CN104606189B - 一种化合物在制备mTOR抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化合物在制备mTOR抑制剂中的应用，属于药物领域，具体涉及化合物SC06在制备mTOR抑制剂中的应用；所述化合物具有能够抑制mTOR信号通路而诱导肿瘤的凋亡，抑制肿瘤的生长的功能。本发明所述化合物SC06既可以抑制肿瘤细胞的增殖生长，更能有效地诱导肿瘤细胞的凋亡，从而表现出对肿瘤的治疗作用。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及mTOR抑制剂，具体涉及一种化合物作为mTOR抑制剂的应用。
背景技术
目前，肿瘤越来越严重威胁到人类的生命健康。我国2012年首次发布了肿瘤发病情况登记年报。年报显示，我国每年新发肿瘤病例约为312万例，其中，全国平均每天8550人、每分钟有6人被诊断为肿瘤。同时，全国肿瘤死亡率为180.54/10万，每年因肿瘤死亡的病例达270万例。其中，我国居民因肿瘤死亡的几率是13%，即每7至8人中有1人因肿瘤死亡。肿瘤的死亡率高居不下的原因除了发病率外，其中缺乏有效的抗肿瘤药物是一个重要原因。
目前临床上使用的多数是细胞毒性抗肿瘤药物，这类药物在杀死肿瘤细胞的同时对人体正常细胞也有很强的毒副作用。而肿瘤作为一类遗传性疾病已经达成了共识。遗传物质的改变例如DNA突变和染色体畸变以及相应的细胞信号传导异常等是肿瘤发生发展和预后不良的重要分子基础，而针对这些分子设计新的靶向抗肿瘤药物是肿瘤治疗的新策略，例如美国食品与药品管理局（FDA）批准的用于治疗恶性血液病的Idelalisib，它就是一种磷脂酰肌醇-3-激酶的特异性抑制剂。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。在细胞中，mTOR在复合物mTORCl和mTORC2中以催化亚基形式存在。这两种复合物参与细胞基因转录、蛋白质翻译起始、核糖体生物合成、细胞凋亡等过程。
在肿瘤细胞中，mTOR及其信号通路常常发生异常改变，并与肿瘤的恶性程度和不良预后密切相关，这些肿瘤包括乳腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等。mTOR信号通路通过激活与蛋白质合成的相关信号从而调节肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和迁移等，而干扰该信号分子能诱导肿瘤细胞的凋亡并促进肿瘤的消退。因此mTOR已经成为肿瘤的治疗靶标，其中，一些特异性mTOR抑制剂已经进入了临床并用于肿瘤的治疗，例如惠氏制药生产的Temsirolimus就用于肾癌和乳腺癌的治疗，而诺华生产的Everolimus除了用于治疗肾癌和乳腺癌外，还用于恶性胰腺癌的治疗。
尽管现有技术中已经报道了一些化合物能够抑制mTOR信号传导，但存在着毒副作用大，药学参数差（例如对正常细胞毒性大以及在水相中不稳定），因而限制其应用。因此有必要研究新mTOR信号通路抑制剂，从而开发出新的有效的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种化合物作为mTOR抑制剂的应用，所述化合物具有能够抑制mTOR信号通路而诱导肿瘤的凋亡，抑制肿瘤的生长的功能，同时毒性较低，可以开发成为新的抗肿瘤药物。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：式Ⅰ的化合物在制备mTOR抑制剂中的应用；
式Ⅰ。
本发明公开的用于制备mTOR小分子抑制剂的式Ⅰ化合物的分子式为C18H11ClF6N4O，分子量为448.5，称为SC06，可市购。
本发明同时保护上述化合物SC06在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述肿瘤为以下的任一种：多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等；进一步优选为白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤。
本发明公开的化合物SC06可显著抑制mTOR的磷酸化水平，主要表现为显著抑制mTOR下游经典蛋白p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平，从而显著抑制mTOR的磷酸化激活；进而有效地控制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，对肿瘤具有抑制和治疗作用。
本发明同时公开了一种抗肿瘤药物组合物，所述抗肿瘤药物组合物的活性成分为上述化合物SC06，还包括药学上能接受的载体或辅料。
本发明所述化合物SC06可以单独或与一种以上可接受的载体组合剂制成制剂给药。例如，溶剂、稀释剂等。可以口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等；也可以注射型给药，如冻干粉针剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如 0.05%～90% 重量活性成分，更常见约15%～60%之间的活性成分。本发明化合物剂量可以是0.005～5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。
本发明公开了化合物SC06具有抑制mTOR的作用，并阐明其抗肿瘤活性是通过抑制mTOR信号通路实现的，因此本发明公开了一种mTOR抑制剂，为化合物SC06或者以SC06为基础的药学上可接受的盐。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明首次公开了化合物SC06可以作为mTOR信号通路小分子抑制剂，其对正常细胞毒性低，并显著抑制mTOR下游经典蛋白p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平，因此能够有效抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，从而有望将其开发成新的抗肿瘤药物。
附图说明
图1为实施例一中SC06处理不同骨髓瘤、白血病细胞株和淋巴瘤细胞株后细胞存活曲线（MTT）图；
图2为实施例二中SC06处理不同实体瘤细胞株后的显微镜图；
图3为实施例三中不同肿瘤细胞处理后的蛋白免疫印迹（Western Blot）图；
图4为实施例三中不同肿瘤细胞低血清培养后的蛋白免疫印迹（Western Blot）图；
图5为实施例四中SC06处理多种血液肿瘤细胞后的Western Blot图；
图6为实施例五中SC06处理多种血液肿瘤细胞后的Western Blot图；
