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CN104611319B - 一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法 - Google Patents

一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，其通过以下步骤完成：1)配制含有果糖氨基酸氧化酶、叠氮钠的pH7.5‑8.5三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液；2)在低温搅拌条件下向步骤(1)所述的缓冲液中添加1‑丁基磺酸‑3‑甲基三氟甲磺酸盐、海藻糖、TritonX‑100。采用本发明的方法，使得的果糖氨基酸氧化酶热稳定性显著提高，可很好地应用于FAOD清除法测定糖化白蛋白的测定试剂开发。本发明的提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法对FAOD清除法测定GA含量无干扰、可显著提高液态氨基酸氧化酶热稳定性，使液态果糖氨基酸氧化酶置4℃保存12个月仍保留足够的活性。

Description

一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法
技术领域
本发明涉及液体酶稳定性技术领域，尤其涉及一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法。
背景技术
糖化血清白蛋白(GA)是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的产物，即血清白蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基基团被糖化。糖化白蛋白半衰期较短，测定糖化白蛋白的浓度可有效反映患者过去2～3周内平均血糖的水平，并不受临时血糖浓度波动的影响。目前，临床广泛采用清除游离糖化氨基酸的果糖氨基酸氧化酶(FAOD)法(下称FAOD清除法)测定GA含量，果糖氨基酸氧化酶是该方法中的关键工具酶，用于催化由糖化白蛋白酶解而来的果糖氨基酸发生氧化反应生成氨基酸、葡萄糖醛酮和过氧化氢。由于液态果糖氨基酸氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其热稳定性是该酶大量应用的基础。提高酶稳定性的主要方法有蛋白质工程、固定化、化学修饰、添加酶保护剂等。添加酶保护剂是提高液态酶热稳定性的主要方法，常见的酶保护剂有牛血清白蛋白等蛋白质类、L-天门冬氨酸等氨基酸类、蔗糖等二元糖类、甘油等多元醇等物质。这些保护剂对单独存在的液态果糖氨基酸氧化酶有一定的稳定作用，但并不适合采用FAOD清除法的GA测定试剂中果糖氨基酸氧化酶的保存。采用FAOD清除法的GA测定试剂由试剂1和试剂2组成，试剂1的主要成分为一种碱性缓冲液，含有一定浓度的果糖氨基酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、Trinder’S反应组分、防腐剂，试剂2的主要成分也是一种碱性缓冲液，含有一定浓度的碱性蛋白酶、金属离子、Trinder’S反应组分、防腐剂。该试剂在测定GA时，先用碱性蛋白酶将糖化白蛋白酶解为糖化氨基酸，然后用果糖氨基酸氧化酶进行氧化，再偶联Trinder’s反应进行显色定量。在试剂1中添加高浓度的牛血清白蛋白等蛋白质、L-天门冬氨酸等氨基酸虽然都可以在一定程度上提高果糖氨基酸氧化酶的热稳定性，但牛血清白蛋白等蛋白质本身也可被碱性蛋白酶所酶解，在检测时会降低碱性蛋白酶对血清糖化白蛋白的酶解作用，高浓度的L-天门冬氨酸等氨基酸则会阻碍碱性蛋白酶对血清糖化白蛋白的酶解反应，这两者均使酶解反应不到终点，降低检测的灵敏度和准确性；蔗糖、麦芽糖、果糖等二元糖在碱性缓冲液中长时间存储时，会逐渐水解释放出葡萄糖，葡萄糖具有较强的还原性，可明显降低检测的灵敏度；高浓度的甘油等多元醇对果糖氨基酸氧化酶有良好的稳定作用，但多元醇的还原性同样降低了检测灵敏度。现有的技术为提高FAOD清除法测定试剂中果糖氨基酸氧化酶的热稳定性，多数情况下都是加入大量的对GA检测无干扰的非专一性保护剂，未能解决液态糖化氨基酸氧化酶热稳定性不佳的缺点，另一方面，大量保护剂的加入导致测定试剂粘度较高，不利于在全自动生化分析仪上应用。
因此，需求一种不对FAOD清除法测定GA含量产生干扰、可显著提高液态氨基酸氧化酶热稳定性的方法，对于实现FAOD清除法测定GA含量的测定试剂开发显得尤为重要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，建立一种对FAOD清除法测定GA含量无干扰、可显著提高液态氨基酸氧化酶热稳定性的方法，该方法通过在含有果糖氨基酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、Trinder’S反应组分、防腐剂的碱性缓冲液中添加一定浓度的离子液体1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐([BSMIM]OTf)，联合非离子型表面活性剂TritonX-100和海藻糖的协同稳定作用，使液态果糖氨基酸氧化酶置4℃保存12个月仍保留足够的活性，特别适合FAOD清除法测定糖化白蛋白的测定试剂开发。
本发明采用如下技术方案：
本发明的提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法的具体步骤如下：
(1)配制含有果糖氨基酸氧化酶(来源于recombinant E.coli)、叠氮钠的pH7.5-8.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液；
