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CN104017020B - 核苷氨基磷酸酯 - Google Patents

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Abstract

本文公开核苷氨基磷酸酯和其用作治疗病毒疾病的剂的用途。这些化合物是RNA依赖性RNA病毒复制的抑制剂，并可用作HCVNS5B聚合酶的抑制剂、用作HCV复制的抑制剂和用于治疗哺乳动物中的丙型肝炎感染。

Description

核苷氨基磷酸酯
本申请是申请号为201180017181.3(PCT/US2011/030725)、申请日为2011年3月31日、发明名称为“核苷氨基磷酸酯”的中国专利申请的分案申请。
本申请要求2010年3月31日提交的美国专利申请第61/319,513号、2010年3月31日提交的美国专利申请第61/319,548号、和2010年5月20日提交的美国专利申请第12/783,680号的优先权，其主题通过引用整体并入本文。
技术领域
本文公开核苷氨基磷酸酯和其用作治疗病毒疾病的剂的用途。这些化合物是RNA依赖性RNA病毒复制的抑制剂，并可用作HCVNS5B聚合酶的抑制剂、用作HCV复制的抑制剂和用于治疗哺乳动物中的丙型肝炎感染。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)感染是导致慢性肝病(如肝硬化和肝细胞癌)的主要健康问题，有大量的受感染个体，估计占世界人口的2-15％。根据美国疾病控制中心，单美国估计就有450万受感染人口。根据世界卫生组织，全世界有超过2亿受感染人口，并且每年有至少300-400万人被感染。一旦被感染，约20％的人可清除病毒，但其余的人在其余生中将携带HCV。10-20％的慢性受感染个体最终发展为肝破坏性肝硬化或癌症。通过污染的血液和血液制品、污染的针或性行为以及从受感染的母亲或携带者母亲垂直地到其后代，胃肠外地传播该病毒性疾病。HCV感染的现有治疗局限于单用重组干扰素α或联合使用核苷类似物利巴韦林的免疫治疗，取得有限的临床益处。此外，尚未建立用于HCV的疫苗。因此，急切需要一种可有效对抗慢性HCV感染的改善的治疗剂。
HCV病毒体是有包膜的正链RNA病毒，其具有约9600个碱基的单寡核糖核苷酸基因组序列，所述单寡核糖核苷酸基因组序列编码约3,010个氨基酸的多蛋白。HCV基因的蛋白产物由结构蛋白C、E1和E2，以及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A和NS4B、和NS5A和NS5B组成。认为非结构(NS)蛋白提供病毒复制的催化机制。NS3蛋白酶释放NS5B(即来自多蛋白链的RNA依赖性的RNA聚合酶)。HCV NS5B聚合酶是从单链病毒RNA合成双链RNA所必需的，所述单链病毒RNA在HCV的复制循环中作为模板。因此，认为NS5B聚合酶是HCV复制复合体中的必要组分(K.Ishi等人,Heaptology,1999,29:1227-1235；V.Lohmann等,Virology,1998,249:108-118)。HCV NS5B聚合酶的抑制会阻止双链HCV RNA的形成，因而构成发展HCV-特异性的抗病毒疗法的具有吸引力的方法。
HCV属于具有许多共性的很大的病毒家族。
黄病毒科(Flaviviridae)病毒
病毒的黄病毒科家族包括至少三个不同的属：瘟病毒属(pestiviruses)，它可导致牛和猪的疾病；黄病毒属(flaviviruses)，它是导致诸如登革热和黄热病等疾病的主要原因；和丙型肝炎病毒属(Hepaciviruses)，其唯一成员是HCV。基于血清学相关性的分组，黄病毒属包括超过68个成员(Calisher等人,J.Gen.Virol,1993,70,37-43)。临床症状各不相同，包括发热、脑炎和出血热(Fields Virology,编辑:Fields,B.N.,Knipe,D.M.,和Howley,P.M.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,PA,1996,第31章,931-959)。全球关心的与人类疾病相关的黄病毒属包括登革出血热病毒(Dengue Hemorrhagic Feverviruses)(DHF)、黄热病病毒、休克综合征(shock syndrome)和日本脑炎病毒(Halstead,S.B.,Rev.Infect.Dis.,1984,6,251-264；Halstead,S.B.,Science,239:476-481,1988；Monath,T.P.,New Eng.J.Med,1988,319,641-643)。
瘟病毒属包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、典型性猪瘟病毒(classical swinefever virus)(CSFV，也称为猪霍乱病毒)和绵羊边界病病毒(border disease vlrus)(BDV)(Moennig,V.等人，Adv.Vir.Res.1992,41,53-98)。家畜(牛、猪和绵羊)的瘟病毒感染造成世界范围内巨大的经济损失。BVDV导致牛的粘膜病，且对于家畜产业具有显著的经济重要性(Meyers,G.和Thiel,H.J.,Advances in Virus Research,1996,47,53-118；Moennig V.等人,Adv.Vir.Res.1992,41,53-98)。尚未像动物瘟病毒那样充分表征人的瘟病毒。然而，血清学研究显示，人类中有相当多的瘟病毒暴露。
瘟病毒属和丙型肝炎病毒属是黄病毒科家族内密切相关的病毒属。该家族内其它密切相关的病毒包括GB病毒A、GB病毒A-样病原体、GB病毒-B和GB病毒-C(也称为G型肝炎病毒，HGV)。丙型肝炎病毒属(丙型肝炎病毒；HCV)由许多感染人体的密切相关但基因型不同的病毒组成。至少有6种HCV基因型和超过50种亚型。由于瘟病毒和丙型肝炎病毒之间的相似性，加上丙型肝炎病毒在细胞培养中很难有效生长，所以，在HCV病毒研究中经常使用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为代用品。
瘟病毒和丙型肝炎病毒的遗传组构非常相似。这些正链RNA病毒具有单个大的开放阅读框(ORF)，其编码病毒复制所需的所有病毒蛋白。这些蛋白表达为多蛋白，所述多蛋白被细胞和病毒编码的蛋白酶在翻译同时加工和在翻译后加工，产生成熟的病毒蛋白。负责病毒基因组RNA复制的病毒蛋白位于接近羧基末端之内。2/3的ORF被称为非结构(NS)蛋白。瘟病毒和丙型肝炎病毒的ORF的非结构蛋白部分的基因组构和多蛋白加工非常相似。对于瘟病毒和丙型肝炎病毒二者，按照从非结构蛋白编码区的氨基末端到ORF的羧基末端的先后次序，成熟的非结构(NS)蛋白由p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B组成。
瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS蛋白共有这样的序列结构域，所述序列结构域是特定蛋白功能的特征。例如，两组内病毒的NS3蛋白都具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶特有的氨基酸序列基序(Gorbalenya等人,Nature,1988,333,22；Bazan和Fletterick Virology,1989,171,637-639；Gorbalenya等,Nucleic Acid Res.,1989,17,3889-3897)。类似地，瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS5B蛋白都具有RNA-指导的RNA聚合酶特有的基序(Koonin,E.V.和Dolja,V.V.,Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.1993,28,375-430)。
瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS蛋白在病毒生命周期中的实际作用和功能是直接类似的。在两种情况下，NS3丝氨酸蛋白酶负责ORF中在其位置下游的多蛋白前体的所有蛋白水解加工(Wiskerchen和Collett,Virology,1991,184,341-350；Bartenschlager等人,JVirol.1993,67,3835-3844；Eckart等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1993,192,399-406；Grakoui等人,J.Virol.1993,67,2832-2843；Grakoui等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA1993,90,10583-10587；Hijikata等人,J.Virol.1993,67,4665-4675；Tome等人,J.Virol,1993,67,4017-4026)。在两种情况下，NS4A蛋白起NS3丝氨酸蛋白酶的辅因子的作用(Bartenschlager等人,J Virol.1994,68,5045-5055；Failla等人,J.Virol.1994,68,3753-3760；Xu等人,J.Virol.,1997,71:5312-5322)。两种病毒的NS3蛋白还都起解旋酶的作用(Kim等人,Biochem。Biophys.Res.Comm.,1995,215,160-166；Jin和Peterson,Arch.Biochem.Biophys.,1995,323,47-53；Warrener和Collett,J.Virol.1995,69,1720-1726)。最后，瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS5B蛋白都具有预测的RNA-指导的RNA聚合酶活性(Behrens等人,EMBO,1996,15,12-22；Lechmann等人,J.Virol.,1997,71,8416-8428；Yuan等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.1997,232,231-235；Hagedorn,PCT WO97/12033；Zhong等人,J.Virol.,1998,72,9365-9369)。
目前，受到丙型肝炎病毒感染的个体具有有限的治疗选择。目前批准的治疗选择是，单独使用重组干扰素-α或联合使用干扰素-α与核苷类似物利巴韦林的免疫疗法。该疗法的临床有效性有限，且仅50％的受治疗的患者对治疗有响应。因此，非常需要更有效的和新颖的疗法来解决未得到满足的由HCV感染引起的医学需要。
现己鉴定了可用于药物开发作为抗-HCV治疗剂的直接作用性抗病毒药的许多潜在分子靶标，这些靶标包括(但不限于)：NS2-NS3自体蛋白酶(autoprotease)、N3蛋白酶、N3解旋酶和NS5B聚合酶。RNA-依赖性的RNA聚合酶是单链正义RNA基因组复制所绝对必需的，并且该酶已经引起了医药化学家的极大兴趣。
HCV NS5B的抑制剂作为HCV感染的潜在治疗剂已经综述在：Tan,S.-L.等人,Nature Rev.Drug Discov.,2002,1,867-881；Walker,M.P.等人,Exp.Opin.Investigational Drugs,2003,12,1269-1280；Ni,Z-J.等人,Current Opinionin Drug Discovery and Development,2004,7,446-459；Beaulieu,P.L.等人,CurrentOpinion in Investigational Drugs,2004,5,838-850；Wu,J.等人,Current DrugTargets-Infectious Disorders,2003,3,207-219；Griffith,R.C.等人,Annual Reportsin Medicinal Chemistry,2004,39,223-237；Carrol,S.等人,Infectious Disorders-Drug Targets,2006,6,17-29。出现抗性HCV毒株的可能性和鉴别具有广基因型覆盖度的药剂的需求支持了继续努力鉴别新颖的且更有效的作为HCV NS5B抑制剂的核苷的需要。
NS5B聚合酶的核苷抑制剂可以用作造成链终止的非天然底物，或用作与核苷酸竞争结合聚合酶的竞争性抑制剂。为起到链终止剂的作用，核苷类似物必须被细胞摄取，并在体内转化成三磷酸酯，以竞争聚合酶核苷酸结合位点。这种向三磷酸酯的转化通常由细胞激酶介导，所述细胞激酶对潜在的核苷聚合酶抑制剂提出了额外的结构要求。不幸的是，这将作为HCV复制抑制剂的核苷的直接评价局限至能原位磷酸化的基于细胞的测定法。
在有些情况下，核苷的生物活性受到将它转化成有活性的三磷酸酯形式所需的一种或多种激酶中的差底物特性的阻碍。核苷激酶形成单磷酸酯，通常被视作三磷酸化事件的限速步骤。为了回避核苷向有活性的三磷酸酯类似物代谢中的起始磷酸化步骤的需求，已经报道了稳定的磷酸酯前药的制备。已经显示，核苷氨基磷酸酯前药是有活性的核苷三磷酸酯的前体，且当施用至病毒感染的完整细胞时会抑制病毒复制(McGuigan,C等人,J.Med.Chem.,1996,39,1748-1753；Valette,G.等人,J.Med.Chem.,1996,39,1981-1990；Balzarini,J.等人,Proc.National Acad Sci USA,1996,93,7295-7299；Siddiqui,A.Q.等人,J.Med.Chem.,1999,42,4122-4128；Eisenberg,E.J.等人,Nucleosides,Nucleotidesand Nucleic Acids,2001,20,1091-1098；Lee,W.A.等人,Antimicrobial Agents andChemotherapy,2005,49,1898)；US2006/0241064；和WO2007/095269。
