在80℃加热。加入10％LiCl并将反应混合物用EtOAc萃取，干燥，并浓缩得到预期产物(800mg)，其无需进一步纯化即可使用。
HPLC保留时间＝0.74,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时2分钟，然后2分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min.MS(ES):m/z＝350[M+H]+.
向8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸(26mg,0.074mmol)中加入HCTU(89mg,0.223mmol)、N,N-二甲基吡啶-4-胺(27.3mg,0.223mmol)和DMF(1.0mL)。然后加入哌啶(38.0mg,0.447mmol)并将反应混合物在室温搅拌2h。将粗物质滤过并经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。
最终产物的收率为3.7mg，且其经LCMS分析评估的纯度为100％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。注射1条件：保留时间：1.51min；柱：Waters Acquity UPLC BEHC18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝416[M+H+]。注射2条件：保留时间：1.52min；柱：WatersAcquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.
实施例2
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤2a:8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸
向8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸(800mg,2.290mmol)中加入丙酮(1.0mL)、碳酸钾(1266mg,9.16mmol)、18C6(60.5mg,0.229mmol)和(溴甲基)环丙烷(3092mg,22.90mmol)。将反应混合物加热至70℃。24小时后，将反应混合物浓缩。将残留物溶于MeOH(1.0mL)中并加入氢氧化钠(2.186mL,21.86mmol)。将反应混合物在室温搅拌两小时。将反应混合物浓缩，加入1N HCl，并收集析出物得到预期产物(970mg)。
HPLC保留时间＝0.77,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时2分钟，然后2分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ES):m/z＝404[M+H]+.
向8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸(52mg,0.129mmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中加入HCTU(154mg,0.387mmol)、DMAP(47.2mg,0.387mmol)和顺-2,6-二甲基吗啉(89mg,0.773mmol)。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：WatersXBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。最终产物的收率为28.3mg，且其经LCMS分析评估的纯度为95％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：保留时间：1.554min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝501[M+H+].
注射2条件：保留时间：1.548min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝501[M+H+].
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.35-8.31(m,2H),8.25(s,1H),7.82(s,1H),7.75(s,1H),7.45(d,J＝1.8Hz,1H),7.26(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),4.55(d,J＝6.8Hz,2H),3.61(d,J＝6.6Hz,2H),2.48(s,2H),2.31(s,2H),1.30-0.86(m,7H),0.37(d,J＝6.8Hz,4H).
实施例3
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤3a:3-溴-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸(542mg,1.302mmol)在DMF(5.0mL)中的溶液中加入HCTU(518mg,1.302mmol)、DMAP(477mg,3.90mmol)和吗啉(680mg,7.81mmol)。2小时后，加入10％LiCl在水中的溶液并收集析出物。将固体用水洗涤并空气干燥得到预期产物(385mg)。
HPLC保留时间＝0.77,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时2分钟，然后2分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ES):m/z＝402[M+H]+.
向3-溴-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(300mg,0.746mmol)和3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑(233mg,1.044mmol)中加入DMF(5ml)。将反应混合物脱气，然后加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(15.23mg,0.019mmol)和磷酸三钾水溶液(0.746ml,2.237mmol)。将反应混合物脱气并在80℃加热过夜。加入水并收集析出物。将固体用水洗涤并干燥得到预期产物(320mg)。
HPLC保留时间＝0.74,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时2分钟，然后2分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ES):m/z＝419[M+H]+.
实施例4
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(36mg,0.086mmol)在丙酮(1mL)中的溶液中加入(溴甲基)环丙烷(116mg,0.860mmol)和碳酸钾(47.6mg,0.344mmol)。将反应混合物加热至70℃过夜。将反应混合物滤过并浓缩。
将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。化合物的收率为12.6mg.
HPLC保留时间＝0.78,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时2分钟，然后2分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ES):m/z＝473[M+H]+.
实施例5
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9-(甲基磺酰基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(64mg,0.153mmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中加入氢化钠(60％混悬于矿物油中,18.35mg,0.459mmol)。将反应混合物在室温搅拌15分钟，然后加入甲磺酰氯(0.012mL,0.153mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。将反应混合物用一滴水淬灭并滤过。
将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。产物的收率为3.2mg，且其经LCMS分析评估的纯度为99％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：保留时间：1.162min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝497[M+H+].
注射2条件：保留时间：1.174min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝497[M+H+].
实施例6
7-((4-氰基-1-哌啶基)羰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤6a:8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸
在氮气下向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸(2g,6.00mmol)、(3,5-二甲基异噁唑-4-基)硼酸(1.269g,9.01mmol)在DMF(60.0ml)中的脱气溶液中加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(300mg,0.367mmol)和K2CO3(2.489g,18.01mmol)。将反应混合物用氮气净化并在95℃加热2小时。将反应混合物滤过，并用1N aq.HCl中和至pH～7。将反应混合物倒入800mL冰上并在室温搅拌过夜。将析出物经多孔玻璃漏斗滤过得到8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸(2.42g,6.93mmol,115％的收率)。LC/MS；(M+H)+＝350.1
步骤6b:7-(4-氰基哌啶-1-羰基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸(80mg,0.229mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入哌啶-4-腈(76mg,0.687mmol)和DIPEA(0.120mL,0.687mmol)，随后加入HOBT(105mg,0.687mmol)和EDC(132mg,0.687mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水中得到析出物。滤过得到7-(4-氰基哌啶-1-羰基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(96mg,0.217mmol,95％的收率)，其为棕色固体。LC/MS；(M+H)+＝442.4
向7-(4-氰基哌啶-1-羰基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(46mg,0.104mmol)在THF(2mL)中的混悬液中在室温加入KOtBu(1M在THF中,0.135mL,0.135mmol)。反应混合物变为黄色并搅拌5分钟，随后加入甲磺酰氯(0.024mL,0.313mmol)。将反应混合物在室温搅拌10分钟然后浓缩。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 100mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。
产物的收率为3.9mg，且其经LCMS分析评估的纯度为89％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：保留时间：1.16min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝520[M+H+].
注射2条件：保留时间：1.16min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝520[M+H+].
表1中的实施例按照如实施例6给出的相同操作合成。
表1
HPLC条件A:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。条件B:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min
实施例20
7-((4-氰基-1-哌啶基)羰基)-9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向7-(4-氰基哌啶-1-羰基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(20mg,0.045mmol)在THF(2mL)中的混悬液中在室温加入KOtBu(1M于THF中,0.059mL,0.059mmol)。反应混合物变为黄色并搅拌5分钟，随后加入环丙烷磺酰氯(19.11mg,0.136mmol)。将反应混合物在室温搅拌10分钟，然后浓缩。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。产物的收率为2.3mg，且其经LCMS分析评估的纯度为93％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：保留时间：1.20min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝546[M+H+].
注射2条件：保留时间：1.20min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝546[M+H+].
表2中的实施例按照如实施例20给出的相同操作合成。
表2
HPLC条件A:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。条件B:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min
实施例27
(8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯
步骤27a:环丙基甲基6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸酯
向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸(528mg,1.585mmol)中加入丙酮(1.0mL)、碳酸钾(876mg,6.34mmol)、18C6(41.9mg,0.158mmol)和(溴甲基)环丙烷(2140mg,15.85mmol)。将反应混合物加热至50℃过夜。将反应混合物浓缩并加入MeOH(1.0mL)、水(1.0ml)和50％NaOH(0.792mL,7.92mmol)。将反应混合物在室温搅拌8小时，部分浓缩，用1NHCl(5.0ml)稀释并滤过。将固体用水(100ml)洗涤并经空气流干燥过夜得到环丙基甲基6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸酯(408mg,62％)。HPLC保留时间＝0.84,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝416[M+H]+.
步骤27b:6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-基氨基甲酸叔丁酯
将6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸(3)(0.050g,0.129mmol)与4A分子筛(0.100g,0.129mmol)在二噁烷(0.646ml)中混合。向混合物中加入Et3N(0.044ml,0.319mmol)和叠氮磷酸二苯酯(0.069ml,0.319mmol)。将混合物在55℃搅拌2小时。将tBuOH(0.123ml,1.291mmol)加入至混合物中并在80℃搅拌16小时。将混合物浓缩，用0.4ml DCM稀释并在12G ISCO柱上纯化(使用0-100％乙酸乙酯/庚烷)。浓缩后，收集得到6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-基氨基甲酸叔丁酯，其为灰白色固体(11.8mg,20％)。HPLC保留时间＝0.97,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B over 2.20分钟,然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝459[M+H]+.
向(6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(18.50mg,0.040mmol)、3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑(13.51mg,0.061mmol)中加入DMF(404μl)。将反应混合物脱气，然后加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(1.648mg,2.018μmol)和3.0M磷酸钾水溶液(40.4μl,0.121mmol)。将反应混合物用氮气脱气3次，并在80℃加热2小时。将溶剂真空除去并将残留物用DCM(3.0ml)稀释。加入水并分离各层。收集有机层，用1.0ml盐水洗涤，经Na2SO4干燥，滤过并浓缩。将残留物溶于0.5ml DCM中并载入至4G ISCO柱上。用0-75％乙酸乙酯/庚烷洗脱12分钟完成纯化。浓缩后，收集得到(8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯，其为白色固体(16.7mg,88％)。HPLC保留时间＝1.01,柱条件：WatersAcquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B over 2.20分钟,然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝475[M+H]+.
实施例28
7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入(8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.146g,0.308mmol)、DCM(1mL)和TFA(1mL,12.98mmol)。将反应混合物在室温搅拌30分钟然后浓缩，并置于真空下以除去TFA。将残留物用DCM(10.0ml)稀释。加入水并分离各层。收集有机层，用1.0ml盐水洗涤，经Na2SO4干燥，滤过并浓缩得到7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(105mg,91％)。HPLC保留时间＝0.63,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时2.20分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝375[M+H]+.
实施例29
7-乙酰氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.020g,0.053mmol)、DCM(1mL)、吡啶(0.042g,0.534mmol)、N,N-二甲基吡啶-4-胺(0.326mg,2.67μmol)和乙酰氯(0.021g,0.267mmol)。将反应混合物在室温搅拌0.5小时。将反应混合物浓缩，用DMSO稀释，经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到7-乙酰氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(2.5mg,11％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.188,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.(HPLC保留时间方法b).MS(ES):m/z＝417[M+H]+。
注射2条件：HPLC保留时间＝1.291,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝417[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ8.12(d,J＝1.5Hz,1H),8.03-7.99(m,2H),7.61(s,1H),7.39(d,J＝1.5Hz,1H),7.24(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.46(d,J＝6.4Hz,2H),4.34(s,1H),3.01(s,1H),2.48-2.44(m,3H),2.31(s,3H),2.21(s,3H),1.34-1.24(m,1H),0.48-0.40(m,4H).
实施例30
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(二-1,3-噻唑-2-基氨基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在5mL螺旋盖小瓶中加入7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.022g,0.059mmol)、碳酸铯(0.057g,0.176mmol)、2-溴噻唑(0.014g,0.088mmol)和(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]二氯化钯(II)(4.38mg,5.88μmol)在叔丁醇(1mL)中的溶液得到混悬液。将反应混合物抽吸/用氮气净化三次。然后将其加热至80℃且保持3小时。将挥发物在氮气流下除去并将残留物用1.0ml DMSO稀释并经5微米滤片滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；梯度：15-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥(0.8mg,2.3％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.87,柱：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝541[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.78,柱：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝541[M+H]+.
实施例31
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-((乙基氨基甲酰基)氨基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.030g,0.080mmol)、DCM(1mL)、吡啶(1.0ml)、催化的DMAP和异氰酰基乙烷(0.028g,0.401mmol)。2小时15分钟后，将反应混合物浓缩，用DMSO稀释，并经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-((乙基氨基甲酰基)氨基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(3.2mg,8.8％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.318,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝446[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.351,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝446[M+H]+.1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 7.98-7.95(m,1H),7.94(s,1H),7.39-7.29(m,1H),7.26-7.14(m,1H),7.01(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.45(d,J＝6.4Hz,2H),3.29(q,J＝7.4Hz,2H),2.46(s,3H),2.31(s,3H),1.35-1.27(m,1H),1.22-1.17(m,3H),0.49-0.38(m,4H)
实施例32
(8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-2-基)氨基甲酸乙酯
在2打兰小瓶中加入7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.025g,0.067mmol)、DCM(1mL)、吡啶(0.053g,0.668mmol)和氯甲酸乙酯(0.036g,0.334mmol)。将反应混合物在室温搅拌0.5小时。将反应混合物浓缩，用DMSO稀释，经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：WatersXBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到(8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-2-基)氨基甲酸乙酯(5.9mg,19％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.588,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝447[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.588,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝447[M+H]+.1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 8.01-7.96(m,1H),7.95-7.90(m,1H),7.62(s,1H),7.38(d,J＝2.0Hz,1H),7.16(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),4.46(d,J＝6.9Hz,2H),4.35(br.s.,1H),4.25(q,J＝7.1Hz,2H),2.46(s,3H),2.31(s,3H),1.36(t,J＝6.9Hz,3H),1.33-1.26(m,1H),0.49-0.39(m,4H).
实施例33
(8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-2-基)氨基甲酸甲酯
上述标题化合物由氯甲酸甲酯根据制备实施例32，即(8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-2-基)氨基甲酸乙酯所述的条件制备。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。产物的收率为10.3mg，且其经LCMS分析评估的纯度为100％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：保留时间：1.457。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝453[M+H+].
注射2条件：保留时间：1.456min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.
实施例34
7-溴-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
和
实施例35
6,7-二溴-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.035g,0.093mmol)、乙腈(0.467ml)、溴化铜(II)(0.025g,0.112mmol)，并逐滴加入2-甲基-2-亚硝基丙烷(0.012g,0.126mmol)。将反应混合物在室温搅拌8小时。将反应混合物用1.0ml 10％亚硫酸钠溶液淬灭并浓缩。将10mg粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridgeC18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：25-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到7-溴-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.5mg,1.16％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.93,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝438[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.941,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝438[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 8.25(d,J＝2.0Hz,1H),8.06(d,J＝2.0Hz,1H),7.61-7.58(m,2H),7.49-7.44(m,3H),4.49(d,J＝6.9Hz,2H),2.47(s,3H),2.32(s,3H),1.26(br.s.,1H),0.49-0.42(m,2H),0.40-0.33(m,2H)。
将第二个产物，即6,7-二溴-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺经制备性HPLC纯化，使用以下条件：Phenomenex Luna柱5u,100A°,21.2X100mm,40-100％溶剂B,(溶剂A(90％水,10％甲醇,0.1％TFA),溶剂B(10％水,90％甲醇,0.1％TFA),10分钟梯度，运行15分钟，25mL/min)。在将溶剂经旋转蒸发浓缩后，收集6,7-二溴-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺，其为黄色固体(10.0mg,20％)。分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。注射条件：HPLC保留时间＝1.09,HPLC保留时间＝1.09,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝516[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.78(s,1H),8.41(d,J＝1.8Hz,1H),8.27(s,1H),8.22(s,1H),7.85(s,1H),7.48(d,J＝1.8Hz,1H),4.52(d,J＝7.0Hz,2H),2.54-2.48(m,3H),2.33(s,3H),1.30-1.18(m,1H),0.38-0.33(m,1H),0.41-0.33(m,3H).
实施例36
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吡啶基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向7-溴-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.025g,0.057mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)吡啶(0.029g,0.143mmol)中加入THF(0.570ml)。将反应混合物脱气，然后加入[1,1′-二(二-叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(1.859mg,2.85μmol)和3.0M磷酸钾水溶液(0.057ml,0.171mmol)。将反应混合物脱气并用氮气回填三次。将混合物设置为在60℃加热30分钟。将反应混合物浓缩，用DMSO稀释并经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吡啶基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(2.6mg,9.2％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.514,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝437[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.419,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝437[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 8.74-8.67(m,2H),8.26(d,J＝1.5Hz,1H),8.23(d,J＝6.4Hz,2H),8.04(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.76(d,J＝8.9Hz,1H),7.62(s,2H),7.55(d,J＝1.5Hz,1H),4.59(d,J＝6.9Hz,2H),2.50(s,3H),2.35(s,3H),1.33(br.s.,1H),0.53-0.39(m,4H).