(2)在低温搅拌条件下向步骤(1)所述的缓冲液中添加1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐([BSMIM]OTf)、海藻糖、TritonX-100。
步骤(1)中的pH7.5-8.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液的Tris-HCL浓度为30-100mmol/L，含有的果糖氨基酸氧化酶浓度为1-10KU/L，叠氮钠的浓度为1g/L。
步骤(2)中的低温搅拌条件是转速为200rpm的低速搅拌，温度为2-8℃。
步骤(2)中的[BSMIM]OTf与Tris-HCL缓冲液的质量体积比为2～10g/L(即1LTris-HCL缓冲液中加入2-10g的[BSMIM]OTf)。
步骤(2)中的海藻糖与Tris-HCL缓冲液的质量体积比为10～50g/L(即1L Tris-HCL缓冲液中加入10～50g的海藻糖)。
步骤(2)中的TritonX-100与Tris-HCL缓冲液的体积比为0.5～5ml/L(即1L Tris-HCL缓冲液中加入0.5～5ml的TritonX-100)。
本发明提高液体果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，是在下述基础上获得的：首选筛选出对FAOD清除法测定GA含量无干扰、能延长recombinant E.coli来源的果糖氨基酸氧化酶热稳定性的保护剂，并对得到的复合保护剂进行优化，最终获得了能显著提高recombinant E.coli来源的果糖氨基酸氧化酶稳定性的最佳保护剂配比。采用本发明的方法，使得recombinant E.coli来源的果糖氨基酸氧化酶热稳定性显著提高，可很好地应用于FAOD清除法测定GA的测定试剂开发。
本发明的积极效果如下：
本发明的提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法具有方法简单、方便快捷、易于操作的优点，采用本发明的方法，使得果糖氨基酸氧化酶热稳定性显著提高，可很好地应用于FAOD清除法测定GA的测定试剂开发。
本发明的提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法对FAOD清除法测定GA含量无干扰、可显著提高液态氨基酸氧化酶热稳定性，使液态果糖氨基酸氧化酶置4℃保存12个月仍保留足够的活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
(1)配制pH7.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液100ml，含有的Tris-HCL的浓度为30mmol/L，果糖氨基酸氧化酶(来源于recombinant E.coli)的浓度为1KU/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
(2)在温度为2℃、转速为200rpm的低温搅拌条件下向步骤(1)所述的缓冲液中添加0.2g 1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐([BSMIM]OTf)、1g海藻糖、0.05ml TritonX-100，搅拌溶解。
将步骤(2)所得溶液置于37℃水浴保温30min后测定酶保留率。以4℃放置的未作热处理未加保护剂的酶活保留率作为100％，以未加保护剂在相同实验条件下处理为对照组，计算和比较酶活力保留率(％)。本发明组和对照组所测得的酶活保留率分别为98.2％、45.7％，可以看出，本发明的方法可明显提高液态果糖氨基酸氧化酶的热稳定性。
实施例2
(1)配制pH8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液100ml，含有的Tris-HCL的浓度为65mmol/L，果糖氨基酸氧化酶(来源于recombinant E.coli)的浓度为5.5KU/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
(2)在温度为5℃、转速为200rpm的低温搅拌条件下向步骤(1)所述的缓冲液中添加0.6g 1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐([BSMIM]OTf)、3g海藻糖、0.3ml TritonX-100，搅拌溶解。
将步骤(2)所得溶液置于37℃水浴保温30min后测定酶保留率。以4℃放置的未作热处理未加保护剂的酶活保留率作为100％，以未加保护剂在相同实验条件下处理为对照组，计算和比较酶活力保留率(％)。本发明组和对照组所测得的酶活保留率分别为98.5％、47.4％，可以看出，本发明的方法可明显提高液态果糖氨基酸氧化酶的热稳定性。
实施例3
(1)配制pH8.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液100ml，含有的Tris-HCL的浓度为100mmol/L，果糖氨基酸氧化酶(来源于recombinant E.coli)的浓度为10KU/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
(2)在温度为8℃、转速为200rpm的低温搅拌条件下向步骤(1)所述的缓冲液中添加1g 1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐([BSMIM]OTf)、5g海藻糖、0.5ml TritonX-100，搅拌溶解。
将步骤(2)所得溶液置于37℃水浴保温30min后测定酶保留率。以4℃放置的未作热处理未加保护剂的酶活保留率作为100％，以未加保护剂在相同实验条件下处理为对照组，计算和比较酶活力保留率(％)。本发明组和对照组所测得的酶活保留率分别为98.0％、46.3％，可以看出，本发明的方法可明显提高液态果糖氨基酸氧化酶的热稳定性。