核苷作为可行治疗剂的实用性的另一个限制是，它们有时较差的物理化学的和药代动力学的性质。这些较差的性质可以限制药剂的肠吸收，并限制向靶组织或细胞中的摄取。为了改良它们的性质，已经采用了核苷的前药。已证明核苷氨基磷酸酯的制剂改善了核苷的系统吸收，并且此外，这些“前核苷酸(pronucleotide)”的氨基磷酸酯部分被中性亲脂基团掩蔽以获得合适的分配系数以优化被细胞的摄取和至细胞的转运，相对于单独母体核苷的施用，这极大地增强了核苷单磷酸酯类似物的胞内浓度。酶介导的磷酸酯部分的水解产生核苷单磷酸酯，其中不需要限速的初始磷酸化。为此目的，对应于WO2008/121634和US2010/0016251的美国专利申请12/053,015公开了大量氨基磷酸酯核苷前药，其中许多在HCV测定法中显示活性。测试了US2010/0016251中公开的几种化合物作为潜在的临床候选物以用于FDA批准。
发明概述
本文公开由式4表示的化合物和由式SP-4和RP-4表示的其相应的基于磷的非对映体。
附图简述
图1：4的高分辨率XRPD衍射图。
图2：RP-4的高分辨率XRPD衍射图。
图3：SP-4(形式1)的高分辨率XRPD衍射图。
图4：SP-4(形式1)的高分辨率XRPD衍射图。
图5：SP-4·CH2Cl2(形式2)的高分辨率XRPD衍射图。
图6：SP-4·CHCl3(形式3)的高分辨率XRPD衍射图。
图7：SP-4(形式4)的高分辨率XRPD衍射图。
图8：SP-4(形式5)的高分辨率XRPD衍射图。
图9：SP-4(无定形的)的高分辨率XRPD衍射图。
图10：SP-4(形式1)的X-射线晶体结构
图11：SP-4·CH2Cl2(形式2)的X-射线晶体(各向同性)结构
图12：SP-4·CH2Cl2(形式2)的X-射线晶体(各向异性)结构
图13：SP-4·CHCl3(形式3)的X-射线晶体结构
图14：4的FT-IR光谱。
图15：RP-4的FT-IR光谱。
图16：SP-4的FT-IR光谱
图17：4的TGA和DSC分析。
图18：RP-4的TGA和DSC分析。
图19：SP-4的TGA和DSC分析。
图20A：8(SP-异构体)(不对称单元的分子编号1)的X-射线晶体结构。
图20B：8(SP-异构体)(不对称单元的分子编号2)的X-射线晶体结构。
图21：SP-4(形式6)的高分辨率XRPD衍射图。
图22A：(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(不对称单元的分子编号1)的X-射线晶体结构。
图22B：(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(不对称单元的分子编号2)的X-射线晶体结构。
发明详述
定义
本文所用的短语“一(a)”或“一个(an)”实体是指一个或多个该实体；例如，一个化合物指一个或多个化合物或至少一个化合物。因此，术语“一(a)”(或“一个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
本文所用的术语“任选的”或“任选地”表示接下来描述的事件或情况可以但不一定发生，且该描述包括所述事件或情况发生和不发生的实例。例如，“任选的键”表示该键可以存在或不存在，并且该描述包括单键、双键或三键。
术语“P*”意指该磷原子是手性的，并且其具有相应的“R”或”S”Cahn-Ingold-Prelog命名，“R”或”S”具有它们所被接受的普通含义。
如本文所述的术语“纯化的”指给定化合物的纯度。例如，当化合物是组合物的主要组分，即至少50％w/w纯时，该给定化合物是“纯化的”。因此，“纯化的”涵盖至少50％w/w纯度、至少60％w/w纯度、至少70％纯度、至少80％纯度、至少85％纯度、至少90％纯度、至少92％纯度、至少94％纯度、至少96％纯度、至少97％纯度、至少98％纯度、至少99％纯度、至少99.5％纯度、和至少99.9％纯度，其中“大致纯的”涵盖至少97％纯度、至少98％纯度、至少99％纯度、至少99.5％纯度、和至少99.9％纯度。
如本文所述的术语“代谢物”指在向有相应需要的受试者施用后体内产生的化合物。
术语“约”(也由～表示)意指所述的数值是在标准实验误差内变化的范围的一部分。
措辞“大致如...所示“指定的XRPD模式意指XRPD模式中显示的峰位置在目测检查或手段内与选定的峰列表是大致相同的(±0.2°2θ)。普通技术人员理解强度可取决于样品而变化。
术语“大致无水的”意指物质含有按重量计至多10％的水、优选地按重量计至多1％的水、更优选地按重量计至多0.5％的水、和最优选地按重量计至多0.1％的水。
溶剂或反溶剂(如反应、结晶等或晶格和/或吸附溶剂中所用)包括C1至C8醇、C2至C8醚、C3至C7酮、C3至C7酯、C1至C2氯碳化合物、C2至C7腈、杂溶剂、C5至C12饱和烃、和C6至C12芳香烃中的至少一种。
C1至C8醇指具有所述碳原子数的直链/支链和/或环状/非环状醇。C1至C8醇包括(但不限于)甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、异丁醇、己醇、和环己醇。
C2至C8醚指具有所述碳原子数的直链/支链和/或环状/非环状醚。C2至C8醚包括(但不限于)二甲醚、二乙醚、二异丙醚、二正丁醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、四氢呋喃、和二噁烷。
C3至C7酮指具有所述碳原子数的直链/支链和/或环状/非环状酮。C3至C7酮包括(但不限于)丙酮(acetone)、甲基乙基酮、丙酮(propanone)、丁酮、甲基异丁基酮、甲基丁基酮、和环己酮。
C3至C7酯指具有所述碳原子数的直链/支链和/或环状/非环状酯。C3至C7酯包括(但不限于)乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸正丁酯等。
C1至C2氯碳化合物指具有所述碳原子数的氯碳化合物。C1至C2氯碳化合物包括(但不限于)氯仿、二氯甲烷(DCM)、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、和四氯乙烷。
C2至C7腈指具有所述碳原子数的腈。C2至C7腈包括(但不限于)乙腈、丙腈等。