实施例37
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(甲基氨基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
和
实施例38
9-(环丙基甲基)-7-(二甲基氨基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.020g,0.053mmol)、THF(1.0mL)、Na2CO3(0.023g,0.214mmol)和碘甲烷(0.015g,0.107mmol)。将反应混合物在50℃搅拌4小时，然后将其在室温搅拌过夜。将反应混合物用水(0.1ml)淬灭，浓缩，用DMSO稀释并经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。
将含有每个预期产物的馏分合并并经离心蒸发干燥得到最终化合物：
实施例37,9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(甲基氨基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(1.6mg,7.7％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.515,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝389[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.085,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝389[M+H]+.1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 7.97(s,1H),7.90-7.79(m,2H),7.60(s,1H),7.26(d,J＝1.5Hz,1H),6.70-6.59(m,2H),4.42(d,J＝6.9Hz,2H),4.32(br.s.,1H),2.93(s,3H),2.45(s,3H),2.30(s,3H),1.35-1.19(m,1H),0.50-0.35(m,4H)。
实施例38,9-(环丙基甲基)-7-(二甲基氨基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(4.1mg,18.7％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.768,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝403[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.133,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝403[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.91(d,J＝8.4Hz,1H),7.89(d,J＝2.0Hz,1H),7.60(s,1H),7.28(d,J＝2.0Hz,1H),6.82(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.74(d,J＝2.0Hz,1H),4.43(d,J＝6.4Hz,2H),4.31(s,1H),3.09(s,6H),2.45(s,3H),2.31(s,3H),1.34-1.22(m,1H),0.50-0.35(m,4H).
实施例39
7-(环戊基甲基氨基)-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.030g,0.080mmol)、DMF(1mL)、Na2CO3(0.085g,0.801mmol)和(碘甲基)环戊烷(0.034g,0.160mmol)。将反应混合物在80℃加热过夜。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridgeC18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：30-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。
化合物的收率为1.0mg，且其经LCMS分析评估的纯度为99％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：保留时间：1.802min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝457[M+H+].
注射2条件：保留时间：1.563min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝457[M+H+].
实施例40
7-(乙酰基(甲基)氨基)-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(甲基氨基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.033g,0.085mmol)、DCM(1.0mL)、吡啶(0.336g,4.25mmol)和乙酰氯(0.033g,0.425mmol)。将反应混合物在室温搅拌0.5小时。将反应混合物用水(0.1ml)淬灭，浓缩，用DMSO稀释并经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridgeC18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到7-(乙酰基(甲基)氨基)-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(9.5mg,25％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.446,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝431[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.446,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝431[M+H]+.1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 8.20(d,J＝7.9Hz,1H),8.12(d,J＝2.0Hz,1H),7.60(s,1H),7.50(d,J＝1.5Hz,1H),7.44(d,J＝2.0Hz,1H),7.14(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),4.53(d,J＝6.4Hz,2H),4.32(s,1H),3.38(s,3H),2.47(s,3H),2.32(s,3H),1.93(s,3H),1.31-1.22(m,1H),0.51-0.44(m,2H),0.38(q,J＝5.0Hz,2H).
实施例41
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.012g,0.032mmol)、DMF(1.0mL)、Na2CO3(0.014g,0.128mmol)和1-氯-2-(2-氯乙氧基)乙烷(4.58mg,0.032mmol)。将反应混合物在110℃搅拌72小时。将反应混合物浓缩，用DMSO(2.0ml)稀释并经制备性HPLC纯化，使用以下条件：Phenomenex Luna柱5u,100A°,21.2X 100mm,30-90％溶剂B,(溶剂A(90％水,10％甲醇,0.1％TFA),溶剂B(10％水,90％甲醇,0.1％TFA),10分钟梯度，运行15分钟，25mL/min)。在将溶剂经旋转蒸发浓缩后，收集得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基)-9H-咔唑-1-甲酰胺，其为灰白色固体(1.2mg,8.2％)。最终纯度经三次LC/MS确定。注射条件：HPLC保留时间＝0.8,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝444[M+H]+。HPLC保留时间＝11.599,柱条件：Xbridge 4.6mm x 50mm,3.5μm粒度；流速1mL/min；梯度时间15min；100％溶剂A至100％溶剂B且保持100％溶剂B，3min；在254nm监测(溶剂A:10％MeOH,90％H2O,0.1％TFA；溶剂B:90％MeOH,10％H2O,0.1％TFA)。HPLC保留时间＝12.433,柱条件：Sunfire 4.6mm x 50mm,3.5μm粒度；流速1mL/min；梯度时间15min；100％溶剂A至100％溶剂B且保持100％溶剂B，3min；在220nm监测(溶剂A:10％MeOH,90％H2O,0.1％TFA；溶剂B:90％MeOH,10％H2O,0.1％TFA)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)d 8.06(d,J＝1.8Hz,1H),7.38(d,J＝1.8Hz,1H),7.14(d,J＝1.5Hz,1H),7.04(dd,J＝8.7,1.9Hz,1H),6.95(d,J＝2.2Hz,1H),6.82(d,J＝2.2Hz,1H),4.52(d,J＝6.6Hz,2H),3.82-3.74(m,4H),3.69(dd,J＝9.5,4.8Hz,4H),2.68(s,3H),2.33(s,3H),2.14-2.00(m,1H),1.39-1.28(m,4H).
实施例42
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代-1-哌啶基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入5-氯戊酸(0.108g,0.791mmol)、DCM(1mL)、1滴DMF和草酰氯(0.014g,0.107mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后浓缩干燥。向其中加入DCM(1.0mL)、7-氨基-9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.020g,0.053mmol)和吡啶(0.021g,0.267mmol)。将反应混合物在室温搅拌0.5小时。将反应混合物用DCM(3.0ml)稀释并用水(2.0ml)洗涤。分离各层并将水层用DCM(3.0ml)反萃取。将合并的有机层用盐水(1.0ml)洗涤并分离各层。将有机层经Na2SO4干燥，滤过并浓缩。将残留物转移至2打兰小瓶中并向其中加入丙酮(1.0mL)、18C6(0.706mg,2.67μmol)和碳酸钾(2.95mg,0.021mmol)。将小瓶封盖并在50℃搅拌3小时。将反应混合物冷却至室温，浓缩并用DMSO稀释并经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代-1-哌啶基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(10.5mg,40％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.505,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝457[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.504,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝457[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 8.16(d,J＝8.4Hz,1H),8.09(d,J＝1.5Hz,1H),7.64(s,1H),7.46(d,J＝2.0Hz,1H),7.45(d,J＝1.5Hz,1H),7.17-7.13(m,1H),4.50(d,J＝6.9Hz,2H),4.38(s,2H),3.81(t,J＝5.4Hz,2H),2.61(s,2H),2.47(s,3H),2.32(s,3H),2.10-2.00(m,2H),1.34-1.22(m,1H),0.49-0.37(m,4H).
实施例43
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代-1,3-噁嗪烷-3-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
上述标题化合物由氯甲酸3-氯丙酯根据制备9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代-1-哌啶基)-9H-咔唑-1-甲酰胺所述的条件制备。得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代-1,3-噁嗪烷-3-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(8.9mg,40％)。HPLC保留时间＝1.375柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝459[M+H]+.
实施例44
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代吡咯烷-1-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
上述标题化合物由4-溴丁酸根据制备9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代-1-哌啶基)-9H-咔唑-1-甲酰胺所述的条件制备。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：WatersXBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。将该物质进一步经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：WatersXBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：20-60％B，历时25分钟，然后15分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。
产物的收率为1.7mg，且其经LCMS分析评估的纯度为100％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：保留时间：1.456min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝445[M+H+].
注射2条件：保留时间：1.453min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES)m/z＝445[M+H+].
实施例45
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
上述标题化合物由氯甲酸2-氯乙酯根据制备9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(2-氧代-1-哌啶基)-9H-咔唑-1-甲酰胺所述的条件制备。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：WatersXBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。
预期产物的收率为7.6mg，且其经LCMS分析评估的纯度为99％。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.
注射2条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.
实施例46
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(羟基甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤46a:6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯
向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(2g,5.54mmol)在丙酮(20mL)中的溶液中加入K2CO3(1.531g,11.07mmol)、18C6(0.146g,0.554mmol)和(溴甲基)环丙烷(3.74g,27.7mmol)。将反应混合物加热至70℃过夜。将反应混合物经硅藻土填料滤过并用丙酮洗涤，然后将滤液浓缩。将固体用Et2O研磨得到6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(2g,4.82mmol,87％的收率)。HPLC保留时间＝1.01,柱：Waters AcquityUPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时2分钟，然后2分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ES):m/z＝417[M+H]+.
步骤46b:8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯
向6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(0.600g,1.445mmol)、3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑-(0.387g,1.734mmol)中加入THF(4.8ml)。将反应混合物用Teflon内衬盖密封，并脱气三次并用氮气回填。加入[1,1′-二(二-叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(0.047g,0.072mmol)和3.0M磷酸钾水溶液(1.445ml,4.33mmol)。将反应混合物脱气三次并在55℃加热30分钟。将反应混合物浓缩，用DCM(100ml)和水(50ml)稀释并加入至分液漏斗中。分离各层并收集有机层，经Na2SO4干燥，滤过并浓缩为约2.0ml体积。将其加入至24G ISCO柱并使用0-75％乙酸乙酯/庚烷作为洗脱剂纯化。浓缩后，收集得到8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(480mg,77％)，其为白色固体。HPLC保留时间＝0.97,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝432[M+H]+.
在0℃将氢化铝锂(1246mg,32.8mmol)加入至8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(624mg,10.95mmol)在THF(10mL)中的溶液中并在室温搅拌2小时。加入另外的氢化铝锂(1246mg,32.8mmol)并将反应混合物搅拌20分钟。将反应混合物小心地用MeOH(3ml)淬灭并将pH用1N HCl调节至pH＝2。将混合物经硅藻土填料滤过并用MeOH(20ml)洗涤。将滤液浓缩并将深色残留物在EtOAc(100ml)和饱和NaHCO3水溶液(50ml)之间分配。将有机相用盐水(10ml)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残留物经硅胶色谱法纯化(24G柱)(用0至10％MeOH/DCM洗脱)得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(羟基甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(520mg,82％)，其为棕色固体。将该物质进一步经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(羟基甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.353,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝390[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.365,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝390[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 8.10-8.05(m,2H),7.61(s,1H),7.57(s,1H),7.27(d,J＝7.9Hz,1H),4.84(s,2H),4.52(d,J＝6.4Hz,2H),4.33(s,1H),2.47(s,3H),2.32(s,3H),1.35-1.23(m,1H),0.50-0.35(m,4H).
实施例47
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-甲酰基-9H-咔唑-1-甲酰胺
将9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(羟基甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(450mg,1.155mmol)溶于二氯甲烷(3.0mL)和THF(3mL)。在室温将Dess-Martin高碘烷(6535mg,2.311mmol)加入至溶液中。在室温30分钟后，将混合物用乙酸乙酯(30mL)稀释，用1M亚硫酸钠溶液(2x15mL)、盐水(10mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩得到褐色固体。通过固体加载将粗物质经柱色谱法纯化(24G ISCO柱)。将化合物使用0-100％乙酸乙酯/庚烷作为梯度/洗脱剂纯化。浓缩后，收集得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-甲酰基-9H-咔唑-1-甲酰胺(320mg,70％)，其为灰白色固体。HPLC保留时间＝0.90,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝388[M+H]+.
实施例48
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-羟基-9H-咔唑-1-甲酰胺
在0℃将在冰浴中冷冻的30％过氧化氢水溶液(0.016mL,0.155mmol)和硫酸(8.25μl,0.155mmol)加入至9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-甲酰基-9H-咔唑-1-甲酰胺(12.00mg,0.031mmol)在甲醇(1.0mL)中的溶液中。1.5小时后，加入30％过氧化氢水溶液(0.100mL)和硫酸(0.050mL)的冷冻溶液。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后将混合物在室温搅拌6小时。加入1.0N NaOH溶液(2.0mL)。搅拌1小时后，将混合物用1.0N HCl酸化为pH＝4。加入DCM(3.0ml)并将混合物加入至分液漏斗中。分离各层并将水层用DCM(3.0ml)反萃取。收集有机层，经Na2SO4干燥，滤过并浓缩。将残留物用DMSO(1.0ml)稀释并经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到纯的9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-羟基-9H-咔唑-1-甲酰胺(5.1mg,44％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.279,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝376[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.280,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。(MS(ES):m/z＝376[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.93(d,J＝1.5Hz,1H),7.90(d,J＝8.4Hz,1H),7.60(s,1H),7.32(d,J＝1.5Hz,1H),6.93(d,J＝2.0Hz,1H),6.80(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.40(d,J＝6.4Hz,2H),4.31(s,1H),2.45(s,3H),2.31(s,3H),1.27(br.s.,1H),0.49-0.34(m,4H).
实施例49
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-甲氧基-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-羟基-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.025g,0.067mmol)、碳酸钾(0.037g,0.266mmol)、丙酮(1.0mL)、18C6(1.760mg,6.66μmol)和碘甲烷(0.095g,0.666mmol)。将反应混合物封盖并在75℃搅拌16小时。将反应混合物用MeOH(0.1ml)淬灭并浓缩。将残留物用DMSO(1.0ml)稀释并经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridgeC18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-甲氧基-9H-咔唑-1-甲酰胺(9.8mg,35％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.503,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝390[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.501,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝390[M+H]+.
实施例50
吗啉-4-羧酸8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-2-酯
在2打兰小瓶中加入9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-羟基-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.025g,0.067mmol)、DCM(1.0mL)、吡啶(0.263g,3.33mmol)和吡咯烷-1-碳酰氯(0.044g,0.333mmol)。将反应混合物在室温搅拌0.5小时，然后将反应混合物加热至80℃且保持30分钟。将反应混合物浓缩，用DMSO(1.5ml)稀释并经0.45um尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到吗啉-4-羧酸9-(环丙基甲基)-6-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-2-酯(8.8mg,25％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.386,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝489[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.384,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝489[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)d 8.10(d,J＝8.4Hz,1H),8.06(d,J＝2.0Hz,1H),7.44(d,J＝2.0Hz,1H),7.32(d,J＝2.0Hz,1H),7.04(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.48(d,J＝6.4Hz,2H),3.81(br.s.,6H),3.60(br.s.,2H),2.47(s,3H),2.32(s,3H),1.29(s,1H),0.50-0.35(m,4H).
