CN104327141B - Rna纳米颗粒及其在胃癌防治中的应用 - Google Patents

Abstract

一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA按碱基配对规则形成颗粒，a链RNA序列为SEQ ID No.1，b链RNA序列为SEQ ID No.2，以及c链RNA序列为SEQ ID No.3。本发明提供的RNA纳米颗粒经细胞和动物水平的实验验证表明其具有良好的生物安全性，优异的基因干扰效果和专一性，能够有效的抑制胃癌细胞株和皮下移植瘤的生长，可应用于胃癌防治和诊断。

Description

RNA纳米颗粒及其在胃癌防治中的应用

技术领域

本发明涉及一种生物纳米颗粒，尤其涉及一种RNA纳米颗粒，以其作为载体进行siRNA体内和体外递送的方法，以及以近红外染料标记后的RNA纳米颗粒在皮下瘤模型中的活体荧光成像中的应用

背景技术

胃癌具有发病率高、易转移和病死率高等特点,根据临床统计,根治术后肿瘤的复发和转移率高达33％。在中国，胃癌发病率位于第二位，死亡率位于第三位。全球每年新发胃癌100余万，死亡约80万，中国每年新发胃癌占全球的42％，死亡占35％，其发病率和死亡率均是世界平均水平两倍多。

胃癌起源于胃壁最表层的粘膜上皮细胞，可发生于胃的各个部位，可侵犯胃壁的不同深度和广度，胃癌的早期诊断和实时追踪胃癌细胞对胃癌的治疗至关重要。手术、化疗、放疗和生物靶向治疗是治疗恶性肿瘤的主要方法。

中国发明专利申请201110045024.5公开了一种胃部淋巴结清楚方法，包括先切开肝胃韧带，清扫第12组肝十二指肠韧带淋巴结，再由幽门上方清扫第5组幽门上区淋巴结，并切断、结扎胃右动、静脉，再沿膈肌脚、肝尾状叶下缘将小网膜内膜组织切开，沿顺时针方向绕至贲门区右侧，清扫第1组贲门右淋巴结及第3组胃小弯淋巴结，再沿胰腺上缘处切开胰腺被膜，至幽门下方，清扫第6组幽门下淋巴结，与幽门上区会合；再沿肝总动脉干表面依次清扫第7组胃左动脉旁、第8组肝总动脉旁、第9组腹腔动脉旁及脾动脉干淋巴结，从而完成淋巴结的清除。该技术首次提出了以“围歼式”的淋巴结清扫方法，并采取更合理的清除途径，大大简化操作步骤，提高可操作性，减少清除过程对周围组织的损伤，显著降低创面，提高作业的安全性。但是，单纯的手术治疗对于胃癌病人的疗效是有限的，晚期病人或术后复发或转移者的主要治疗手段是化疗和放疗。

随着胃癌分子生物学研究的不断深入，生物靶向治疗为胃癌的治疗开辟了新的途径。RNA干扰作为目前最为有效的基因沉默技术，在肿瘤的治疗中有着重大的应用前景，其能够特异性的阻断目标基因的表达，下调相应蛋白水平及功能，调控相关信号通路，从而抑制肿瘤生长、侵袭，具有分子特异性和选择性，能够专一性的杀灭肿瘤细胞，而对人体的正常组织没有损伤。然而裸露的小干扰RNA无保护，容易受机体内以及周围环境中的核酸酶的作用而降解，稳定性低，且因小干扰RNA具有过多阴离子而导致不能自由穿透细胞膜，达到靶组织时的剂量显著降低。因此，采用适当的递送系统将siRNA特异性的地送到靶细胞是siRNA治疗领域的挑战。因此发展一种安全、特异性的siRNA递送体系对于胃癌的治疗具有重大的意义。

Salih Gencer等人通过lipofectamin2000作为转染试剂将针对MMP-3基因的siRNA转入胃癌细胞株AGS中，有效的降低了AGS细胞的迁移以及浸润性(Journal ofGastrointestinal and Liver Diseases.2011Mar；20(1):19-26)。此外，WeiZhou等人通过慢病毒作为载体将Akt1基因的siRNA转入胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823中，体内和体外的研究表明胃癌细胞对药物顺铂的敏感性明显增强(Regulatory Peptides.2012Jun10；176(1-3):13-21)。上述两项技术中涉及的siRNA递送的载体lipofectamin2000和慢病毒在实际应用中受到lipofectamin2000较高的细胞毒性以及慢病毒潜在生物安全性的限制，尚难以实现在胃癌治疗中的得以应用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，生物相容性高，实现siRNA高效且特异性的递送。