杂溶剂指有机化学中经常使用的溶剂，其包括(但不限于)二乙二醇、二乙二醇二甲醚(diglyme)(二乙二醇二甲基醚)、1,2-二甲氧基乙烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、丙三醇、六甲基磷酰胺、六甲基磷三胺(hexamethylphosphorous triamide)、N-甲基-2-吡咯烷酮、硝基甲烷、吡啶、三乙胺、和乙酸。
术语C5至C12饱和烃指直链/支链和/或环状/非环状烃。C5至C12饱和烃包括(但不限于)正戊烷、石油醚(石油英)、正己烷、正庚烷、环己烷、和环庚烷。
术语C6至C12芳香烃指具有作为其主链的苯基基团的经取代的和未经取代的烃。优选的烃包括苯、二甲苯、甲苯、氯苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、二甲苯类，并且甲苯是更优选的。
如本文所用的术语“卤代”或”卤素”包括氯代、溴代、碘代和氟代。
术语“封端基团”指展示下列特征的化学基团。该“基团”衍生自“保护化合物”。该基团对伯羟基的选择性超过仲羟基、可以在与氨基磷酸酯(pH2-8)的稳定性一致的条件下加上并赋予所得产物显著不同的物理性质以允许更容易地分离3’-氨基磷酸酯-5’-新基团产物与未反应的期望化合物。该基团必须以良好收率选择性反应以产生对所述目标反应稳定的受保护的底物(参见Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1999)。基团的实例包括(但不限于)：苯甲酰基、乙酰基、苯基取代的苯甲酰基、四氢吡喃基、三苯甲基、DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-单甲氧基三苯甲基)、三甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基(pixyl)(9-苯基呫吨-9-基)基团、9-(9-苯基)硫代呫吨基(thiopixyl)(9-苯基硫代呫吨-9-基)或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)等；C(O)-烷基、C(O)Ph、C(O)芳基、CH2O-烷基、CH2O-芳基、SO2-烷基、SO2-芳基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基。缩醛(诸如MOM或THP和类似缩醛)被视为可能的基团。在氟化化合物可被连接至化合物并可通过穿过氟固相萃取介质()而选择性除去的范围内，还涵盖氟化化合物。具体实例包括氟化三苯甲基类似物、三苯甲基类似物l-[4-(1H,1H,2H,2H-全氟癸基)苯基)-1,1-二苯基甲醇。还涵盖三苯甲基、BOC、FMOC、CBz等的其他氟化类似物。磺酰氯(如对甲苯磺酰氯)可在5’位置选择性反应。可选择性形成酯诸如乙酸酯和苯甲酸酯。二羧基酸酐诸如琥珀酸酐和其衍生物可用于产生与游离羧酸的酯键，这种实例包括(但不限于)草酰基、丙二酰基、琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、庚二酰基(pimelyl)、辛二酰基(superyl)、壬二酰基(azelayl)、癸二酰基(sebacyl)、邻苯二甲酰基、异邻苯二甲酰基、对邻苯二甲酰基等。游离羧酸极大地增加极性并且还可用作将反应产物萃取到温和碱性水相(诸如碳酸氢钠溶液)的工具。氨基磷酸酯基团在酸性介质中是相对稳定的，所以还可使用需要酸性反应条件的基团(诸如四氢吡喃基)。
术语“保护基团”衍生自“保护化合物”，具有其常见和普通的含义，即至少一个保护或封端基团与至少一个官能团(如，-ΟΗ、-NH2等)结合，该官能团允许化学修饰至少一个其他官能团。保护基团的实例包括但不限于苯甲酰基、乙酰基、苯基取代的苯甲酰基、四氢吡喃基、三苯甲基、DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-单甲氧基三苯甲基)、三甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基(9-苯基呫吨-9-基)基团、9-(9-苯基)硫代呫吨基(9-苯基硫代呫吨-9-基)或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)等；C(O)-烷基、C(O)Ph、C(O)芳基、C(O)O(低级烷基)、C(O)O(低级亚烷基)芳基(如，-C(O)OCH2Ph)、C(O)O-芳基、CH2O-烷基、CH2O-芳基、SO2-烷基、SO2-芳基、包含至少一个硅原子的保护基团，诸如叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、Si(低级烷基)2OSi(低级烷基)2OH(诸如，-Si(iPr)2OSi(iPr)2OH。
如本文所用的且除非另外指明，术语“保护化合物”指含有“保护基团”并且能够与含有能够被保护的官能团的化合物反应的化合物。
如本文所用，术语“离去基团”对技术人员具有相同含义(Advanced OrganicChemistry:reactions,mechanisms and structure-第4版，Jerry March,John Wiley andSons Ed.；1992，第351-357页)，并表示为底物分子的一部分并与底物分子连接的基团；在底物分子经历置换反应(与例如亲核体)的反应中，则离去基团被置换。离去基团的实例包括(但不限于)：卤素(F、Cl、Br、和I)，优选为Cl、Br、或I；甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲基磺酸酯、乙酸酯、樟脑磺酸酯、芳族醚、和被至少一个吸电子基团取代的芳族醚(如，对硝基苯氧化物、2-氯苯氧化物、4-氯苯氧化物、2,4-二硝基苯氧化物、五氟苯氧化物等)等。术语“吸电子基团”在本文按照其常见含义。吸电子基团的实例包括(但不限于)卤素、NO2、-C(O)(低级烷基)、-C(O)(芳基)、-C(O)O(低级烷基)、-C(O)O(芳基)等。
如本文所用，术语“碱性试剂”意指能够使羟基基团脱质子化的化合物。碱性试剂的实例包括(但不限于)与醇试剂组合的(低级烷)氧化物((低级烷基)OM)，其中(低级烷)氧化物包括(但不限于)MeO-、EtO-、nPrO-、iPrO-、tBuO-、iAmO-(异戊基氧化物)等，并且其中M是碱金属阳离子，诸如Li+、Na+、K+等。醇溶剂包括(低级烷基)OH，诸如，例如MeOH、EtOH、nPrOH、iPrOH、tBuOH、iAmOH等。也可使用非烷氧基键，诸如氢化钠、六甲基二硅氮烷钠、六甲基二硅氮烷锂、二异丙基酰胺锂、氢化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、DBU、DBN、格氏试剂，诸如(低级烷基)Mg(卤素)，其包括但不限于MeMgCl、MeMgBr、tBuMgCl、tBuMgBr等。