实施例51
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在2打兰小瓶中加入9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-甲酰基-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.015g,0.039mmol)、DMF(1.0mL)、TEA(8.09μl,0.058mmol)和吗啉(3.37mg,0.039mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时并加入三乙酰氧基硼氢化钠(8.21mg,0.039mmol)和1滴乙酸。将反应混合物搅拌6小时，然后用MeOH(0.1ml)淬灭并浓缩。将残留物用DMSO/MeOH稀释并经硅藻土滤过并经制备性HPLC纯化，使用以下条件：Phenomenex Luna柱5u,100A°,21.2X 100mm,30-90％溶剂B,(溶剂A(90％水,10％甲醇,0.1％TFA),溶剂B(10％水,90％甲醇,0.1％TFA),10分钟梯度，运行15分钟，25mL/min)。在将溶剂经旋转蒸发浓缩后，收集得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺，其为褐色固体(1.1mg,4.7％)。最终纯度经三次LC/MS确定。注射条件：HPLC保留时间＝0.65,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝459[M+H]+。HPLC保留时间＝8.766,柱条件：Xbridge 4.6mm x 50mm,3.5μm粒度；流速1mL/min；梯度时间15min；100％溶剂A至100％溶剂B且保持100％溶剂B，3min；在254nm监测(溶剂A:10％MeOH,90％H2O,0.1％TFA；溶剂B:90％MeOH,10％H2O,0.1％TFA)。HPLC保留时间＝8.883,柱条件：Sunfire 4.6mm x 50mm,3.5μm粒度；流速1mL/min；梯度时间15min；100％溶剂A至100％溶剂B且保持100％溶剂B，3min；在220nm监测(溶剂A:10％MeOH,90％H2O,0.1％TFA；溶剂B:90％MeOH,10％H2O,0.1％TFA)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)d8.19-8.13(m,1H),8.11-8.07(m,1H),7.82(s,1H),7.79(s,1H),7.55(s,1H),7.51(d,J＝1.8Hz,2H),4.57-4.50(m,2H),4.44(s,2H),4.01(br.s.,4H),2.86(s,2H),2.68(s,2H),2.48(s,3H),2.36-2.32(m,3H),1.34-1.20(m,1H),0.54-0.38(m,4H).
实施例52
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1-甲基-1-(4-吗啉基)乙基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤52a:3-溴-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(10.5g,24.71mmol)在THF(1000mL)中的搅拌溶液中在室温逐滴加入甲基溴化镁(3.0M乙醚溶液)(124mL,371mmol)，将反应混合物搅拌1小时。将反应混合物在干冰/丙酮浴中冷却至-78℃并用丙酮(50mL,681mmol)处理。将混合物搅拌5分钟并温热至0℃，倒入含有乙酸乙酯和饱和NH4Cl水溶液的分液漏斗中。分离有机层并将水层用另外的乙酸乙酯萃取。合并有机萃取物并用水、饱和NaCl水溶液洗涤，并干燥(MgSO4)，滤过并真空浓缩得到粗产物，其为油状物。将粗物质使用300gBiotage柱在硅胶上纯化(用10％乙酸乙酯/DCM至70％乙酸乙酯/DCM洗脱)得到3-溴-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(3.7g,37％)。MS(ES)347/349(M+1).
步骤52b:3-溴-7-(2-吗啉代丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
将3-溴-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(195mg,0.533mmol)混悬于HCl(1.0M乙醚溶液)(2.0ml,2.00mmol)中并超声5分钟以助于溶解起始物质。将反应混合物在室温搅拌2小时。在剧烈搅拌下将吗啉(3.0ml,34.4mmol)加入至反应混合物中，并在室温继续搅拌30分钟。然后将混合物倒入分液漏斗中并用饱和NaHCO3水溶液和乙酸乙酯稀释。分离各层并将水层用乙酸乙酯反萃取。收集有机层，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，滤过并真空浓缩。将粗物质经ISCO(12G柱)纯化(使用)0-100％乙酸乙酯/庚烷作为梯度/洗脱剂。浓缩后，收集得到3-溴-7-(2-吗啉代丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(25mg,11％)，其为褐色/棕色油状物。HPLC保留时间＝0.68,柱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝416[M+H]+.
步骤52c:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(2-吗啉代丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向3-溴-7-(2-吗啉代丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.025g,0.060mmol)、(3,5-二甲基异噁唑-4-基)硼酸(10.16mg,0.072mmol)中加入THF(1.0mL)。将混合物脱气三次并用氮气回填。加入[1,1′-二(二-叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(1.957mg,3.00μmol)和3.0M磷酸钾水溶液(0.060mL,0.180mmol)。将反应混合物脱气另外的三次并在55℃加热30分钟。将反应混合物浓缩，用DCM(1.0ml)稀释并在4G ISCO柱上纯化(使用0-75％乙酸乙酯/庚烷作为梯度/洗脱剂)。浓缩后，收集得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(2-吗啉代丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺，其为白色固体。HPLC保留时间＝0.66,柱条件：Waters AcquityUPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝433[M+H]+.
在2打兰小瓶中,将3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(2-吗啉代丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(25mg,0.060mmol)用(溴甲基)环丙烷(8.11mg,0.060mmol)和碳酸钾(8.30mg,0.060mmol)在丙酮(1.0mL)中处理。将反应混合物加热至50℃过夜。将反应混合物经0.45u注射过滤器滤过，并浓缩。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：WatersXBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1-甲基-1-(4-吗啉基)乙基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(4.2mg,14％)。两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
注射1条件：HPLC保留时间＝1.808,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.。MS(ES):m/z＝487[M+H]+.
注射2条件：HPLC保留时间＝1.173,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ES):m/z＝487[M+H]+。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ8.07-8.04(m,1H),8.04(s,1H),7.74(s,2H),7.51-7.47(m,1H),7.42(d,J＝1.5Hz,2H),4.52(d,J＝6.4Hz,2H),3.75-3.70(m,4H),2.60-2.54(m,4H),2.46(s,3H),2.31(s,3H),1.50(s,6H),1.31-1.23(m,1H),0.49-0.36(m,4H).
实施例53
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1-羟基-1-甲基乙基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤53a:3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
将3-溴-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(150mg,0.432mmol)、环丙基甲基溴(71.8mL,0.741mmol)和K2CO3(299mg,2.160mmol)在丙酮(2.0mL)中的混合物在75℃加热20小时。将混合物滤过，用丙酮淋洗并真空浓缩。将粗产物溶于少量DCM中并加入至硅胶12gISCO柱，将其经10分钟梯度用0％-100％乙酸乙酯/庚烷洗脱得到3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(38)(100mg,58％)。MS(ES)401/403(M+H+).
向小瓶中加入3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(25mg,0.062mmol)、(3,5-二甲基异噁唑-4-基)硼酸(10.54mg,0.075mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(2.54mg,3.11μmol)。小瓶配备有Teflon内衬的血清帽，抽空并用氮气回填。加入THF(1.0mL)，随后加入3.0M磷酸三钾水溶液(0.062mL,0.187mmol)。将系统再次抽空并用氮气回填(按顺序重复两次)。将小瓶密封并在70℃加热16小时。将反应混合物在氮气流下浓缩并重新混悬于DMF(2.0mL)中，经硅藻土填料滤过并经制备性HPLC纯化，使用WatersXBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1-羟基-1-甲基乙基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(2mg,5％)。MS(ES)418(M+H+)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4/CDCl3)δ8.06(dd,J＝5.0,3.0Hz,2H),7.73(d,J＝1.0Hz,1H),7.42(d,J＝2.0Hz,1H),7.38(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),4.53(d,J＝6.4Hz,2H),2.47(s,3H),2.32(s,3H),1.67(s,6H),1.33-1.25(m,1H),0.48-0.38(m,4H).
实施例54
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1-羟基-1-甲基乙基)-9-(甲磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤54a:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在螺旋帽小瓶中向3-溴-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(300mg,0.864mmol)、3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑(212mg,0.950mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(35.3mg,0.043mmol)的混合物中加入THF(5mL)，随后加入磷酸三钾水溶液(0.530mL,1.591mmol)。小瓶配备有Teflon内衬的血清帽。将系统在真空下抽空(经来自氮气/真空歧管管线的针)并用氮气回填。该操作重复两次。移除氮气管线并将小瓶加热3小时。将反应混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，倒入分液漏斗中并用水(2X25mL)和饱和NaCl水溶液(25mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，滤过并真空浓缩得到粗产物。将粗产物溶于少量DCM中并加入至ISCO硅胶12g ISCO柱，将其经10分钟梯度用5％-100％二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(V)，其为浅黄色固体(270mg,86％)。MS(ES),364(M+H+).
在氮气气氛下向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(50mg,0.138mmol)在无水THF(2mL)中的溶液中加入叔丁醇钾(1摩尔THF溶液)(0.275mL,0.275mmol)。将反应混合物在室温搅拌10分钟，然后在冰浴中冷却并经注射器加入甲磺酰氯(0.013mL,0.165mmol)。将反应混合物搅拌另外的20分钟，并用～100μL 1N HCl水溶液淬灭。将反应混合物用乙酸乙酯(10mL)和水(10mL)稀释，倒入分液漏斗中，分配各层并分离EtOAc层。经水层用乙酸乙酯(2X 5mL)萃取。合并有机萃取物并用饱和NaHCO2水溶液(1X 5mL)、饱和NaCl水溶液(1X 5mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并滤过。将溶剂真空除去得到粗产物。将粗产物溶于少量DCM中并加入至ISCO硅胶4g ISCO柱中，将其经10分钟梯度用5％-100％DCM/EtOAc洗脱得到固体3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1-羟基-1-甲基乙基)-9-(甲磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(30mg,45％)。MS(ES),(442,M+H+)。HPLC保留时间1.34min。分析柱:Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.17(d,J＝1.1Hz,1H),7.96(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝1.8Hz,1H),7.57(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.50(d,J＝1.8Hz,1H),3.63(s,3H),2.46(s,3H),2.32(s,3H),1.72(s,6H).
实施例55
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1-羟基-1-甲基乙基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
化合物通过3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(2-羟基丙-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺与环丙烷磺酰氯的反应以与针对制备实施例54所述的相同方式制备，收率为34％。MS(ES),468(M+H+)。HPLC保留时间1.27min。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.28(d,J＝1.8Hz,1H),8.22-8.16(m,2H),8.01(s,1H),7.95(s,1H),7.57(s,1H),7.53(d,J＝7.9Hz,1H),7.48(d,J＝1.8Hz,1H),4.19(q,J＝4.9Hz,1H),3.17(d,J＝4.9Hz,2H),2.49(s,3H),2.31(s,3H),1.52(s,6H),1.36(d,J＝4.3Hz,1H),1.24-1.19(m,1H)
实施例56
9-(环丙基甲基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-3-(3-甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤56a:6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸
将6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(2g,4.82mmol)在THF(30mL)/MeOH(10mL)中的溶液用3M NaOH水溶液(3.21mL,9.63mmol)处理。将反应混合物在55℃加热2小时。将反应混合物真空浓缩为1/3体积。加入水(25mL)并用HCl水溶液酸化为pH 2。将所得的固体滤过，用水淋洗并干燥得到6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸(1.6g,86％)。粗产物如原样用于下一步反应。MS(ES),387(M+H+).
步骤56b:3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
将6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸(1.4g,3.62mmol)和TBTU(1.277g,3.98mmol)在DMF(15mL)中的溶液用TEA(0.756mL,5.42mmol)和顺-2,6-二甲基吗啉(0.625g,5.42mmol)处理。将混合物搅拌2小时，用乙酸乙酯(150mL)稀释，倒入分液漏斗中并用水(2X50mL)、1N HCl水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，滤过并真空浓缩得到固体。将粗产物溶于少量DCM/MeOH中并吸附于10g硅胶上，并在40g ISCO硅胶柱上纯化。将其经20分钟梯度由0％-5％MeOH/DCM洗脱得到3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(1.4g,80％)。MS(ES)485(M+H+).
步骤56c:9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在螺旋帽小瓶中向3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(100mg,0.206mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧硼杂环戊烷)(62.9mg,0.248mmol)、乙酸钾(40.5mg,0.413mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(8.43mg,10.32μmol)的混合物中加入二噁烷(2mL)。小瓶配备有Teflon内衬的血清帽，然后在真空下抽空(经来自氮气/真空歧管管线的针)并用氮气回填。该操作重复三次。移除针并将密封的小瓶在100℃加热2小时。将反应混合物用DCM稀释并经硅藻土填料滤过并真空浓缩。将粗产物溶于少量DCM中并加入至12g ISCO硅胶柱。将其经10分钟梯度用20％-100％DCM/EtOAc洗脱得到9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺,80mg,72％)。MS(ES)532(M+H+).
在螺旋帽小瓶中向9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(25mg,0.047mmol)、PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(1.921mg,2.352μmol)、4-溴-3-甲基异噁唑-(11.43mg,0.071mmol)的混合物中加入THF(0.5mL)，随后加入3M磷酸三钾水溶液(0.039mL,0.118mmol)。小瓶配备有Teflon内衬的血清帽。将系统在真空下抽空(经来自氮气/真空歧管管线的针)并用氮气回填。该操作重复两次。移除氮气管线并将小瓶在75℃加热4小时。将反应混合物在氮气流下浓缩，重新混悬于DMF(2mL)中，经0.45微米尼龙膜滤过并经制备性HPLC纯化，使用WatersXBridge C18,19x 150mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-100％B，历时15分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。得到9-(环丙基甲基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-3-(3-甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺,8.6mg(38％)。MS(ES)487(M+H+)。HPLC保留时间1.42min.
分析柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.
1H NMR(500MHz,甲醇-d4/CD3Cl)δ8.70(s,1H),8.27(d,J＝2.0Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.67(d,J＝1.5Hz,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,1H),4.54(d,J＝6.4Hz,2H),4.30(br.s.,1H),3.79-3.60(m,3H),2.97-2.86(m,1H),2.70-2.60(m,1H),2.51(s,3H),1.33-1.23(m,4H),1.08(br.s.,3H),0.45(d,J＝8.4Hz,2H),0.37(d,J＝4.0Hz,2H)
实施例57
9-(环丙基甲基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-3-(5-甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
化合物根据用于制备实施例56的方法来制备。使9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(25mg,0.047mmol)与4-碘-5-甲基异噁唑-(14.75mg,0.071mmol)反应得到9-(环丙基甲基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-3-(5-甲基-4-异噁唑基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(14mg,62％)。MS(ES)487(M+H+)。HPLC保留时间,1.44min。分析柱：Waters Acquity UPLCBEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min).
1H NMR(旋转异构体)(500MHz,甲醇-d4/CDCl3)δ8.58(s,1H),8.28(d,J＝1.5Hz,1H),8.23(d,J＝7.9Hz,1H),7.68(d,J＝2.0Hz,1H),7.31(dd,J＝7.9,1.0Hz,1H),4.60(d,J＝9.4Hz,1H),4.55(d,J＝6.9Hz,2H),4.30(br.s.,1H),3.67(br.s.,2H),2.98-2.90(m,1H),2.69(s,3H),2.66-2.61(m,1H),1.35-1.24(m,4H),1.10(br.s.,3H),0.46(d,J＝7.9Hz,2H),0.38(d,J＝4.0Hz,2H).
实施例58
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-腈
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(65mg,0.155mmol)中加入DCM(1.0mL)和Burgess试剂(130mg,0.544mmol)。将反应混合物在室温搅拌。1小时后，将反应混合物浓缩干燥，并将粗产物分为两等份。将一半粗产物经制备性LC/MS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：WatersXBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-腈的收率为14.3mg，且其经LCMS分析评估的纯度为99％。
HPLC:RT＝1.307min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝401[M+H+].
实施例59
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-腈
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-腈(30mg,0.075mmol)在丙酮(1mL)中的溶液中加入(溴甲基)环丙烷(101mg,0.749mmol)和碳酸钾(41.4mg,0.300mmol)。然后将反应混合物加热至80℃。4小时后，将反应混合物浓缩干燥，用DMF稀释并滤过。将粗物质经制备性LCMS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-55％B，历时25分钟，然后10分钟保持在55％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-腈的收率为7.7mg，且其经LCMS分析评估的纯度为99％。
HPLC:RT＝1.537min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝455[M+H+].
实施例60
9-乙酰基-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(32mg,0.072mmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中加入氢化钠(11.47mg,0.287mmol)。将反应混合物在室温搅拌15分钟，然后加入乙酰氯(19.69mg,0.251mmol)。然后将反应混合物在室温搅拌1/2小时。将反应混合物用水淬灭并用DMF稀释。将粗物质经制备性LCMS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-55％B，历时25分钟，然后10分钟保持在55％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-腈的收率为3.8mg，且其经LCMS分析评估的纯度为92％。
HPLC:RT＝1.352min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝489[M+H+].