本发明的另一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，针对BRCAA1基因的沉默可有效抑制人胃癌细胞的增值并诱导细胞凋亡。

本发明的再一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，将近红外染料标记的RNA纳米颗粒作为裸鼠胃癌皮下移植瘤模型的活体荧光成像的探针。

本发明的又一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，用于胃癌的防治。

本发明提供的一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA按碱基配对规则形成颗粒，其各自的序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，形成结构如下式Ⅰ所示

本发明提供的另一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA组成，按碱基配对规则形成颗粒，其各自的序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，b链RNA5’端携带乳腺癌相关抗原基因1(Breast cancer-associated antigen1，BRCAA1)的siRNA，该siRNA的有义链与b链RNA5’端相连，序列为SEQ ID No.4，其反义链序列为SEQ ID No.5，形成结构如下式Ⅱ所示。

本发明提供的siRNA，出于保护稳定性的目的，还可在其上加上保护序列，如在其反义链和有义链的3’端上均加上两个u碱基组成的序列。

本发明提供的RNA纳米颗粒，还在a链RNA的5’端标记叶酸。

本发明提供的RNA纳米颗粒，还在c链RNA的5’端标记示踪剂，如：但不仅限于酶标记、荧光标记和同位素标记等，使得RNA纳米颗粒可用于生物体(活体)成像的探针，并制成检测试剂(盒)组合物。

本发明提供的各种RNA纳米颗粒，能实现siRNA高效且特异性的递送和靶向递送，可用于制备胃癌防治的药物。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA等三种RNA按碱基配对规则形成纳米颗粒，生物相容性高，能实现siRNA高效且特异性的递送。

本发明通过RNA纳米颗粒携带siRNA进入胃癌细胞,实现杀伤胃癌细胞以及抑制裸鼠皮下瘤生长。采用热动力稳定的RNA纳米颗粒作为载体携带BRCAA1基因的干扰RNA，并将叶酸作为靶标，实现对叶酸受体高表达的胃癌细胞株MGC-803细胞的特异性识别，并引起胃癌细胞的凋亡，增强了治疗效果。

本发明提供的RNA纳米颗粒，在其携带示踪剂后，可作为生物体皮下移植瘤模型的活体成像探针，应用于胃癌的诊断和治疗。

附图说明

图1为本发明RNA纳米颗粒同时携带叶酸、示踪剂和针对BRCAA1基因的siRNA结构示意图；

图2A为MGC-803细胞与Alexa Fluor647和叶酸标记的RNA纳米颗粒共孵育后的流式分析图；

图2B为GES-1细胞与Alexa Fluor647和叶酸标记的RNA纳米颗粒共孵育后的流式分析图；

图3A为采用荧光定量PCR实验验证RNA纳米颗粒对BRCAA1基因的沉默效果图；

图3B为采用免疫印迹实验验证RNA纳米颗粒对BRCAA1基因的沉默效果图；

图4为携带针对BRCAA1基因的siRNA的RNA纳米颗粒引起的MGC-803细胞的凋亡情况图；

图5为携带针对BRCAA1基因的siRNA的RNA纳米颗粒对裸鼠皮下瘤的生长抑制情况与阴性和阳性对照组的比较图；

图6A为静脉注射RNA纳米颗粒后分别在30分钟、3小时、5小时、12小时和24小时的活体荧光成像图，箭头指示的为肿瘤部位；

图6B为静脉注射RNA纳米颗粒后分别在5小时、24小时、48小时、96小时和7天时的离体器官荧光成像图；图中，数字“1”表示肿瘤，数字“2”表示心脏，数字“3”表示肝脏，数字“4”表示脾脏，数字“5”表示肺，数字“6”表示胃，数字“7”表示肾脏，数字“8”表示膀胱，数字“9”表示肌肉组织。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明涉及分子生物学实验，若没有特别注明，可参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。此外，根据不同实验目的，本领域技术人员在各种商品化试剂盒(Kit)所附带的操作手册的指导下完成相应的实验或委托专业化的公司进行，如：基因测序、质粒测序和确定分子量等。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛－奥德里奇(Sigma－Aldrich)。