术语“碱”涵盖术语“碱性试剂”，并意指能够使含质子化合物脱质子化的化合物，即碱。除了以上所述的实例以外，碱的进一步实例包括但不限于吡啶、三甲吡啶、2,6-(低级烷基)-吡啶、二甲基-苯胺、咪唑、N-甲基-咪唑、吡唑、N-甲基-吡唑、三乙胺、二异丙基乙胺等。
术语“非亲核性碱”意指能够作为碱起作用、但具有低亲核性的化合物。非亲核性碱的实例包括(但不限于)碳酸钾、碳酸铯、二异丙胺、二异丙基乙胺、三乙胺、奎宁环、萘-1,8-二胺、2,2,6,6-四甲基哌啶、1,8-二氮杂双环十一-7-烯、4-二甲基氨基-吡啶、吡啶、2,6-二-C1-6-烷基-吡啶、2,4,6-三-C1-6-烷基-吡啶、l,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯、和1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。
术语“吸电子基团”根据其常见含义。吸电子基团的实例包括但不限于卤素(F、Cl、Br、或I)、-NO2、-C(O)(低级烷基)、-C(O)(芳基)、-C(O)O(低级烷基)、C(O)O(芳基)等。
术语“共结晶物”包括与盐组合的4、RP-4、或SP-4的共结晶物，所述盐涵盖药学上可接受的盐。
如本文所述，术语“盐”指包含阳离子和阴离子的化合物，其可通过接受质子的部分的质子化和/或贡献质子的部分的脱质子化产生。应注意，接受质子的部分的质子化导致形成其中电荷被生理阴离子的存在平衡的阳离子物类，而贡献质子的部分的脱质子化导致形成其中电荷被生理阳离子的存在平衡的阴离子物类。
短语“药学上可接受的盐”意指在药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：(1)酸加成盐，与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与有机酸诸如乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、水杨酸、粘康酸等，或(2)与以上所列的无机酸中的任何一种的共轭碱形成的碱加成盐，其中共轭碱包含选自Na+、K+、Mg2+、Ca2+、NHgR”’4-g +，其中R”’是C1-3烷基而g是选自0、1、2、3、或4的数。应理解，所有提及的药学上可接受的盐包括相同酸加成盐的如本文所定义的溶剂加成形式(溶剂化物)或晶形(多晶型物)。
术语“烷基”是指直链的或支链的、饱和的单价烃残基，其含有1-30个碳原子。术语“C1-M烷基”是指包含1至M个碳原子的烷基，其中M是具有下述值的整数：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。术语“C1-4烷基”是指含有1-4个碳原子的烷基。术语“低级烷基”表示包含1-6个碳原子的直链或支链烃残基。本文所用的“C1-20烷基”是指包含1-20个碳原子的烷基。本文所用的“C1-10烷基”是指包含1-10个碳的烷基。烷基的实例包括(但不限于)：低级烷基基团，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基和辛基。术语(芳)烷基或(杂芳基)烷基是指分别被芳基或杂芳基任选地取代的烷基。
术语“烯基”是指具有2-10个碳原子且具有1个或2个烯双键(优选1个烯双键)的未取代的烃链原子团。术语“C2-N烯基”是指包含2-N个碳原子的烯基，其中N是具有下述值的整数：3、4、5、6、7、8、9或10。术语“C2-10烯基”是指包含2-10个碳原子的烯基。术语“C2-4烯基”是指包含2-4个碳原子的烯基。实例包括但不限于：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)或2-丁烯基(巴豆基)。
除非另有说明，本文所用的术语“芳基”是指取代的或未取代的苯基(Ph)、联苯基或萘基，优选地，术语芳基是指取代的或未取代的苯基。芳基可以被选自下述的一个或多个部分取代：羟基、F、Cl、Br、I、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯、膦酸、磷酸酯或膦酸酯，该基团未被保护或在需要时保护，正如本领域技术人员所知，例如，如在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis，”第3版，John Wiley&Sons，1999中所教导。
如本文所用且除非另外指明，术语“芳族醚”指经取代的或未经取代的苯氧化物(PhO-)、对苯基-苯氧化物(p-Ph-PhO-)、或萘氧化物，优选地术语芳族醚指经取代的或未经取代的苯氧化物。芳族醚基团可以被选自下述的一个或多个部分取代：羟基、F、Cl、Br、I、-C(O)(低级烷基)、-C(O)O(低级烷基)、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯、膦酸、磷酸酯或膦酸酯，该基团未被保护或在需要时保护，正如本领域技术人员所知，例如，如在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in OrganicSynthesis，”第3版，John Wiley&Sons，1999中所教导。
术语“制剂”或“剂型”应包括活性化合物的固体和液体制剂，本领域技术人员会理解，根据所需剂量和药代动力学参数，活性成分可存在于不同的制剂中。
本文所用的术语“赋形剂”指用于制备药物组合物的化合物，该化合物通常安全、无毒并且既不是生物学不期望的又不是其它方面不期望的，且包括适合于兽医学应用以及人药用的赋形剂。
术语“结晶”指其中SP-4或RP-4的固体样品在通过X-射线粉末衍射或单晶X-射线技术测定时具有晶体特征的情形。
术语“晶体样”指以下情形：其中SP-4或RP-4的固体样品在通过一种手段，如目测或通过光学显微术或偏光显微术测定时具有晶体特征，但是在通过另一手段如x-射线粉末衍射测定时没有晶体特征。通过目测或通过光学显微术或偏光显微术测定测定固体样品的结晶性的视觉方法公开于USP<695>和<776>，二者均通过引用并入。“晶体样”的SP-4或RP-4固体样品在某些条件下可以是结晶的，但在处于其他条件是可以是非结晶的。
术语“无定形的”指SP-4或RP-4固体样品既不是结晶的也不是晶体样的情形。
实施方案
第一实施方案涉及由式4表示的化合物:
其中P*表示手性磷原子。由于该手性磷原子，由式4表示的化合物包含两个命名为RP-4和SP-4的非对映体。由式4表示的化合物还可以是溶剂化物、水化物、或混合的溶剂化物/水化物的一部分。溶剂化物命名为4·nS，而水化物命名为4·mH2O，其中S是晶格溶剂，n是在约0至约3变化的整数或非整数量，且m是在约0至约5变化的整数或非整数量。最后，由式4表示的化合物可不作为溶剂化物或水化物存在，而是具有某一有利量的吸附的溶剂(S)或水。在该情形下，S或水的量可在基于由式4表示的化合物的重量的约0wt.％至约10wt.％变化。由式4表示的化合物和其溶剂化物和其水化物是结晶的、晶体样的、或无定形的。