实施例61
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-N9-乙基-9H-咔唑-1,9-二甲酰胺
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(39mg,0.087mmol)在DCM(1.0mL)中的溶液中加入DMAP(0.534mg,4.37μmol)、吡啶(0.071mL,0.873mmol)和异氰酰基乙烷(62.1mg,0.873mmol)。将反应混合物在室温搅拌6小时，然后加热至80℃过夜。加入另外的300ul异氰酸乙酯。24小时后，将反应混合物浓缩干燥，用DMF稀释并滤过。
将粗物质经制备性LC/MS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters Xbridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-55％B，历时25分钟，然后10分钟保持在55％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-N9-乙基-9H-咔唑-1,9-二甲酰胺的收率为2.8mg，且其经LCMS分析评估的纯度为98％。
HPLC:RT＝1.448min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝518[M+H+].
实施例62
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-1-(5-甲基-1,3-噁唑-2-基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(51mg,0.122mmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中加入碳酸铯(131mg,0.402mmol)和2,3-二溴丙-1-烯(0.018mL,0.183mmol)。然后将反应混合物在110℃加热2小时。将反应混合物滤过并将粗物质经制备性LCMS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-1-(5-甲基-1,3-噁唑-2-基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑的收率为1.9mg，且其经LCMS分析评估的纯度为100。
HPLC:RT＝1.753min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝457[M+H+].
实施例63
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基硫代羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(53mg,0.127mmol)在二乙二醇二甲醚(1.0mL)中的溶液中加入五硫化二磷(0.032mL,0.152mmol)和碳酸氢钠(74.5mg,0.887mmol)。然后将反应混合物加热至100℃。1/4小时后，将反应混合物用水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机萃取物干燥并浓缩。将一半粗物质经制备性LC/MS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：WatersXBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基硫代羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺的收率为3.0mg，且其经LCMS分析评估的纯度为98％。
HPLC:RT＝1.388min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝451[M+H+].
实施例64
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(45mg,0.108mmol)在二乙二醇二甲醚(1.0mL)中的溶液中加入五硫化二磷(6.86μl,0.032mmol)和碳酸氢钠(18.07mg,0.215mmol)。然后将反应混合物加热至50℃。1小时后，温度升至65℃。另外的一小时后，温度升至80℃。另外的一小时后，温度再次升至100℃。2小时后，加入另外的10mg五硫化二磷并继续加热。另外的一小时后，将反应混合物冷却至室温并浓缩。将一半粗物质经制备性LCMS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺的收率为0.8mg，且其经LCMS分析所评估的纯度为98％。
HPLC:RT＝1.44min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝435[M+H+].
实施例65
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-1-(4-甲基-1,3-噻唑-2-基)-7-(4-吗啉基硫代羰基)-9H-咔唑
和
实施例66
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-1-(4-甲基-1,3-噻唑-2-基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺和3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基硫代羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺(32mg,0.071mmol)在DMF(1ml)中的1:2混合物(在实施例63中制备)中加入1-氯丙-2-酮(3.41mg,0.037mmol)。然后将反应混合物加热至70℃。5小时后，加入另外的50μl氯丙酮，并将反应混合物加热另外的3小时。总计16小时后，将反应混合物浓缩。
将含有两种不同产物的粗物质经制备性LCMS纯化，使用以下条件：柱：WatersXBridge Shield RP18,19x 200mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：25-100％B over 20分钟,然后5分钟保持在100％B；流速：25mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-1-(4-甲基-1,3-噻唑-2-基)-7-(4-吗啉基硫代羰基)-9H-咔唑的收率为0.9mg，且其经LCMS分析所评估的纯度为92％。
HPLC:RT＝1.920min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝473[M+H+].
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-1-(4-甲基-1,3-噻唑-2-基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑的收率为1.4mg，且其经LCMS分析评估的纯度为98％。
HPLC:RT＝1.841min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝489[M+H+].
实施例67
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9-乙基-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺
步骤67a:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9-乙基-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(41mg,0.098mmol)在丙酮(1mL)中的溶液中加入碘乙烷(153mg,0.980mmol)和碳酸钾(54.2mg,0.392mmol)。将反应混合物加热至70℃且保持24小时，然后滤过并浓缩得到40mg(91％)粗产物，其无需进一步纯化即可使用。
HPLC RT:0.74min柱：Waters Acquity SDS BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时2.20分钟。流速：1.11mL/min。LCMS:(ES)m/z 447.08(M+H).
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9-乙基-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(20mg,0.045mmol)在二乙二醇二甲醚(1.0mL)中的溶液中加入五硫化二磷(0.011mL,0.054mmol)和碳酸氢钠(26.3mg,0.314mmol)。然后将反应混合物加热至100℃。7小时后，LCMS显示完全转化为产物。将混合物用DMF稀释并经制备性LCMS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：10-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-9-乙基-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺的收率为4.0mg，且其经LCMS分析评估的纯度为100％。
HPLC:RT＝1.841min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝489[M+H+].
实施例68
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺
向9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(50mg,0.106mmol)在二乙二醇二甲醚(1.0mL)中的溶液中加入五硫化二磷(6.75μl,0.032mmol)和碳酸氢钠(17.78mg,0.212mmol)。然后将反应混合物加热至65℃。2小时后，将混合物用DMF稀释，将粗物质经制备性LCMS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-硫代甲酰胺的收率为9.3mg，且其经LCMS分析评估的纯度为98％。
HPLC:RT＝1.382min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝489[M+H+].
实施例69
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-1-(1H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑
向3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(60mg,0.143mmol)中加入二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(1.0mL)。然后将反应混合物加热至110℃且保持1/2小时。接下来，将混合物浓缩干燥。然后将残留物溶于AcOH(0.5ml)中，然后加入肼水合物(7.73μl,0.158mmol)和更多的AcOH(0.5ml)。接下来，将反应混合物在90℃搅拌1小时。将反应混合物冷却至室温，浓缩，用DMF稀释并将粗物质经制备性LCMS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-40％B，历时25分钟，然后15分钟保持在40％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-1-(1H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑的收率为10.9mg，且其经LCMS分析评估的纯度为99％.
HPLC:RT＝1.200min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝443[M+H+].
实施例70
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-1-(1H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑
向9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(40mg,0.085mmol)中加入二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(1.0mL)。然后将反应混合物加热至110℃且保持1/2小时。接下来，将混合物浓缩干燥。然后将残留物溶于AcOH(0.5ml)并加入肼水合物(4.57μl,0.093mmol)在AcOH(0.5ml)中的溶液。接下来，将反应混合物在90℃搅拌1小时。将反应混合物冷却至室温，浓缩，用DMF稀释并进行纯化。
将粗物质经制备性LCMS纯化，使用以下条件：柱：Waters XBridge Shield RP18,19x 200mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-45％B，历时25分钟，然后5分钟保持在45％B；流速：25mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(4-吗啉基羰基)-1-(1H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑的收率为7.1mg，且其经LCMS分析评估的纯度为95％。
HPLC:RT＝1.236min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI)m/z＝497[M+H+].
实施例71
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1,1-二氧化-2-异噻唑烷基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤71a:7-(3-氯丙基磺酰氨基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向7-氨基-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(50mg,0.156mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入TEA(0.044mL,0.312mmol)，随后加入3-氯丙-1-磺酰氯(0.028mL,0.234mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，并真空浓缩得到粗的7-(3-氯丙基磺酰氨基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺,MS(ESI)485(M+H+).
步骤71b:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(1,1-二氧化异噻唑烷-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
将粗的7-(3-氯丙基磺酰氨基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺溶于DMF(0.5mL)中，并加入碳酸铯(102mg,0.312mmol)。将混合物在75℃加热2小时，冷却至室温，用乙酸乙酯(15mL)稀释并倒入分液漏斗中。将乙酸乙酯层用10％LiCl水溶液(2X5mL)、饱和NaCl水溶液(1X5mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，滤过并真空浓缩得到粗的3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(1,1-二氧化异噻唑烷-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(40mg,粗的)。MS(ESI)425(M+H+)。HPLC保留时间1.49min。柱:Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min.
向粗的3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(1,1-二氧化异噻唑烷-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(25mg,0.059mmol)在丙酮(1mL)中的溶液中加入K2CO3(40.7mg,0.294mmol)、18-冠-6(5mg)和(溴甲基)环丙烷(0.029mL,0.294mmol)。将小瓶密封并在75℃加热4小时。将丙酮在氮气流下蒸发。接下来，将残留物重新混悬于DMF(2mL)并经0.45微米尼龙膜注射过滤器滤过。将粗物质经制备性HPLC纯化，使用Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm粒度；柱；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(1,1-二氧化-2-异噻唑烷基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(5.6mg,0.012mmol,19.87％的收率)。MS(ESI)479(M+H+).
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.28-8.23(m,3H),7.82(s,1H),7.40(s,1H),7.36(d,J＝1.3Hz,1H),7.21(d,J＝8.8Hz,1H),4.47(d,J＝7.1Hz,2H),3.91(t,J＝6.4Hz,2H),3.58(t,J＝7.4Hz,2H),2.50-2.44(m,5H),2.32(s,3H),1.25(br.s.,1H),0.43-0.37(m,4H).
实施例72
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤72a:2-氨基-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)苯甲酸甲酯
在压力小瓶中将2-氨基-5-溴苯甲酸甲酯(1.065g,4.63mmol)溶于THF(23.15ml)中。加入(3,5-二甲基异噁唑-4-基)硼酸(0.718g,5.09mmol)和磷酸三钾(3M在H2O中)(4.63ml,13.89mmol)，然后将溶液用氮气鼓泡脱气。加入PdCl2(dppf)(0.169g,0.232mmol)，然后密封压力小瓶并加热至70℃。3小时后，将反应混合物冷却，用水稀释，并用EtOAc萃取两次。将有机层用硫酸钠干燥并浓缩。将残留物经ISCO纯化(40g柱；Hex/EtOAc；0至60％梯度)得到2-氨基-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)苯甲酸甲酯(0.742g,3.01mmol,65.1％的收率)。
HPLC RT＝0.84min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝247[M+H]+.
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.75(d,J＝2.2Hz,1H),7.16(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),6.74(d,J＝8.6Hz,1H),5.82(br.s.,2H),3.90(s,3H),2.38(s,3H),2.25(s,3H)
步骤72b:5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((4-甲氧基苯基)氨基)苯甲酸甲酯
将1-溴-4-甲氧基苯(1.812g,9.68mmol)、2-氨基-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)苯甲酸甲酯(1.704g,6.92mmol)和Cs2CO3(4.508g,13.84mmol)(将碳酸铯混悬)在甲苯(46mL)中的溶液用氮气鼓泡脱气。加入(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]二氯化钯(II)(0.136g,0.173mmol)，然后将反应混合物加热至100℃过夜。将反应混合物冷却至室温，然后用水和EtOAc稀释。将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并浓缩。将残留物经ISCO纯化(80g柱；Hex/EtOAc；0至60％梯度)。得到1.935g产物,79％.
HPLC RT＝1.10min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝353[M+H]+.
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.34(s,1H),7.84(d,J＝2.0Hz,1H),7.24-7.17(m,2H),7.14(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),7.03(d,J＝8.8Hz,1H),6.96-6.88(m,2H),3.93(s,3H),3.84(s,3H),2.39(s,3H),2.26(s,3H)
步骤72c:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9H-咔唑-1-羧酸甲酯
将5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((4-甲氧基苯基)氨基)苯甲酸甲酯(1.936g,5.50mmol)、乙酸钯(II)(0.124g,0.550mmol)和碳酸钾(0.076g,0.550mmol)溶于特戊酸(16mL)。将反应混合物在对空气敞开的小瓶中加热至110℃过夜。将反应混合物冷却并在搅拌的饱和NaHCO3水溶液中淬灭。将溶液用EtOAc萃取两次。将有机层用硫酸钠干燥并浓缩。将残留物经ISCO纯化(80g柱；Hex/EtOAc；0至60％梯度)。1.054g产物,55％.
HPLC RT＝1.02min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝351[M+H]+.
步骤72d:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9H-咔唑-1-羧酸
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9H-咔唑-1-羧酸甲酯(0.050g,0.143mmol)在THF(0.571ml)和水(0.143ml)中的溶液中加入氢氧化锂水合物(0.030g,0.714mmol)。1小时后，加入0.070mL H2O和0.280mL THF。将反应混合物在室温搅拌两天。将反应混合物用1M HCl淬灭并用EtOAc萃取两次。将有机层浓缩得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9H-咔唑-1-羧酸(0.051g,0.152mmol,106％的收率)，其无需进一步纯化即可使用。
HPLC RT＝0.89min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝337[M+H]+.
步骤72e:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9H-咔唑-1-甲酰胺
将3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9H-咔唑-1-羧酸(0.051g,0.152mmol)溶于THF(1.25mL)和DCM(0.250mL)中。加入EDC(0.058g,0.303mmol)、HOBt(0.046g,0.303mmol)和氢氧化铵(0.035mL,0.910mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩。将残留物用水超声。将固体滤出，用水洗涤，并干燥得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.040g,0.119mmol,79％的收率)。HPLC RT＝0.86min柱：WatersAcquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝336[M+H]+.
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.020g,0.060mmol)在THF(0.596ml)中的溶液中加入叔丁醇钾(1.0M在THF中)(0.078ml,0.078mmol)。5分钟后，加入甲磺酰氯(0.014ml,0.179mmol)。30分钟后，将反应混合物用MeOH淬灭并蒸发。
将物质经制备性HPLC纯化。(柱：YMC ODS C185u 30x100mm.溶剂A:10％MeOH,90％H2O,0.1％TFA.溶剂B:90％MeOH,10％H2O,0.1％TFA.梯度0至100％B，历时30分钟,7分钟保持时间)得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-9-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.011g,0.026mmol,43.0％的收率)。
HPLC RT＝0.81min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝414[M+H]+.
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.18(d,J＝2.0Hz,1H),7.90(d,J＝9.0Hz,1H),7.71(d,J＝2.6Hz,1H),7.56(d,J＝1.8Hz,1H),7.16(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),3.93(s,3H),3.41(s,3H),2.49(s,3H),2.33(s,3H)
实施例73
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-5-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-9-(甲基磺酰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤73a:(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)(顺-2,6-二甲基吗啉代)甲酮
在0℃向3-溴-5-(三氟甲基)苯甲酸(0.250g,0.929mmol)在DCM(4.7ml)中的溶液中加入草酰氯(0.102ml,1.162mmol)和1滴DMF。2小时后，加入顺-2,6-二甲基吗啉(0.268g,2.323mmol)在DCM(0.4mL)中的溶液。2.5小时后，将反应混合物温热至室温。2.5小时后，加入顺-2,6-二甲基吗啉(0.268g,2.323mmol)并将反应混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物用1M HCl洗涤两次并用水/盐水洗涤一次。将有机层用硫酸钠干燥并浓缩。将物质溶于DCM，用1M HCl洗涤两次，用硫酸钠干燥并浓缩得到(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)(顺-2,6-二甲基吗啉代)甲酮(0.265g,0.724mmol,78％的收率)。
HPLC RT＝0.99min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝366[M+H]+.
步骤73b:5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((3-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯
将(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)(顺-2,6-二甲基吗啉代)甲酮(0.265g,0.724mmol)、2-氨基-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)苯甲酸甲酯(0.137g,0.557mmol)和Cs2CO3(0.363g,1.113mmol)的溶液用氮气鼓泡脱气。加入氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)(0.022g,0.028mmol)，然后将反应混合物加热至100℃过夜。将反应混合物冷却，然后用水稀释并用EtOAc萃取两次。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发。将残留物经ISCO纯化(24g柱；Hex/EtOAc；0至75％梯度)得到5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((3-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯(0.280g,0.527mmol,95％的收率)。
HPLC RT＝1.09min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝532[M+H]+.