实施例4
为了进一步证明本发明的创造性，本发明做了如下对比试验，考察不同保护剂的添加对果糖氨基酸氧化酶酶活保留率的影响。在含有1KU/L果糖氨基酸氧化酶、1g/L叠氮钠的50mmol/L pH8.0Tris-HCL缓冲液中分别添加下列保护剂，保护剂的用量如表1所述，于37℃水浴保温30min后测定酶保留率。以4℃放置的未作热处理未加保护剂的酶活保留率作为100％，以未加保护剂在相同实验条件下处理为对照组，计算和比较酶活力保留率(％)。具体见表1。
表1
从表1可以看出，在相同的实验条件下，采用本发明的方法酶活保留率能达到97.9％，此结果表明，本发明能使[BSMIM]OTf、海藻糖、TritonX-100发挥协同作用，进一步提高酶的热稳定性。
实施例5
为了更进一步证明本发明的创造性，本发明将提高液体果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法应用到糖化白蛋白测定试剂配制中。配制含有10KU/L果糖氨基酸氧化酶、12KU/L过氧化物酶、5KU/L抗坏血酸氧化酶、2.0mmol/L TOOS、1g/L叠氮钠、5g/L[BSMIM]OTf、30g/L海藻糖、1ml/L TritonX-100的50mmol/L pH8.0Tris-HCL缓冲液，为测试组GA测定试剂1A(R1A)；配制不含保护剂[BSMIM]OTf、海藻糖、TritonX-100的上述Tris-HCL缓冲液，为对照组GA测定试剂1B(R1B)，配制含有40KU/L碱性蛋白酶、10mmol/LCaCl2、2.0mmol/L4-AAP、1g/L叠氮钠的50mmol/L pH8.0Tris-HCL缓冲液为GA测定试剂2(R2)。将R1A、R1B试剂分成12份，置4℃保存，每个月取出1份，与新制的GA测定试剂2(R2)组合，测定一份定值为300μmol/L的GA校准品反应所产生的吸光度。测定所采用的仪器为日立7080全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为5μl，R1A或R1B体积为240μl，R2体积为60μl，测定主/副波长为560/800nm。R1A或R1B与样本混合后在测定温度反应300秒；加入R2混匀后继续反应300秒，分别读取测试组和对照组反应所产生的吸光度，结果见表2。
表2
R1A、R1B置4℃保存时间 测试组吸光度 对照组吸光度
1月 0.0954 0.0951
2月 0.0955 0.0903
3月 0.0954 0.0841
4月 0.0953 0.0794
5月 0.0953 0.0743
6月 0.0952 0.0692
7月 0.0953 0.0642
8月 0.0951 0.0585
9月 0.0949 0.0527
10月 0.0947 0.0476
11月 0.0941 0.0428
12月 0.0928 0.0372
从表2可以看出，在相同的实验条件下，采用本发明方法的测试组R1A试剂的稳定性显著优于对照组R1B试剂的稳定性，且测试组R1A置4℃保存12个月后所测得的GA标准液吸光度基本保持不变，表明R1中的液态果糖氨基酸氧化酶置4℃保存12个月仍保留足够的活性，因此，本发明所述的方法特别适合FAOD清除法测定糖化白蛋白的测定试剂开发。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)配制含有果糖氨基酸氧化酶、叠氮钠的pH7.5-8.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；
(2)在低温搅拌条件下向步骤(1)所述的缓冲液中添加1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐、海藻糖、TritonX-100。
2.根据权利要求1所述的一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的pH7.5-8.5三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的三羟甲基氨基甲烷-盐酸浓度为30-100mmol/L，含有的果糖氨基酸氧化酶浓度为1-10KU/L，叠氮钠的浓度为1g/L。
3.根据权利要求1所述的一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的果糖氨基酸氧化酶来源于recombinant E.coli。
4.根据权利要求1所述的一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，其特征在于：步骤(2)中，的低温搅拌条件是转速为200rpm的低速搅拌，温度为2-8℃。
5.根据权利要求1所述的一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的质量体积比为2～10g/L。
6.根据权利要求1所述的一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的海藻糖与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的质量体积比为10～50g/L。
7.根据权利要求1所述的一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的TritonX-100与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的体积比为0.5～5ml/L。
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