图7为实施例六中SC06处理多种血液肿瘤细胞后的Western Blot图；
图8为实施例六中SC06处理多种血液肿瘤细胞经双染后的流式细胞分析图；
图9为实施例七中小鼠体重与给药天数的关系图；
图10为实施例七中小鼠肿瘤体积与给药天数的关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一 SC06抑制骨髓瘤和白血病细胞株、淋巴瘤细胞株的增殖
不同的多发性骨髓瘤细胞株（RPMI-8226，JJN3，KMS11，LP1，OCI-My5，OPM2，U266）、白血病细胞株（AML2，K562，NB4，THP1）和淋巴瘤细胞株（Jurkat）经SC06（20 μM，药物用100%DMSO配制后稀释在0.5%的DMSO溶液）处理72小时后，加噻唑蓝（MTT）孵育2到4小时，加MTTbuffer，过夜孵育后读板计算细胞存活率（每组细胞三个复孔）。附图1为经SC06处理不同骨髓瘤和白血病细胞株后细胞存活曲线（MTT）图，可以看出SC06能够有效抑制多发性骨髓瘤细胞和白血病细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。
实施例二 SC06抑制实体瘤细胞株的生长
不同的实体瘤细胞株（肺癌（A549、H460），宫颈癌（HeLa），前列腺癌（PC3），卵巢癌（SKOV3），乳腺癌（T47D）经SC06（20 μM，药物用100%DMSO配制后稀释在0.5%的DMSO溶液）处理72小时后，用倒置荧光显微镜拍照。附图2为SC06处理不同实体瘤细胞株后的显微镜图，可以看出SC06能够有效抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。
实施例三 SC06抑制mTOR的磷酸化
不同的多发性骨髓瘤细胞株（LP1, OPM2，JJN3和RPMI-8226）经SC06 ( 20 μM，药物用100%DMSO配制后稀释在0.5%的DMSO溶液) 处理24小时后，收集细胞，提取总蛋白，用Western blot检测磷酸化mTOR（p-mTOR）和总mTOR的表达；附图3为不同肿瘤细胞处理后的蛋白免疫印迹（Western Blot）图，SC06可显著抑制mTOR的磷酸化水平，对其表现出明显的抑制作用。
不同肿瘤细胞隔夜低血清（0.5%）培养后，经SC06，S14161和雷帕霉素(Rapamycin)（10 nM）处理2小时后用胰岛素样生长因子（IGF-1）作用15分钟，收集细胞，提取总蛋白，用Western blot检测磷酸化mTOR（p-mTOR）的表达，GAPDH作为内参，附图4为不同肿瘤细胞处理后的蛋白免疫印迹（Western Blot）图，SC06可显著抑制mTOR的磷酸化水平，对其表现出明显的抑制作用。
实施例四 SC06抑制mTOR信号通路
SC06处理多种血液肿瘤细胞，24小时后收集细胞，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，分别用特异性抗体检测p-mTOR、p-P70S6K、p-4E-BP1、Raptor、mTOR、P70S6K、4E-BP1和GAPDH，附图5为SC06处理多种血液肿瘤细胞中后的Western Blot图，SC06显著抑制mTOR下游经典蛋白p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平。
实施例五 SC06特异性抑制mTOR信号通路
SC06处理多种血液肿瘤细胞，24小时后收集细胞，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，分别用特异性抗体检测p-ERK、p-JNK、p-STAT3、p38、p-Src的蛋白表达水平，附图6为SC06处理多种血液肿瘤细胞中后的Western Blot图，SC06对其它信号通路蛋白没有影响。
实施例六 SC06诱导血液肿瘤细胞的凋亡
SC06 处理不同的血液肿瘤细胞（LP1, OPM2，JJN3和RPMI-8226）24小时后，收集细胞。经SDS-PAGE凝胶电泳，分别用特异性抗体检测PARP，Caspase 3，Mcl-1，Bcl-2的蛋白表达水平，附图7为SC06不同肿瘤细胞处理后的Western Blot图，结果显示：SC06能够有效诱导血液肿瘤细胞的凋亡，并且SC06诱导的细胞凋亡与PARP、Caspase3的活化有关。
血液肿瘤细胞经SC06处理后经Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）双染，用流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞所占的比例，附图8为SC06不同肿瘤细胞处理后的流式细胞分析图，结果显示：细胞经Annexin V 和PI双染后，流式细胞仪检测到早期凋亡细胞所占的比例显著升高。
实施例七 SC06抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长
5-6 周龄雌性NOD/SCID小鼠，左肩岬皮下注射骨髓瘤细胞株JJN3和OPM2（3×107），待肿瘤长到可以触及时，灌胃SC06（50mg/kg/d）进行干预，对照组则注射等量溶剂（PBS缓冲液含10%DMSO和10%Tween80)，连续23天。每天测量肿瘤体积的变化，同时监测小鼠的体重变化，附图9和10分别为小鼠体重和肿瘤体积与给药天数的关系图，可以看出实验组和对照组的小鼠体积没有明显变化；SC06显著抑制了两种荷瘤小鼠体内肿瘤的生长，从第10天开始至实验结束，SC06干预组的肿瘤体积与对照组相比差异均有统计学意义（*p﹤0.05；＃ p﹤0.01）。说明本发明公开的mTOR抑制剂连续给药23天后，显著抑制了荷瘤小鼠的肿瘤生长；在发挥抗肿瘤作用的同时，对荷瘤小鼠的体重也没有明显的影响。
Claims (5)
1.式Ⅰ的化合物在制备mTOR抑制剂中的应用；
式Ⅰ。
2.式Ⅰ的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用；
式Ⅰ。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌或者乳腺癌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为多发性骨髓瘤、白血病或者淋巴瘤。
5.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述抗肿瘤药物组合物的活性成分为式Ⅰ的化合物，还包括药学上能接受的载体或辅料；
式Ⅰ。
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