步骤73c:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯
将5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((3-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯(0.280g,0.527mmol)溶于特戊酸(1.756ml)。加入乙酸钯(II)(0.012g,0.053mmol)和碳酸钾(7.28mg,0.053mmol)，然后在部分对空气敞开的小瓶中将反应混合物加热至110℃过夜。将反应混合物冷却至室温，用MeOH稀释，并经膜过滤器滤过。将滤液浓缩。将残留物经ISCO纯化(40g柱；Hex/EtOAc；0至65％梯度)。收集混合的馏分。将残留物经ISCO纯化(40g柱；Hex/EtOAc；0至75％梯度)得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯(0.106g,0.200mmol,38.0％的收率)。
HPLC RT＝1.04min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝530[M+H]+.
步骤73d:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-羧酸
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯(0.096g,0.181mmol)在THF(1.450ml)和水(0.363ml)中的溶液中加入氢氧化锂水合物(0.061g,1.450mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物用1M HCl淬灭并用EtOAc萃取两次。将有机层浓缩得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-羧酸(0.058g,0.113mmol,62.1％的收率)，其无需进一步纯化即可继续使用。
HPLC RT＝0.94min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝516[M+H]+.
步骤73e:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-羧酸(0.058g,0.113mmol)在THF(0.938ml)和DCM(0.188ml)中的溶液中加入EDC(0.043g,0.225mmol)、HOBt(0.034g,0.225mmol)和氢氧化铵(0.026ml,0.675mmol)。
4.5小时后，加入EDC(0.043g,0.225mmol)和HOBt(0.034g,0.225mmol)。1.5小时后，将反应混合物浓缩，然后加入水并将淤浆超声得到产物(80mg,138％),其无需进一步纯化即可继续使用。
HPLC RT＝0.92min柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝515[M+H]+.
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(0.040g,0.078mmol)在THF(0.777ml)中的溶液中加入叔丁醇钾(1.0M在THF中)(0.117ml,0.117mmol)。5分钟后，加入甲磺酰氯(0.015ml,0.194mmol)。40分钟后，将反应混合物用MeOH淬灭并浓缩。将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。产物的收率为10.8mg，且其经LCMS分析评估的纯度为100％。
HPLC RT＝1.73min；柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝593[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.39(s,1H),8.33(br.s.,1H),7.95(d,J＝7.7Hz,1H),7.79(d,J＝14.5Hz,1H),7.74-7.64(m,2H),4.61-4.55(m,1H),4.10(s,3H),2.89(s,3H),2.73(s,3H),2.69-2.57(m,1H),2.48(s,2H),2.29(d,J＝5.7Hz,2H),1.19(t,J＝6.9Hz,3H),0.88(d,J＝5.7Hz,3H)
实施例74
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-5-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-7-(三氟甲基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
实施例74由化合物73e和环丙烷磺酰氯使用如实施例73给出的相同操作合成。
HPLC RT＝1.82min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝619[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.33(br.s.,1H),8.09(br.s.,1H),7.96(d,J＝15.8Hz,1H),7.83(d,J＝15.1Hz,1H),7.74(d,J＝4.7Hz,1H),7.68(br.s.,1H),4.63-4.52(m,1H),4.09(br.s.,1H),2.89(s,1H),2.73(s,3H),2.69-2.56(m,3H),2.48(br.s.,2H),2.29(d,J＝6.1Hz,2H),1.43(br.s.,2H),1.33(d,J＝7.4Hz,2H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(d,J＝6.1Hz,3H)
实施例75
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-5-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-7-(三氟甲氧基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤75a:(3-溴-5-(三氟甲氧基)苯基)(顺-2,6-二甲基吗啉代)甲酮
上述化合物由3-溴-5-(三氟甲氧基)苯甲酸使用如化合物73a所述的相同操作合成。
HPLC RT＝1.02min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝382[M+H]+.
步骤75b:5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((3-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-5-(三氟甲氧基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯
5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((3-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-5-(三氟甲氧基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯由化合物72a和化合物75a使用如化合物73b所述的相同操作合成。
HPLC RT＝1.11min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝548[M+H]+.
步骤75c:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲氧基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲氧基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯由化合物75b使用如化合物73c所述的相同操作合成。
HPLC RT＝1.06min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝546[M+H]+.
步骤75d:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲氧基)-9H-咔唑-1-羧酸
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲氧基)-9H-咔唑-1-羧酸由化合物75c使用如化合物73d所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.95min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝532[M+H]+.
步骤75e:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲氧基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-7-(三氟甲氧基)-9H-咔唑-1-甲酰胺由化合物75d使用如化合物73e所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.94min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝531[M+H]+.
化合物75由化合物75e和环丙烷磺酰氯使用如化合物73所述的相同操作合成。
HPLC RT＝1.87min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝635[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.31(s,1H),7.93(d,J＝15.5Hz,1H),7.81(br.s.,1H),7.70(s,1H),7.62(br.s.,1H),7.56-7.48(m,1H),4.57(dd,J＝19.5,13.1Hz,1H),4.05(d,J＝7.7Hz,1H),3.77-3.63(m,1H),2.88(s,3H),2.72(s,3H),2.47(s,2H),2.29(d,J＝6.7Hz,2H),1.45(br.s.,2H),1.30(d,J＝8.1Hz,2H),1.19(t,J＝7.1Hz,3H),0.89(d,J＝6.1Hz,3H).
实施例76
3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-5-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-9-(甲基磺酰基)-7-(三氟甲氧基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
实施例76由化合物75e使用如实施例73所述的相同操作合成。
HPLC RT＝1.78min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝609[M+H]+.
实施例77
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-6-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤77a:5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((4-(甲基磺酰基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯
5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((4-(甲基磺酰基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯由化合物72a和1-溴-4-(甲基磺酰基)苯使用如化合物72b所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.92min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝401[M+H]+.
步骤77b:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯由化合物77a使用如化合物72c所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.88min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝399[M+H]+.
步骤77c:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸由化合物77b使用如化合物72d所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.76min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝385[M+H]+.
步骤77d:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺由化合物77c使用如化合物72e所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.73min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝384[M+H]+.
最终产物由化合物77d和环丙烷磺酰氯使用如实施例72所述的相同操作合成。
HPLC RT＝1.15min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝488[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.63(d,J＝8.4Hz,1H),8.51(s,1H),8.32-8.24(m,2H),8.05(d,J＝7.1Hz,1H),7.71(s,1H),7.64(s,1H),4.03(br.s.,1H),3.35(s,3H),2.50(br.s.,3H),2.33(s,3H),1.40(br.s.,2H),1.30(d,J＝5.7Hz,2H)
实施例78
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-6-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向化合物77d(0.011g,0.029mmol)在丙酮(0.287ml)中的溶液中加入18C6(0.758mg,2.87μmol)、碳酸钾(0.016g,0.115mmol)和(溴甲基)环丙烷(0.056ml,0.574mmol)。将溶液加热至65℃过夜。将反应混合物冷却，然后弃去溶剂并将固体用丙酮洗涤。将溶剂浓缩并将所得的固体经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridgeC18,19x 250mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：15-100％B over 20分钟,然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。产物的收率为6.1mg。
HPLC RT＝1.24min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝438[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.95(s,1H),8.52(s,1H),8.34(s,1H),8.00(d,J＝1.2Hz,1H),7.97-7.93(m,1H),7.91(s,1H),7.50(d,J＝1.8Hz,1H),4.58(d,J＝6.7Hz,2H),3.27(s,3H),2.50-2.49(s,3H),2.33(s,3H),1.31-1.20(m,1H),0.43-0.34(m,4H)
实施例79
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤79a:5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((3-(甲基磺酰基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯
5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-((3-(甲基磺酰基)苯基)氨基)苯甲酸甲酯由化合物72a和1-溴-3-(甲基磺酰基)苯使用如化合物72b所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.94min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝401[M+H]+.
步骤79b:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯
和
步骤79c:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸甲酯
化合物79b和79c由化合物79a使用如化合物72c所述的相同操作合成。
化合物79b:1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ10.34(s,1H),8.28(d,J＝8.1Hz,1H),8.22(dd,J＝9.1,1.2Hz,2H),8.08(d,J＝1.5Hz,1H),7.87(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),4.09(s,3H),3.17(s,3H),2.46(s,3H),2.32(s,3H)
化合物79c:1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ10.55(br.s.,1H),9.03(d,J＝1.3Hz,1H),8.11(d,J＝1.5Hz,1H),8.04(dd,J＝7.7,0.9Hz,1H),7.89(dd,J＝8.1,0.9Hz,1H),7.75-7.61(m,1H),4.08(s,3H),3.24(s,3H),2.52(s,3H),2.39(s,3H)
化合物79d:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸由化合物79b使用如化合物72d所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.79min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝385[M+H]+.
步骤79e:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺由化合物79d使用如化合物72e所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.75min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝384[M+H]+.
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺由化合物79e使用如实施例72所述的相同操作合成。
HPLC RT＝1.31min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝488[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.63(d,J＝7.9Hz,1H),8.51(d,J＝1.8Hz,1H),8.33-8.25(m,2H),8.05(d,J＝7.9Hz,1H),7.71(s,1H),7.64(d,J＝1.8Hz,1H),4.03(br.s.,1H),3.34(br.s.,3H),2.49-2.49(m,3H),2.33(s,3H),1.40(d,J＝4.9Hz,2H),1.33-1.24(m,2H).
实施例80
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺由化合物79e使用如实施例78所述的相同操作合成。
HPLC RT＝1.29min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝438[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.33(d,J＝8.1Hz,1H),8.24(d,J＝1.3Hz,1H),8.11(s,1H),8.05(s,1H),7.75-7.64(m,1H),7.56(d,J＝8.1Hz,1H),7.31(d,J＝1.3Hz,1H),4.39(d,J＝7.1Hz,2H),2.66(s,3H),2.27(s,3H),2.10(s,3H),1.10-0.94(m,1H),0.22-0.10(m,4H).
实施例81
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-5-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
和
实施例82
N,9-二(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-5-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤81a:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-羧酸由化合物79c使用如化合物72d所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.79min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝385[M+H]+.
步骤81b:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-(甲基磺酰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺由化合物81a使用如化合物72e所述的相同操作合成。
HPLC RT＝0.76min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：2-98％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在98％B；流速：0.8mL/min。MS(ESI):m/z＝384[M+H]+.
化合物81和82由化合物81b按照如化合物78所述的相同操作制备。
化合物81
HPLC RT＝1.32min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝438[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.82(s,1H),8.36(s,1H),8.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.95(s,1H),7.89(d,J＝7.4Hz,1H),7.76(t,J＝7.9Hz,1H),7.57(s,1H),4.64(d,J＝7.1Hz,2H),2.51(d,J＝11.1Hz,6H),2.34(s,3H),1.27(d,J＝5.7Hz,1H),0.39(t,J＝8.1Hz,4H)
化合物82
HPLC RT＝1.72min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。MS(ESI):m/z＝492[M+H]+.
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.05(t,J＝5.6Hz,1H),8.82(s,1H),8.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.89(d,J＝7.4Hz,1H),7.76(t,J＝8.1Hz,1H),7.51(s,1H),4.60(d,J＝6.7Hz,2H),3.43-3.12(m,2H),2.54-2.48(m,6H),2.34(s,3H),1.31-1.18(m,1H),1.11(br.s.,1H),0.54-0.46(m,2H),0.42-0.25(m,6H)
实施例83
9-(环丙基甲基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤83a:6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯
在室温向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(1g,2.77mmol)在丙酮(10mL)中的溶液中加入K2CO3(0.765g,5.54mmol)和18-冠-6(0.073g,0.277mmol)，随后加入(溴甲基)环丙烷(1.869g,13.84mmol)。在70℃搅拌36小时后，加入另外的380mg(溴甲基)环丙烷并在相同温度继续搅拌另外的5小时。反应完成经TLC和LC-MS证实。将反应混合物经硅藻土滤过并蒸发溶剂得到粗产物(2g)。将其与另外相同批次的粗产物混合，并将总计4g粗物质进一步用乙醚研磨得到6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(2g,86％)，其为淡黄色固体。
LCMS:HPLC:RT＝0.99min(含有TFA的ACN/H2O,Acquity BEH C181.7μm(50x 2.1)mm,梯度＝3min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝417[M+H]+.
1H NMR:400MHz(DMSO-d6):δ8.65(d,J＝2.00Hz,1H),8.37-8.41(m,2H),8.28(s,1H),7.86-7.92(m,2H),7.66(d,J＝2.00Hz,1H),4.56(d,J＝7.20Hz,2H),4.38-4.43(m,2H),1.37-1.41(m,3H),1.17-1.20(m,1H),0.35-0.39(m,4H).
步骤83b:6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸
向6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(800mg,1.926mmol)在MeOH(8mL)和水(4mL)中的混合物中加入NaOH(539mg,13.48mmol)并在室温搅拌24小时。经TLC和LC-MS监测反应并证实反应完成。减压除去甲醇，将残留物使用1.5N HCl水溶液酸化。将析出的固体滤过并用水洗涤，真空干燥得到6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸(400mg,53.6％)，其为淡棕色固体。
LCMS:HPLC:RT＝0.84min(含有TFA的ACN/H2O,Acquity BEH C181.7μm(50x 2.1)mm,梯度＝3min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝387[M+H]+.
1H NMR:400MHz(DMSO-d6):δ13.0(s,1H)8.63(d,J＝2.00Hz,1H),8.35-8.37(m,2H),8.26(s,1H),7.83-7.91(m,2H),7.64-7.65(m,1H),4.54(d,J＝6.80Hz,2H),1.18-1.23(m,1H),0.33-0.37(m,4H).
步骤83c:3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
在0℃向6-溴-8-氨基甲酰基-9-(环丙基甲基)-9H-咔唑-2-羧酸(450mg,1.162mmol)和顺-2,6-二甲基吗啉(201mg,1.743mmol)在DMF(4.5mL)中的溶液中加入2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷-2,4,6-三氧化物(50％在EtOAc中)(1.48g,2.324mmol)和三乙胺(0.486mL,3.49mmol)，并在室温搅拌10小时。加入另外的1.48g 2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷-2,4,6-三氧化物(50％在EtOAc中)并继续搅拌另外的3小时。经TLC和LC-MS监测反应并证实反应完成。将反应混合物用水(5mL)淬灭并用EtOAc(3x10mL)萃取，将有机层用盐水(2x10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩得到500mg粗产物。将该粗物质与其他批次的800mg粗产物混合，并一起经Teledyne ISCO纯化(24gRedisep硅胶柱)(使用乙酸乙酯作为洗脱剂)。将含有产物的馏分浓缩得到550mg(40％)3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺，其为淡黄色固体。
LCMS:HPLC:RT＝0.92min(含有TFA的ACN/H2O,Acquity BEH C181.7μm(50x 2.1)mm,梯度＝3min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝484.1[M+H]+.
1H NMR:400MHz(DMSO-d6):δ8.60(d,J＝2.00Hz,1H),8.32-8.34(m,2H),7.89(s,1H),7.76(s,1H),7.61(d,J＝2.00Hz,1H),7.27(dd,J＝1.20,7.80Hz,1H),4.51(d,J＝7.20Hz,2H),3.62(s,2H),1.09-1.19(m,9H),0.34-0.36(m,4H).