本发明以下实施例基于BRCAA1基因的沉默可有效抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖和诱导细胞凋亡，其机制与其促进Rb和Bax蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白表达有关。BRCAA1基因将是一个潜在的针对胃癌的基因治疗靶点。

实施例1RNA纳米颗粒携带siRNA杀伤胃癌细胞的实现

RNA纳米颗粒携带siRNA进入胃癌细胞，实现杀伤胃癌细胞以及抑制裸鼠皮下瘤生长，其实验方法如下：

第一步，pRNA-3WJ RNA纳米颗粒的构建：

该RNA纳米颗粒由三部分组成(参见图1)，分别为链a、链b和链c等三部分的5’端分别共价修饰上叶酸分子(作为靶向配体)，Alexa Fluor647(近红外荧光指示剂)，和BRCAA1siRNA，制成a3WJ、b3WJ和c3WJ三部分，上述三部分均由美国TriLink公司制取。将a3WJ、b3WJ和c3WJ三部分以1:1:1的摩尔比混合于DEPC处理过的超纯水中或者是TMS缓冲液(89mM Tris,5mM MgCl2,pH7.6)。为了由上述三部分纯化组成的二聚体，三聚体，和3WJ结构的纳米颗粒，将上述混合物进行12％浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳然后分离出3WJ结构的纳米颗粒，然后用无水乙醇过夜沉淀放于-20℃。收集到的沉淀去掉乙醇后重新溶解于纯水中。

第二步，流式细胞仪分析胃癌MGC-803细胞和胃粘膜上皮细胞GES-1对步骤一构建的RNA纳米颗粒的不同摄取效率

首先将MGC-803细胞和GES-1细胞接种于六孔板中，生长过夜，然后将AlexaFluor647标记的RNA纳米颗粒与MGC-803细胞和GES-1细胞孵育，RNA纳米颗粒浓度为200nM，孵育时间为3小时。孵育结束后，用PBS缓冲液冲洗三次，然后分别收集1×10⁵个MGC-803细胞和GES-1细胞进行流式细胞分析。收集细胞荧光信号采用的是BD FACSCalibur的FL-4通道(参加图2A和图2B)。

第三步，3WJ RNA纳米颗粒对MGC-803细胞中的BRCAA1基因的沉默效果

两种类型的RNA纳米颗粒用来研究沉默效果，一种是在RNA纳米颗粒的c3WJ部分结合了BRCAA1的siRNA，另一种RNA纳米颗粒是在c3WJ部分结合了随机的siRNA作为对照。两种颗粒在本实施例中合称3WJ RNA纳米颗粒。

此外，用Lipofectamine2000转染BRCAA1的siRNA作为阳性对照。将3WJ RNA纳米颗粒以及Lipofectamine2000作为转染试剂的处理MGC-803细胞12小时，3WJ RNA纳米颗粒以及相应的BRCAA1的siRNA的浓度为200nM。孵育完毕后继续培养，总计48小时。然后用Trizol试剂收集不同处理的MGC-803细胞的总RNA，然后逆转录成cDNA，并进行荧光定量RCR来测定mRNA水平的沉默效果(参见图3A)。

使用的BRCAA1引物如下：

上游:5'-ACCAAATCTCCCGCAAGG-3'；

下游:5'-CATATTTTCCAGGTCCGACA-3'

使用的GAPDH引物如下：

上游:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'；

下游:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC--3'。

将MGC-803细胞进行上述类似的处理，并收集细胞裂解液做免疫蛋白印迹实验测定蛋白水平的沉默效果(参见图3B)。

第四步，MGC-803细胞凋亡水平的测定

通过用3WJ RNA颗粒对MGC-803细胞进行上述步骤三种处理，然后采用Annexin V-FITC/PI双染法并用流式细胞仪检测MGC-803细胞的凋亡情况(参见图4)。由图4可见，相较于没有做任何处理的MGC-803细胞的对照组，携带随机siRNA的RNA纳米颗粒仅引起了极少量的细胞凋亡，而携带BRCAA 1 siRNA的RNA纳米颗粒则引起了2.51％的细胞发生了早期凋亡，15.0％的细胞发生了晚期凋亡。