第二实施方案涉及由式RP-4表示的化合物：
由式RP-4表示的化合物也可以是溶剂化物、水化物、或混合的溶剂化物/水化物的一部分。溶剂化物命名为RP-4·nS，而水化物命名为SP-4·mH2O，其中S是晶格溶剂，n是在约0至约3变化的整数或非整数量，且m是在约0至约5变化的整数或非整数量。最后，由式RP-4表示的化合物可不作为溶剂化物或水化物存在，而是具有某一有利量的吸附的溶剂(S)、水、或S和水二者。在该情形下，S或水的量可在基于由式RP-4表示的化合物的重量的约0wt.％至约10wt.％变化。由式RP-4表示的化合物和其溶剂化物和其水化物是结晶的、晶体样的、或无定形的。
第二实施方案的第一方面涉及结晶RP-4。
第二实施方案的第二方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶RP-4：6.6、7.1、9.0、11.6、17.9、20.7、24.1、24.4、和26.2。
第二实施方案的第三方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶RP-4：6.6、7.1、9.0、11.0、11.6、12.0、16.0、17.9、19.6、20.7、21.0、21.7、21.9、22.2、23.1、24.1、24.4、26.1、27.3、27.7、和28.2。
第二实施方案的第四方面涉及具有大致如图2所示的XRPD衍射模式的结晶RP-4。
第二实施方案的第五方面涉及RP-4具有以下FT-IR峰(cm-1)的：1742、1713、1679、1460、1377、1259、1157、和1079。
第二实施方案的第六方面涉及具有大致如图15中所示的FT-IR光谱的RP-4。
第二实施方案的第七方面涉及大致纯的RP-4。
第二实施方案的第八方面涉及大致纯的结晶RP-4。
第二实施方案的第九方面涉及大致纯的无定形的RP-4。
第三实施方案涉及由式SP-4表示的化合物：
由式SP-4表示的化合物还可以是溶剂化物、水化物、或混合的溶剂化物/水化物的一部分。溶剂化物命名为SP-4·nS，而水化物命名为SP-4·mH2O，其中S是晶格溶剂，n是在约0至约3变化的整数或非整数量，且m是在约0至约5变化的整数或非整数量。最后，由式SP-4表示的化合物可不作为溶剂化物或水化物存在，而是具有某一有利量的吸附溶剂(S)或水。在该情形下，S或水的量可在基于由式SP-4表示的化合物的重量的约0wt.％至约10wt.％变化。由式SP-4表示的化合物和其溶剂化物和其水化物是结晶的、晶体样的、或无定形的。
第三实施方案的第一方面涉及结晶SP-4。
第三实施方案的第二方面涉及单斜晶SP-4，优选地具有以下单元晶胞参数：和β～92.05°。
第三实施方案的第三方面涉及单斜晶SP-4，优选地具有以下单元晶胞参数：和β～112.29°。
第三实施方案的第四方面涉及单斜晶SP-4，优选地具有以下单元晶胞参数：和β～91.75°。
第三实施方案的第五方面涉及单斜晶SP-4，优选地具有以下单元晶胞参数：和β～96.40°。
第三实施方案的第六方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶SP-4：5.2、7.5、9.6、16.7、18.3、22.2。
第三实施方案的第七方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶SP-4：5.0、7.3、9.4、和18.1。
第三实施方案的第八方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶SP-4：4.9、6.9、9.8、19.8、20.6、24.7、和26.1。
第三实施方案的第九方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶SP-4：6.9、9.8、19.7、20.6、和24.6。
第三实施方案的第九方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶SP-4：5.0、6.8、19.9、20.6、20.9、和24.9。
第三实施方案的第十方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶SP-4：5.2、6.6、7.1、15.7、19.1、和25.0。
第三实施方案的第十一方面涉及具有约以下的XRPD2θ-反射(°)的结晶SP-4：6.1、8.2、10.4、12.7、17.2、17.7、18.0、18.8、19.4、19.8、20.1、20.8、21.8、和23.3。
第三实施方案的第十二方面涉及具有大致如图3、图4、图5、图6、图7、图8、和图21中的任一项所示的XRPD衍射模式的结晶SP-4。
第三实施方案的第十三方面涉及具有约以下FT-IR峰(cm-1)的SP-4：1743、1713、1688、1454、1378、1208、和1082。
第三实施方案的第十四方面涉及具有大致如图7中所示的FT-IR光谱的SP-4。
第三实施方案的第十五方面涉及大致纯的SP-4。
第三实施方案的第十六方面涉及大致纯的结晶SP-4。
第三实施方案的第十七方面涉及大致纯的无定形的SP-4。
剂量、施用、和用途
第四实施方案涉及使用化合物4、RP-4、或SP-4中的任一种治疗和/或预防任何病毒病原体的组合物。可能的病毒病原体包括(但不限于)：丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、登革病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、日本脑炎病毒、或属于瘟病毒、丙型肝炎病毒、或黄病毒的组的那些病毒。
该实施方案的一方面涉及用于治疗本文公开的任何病毒病原体的组合物。所述组合物包含选自赋形剂、运载体、稀释剂和等同介质的药学上可接受的介质，和化合物4、RP-4、或SP-4中的任一种，意图包括其水化物、溶剂化物、和化合物4、RP-4、或SP-4或其水化物和其溶剂化物的任何一种的任何结晶形式。
可将化合物4、RP-4、或SP-4配制在多种口服施用剂型和载体中。口服施用可以是片剂、包衣片剂、硬和软明胶胶囊剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或混悬剂等形式。当采用栓剂施用等其它施用途径给予时，化合物4、RP-4、或SP-4也是有效的。最方便的施用方式一般是采用方便的每日施用方案的口服施用，该方案可根据疾病的严重程度及患者对抗病毒药物的反应而作出调整。