向K2CO3(28.5mg,0.206mmol)在水(1.5mL)中的搅拌混合物中加入3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(20mg,0.041mmol)在二噁烷(2mL)中的溶液，随后加入3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-1H-吡唑(11.00mg,0.050mmol)。将混合物用氮气脱气并加入PdCl2(dppf).CH2Cl2(3.37mg,4.13μmol)，然后在95℃加热1小时。反应完成经TLC和LC-MS证实。将反应混合物用5ml水稀释并用EtOAc(3x20mL)萃取。将乙酸乙酯层经无水Na2SO4干燥并减压蒸发溶剂得到60mg粗产物。将粗产物经制备性HPLC纯化得到9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(7mg,32.9％的收率)，其为无色固体。
制备性HPLC条件：柱：Xselect C-18(150mm x 19mm ID,5微米),流动相A＝含有乙酸的缓冲剂:10m M NH4OAC在水中的溶液，pH 4.5，流动相B＝乙腈,流速：16ml/min,梯度-10-50％流动相-B/流动相-A，10分钟。
LCMS:HPLC:RT＝2.17min(含有HCOONH4的ACN/H2O,Ascentis Express C82.7μm(5x2.1)mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝500[M+H]+.
HPLC RT＝6.0min SUNFIRE C18(4.6X150)mm,3.5微米,流动相A:0.05％TFA/水:乙腈(95:5),流动相B:乙腈:0.05％TFA/水(95:5).流速：1ml\min,波长＝220nm&254nm)；HPLC RT＝6.0min Sunfire C18(4.6X150)mm,3.5微米,流动相A:0.05％TFA/水:乙腈(95:5),流动相B:乙腈:0.05％TFA/水(95:5).流速：1ml\min,波长＝220nm&254nm).
1H NMR:400MHz(CD3OD):δ8.25(d,J＝8.00Hz,1H),8.21(d,J＝4.00Hz,1H),7.69(s,1H),7.52(d,J＝1.60Hz,1H),7.30(s,1H),7.28(d,J＝4.00Hz,1H),4.54(d,J＝28.00Hz,3H),3.67-3.68(m,3H),2.10-0.00(m,1H),2.60-0.00(m,1H),2.36(s,6H),1.10-1.40(m,7H),0.42-0.44(m,4H)。NH2质子与CD3OD中的氘交换。
实施例84
9-(环丙基甲基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-3-(1,4-二甲基-1H-1,2,3-三唑-5-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤84a:9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺.
向3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(150mg,0.310mmol)、二(频哪醇合)二硼(141mg,0.557mmol)在DMSO(2mL)中的溶液中加入乙酸钾(137mg,1.394mmol)。将混合物用氩气脱气5分钟并加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2(10.20mg,0.014mmol)。将混合物在80℃搅拌4h。反应完成经TLC和LC-MS证实。使反应混合物达到室温，用水(5mL)处理并用乙酸乙酯(2x5mL)萃取。将乙酸乙酯层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩得到粗产物。将粗产物经Teledyne ISCO纯化(12g Redisep硅胶柱)(使用60％-80％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂)。将含有产物的馏分浓缩得到9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(70mg,42.5％的收率)，其为淡黄色固体。
LCMS:HPLC:RT＝1.879min(含有HCOONH4的ACN/H2O,Ascentis Express C18(50x2.1mm；2.7u),梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝532.2[M+H]+.
1H NMR:400MHz(CDCl3):δ8.71(d,J＝1.60Hz,1H),8.18(d,J＝10.40Hz,1H),8.09(d,J＝1.60Hz,1H),7.56(s,1H),7.30-7.33(m,1H),6.20(s,1H),5.85(s,1H),4.55(d,J＝8.80Hz,2H),3.66(br m,4H),1.50(s,12H),1.10-1.18(m,9H),0.33-0.45(m,4H).
步骤84b:1,4-二甲基-1H-1,2,3-三唑
1,4-二甲基-1H-1,2,3-三唑按照在专利WO2008/98104A1中所述的操作合成。在-78℃向1,4-二甲基-1H-1,2,3-三唑(50mg,0.515mmol)在THF(1mL)中的搅拌溶液中加入nBuLi(0.386mL,0.618mmol)并在-78℃搅拌1小时。加入碘(144mg,0.566mmol)在0.2ml THF中的溶液并在-78℃搅拌1小时。历时3小时将反应混合物缓慢温热至RT。将其用5ml饱和NH4Cl水溶液淬灭并用乙醚(2x10mL)萃取，经无水Na2SO4干燥。蒸发乙醚得到5-碘-1,4-二甲基-1H-1,2,3-三唑(75mg,65％)，其为黄色固体。
1H NMR:400MHz,CDCl3:δ4.00(s,3H),2.32(s,3H).
将9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(20mg,0.038mmol)、5-碘-1,4-二甲基-1H-1,2,3-三唑(12.59mg,0.056mmol)和K2CO3(15.60mg,0.113mmol)在二噁烷(1mL)和水(0.3mL)中的混合物用氩气脱气5分钟并加入PdCl2(dppf),CH2Cl2(2.75mg,3.76μmol)。将混合物加热至95℃且保持4小时。反应完成经TLC和LC-MS证实。将反应混合物温热至RT并用乙酸乙酯(5mL)稀释，用盐水(2x 5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩得到粗产物。
将粗产物经制备性HPLC纯化并冻干得到9-(环丙基甲基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-3-(1,4-二甲基-1H-1,2,3-三唑-5-基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(2.15mg,11％)，其为无色固体。
制备性HPLC条件：柱：Symmetry C18(19x 250)mm x 5μ；溶剂A:10mM NH4OAc,pH4.5；溶剂B:ACN；流速：15.0mL/min；梯度：时间(min)％B–0/10,10/50,15/100
LCMS:RT＝2.088min(含有10mM碳酸氢铵的ACN/H2O,X-bridge BEH C18 2.5mm(2.1x50)mm,梯度＝3min,波长＝254nm)；MS(ES):m/z＝501.5[M+H+].
HPLC:95/5至5/95H2O/CH3CN/0.05％TFA,流速＝1mL/min,梯度＝15min,SunfireC183.5um,4.6x150mm:RT＝7.483min.Xbridge Phenyl 3.5um,4.6x150mm:RT＝6.669min.
1H NMR:400MHz(CD3OD):δ8.38(d,J＝2.00Hz,1H),8.32(d,J＝8.00Hz,1H),7.75(s,1H),7.61(d,J＝2.00Hz,1H),7.33(dd,J＝1.20,8.00Hz,1H),4.60(d,J＝6.80Hz,2H),4.04(s,3H),3.64(s,3H),2.94(s,1H),2.66(s,1H),2.35(s,3H),1.05-1.34(m,8H),0.41-0.47(m,4H).
实施例85
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-1-(1H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑
步骤85a:(6-溴-9-(环丙基甲基)-8-(4H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑-2-基)(顺-2,6-二甲基吗啉代)甲酮
将3-溴-9-(环丙基甲基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(50mg,0.103mmol)和1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺(2.2mL,0.103mmol)混合并在80℃搅拌3h。蒸发溶剂并加入乙酸(1ml,17.47mmol)、肼(HCl盐)(3.24μl,0.103mmol)并在90℃搅拌2h。减压蒸发溶剂并将粗物质经ISCO纯化(24g硅胶,50-70％乙酸乙酯:己烷)得到(6-溴-9-(环丙基甲基)-8-(4H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑-2-基)(顺-2,6-二甲基吗啉代)甲酮(50mg).
LCMS:HPLC:RT＝0.94min(含有NH4OAc的ACN/H2O,Acquity BEH C18 1.7μm(50x2.1)mm,梯度＝3min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝508.0[M+H]+.
1H NMR:400MHz(DMSO-d6):δ8.64-8.65(m,2H),8.36(d,J＝8.00Hz,1H),7.74(s,1H),7.68-7684.00(m,1H),7.27-7.29(m,1H),4.37(d,J＝6.80Hz,3H),3.61(s,4H),2.85(s,1H),0.97-1.24(m,6H),0.61-0.65(m,1H),0.14(d,J＝1.20Hz,2H),0.12(d,J＝1.60Hz,2H).
将(6-溴-9-(环丙基甲基)-8-(4H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑-2-基)(顺-2,6-二甲基吗啉代)甲酮(15mg,0.030mmol)、3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑-(7.24mg,0.032mmol)和K2CO3(12.23mg,0.089mmol)吸收于二噁烷(1mL)和水(0.2mL)中。将混合物用氩气脱气10分钟，然后加入PdCl2(dppf).CH2Cl2(2.159mg,2.95μmol)。将混合物在90℃加热1小时。反应完成经TLC和LC-MS证实。将反应混合物冷却至室温并用水(5mL)处理，用乙酸乙酯(3x5mL)萃取，用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压蒸发得到粗产物。
将粗产物经Teledyne ISCO纯化(12g硅胶柱,50-90％乙酸乙酯/己烷)得到7mg 9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-1-(1H-1,2,4-三唑-3-基)-9H-咔唑，其为无色固体。
LCMS:HPLC:RT＝1.996min(含有HCOONH4的ACN/H2O,Ascentis Express C18(50X2.1mm-2.7μm,梯度＝4min,波长＝254nm)；MS(ES):m/z＝525.0[M+H]+.
HPLC RT＝8.460min XBridge Phenyl(4.6X150)mm,3.5微米,流动相A:0.05％TFA/水:乙腈(95:5),流动相B:乙腈:0.05％TFA/水(95:5),FLOW:1ml\min,波长＝220nm&254nm)；
HPLC RT＝9.096min SUNFIRE C18(4.6x150)mm,3.5微米,流动相A:0.05％TFA/水:乙腈(95:5),流动相B:乙腈:0.05％TFA/水(95:5)流速：1ml\min,波长＝220nm&254nm).
1H NMR:400MHz(CD3OD):δ8.77(s,1H),8.31-8.35(m,3H),7.68(s,1H),7.54(s,1H),7.33-7.35(m,1H),4.59(s,1H),4.31-4.32(m,2H),3.65-3.69(m,3H),2.94-0.00(m,1H),2.65-2.66(m,1H),2.50(s,3H),2.35(s,3H),1.36-0.00(m,1H),1.22-1.31(m,3H),1.07-1.19(m,3H),0.93-0.94(m,2H),0.91-0.92(m,2H).
实施例86
9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-3-异噁唑基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-4-氟-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤86a:5-溴-4-氟-2-肼基苯甲酸二盐酸盐
以使得温度不超过0℃的速率将亚硝酸钠(1.548g,22.43mmol)在H2O(8mL)中的溶液逐滴加入至2-氨基-5-溴-4-氟苯甲酸(5g,21.37mmol)在浓HCl(28mL)中的冷却的(-14℃,冰盐浴)、乳白色混悬液中(历时12分钟)。将浅棕色溶液在0℃搅拌6分钟，然后以使得温度保持在-20℃和-5℃之间的速率分批加入至氯化锡(II)(12.15g,64.1mmol)在浓HCl(8mL)中的冷却的(-20℃,异丙醇/干冰)和快速搅拌的溶液中(历时30分钟)。在加入之间，将含有重氮中间体的烧瓶保持在冰/盐浴中。加入完成后，将反应混合物在-10℃搅拌45分钟。将所得的乳白色混悬液温热至室温并在室温搅拌1小时。将固体经滤过收集，用水和乙醚洗涤并干燥得到浅棕色固体5-溴-4-氟-2-肼基苯甲酸二盐酸盐(3.2g,9.94mmol,46.5％的收率)。
HPLC:RT＝1.69min(含有TFA的H2O/MeOH,Sunfire C183.5mm,2.1x30mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝249.06[M+1]+.
步骤86b:6-溴-2-(乙氧基羰基)-5-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-8-羧酸
向5-溴-4-氟-2-肼基苯甲酸二盐酸盐(2g,6.21mmol)在AcOH(12mL)中的溶液中加入3-氧代环己烷羧酸乙酯(1.216g,7.14mmol)。将反应溶液回流加热3小时。将反应溶液冷却至室温并浓缩干燥。将溶液溶于乙酸乙酯，并将所得的析出物滤过得到6-溴-2-(乙氧基羰基)-5-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-8-羧酸(1.15g,2.98mmol,47.9％的收率)。
HPLC:RT＝3.938min(含有TFA的H2O/MeOH,Sunfire C183.5mm,2.1x 30mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝386.06[M+1]+.
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.86(d,J＝6.6Hz,1H),4.85(m,2H),4.21(dd,J＝7.0,1.3Hz,2H),3.13-2.78(m,5H),2.38-2.14(m,1H),2.10-1.83(m,1H),1.30(t,J＝7.0Hz,3H)
步骤86c:6-溴-8-氨基甲酰基-5-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-2-羧酸乙酯
向6-溴-2-(乙氧基羰基)-5-氟-2,3,4,4a,9,9a-六氢-1H-咔唑-8-羧酸(1.1g,2.85mmol)在THF(100mL)和DCM(20.00mL)中的溶液中加入EDC(2.184g,11.39mmol)和HOBt(1.745g,11.39mmol)。将反应溶液在25℃搅拌15分钟，然后加入氢氧化铵(0.665mL,17.09mmol)。混合物变为粘稠的黄色混悬液。将溶液保持在25℃搅拌。2小时后，将反应混合物浓缩至最小体积。向其中加入水和乙酸乙酯。分离有机层并将水层用乙酸乙酯萃取2x。将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，滤过并浓缩。将黄色残留物在乙醚中研磨并将白色固体滤出，并与最初滤过的固体合并(将全部批次用乙醚淋洗)得到总产物6-溴-8-氨基甲酰基-5-氟-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-2-羧酸乙酯(1g,2.60mmol,91％的收率)。
HPLC:RT＝3.56min(含有TFA的H2O/MeOH,Sunfire C183.5mm,2.1x30mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝385[M+1]+；
步骤86d:6-溴-8-氨基甲酰基-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸乙酯
在40ml反应小瓶中加入THF(100ml)、DDQ(1.503g,6.49mmol)和6-溴-8-氨基甲酰基-5-氟-2,3,4,4a,9,9a-六氢-1H-咔唑-2-羧酸乙酯(1g,2.60mmol)。将反应混合物回流90分钟。将反应混合物浓缩干燥，然后用饱和稀碳酸氢钠溶液稀释。在搅拌时白色固体开始沉淀。将固体滤出，用水洗涤，然后用乙醚洗涤。将粗产物混合物经ISCO纯化(0％-100％的EtOAC/DCM，15分钟,40g柱)得到产物6-溴-8-氨基甲酰基-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(.60g,1.582mmol,61.0％的收率)。
HPLC:RT＝3.76min(含有TFA的H2O/MeOH,Sunfire C183.5mm,2.1x30mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝381.03[M+1]+
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.45-8.34(m,1H),8.27-8.13(m,2H),8.07-7.89(m,1H),7.85-7.53(m,1H),4.51-4.38(m,2H),1.59-1.42(m,4H),1.09-0.86(m,3H).
步骤86e:8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸乙酯
在100mL RBF中加入6-溴-8-氨基甲酰基-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(0.45g,1.187mmol)、3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑-(0.397g,1.780mmol)和THF(10ml)。将反应混合物脱气(用氮气和真空净化)，然后加入[1,1'-二(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(0.043g,0.059mmol)和磷酸三钾水溶液(1.187ml,3.56mmol)。将反应混合物脱气并在80℃加热。16小时后，将反应混合物冷却，加入10％LiCl在水中的溶液并收集所得的析出物。将粗产物混合物经ISCO纯化(0％-100％的EtOAC/DCM，15分钟,40g柱)得到产物8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(0.4g,1.012mmol,85％的收率)。
HPLC:RT＝3.56min(含有TFA的H2O/MeOH,Sunfire C183.5mm,2.1x30mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝396.18[M+1]+.