第五步：3WJ RNA纳米颗粒对裸鼠皮下瘤的抑制作用

首先构建裸鼠的皮下瘤模型：将处于对数期的2×10⁶个MGC-803细胞悬浮于200μl的PBS缓冲液中，然后注射于雌性裸鼠皮下(18g-22g)，饲养2周-3周后，待肿瘤的体积达到100mm³-150mm³左右，可用来做皮下瘤抑制试验。将18只生长状态相同的皮下瘤模型裸鼠随机平均随机分成三组，每组6只。

对照组每隔一天注射100μlPBS缓冲液，另外两个实验室组中，一组裸鼠每隔一天瘤内注射100μl浓度为200nM携带有BRCAA 1 siRNA的3WJ RNA纳米颗粒，另外一组的裸鼠每隔一天注射100μl浓度为200nM携带有随机siRNA(scrambled control)。14天后拉颈椎处死小鼠，取肿瘤组织观察拍照(参见图5)。由图5可见，注射PBS缓冲液的对照组的肿瘤体积最大，注射携带随机siRNA的RNA纳米颗粒的实验组其肿瘤体积相对于对照组有变小的趋势，而注射携带BRCAA 1 siRNA的RNA纳米颗粒的实验组，其肿瘤体积最小。

实施例2RNA纳米颗粒作为成像的探针

本实施例为实现将近示踪剂(红外染料)标记的RNA纳米颗粒作为生物体(如：裸鼠胃癌皮下移植瘤模型)活体荧光成像探针，其实验方法如下：

第一步，裸鼠皮下瘤模型的建立

采用实施例1中第五步的方法建立裸鼠的MGC-803细胞株皮下瘤模型，待肿瘤的体积达到200mm3左右时用来做活体荧光动物实验。

将标记有叶酸和近红外染料Alexa Fluor647的RNA纳米颗粒静脉注射到裸鼠体内(按32mg/kg体重浓度，加入约200μl溶于PBS缓冲液中的20nmol RNA纳米颗粒)，在静脉注射后的30分钟、3小时、5小时、12小时和24小时等时间点分别对裸鼠进行全身的活体荧光成像，采用的激发波长是620纳米-640纳米，发射波长是685纳米-715纳米，曝光时间是15秒(参见图6A)由图6A可见，在静脉注射后的30分钟左右，全身的荧光背景很强，肿瘤部位的荧光信号很难区分出来。随着时间的推移，肿瘤部位的信号不断增强，而身体其他部位的背景则不断减弱，因此肿瘤部位的越来越清晰的显示出来。

第二步，离体器官的荧光成像。将静脉注射上一步骤等剂量的RNA纳米颗粒的裸鼠处死取主要器官进行荧光成像观察。杀死小鼠的时间点为静脉注射后的3小时、24小时、48小时和96小时以及7天等时间点对裸鼠进行全身的活体荧光成像，采用的激发波长是620纳米-640纳米，发射波长是685纳米-715纳米，曝光时间是15秒(参见图6B)由图6B可见，离体器官中肿瘤的信号较强，而且在静脉注射后的48小时后仍然保持较高的信号强度，说明该RNA纳米颗粒具有较强的胃癌靶向效果。

Claims (3)

1.一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA组成，按碱基配对规则形成颗粒，

所述a链RNA序列为SEQ ID No.1；

所述c链RNA序列为SEQ ID No.3；

所述b链RNA序列为SEQ ID No.2，其5’端携带乳腺癌相关抗原基因1的siRNA，该siRNA的有义链与b链RNA5’端相连，序列为SEQ ID No.4，其反义链序列为SEQ ID No.5，形成结构如下式Ⅱ所示；

所述a链RNA的5’端还标记叶酸；

所示c链RNA的5’端标还记示踪剂。

2.一种权利要求1所述的RNA纳米颗粒在制备治疗和预防胃癌药物中的应用。

3.一种用于诊断或检测的组合物，其特征在于包括权利要求1所述的RNA纳米颗粒。