可将化合物4、RP-4、或SP-4与一种或多种常规赋形剂、载体或稀释剂一起配制成药物组合物和单位剂量的形式。所述药物组合物和单位剂型可以包含惯用比例的常规成分，可以含或不含其它活性化合物，并且该单位剂型可包含与要使用的预期每日剂量范围相当的任何合适有效量的活性成分。对于口服施用，所述药物组合物可以是固体(例如片剂或填充的胶囊剂)、半固体、散剂、缓释制剂或液体(如混悬剂、乳剂)或填充胶囊的形式；或者，对于直肠或阴道施用，可以是栓剂形式。典型的制剂可含有约5％到约95％的一种或多种活性化合物(w/w)。
可单独施用化合物4、RP-4、或SP-4，但通常与根据预期施用途径和标准药学实践而选择的一种或多种合适的药学赋形剂、稀释剂或载体混合施用。
固体形式制剂包括，例如，散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂和可分散粒剂。固体载体可以是还可用作稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或封装材料的一种或多种物质。在散剂中，载体通常是精细分级的固体，其是含精细分级的活性组分的混合物。在片剂中，活性组分通常与适当比例的具有所需结合能力的载体混合，并压缩成所需形状和大小。合适的载体包括但不限于：碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。除了活性组分以外，固体形式制剂还可以含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、稠化剂、增溶剂等。固体制剂的实例在以下中例证：EP0524579；US2002/0142050；US2004/0224917；US2005/0048116；US2005/0058710；US2006/0034937；US2006/0057196；US2006/0188570；US2007/0026073；US2007/0059360；US2007/0077295；US2007/0099902；US2008/0014228；US6,267,985；US6,294,192；US6,383,471；US6,395,300；US6,569,463；US6,635,278；US6,645,528；US6,923,988；US6,932,983；US7,060,294；和US7,462,608，其中的每一篇通过引用并入。
液体制剂也适合于口服施用，液体制剂包括乳剂、糖浆剂、酏剂和水性混悬剂。这些制剂包括预期在使用前不久转换成液体形式制剂的固体形式制剂。在美国专利号3,994,974、5,695,784和6,977,257中，例证了液体制剂的实例。乳液可制成溶液剂(例如丙二醇水溶液)，或可含有乳化剂(例如卵磷脂、去水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶)。通过将精细分级的活性组分分散在含粘性物质的水中，可以制备水性混悬液，所述粘性物质例如天然或合成的胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它熟知的悬浮剂。
可将化合物4、RP-4、或SP-4独立地配制成作为栓剂施用。首先熔化低熔点蜡，例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，随后例如通过搅拌，使活性组分均匀分散。然后将融化的均匀混合物倒入方便尺寸的模具中，冷却并固化。
可将化合物4、RP-4、或SP-4独立地配制成用于阴道给药。本领域己知，除活性组分以外，还含有载体的阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂是合适的。这些制剂中的某些制剂还可与含或不含杀精剂的避孕套联合使用。
合适制剂以及药物载体、稀释剂和赋形剂的描述在Remington：The Science andPractice of Pharmacy1995，E.W.Martin编辑，Mack Publishing Company，第19版，Easton，Pennsylvania，其通过引用并入本文。熟练的制剂科学家可在本说明书的指导内改进所述制剂，以提供用于特定施用途径的许多制剂，而不会使得含有本文涵盖的化合物的组合物不稳定或损害其治疗活性。
另外，纯化的化合物4、RP-4、或SP-4可以独立地与脂质体或胶束一起配制。关于脂质体，预见到，可以以在美国专利号4,797,285；5,013,556；5,077,056；5,077,057；5,154,930；5,192,549；5,213,804；5,225,212；5,277,914；5,316,771；5,376,380；5,549,910；5,567,434；5,736,155；5,827,533；5,882,679；5,891,468；6,060,080；6,132,763；6,143,321；6,180,134；6,200,598；6,214,375；6,224,903；6,296,870；6,653,455；6,680,068；6,726,925；7,060,689；和7,070,801(它们中的每一篇通过引用并入)中公开的方式配制纯化的化合物。关于胶束，预见到，可以以在美国专利号5,145,684和5,091,188(它们二者通过引用并入)中公开的方式配制纯化的化合物。
第五实施方案涉及化合物4、RP-4、或SP-4在药物制备中的应用，所述药物用于治疗任一种下述病毒性病原体的感染造成的任意病症：丙型肝炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、登革病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和日本脑炎病毒。
术语“药物”是指在需要它的受试者的治疗和/或预防方法中使用的物质，其中所述物质包括(但不限于)：包含化合物4、RP-4、或SP-4中的任一种的组合物、制剂、剂型等。预见到，在用于制备治疗本文公开的任一种抗病毒病状(antiviral condition)的药物中使用化合物4、RP-4、或SP-4中的任一种，它是单独的或与本发明的另一种化合物相组合。药物包括但不限于本文公开的第四个实施方案预见到的任一种组合物。
第六实施方案涉及治疗和/或预防需要它的受试者的方法，所述方法包括，将治疗有效量的化合物4、RP-4、或SP-4中的任一种施用至受试者。
需要它的受试者意指这样的受试者，其具有由本文公开的任一种病毒性病原体的感染造成的任意病症，所述病毒性病原体包括但不限于：丙型肝炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、登革病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒或日本脑炎病毒、黄病毒科病毒或瘟病毒或丙型肝炎病毒或造成与任一种上面列出的病毒等同或相当的症状的病毒性病原体。