步骤86f:8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸
向8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸乙酯(0.4g,1.012mmol)在THF(15mL)和MeOH(3.00mL)中的溶液中加入氢氧化钠(1M在水中,1.012mL,10.12mmol)。将反应溶液在RT搅拌16小时。16小时后，将反应混合物真空浓缩，将残留物重新溶于1M HCl，将析出物滤过得到8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸(300mg,0.817mmol,81％的收率)。
HPLC:RT＝3.04min(含有TFA的H2O/MeOH,Sunfire C183.5mm,2.1x30mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝368.10[M+1]+；
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.44-8.27(m,1H),8.27-8.16(m,1H),8.01-7.84(m,2H),2.46(s,3H),2.32(s,3H)
步骤86g
在烧瓶中加入8-氨基甲酰基-6-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5-氟-9H-咔唑-2-羧酸(.2694g,0.733mmol)在DMF(10mL)中的溶液，加入HCTU(0.437g,1.100mmol)、DMAP(0.090g,0.733mmol)和顺-2,6-二甲基吗啉(0.507g,4.40mmol)在DMF(10mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌16小时。向反应混合物中加入10％LiCl溶液，将所得的棕色析出物滤过，干燥并进一步经ISCO纯化(0％-100％的EtOAC/DCM，15分钟,40g柱)得到产物3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-4-氟-9H-咔唑-1-甲酰胺(300mg,0.646mmol,88％的收率)。
HPLC:RT＝3.22min(含有TFA的H2O/MeOH,Sunfire C183.5mm,2.1x30mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝465.13[M+1]+；
向3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-4-氟-9H-咔唑-1-甲酰胺(52mg,0.112mmol)在丙酮(1.0mL)中的溶液中加入碳酸钾(61.9mg,0.448mmol)、18冠6(2.96mg,0.011mmol)和(溴甲基)环丙烷(0.217mL,2.239mmol)。将反应溶液在80℃加热16小时。将粗产物混合物经制备性HPLC纯化(反相Shimadzu HPLC系统，使用LUNA Phenomenex柱,5μ,100A°,19X 100mm,),20％至80％的溶剂B,(溶剂A(90％水,10％甲醇,0.1％TFA),溶剂B(10％水,90％甲醇,0.1％TFA),10分钟梯度，运行12分钟,25mL/min)得到产物9-(环丙基甲基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-4-氟-9H-咔唑-1-甲酰胺(12mg,0.022mmol,19.64％的收率)。
LCMS:MeOH/H2O/0.1％TFA,Waters Sunfire C18 2.1x 30mm,3.5u,4分钟梯度，波长＝220nm:RT＝3.193min；m/z(M+1)+＝519.22
HPLC Purity:95/5至5/95H2O/CH3CN/0.05％TFA,流速＝0.5mL/min,梯度＝15min
Sunfire C18 3.5um,3.0x150mm:RT＝10.39min；Purity@220nm:96％；@254nm:95％
Xbridge Phenyl 3.5um,3.0x150mm:RT＝9.736min；Purity@220nm:100％；@254nm:95％
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.29(d,J＝7.9Hz,1H),7.77(s,1H),7.53(d,J＝7.3Hz,1H),7.37(dd,J＝8.1,1.1Hz,1H),4.61(d,J＝6.8Hz,3H),3.84-3.52(m,3H),3.09-2.53(m,2H),2.43(s,3H),2.27(s,3H),1.45-0.95(m,9H),0.56-0.34(m,4H).
实施例87
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-6-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤87a:6-溴-3-(乙氧基羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-8-羧酸
向5-溴-2-肼基苯甲酸二盐酸盐(814mg,2.68mmol)在AcOH(12mL)中的溶液中加入4-氧代环己烷羧酸乙酯(524mg,3.08mmol)。将反应混合物回流3小时。将反应混合物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取，干燥并浓缩得到6-溴-3-(乙氧基羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-8-羧酸(1.0g,65％的纯度)。该物质无需进一步纯化即可使用。
HPLC RT:1.00min柱：Waters Acquity SDS BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时2.20分钟。流速：1.11mL/min。LCMS:(ES)m/z 366.08(M+H).
步骤87b:6-溴-8-氨基甲酰基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-3-羧酸乙酯
向65％纯的6-溴-3-(乙氧基羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-8-羧酸(981mg,2.68mmol)、EDC(2054mg,10.72mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(1641mg,10.72mmol)在THF/DCM(5/1)(12mL)中的浅的混悬液中加入氢氧化铵(2.086mL,16.07mmol)，并且其变为粘稠的浅黄色混悬液，并将其在室温搅拌。5小时后，加入水并收集析出物并干燥得到6-溴-8-氨基甲酰基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-3-羧酸乙酯(980mg,65％purity)。该物质无需进一步纯化即可使用。
HPLC RT:0.94min柱：Waters Acquity SDS BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时2.20分钟。流速：1.11mL/min。LCMS:(ES)m/z 365.08(M+H)
步骤87c:6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-3-羧酸乙酯
向65％纯的6-溴-8-氨基甲酰基-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-3-羧酸乙酯(997mg,2.73mmol)在甲苯(12ml)中的溶液中加入DDQ(1391mg,6.01mmol)。将反应混合物回流1.5小时。将反应混合物浓缩干燥，然后加入水。收集固体并干燥得到6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-3-羧酸乙酯(1.0g,含有DDQ-衍生的副产物)。该物质无需进一步纯化即可使用。
HPLC RT:0.95min柱：Waters Acquity SDS BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时2.20分钟。流速：1.11mL/min。LCMS:(ES)m/e 361.08(M+H).
步骤87d:6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-3-羧酸
向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-3-羧酸乙酯(980mg,2.71mmol)在THF(5mL)和MeOH(1mL)中的溶液中加入氢氧化钠(10M在水中,1.357mL,13.57mmol)。3小时后，加入另外的NaOH并将反应混合物温热至60℃。将反应混合物浓缩，加入1N HCl并将析出物经滤过收集得到6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-3-羧酸(1.0g,含有DDQ-衍生的副产物)。该物质无需进一步纯化即可使用。
HPLC RT:0.69min柱：Waters Acquity SDS BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时2.20分钟。流速：1.11mL/min.
步骤87e:3-溴-6-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-3-羧酸(900mg,2.70mmol)在DMF(8mL)中的溶液中加入HATU(3082mg,8.10mmol)、DMAP(990mg,8.10mmol)和吗啉(1412mg,16.21mmol)。1小时后，加入水。收集析出物并用水洗涤得到3-溴-6-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(350mg)。
HPLC RT:0.73min柱：Waters Acquity SDS BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时2.20分钟。流速：1.11mL/min。LCMS:(ES)m/z 402.08(M+H)
步骤87f:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
将含有3-溴-6-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(275mg,0.684mmol)、3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑-(229mg,1.026mmol)和(1'1-二(二苯基膦基)二茂铁)二氯化钯(II)(25.01mg,0.034mmol)的隔板密封小瓶用氮气真空净化(3X)。加入四氢呋喃(20mL)和3M磷酸钾(0.684mL,2.051mmol)，并将混合物再次用氮气真空净化(3X)。将所得的混悬液温热至60℃并搅拌过夜。将混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，经硅藻土滤过，转移至分液漏斗，用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，滤过并浓缩得到深色油状物。将油状物溶于最少的二氯甲烷中并在ISCO Companion色谱系统纯化(24g硅胶柱，用0-100％乙酸乙酯/庚烷洗脱,35mL/min)。将馏分32-45合并得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(93mg,0.222mmol,32.5％的收率)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)d 10.59(s,1H),8.26(s,1H),8.11(d,J＝1.1Hz,1H),7.58(d,J＝1.1Hz,2H),7.53(d,J＝1.3Hz,1H),3.76(br.s.,8H),2.45(s,3H),2.31(s,3H)。LC/MS419(m+1).
将叔丁醇钾(1M THF)(0.155mL,0.155mmol)加入至混悬液of 3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-(吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(48mg,0.115mmol)在四氢呋喃(1mL)中的处于室温的混悬液中，最初形成沉淀物然后溶解。加入环丙烷磺酰氯(0.033mL,0.344mmol)，并将所得的澄清黄色溶液在室温搅拌。约2小时后，将混合物浓缩，溶于DMF(2mL)，经0.45μM过滤器滤过，并经制备性反相HPLC纯化得到9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-6-(4-吗啉基羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(42.2mg,0.081mmol,70.4％的收率)。
制备性LC/MS条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：5-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。产物的收率为42.2mg，且其经LCMS分析评估的纯度为100％。
两次分析型LC/MS注射用于确定最终纯度。
HPLC RT:1.09min。条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min,m/z 523(m+1)。
HPLC RT:1.09min:柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的5:95乙腈:水；流动相B：含有0.05％TFA的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min,m/z 523(m+1)
1H NMR(500MHz,1:1甲醇-d4:氯仿-d)δ8.19(d,J＝1.0Hz,1H),8.10(d,J＝1.5Hz,1H),8.02(d,J＝8.9Hz,1H),7.61(d,J＝2.0Hz,1H),7.60-7.57(m,1H),3.95-3.52(m,9H),2.49(s,3H),2.33(s,3H),1.56-1.37(m,2H),1.24-0.98(m,2H)
实施例88
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
步骤88a:3-溴-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
向6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸(3.60g,8.65mmol)在DMF(30mL)中的溶液中加入HCTU(10.31g,25.9mmol)、DMAP(3.17g,25.9mmol)和顺-2,6-二甲基吗啉(5.97g,51.9mmol)。2小时后，加入10％LiCl水溶液并收集所得的析出物。将析出物用水洗涤并干燥。将产物与使用5.25g 6-溴-8-氨基甲酰基-9H-咔唑-2-羧酸进行的相同反应的产物混合得到3-溴-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(9.30g,99％)。HPLC保留时间＝0.88,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：0-100％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在100％B；流速：0.8mL/min。MS(ES):m/z＝430[M+H]+.
步骤88b:3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺
将3-溴-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(3.59g,8.34mmol)和3,5-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)异噁唑(2.79g,12.51mmol)在DMF(30ml)中的溶液脱气，然后加入PdCl2(dppf)-DCM加合物(0.341g,0.417mmol)和磷酸三钾水溶液(8.34ml,25.03mmol)。将反应混合物脱气并在80℃加热。2小时后，反应显示产生所有产物，并冷却且加入10％LiCl水溶液。收集析出物得到3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(3.70g)，其无需进一步纯化即可使用。HPLC保留时间＝0.83,柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；梯度：0-100％B，历时1分钟，然后0.5分钟保持在100％B；流速：0.8mL/min。MS(ES):m/z＝447[M+H]+.
向SCP管中加入3-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-7-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺(120mg,0.269mmol)、DMF(1.0mL)和氢化钠(43.0mg,1.075mmol)。将反应混合物在室温搅拌15分钟，然后加入环丙烷磺酰氯(132mg,0.941mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。LCMS显示约30％的产物。加入水并收集析出物。
将粗物质经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：0-100％B，历时25分钟，然后5分钟保持在100％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。
将该物质进一步经制备性LC/MS纯化，采用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm颗粒；保护柱：Waters XBridge C18,19x 10mm,5-μm颗粒；流动相A：含有10-mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10-mM乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：25-65％B，历时25分钟，然后10分钟保持在65％B；流速：20mL/min。合并含有预期产物的馏分并经离心蒸发干燥。
9-(环丙基磺酰基)-3-(3,5-二甲基-4-异噁唑基)-7-((顺-2,6-二甲基-4-吗啉基)羰基)-9H-咔唑-1-甲酰胺的收率为6.8mg。
HPLC保留时间：1.481。柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1x 50mm,1.7-μm颗粒；流动相A：含有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相B：含有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0-100％B，历时3分钟，然后0.75分钟保持在100％B；流速：1.11mL/min。
生物活性评估
测试示例性化合物对BRD4活性的抑制作用。以下提供实验过程及结果。
用于热转移测定(TSA)的人类溴区结构域的克隆、表达及纯化
编码人类蛋白的溴区结构域的重组DNA克隆对于大肠杆菌(E.coli)表达最佳，以化学方式合成(GenScript,Piscataway NJ)且插入经修饰的pET28表达载体中以构建烟草叶脉斑点病毒(tobacco vein mottling virus,TVMV)蛋白酶可裂解的N-末端六聚组氨酸融合。非天然氨基酸(MGSSHHHHHHSSGETVRFQSM)之后紧接着为具有如下氨基酸残基序列的溴区结构域(之后为参考Uniprot Knowledgebase；Uniprot Consortium；www.uniprot.org的登记号及根据其得到的编号)：
CECR2(420-543),Q9BXF3-1；FALZ(2917-3037),Q12830-1；
GCN5(731-837),Q92830-1；PCAF(715-831),Q92831-1；BRD2(73-194),
BRD2(344-455),P25440-1；BRD3(24-144),BRD3(306-416),Q15059-1；
BRD4(44-168),BRD4(333-460),BRD4(44-460),O60885-1；BRDT(21-137),
Q58F21-1；BAZ1B(1340-1457),Q9UIG0-1；CREBBP(1081-1197),Q92793-1；
EP300(1040-1161),Q09472-1；WDR9(1310-1430),Q9NSI6-1；
ATAD2(981-1108),Q6PL18-1；BRD1(556-688),O95696-1；BRD7(129-236),
Q9NPI1-1；BRD9(134-239),Q9H8M2-1；BRPF1(626-740),P55201-2；
ATAD2B(952-1086),Q9ULI0-1；BAZ2B(2054-2168),Q9UIF8-1；
SP140L(400-580),Q9H930-4；SP140(687-862),Q13342-1；TIF1(896-1014),
O15164-1；TRIM28(619-805),Q13263-1；BRWD3(1295-1443),Q6RI45-1；
TAF1(1377-1503),TAF1(1501-1635),P21675-1；TAF1L(1402-1522),
TAF1L(1523-1654),Q8IZX4-1；ASH1L(2433-2564),Q9NR48-1；PB1(43-156),
PB1(178-291),PB1(388-494),PB1(645-766),PB1(773-917),Q86U86-1；
SMARCA2(1367-1511),P51531-1；SMARCA2-2(1367-1493),P51531-2。
使重组载体转化成大肠杆菌BL21(DE3)。在37℃、230rpm及OD600nm＝1.0的细胞密度在1L TB培养基(terrific broth)中在2.5L Thomson Ultra Yield震荡烧瓶中培养转化的细胞，用0.5mM IPTG诱导且在20℃用震荡器孵育16-18小时。通过沉降收集细胞团粒且在含有0.1mg/ml溶菌酶的缓冲液中通过超声处理溶解。通过沉降使各样品澄清，且将上清液装载于HisTrap亲和柱(GE Healthcare Life Sciences)上。洗涤柱且接着用咪唑梯度洗脱。使含有溴区结构域的峰值蛋白馏分汇集，浓缩且经用最终储存缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0)、200mM NaCl、5％丙三醇、2mM DTT)平衡的Superdex 200柱(GE Healthcare LifeSciences)通过尺寸排阻色谱进一步纯化蛋白。使含有2-5mg/ml的纯化蛋白的SEC峰馏分汇集，且将汇集物分成等分试样，在液氮中快速冷冻且储存于-80℃。
用于TR-FRET测定的生物素化的人类溴区结构域的克隆、表达及纯化
编码人类BRD4的溴区结构域的重组DNA克隆对于大肠杆菌表达最佳，以化学方式合成(GenScript,Piscataway NJ)且插入经修饰的pET28表达载体中以构建烟草叶脉斑点病毒(TVMV)蛋白酶可裂解的N-末端六聚组氨酸融合，之后为通过大肠杆菌生物素连接酶(BirA)识别的位点特异性生物素化基序。非天然氨基酸(MGSSHHHHHHSSGETVRFQGLNDIFEAQKIEWHED TGHM)之后紧接着为具有如下氨基酸残基序列的BRD4的溴区结构域构建物(之后为参考Uniprot Knowledgebase；Uniprot Consortium；www.uniprot.org的BRD4登记号及根据其得到的编号)：BRD4(44-168),BRD4(333-460),BRD4(44-460),BRD4(1-477),O60885-1。
在氯霉素选择下使各重组载体与编码质粒的BirA一起共转化成大肠杆菌BL21STAR(DE3)。在37℃在含有1L M9-CAS培养基(Teknova)(补充有40μg/ml卡那霉素、35μg/ml氯霉素及100μM生物素)的2.5L Thomson Ultra Yield震荡烧瓶中培养转化的细胞。在相当于OD600nm＝0.6的细胞密度下，用0.5mM IPTG诱导培养物且在20℃在震荡器中再孵育20小时。通过沉降收集细胞团粒且在含有0.1mg/ml溶菌酶的缓冲液中通过超声处理溶解。通过沉降使各样品澄清，且将上清液装载于HisTrap亲和柱上。洗涤柱且接着用咪唑梯度洗脱。使含有溴区结构域蛋白的峰值蛋白馏分汇集且在4℃用纯化的His-TVMV蛋白酶(TVMV:BRD4蛋白的质量比为1:15)孵育18小时。将样品换成低浓度咪唑缓冲液且流经HisTrap柱以捕捉裂解的His-标记物及His-TVMV酶。经Superdex 200柱的尺寸排阻色谱进一步纯化流经HisTrap柱中的蛋白且换成最终储存缓冲液(PBS(pH 7.0)、5％丙三醇、1mM DTT)。为改善纯度，在尺寸排阻色谱之前使BRD4(1-477)及BRD4(44-460)蛋白再进行阳离子交换色谱纯化步骤。通过对最终样品进行电喷雾电离质谱分析来确定各蛋白质的基本上定量的单生物素化(+226Da)。将纯化的样品分成等分试样，在液氮中快速冷冻且储存于-80℃。
时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定
使用时间分辨荧光共振能量转移结合测定(1)评定化合物与溴区结构域BRD4(44-168)、BRD4(333-460)及BRD4(1-477或44-460)的结合，该测定测量荧光标记的探针分子与溴区结构域蛋白的结合。将溴区结构域蛋白、荧光探针分子(生物素化的组蛋白肽或荧光标记的小分子)及剂量响应的测试化合物一起孵育以达到热力学平衡。在不存在测试化合物的情况下，使溴区结构域与小分子结合，产生高荧光性信号。在存在足够浓度的抑制剂的情况下，破坏此相互作用从而导致荧光共振能量转移损失。
对于BRD4(1-477及44-460)而言，将所有测定组分溶解于缓冲液组合物20mMHepes(pH 7.5)、150mM NaCl、5mM DTT、0.005％Tween 20及100μg/ml BSA中。溴区结构域蛋白的最终浓度为1.6nM BRD4(44-168)、1nM BRD4(333-460)及1nM BRD4(1-477或44-460)，且荧光探针分子分别为100nM、50nM及7.5nM。对所有蛋白进行生物素化。用铽穴状化合物(Cisbio SA-Tb)标记的抗生蛋白链菌素用作检测物，且预先与最终浓度为0.2nM的溴区结构域蛋白混合。在BRD4(44-460)的一些情况下，抗His铽穴状化合物用作检测物。在黑色Corning 384孔板中预先点染7.5nl剂量响应测试化合物或DMSO媒介物(0.0375％)，且将10μl各溴区结构域/检测试剂及荧光小分子溶液添加至培养板中，且在室温孵育反应混合物60分钟。接着经EnVision培养板读取器读取培养板(λex＝340nm，受体λEm＝520nm，及供体λEm＝615nm，LANCE D400镜)。在两种发射下进行时间分辨荧光强度测量，且计算受体/供体的比率且用于数据分析。相对于16高媒介物孔及8低参比对照孔校正所有数据，且接着应用四参数曲线拟合：
Y＝a+((b-a)/(1+(10x/10c)d)
其中‘a’为最小值，‘b’为Hill斜率，‘c’为IC50，且‘d’为最大值。
组蛋白肽：购自GenScript
H4K5K8K12K16
生物素-AHA-SGRGK(Ac)GGK(Ac)GLGK(Ac)GGAK(Ac)RHRKV
所用的荧光标记的小分子为本领域中已知的BRD4抑制剂。
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热转移测定
使用BioRad CFX实时PCR仪通过监测外部探针(SYPRO橙)的荧光增强来测量化合物结合对于溴区结构域的热稳定性的效果，这是因为其优先结合于解折叠蛋白。解折叠反应在384孔培养板中在具有2-8μM溴区结构域蛋白、于含有10mM Hepes(pH 7.4)、500mMNaCl的缓冲液中1-2％(v/v)DMSO的4μL体积中进行。添加SYPRO橙染料的1:500稀释液。化合物浓度在1.6-100μM的范围内。通过首先在25℃使仪器平衡2.4秒，之后使温度以0.5℃的增量由25℃匀变至95℃且在各温度平衡60秒之后进行读取来监测解折叠反应。将用于SYPRO橙染料的激发及发射过滤器设定为在450-490nm的激发范围及560-580nm的发射范围下进行FRET。通过使用二阶微分计算拐点来测定中点温度。将观测到的温度转移记录为含有蛋白及二甲基亚砜而无配体的参考孔与含有蛋白及化合物的孔之间的中点之间的差异。
热转移测定为比较在存在及不存在配体的情况下获得的蛋白的解折叠转变温度的改变的生物物理技术(1)。通常，当加热蛋白时，使用荧光染料监测蛋白解折叠。在解折叠过程中，使蛋白的疏水性区域暴露，从而致使染料结合增加及荧光强度增加。将蛋白解折叠转变的中点定义为Tm。结合于蛋白的配体使蛋白热稳定性随配体浓度与其结合亲和力按比例地增加，因此使Tm增加。
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MYC HCS测定
收集补充有10％FBS的完全RPMI生长培养基(Gibco,11875-085)中的肿瘤细胞且于30μl培养基中以每孔10,000个细胞接种于384黑色透明底部PDL细胞培养板中。在37℃处理化合物4小时之后，在室温将细胞固定于4％甲醛中30分钟且随后进行渗透。在洗涤并阻断之后，接着在室温用抗-Myc初级抗体1:1000(Cell Signaling Technology,5605)孵育培养板过夜。第二天，洗涤细胞且加以阻断，之后在室温在黑暗中添加二级抗体Alexa 488山羊抗兔子1:2000(Invitrogen,A11034)持续1小时。随后洗涤细胞且经具有10倍物镜的Cellomics ArrayScan扫描。
MTS细胞增殖测定
将肿瘤细胞以某些接种密度以每孔40μl接种于384孔黑色透明底部Matrix培养板中且在37℃在5％CO2中孵育过夜，之后进行测定。第二天，使用一组细胞培养板(T0培养板)测定零时细胞密度，将来自CellTiter 96AQueous非放射性细胞增殖试剂盒(Promega,G5440)的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓以4μl/孔添加至T0培养板中，之后在37℃在5％CO2中孵育三小时。经Envision读取器(PerkinElmer,Boston,MA)测量490nm的吸亮度。同一天，在37℃在5％CO2中用化合物处理剩余细胞培养板(T72培养板)。72小时之后，接着将4μl MTS试剂添加于那些细胞培养板上。在37℃在5％CO2中进一步孵育培养板三小时，且经Envision读取器测量A490的吸收值。
小鼠中的人类肿瘤异种移植物模型
所有啮齿动物均获自Harlan Sprague Dawley Co.(Indianapolis,Indiana)，且在无氨环境中保持在规定的无病原体群落中。隔离所有小鼠约1周，之后将其用于肿瘤增殖及药物功效测试。小鼠随意取食食物及水。美国实验动物护理评鉴协会(AmericanAssociation for Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)完全认可Bristol-Myers Squibb药物研究所的动物护理程序。所有实验均根据Bristol-MyersSquibb(BMS)动物测试方法及准则执行。
肿瘤异种移植物在免疫功能不全的balb/c nu/nu裸鼠或NOD-SCID小鼠(HarlanSprague Dawley)中皮下(SC)生长且维持。使用获自供体小鼠的肿瘤片段在适当的小鼠品系中使肿瘤以皮下移植物的形式增殖。
临床前化学疗法试验
实验开始时使检测到有意义反应所需的所要数目的动物汇集，且各自用13号套管针皮下植入肿瘤片段(约20mg)。使肿瘤生长至预定尺寸窗(排除该范围以外的肿瘤)且将动物平均分配至各个处理组及对照组中。每治疗组及对照组通常有8只小鼠。基于个体体重处理各动物。每天检查经处理的动物的处理相关毒性/死亡。在开始处理之前对各组动物进行称重(Wt1)，且接着在最后一次处理给药后再次称重(Wt2)。体重差(Wt2-Wt1)提供处理相关毒性的量度。
通过每周两次用测径规测量肿瘤来确定肿瘤反应，直至肿瘤达到0.5gm或1gm的预定“目标”尺寸为止，视肿瘤类型而定。由下式评估肿瘤重量(mg)：
肿瘤重量＝(长度×宽度2)÷2
肿瘤反应准则通过两种不同参数表示：1)肿瘤生长抑制百分比(％TGI)或2)肿瘤生长延迟或对数细胞杀死(LCK)。肿瘤生长延迟定义为经处理的肿瘤(T)达到预定目标尺寸所需的时间(天数)相较于对照组(C)的差值。出于此目的，各组的肿瘤重量表示为中值肿瘤重量(MTW)。
肿瘤生长抑制如下计算：
其中，
Ct＝处理结束时的中值对照组肿瘤尺寸
C0＝处理开始时的中值对照组肿瘤尺寸
Tt＝处理结束时处理组的中值肿瘤尺寸
T0＝在处理开始时处理组的中值肿瘤尺寸
活性定义为实现持续相当于至少1个肿瘤体积倍增时间的时段的持久肿瘤生长抑制为50％或更大(亦即TGI≥50％)，且药物处理必须持续相当于至少2个肿瘤体积倍增时间的时段。
肿瘤反应也以肿瘤生长迟延表示且表示为对数细胞杀死(LCK值)，定义为处理的肿瘤(T)达到预定目标尺寸所要的时间(天数)相较于对照组(C)的差值。
为了评估肿瘤细胞杀死，首先通过以下公式计算肿瘤体积倍增时间(tumorvolume doubling time)：
对数细胞杀死(LCK)＝T-C÷(3.32x TVDT)
其中，TVDT＝用于控制肿瘤重量达到靶标大小的时间中位数(天)–用于控制肿瘤重量达到一半靶标大小的时间中位数(天)。
在可能时，在直至最大耐受剂量(MTD)的剂量范围内测定抗肿瘤活性，该最大耐受剂量定义为恰低于出现过量毒性(即，一例以上死亡)的剂量的剂量。当出现死亡时，记录死亡日。在肿瘤达到目标尺寸之前死亡的经处理小鼠视为因药物毒性而死亡。无带有小于目标尺寸的肿瘤的对照小鼠死亡。具有一例以上因药物毒性所致的死亡的处理组视为经受过度毒性处理且其数据不纳入评估化合物的抗肿瘤功效内。
影响处理可耐受性的潜在药物毒性相互作用为组合化学疗法试验中的重要因素。对组合治疗结果的解释必须基于比较在类似耐受剂量下单个药物相对于组合的最佳可能反应的抗肿瘤活性。因此，治疗协同作用定义为以组合药物的耐受方案达成的治疗作用超过在单一疗法的任何耐受剂量下所达成的最佳作用。使用Gehan的广义Wilcoxon测试对数据进行统计学评估。在P<0.05时表示具统计显著性。
测定结果显示于下表中。活性数据是基于使用所述FRET测定中的一种。IC50小于5μM的化合物用(+)显示，IC50小于0.5μM的化合物用(++)显示，且IC50小于0.05μM的化合物用(+++)显示。
实施例编号 FRET BRD4IC50(uM)
实施例1 ++
实施例2 +++
实施例3 ++
实施例4 +++
实施例5 +++
实施例6 +++
实施例编号 FRET BRD4IC50(uM)
实施例7 +++
实施例8 ++
实施例9 +++
实施例10 +++
实施例11 +++
实施例12 +++
实施例13 +++
实施例14 +++
实施例15 +
实施例16 +++
实施例17 +++
实施例18 +++
实施例19 ++
实施例20 +++
实施例21 +++
实施例22 +++
实施例23 +++
实施例24 +++
实施例25 +++
实施例26 +++
实施例27 ++
实施例28 ++
实施例29 ++
实施例30 ++
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实施例32 +
实施例33 ++
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实施例35 ++
实施例36 ++
实施例37 ++
实施例38 +++
实施例39 ++
实施例40 +++
实施例41 +
实施例42 ++
实施例43 +++
实施例44 +++
实施例45 ++
实施例46 ++
实施例47 ++
实施例48 ++
实施例49 +++
实施例50 ++
实施例51 ++
实施例52 +++
实施例53 ++
实施例54 +++
实施例55 +++
实施例56 ++
实施例编号 FRET BRD4IC50(uM)
实施例57 ++
实施例58 +
实施例59 +
实施例60 +
实施例61 +
实施例62 +
实施例63 ++
实施例64 +
实施例65 +
实施例66 +
实施例67 ++
实施例68 +
实施例69 ++
实施例70 +
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实施例72 ++
实施例73 ++
实施例74 ++
实施例75 ++
实施例76 +++
实施例77 ++
实施例78 +++
实施例79 ++
实施例80 +++
实施例81 +++
实施例82 ++
实施例83 ++
实施例84 ++
实施例85 ++
实施例86 +++
实施例87 +++
实施例88 +++

Claims (7)

1.一种化合物和/或其药用盐、互变异构体或立体异构体，其具有下式
其中
A为
R为任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C3-C8环烷基C1-C6烷基、任选取代的C1-C6烷基-SO2-或任选取代的C3-C8环烷基-SO2；
R1为任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6烷基-SO2-、任选取代的C3-C8环烷基-CO-、任选取代的C3-C8环烷基-SO2-或任选取代的杂环基-CO-；
R2为-CN、-COOH或-CONR7R8；
R3为氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、氰基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基C1-C6烷基、任选取代的芳基氧基C1-C6烷基、任选取代的C1-C6烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基C1-C6烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基C1-C6烷基；
R4为氢、任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C3-C8环烷基；
或R3和R4可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的C2-C8杂芳基或C2-C8杂环；
R7和R8独立地为氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、氰基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基C1-C6烷基、任选取代的芳基氧基C1-C6烷基、任选取代的C1-C6烷基-SO2-、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基C1-C6烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基C1-C6烷基；
或R7和R8可连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的C4-C8杂芳基或C4-C8杂环；
R12为氢；
R13为氢、卤素、-CN、OH、-CONR3R4、-NHCOOR4、-NHCONR3R4、-NHCOR4、-NHSO2R7、-SO2NR3R4、-NHSO2NR3R4、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的C1-C6烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的C1-C6烷基-SO2-、任选取代的芳基-SO2-、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；
R14为氢或任选取代的C1-C6烷基；
R15为氢或任选取代的C1-C6烷基；
R16为氢或任选取代的C1-C6烷基；
条件是R14、R15及R16中至少一个不为氢；
其中
当基团指示为“任选取代”时，取代基选自C1-C6烷基、杂环基、卤素、羟基、C1-C6烷氧基、氧代、其中2个氨基取代基为烷基的二取代的氨基和氰基；
所述杂芳基为吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、1,2,4-噻二唑基或异噻唑基；
所述杂环基为饱和且具有除碳原子外的一个至四个选自硫、氧和氮的杂原子的3-7元单环杂环部分；和
所述芳基为苯基。
2.药物组合物，其包含一种或多种权利要求1的化合物或其药用盐及一种或多种药用载体、稀释剂或赋形剂。
3.组合药物产品，其包含一种或多种权利要求1的化合物或其药用盐以及一种或多种其他治疗活性剂。
4.权利要求1的化合物或其药用盐在制备用于治疗溴区结构域抑制剂所针对的疾病或病症的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中该疾病或病症为癌症。
6.权利要求5的用途，其中该癌症为小细胞肺癌、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤、T-急性淋巴细胞性白血病或AML。
7.权利要求1的化合物或其药用盐在制备用于抑制溴区结构域的药物中的用途。
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