术语“受试者”是指哺乳动物，其包括(但不限于)：牛、猪、绵羊、鸡、火鸡、水牛、美洲驼、鸵鸟、狗、猫和人，优选地，受试者是人。预见到，在第九实施方案的治疗需要它的受试者的方法中，可以是本文预见到的任何化合物，它是单独的或与本文公开的另一种化合物相组合。
本文所用的术语“治疗有效量”是指减轻个体的疾病症状所需的量。在各种具体情况中，可按个体需要调整剂量。该剂量可以在宽限度内变化，这取决于许多因素，例如待治疗疾病的严重程度、患者的年龄和一般健康状况、治疗患者的其它药物、施用途径和形式以及有关医师的偏好和经验。对于口服施用，在单一疗法和/或组合疗法中，每天约0.001至约10g的日剂量应是适宜的，包括其间的所有值，例如0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.050、0.075、0.1、0.125、0.150、0.175、0.2、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9和9.5。具体的日剂量是每天约0.01至约1g，包括其间的所有0.01g(即，10mg)的增加值，优选日剂量每天约0.01至约0.8g、更优选每天约0.01至约0.6g、最优选每天约0.01至约0.25g，它们每个包括其间的所有0.01g增加值。通常，治疗从大起始“负荷剂量”开始，以快速减少或消除病毒，然后将剂量降低至足以防止感染复发的水平。普通技术人员在治疗本文所述疾病时无需过多实验，只依靠知识、经验和本申请的内容，即能确定本文公开的化合物对于给定的疾病和患者的治疗有效量。
从肝功能检验可确定疗效，所述检验包括(但不限于)：蛋白水平，例如血清蛋白(如白蛋白、凝血因子、碱性磷酸酶、氨基转移酶(如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酸)、5'-核苷酶、γ-谷氨酰胺酰基转肽酶等)、胆红素的合成、胆固醇的合成和胆汁酸的合成；肝代谢功能，包括(但不限于)碳水化合物代谢、氨基酸和氨代谢。或者，可通过检测HCV-RNA来监测疗效。这些检验的结果可用于优化剂量。
第六实施方案的第一方面涉及治疗和/或预防需要它的受试者的方法，所述方法包括，给予所述受试者治疗有效量的由化合物4、RP-4、或SP-4中的任一种表示的化合物和治疗有效量另一种抗病毒剂；其中所述施用是同时的或交替的。应当理解，交替施用之间的时间范围可以是1-24小时，包括其间的任意子范圉，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23小时。
“另一种抗病毒剂”的实例包括但不限于：HCV NS3蛋白酶抑制剂(参见EP1881001、US2003187018、US2005267018、WO2003006490、WO200364456、WO2004094452、WO2005028502、WO2005037214、WO2005095403、WO2007014920、WO2007014921、WO2007014922、WO2007014925、WO2007014926、WO2007015824、WO2008010921、和WO2008010921)；HCV NS5B抑制剂(参见US2004229840、US2005154056、US2005-98125、US20060194749、US20060241064、US20060293306、US2006040890、US2006040927、US2006166964、US2007275947、US6784166、US20072759300、WO2002057287、WO2002057425、WO2003010141、WO2003037895、WO2003105770、WO2004000858、WO2004002940、WO2004002944、WO2004002977、WO2004003138、WO2004041201、WO2004065367、WO2004096210、WO2005021568、WO2005103045、WO2005123087、WO2006012078、WO2006020082、WO2006065335、WO2006065590、WO2006093801、WO200702602、WO2007039142、WO2007039145、WO2007076034、WO2007088148、WO2007092000、和WO2007095269)；HCV NS4抑制剂(参见WO2005067900和WO2007070556)；HCV NS5a抑制剂(参见US2006276511、WO2006035061、WO2006100310、WO2006120251、和WO2006120252)；Toll-样受体激动剂(参见WO2007093901)；和其他抑制剂(参见WO2000006529、WO2003101993、WO2004009020、WO2004014313、WO2004014852、和WO2004035571)；和2008年3月21日提交的美国专利申请第12/053,015号(US2010/0016251)(其内容通过引用并入)中公开的化合物、干扰素-α、干扰素-β、聚乙二醇化的干扰素-α、利巴韦林、左旋韦林(levovirin)、韦拉米啶(viramidine)、另一核苷HCV聚合酶抑制剂、HCV非核苷聚合酶抑制剂、HCV蛋白酶抑制剂、HCV解旋酶抑制剂或HCV融合抑制剂。
当与另一种抗病毒剂组合地给予化合物4、RP-4、或SP-4中的任一种时，活性可能会升高超过母体化合物。当治疗是联合疗法时，这种施用可以与所述核苷衍生物的施用同时或先后进行。因此，本文所用的“同时施用”包括在同一时间或在不同时间给予这些药物。通过含有两种或更多种活性成分的单一制剂，或通过基本上同时给予含有一种活性剂的两种或更多种剂型，可以实现同时给予两种或更多种药剂。
应该理解，本文述及的治疗延伸至对已有病症的预防以及治疗。此外，本文所用的术语HCV感染的“治疗”还包括与HCV感染有关的或由其介导的疾病或病症或其临床症状的治疗或预防。
制剂
第七实施方案涉及制备化合物4、RP-4、或SP-4中的任一种的方法，所述方法包含：a)使丙氨酸异丙酯A、二-LG-苯基磷酸酯B、2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷3和碱反应，以获得包含SP-4和RP-4中的任何一种的第一混合物
其中X是酸的共轭碱，n是0或1，和LG是离去基团；b)使第一混合物与保护化合物反应，以获得包含经保护的SP-4和经保护的RP-4中的至少一种的第二混合物；和c)任选地将第二混合物进行结晶、层析、或萃取以获得4、SP-4、或RP-4。
在第七实施方案的第一方面中，丙氨酸异丙酯以它的盐酸盐存在，其优选地是大致无水的。
在第七实施方案的第二方面中，碱是N-甲基咪唑。
在第七实施方案的第三方面中，A-比-B-比-3的摩尔比是约1.6-比-1.3-比-1。
在第七实施方案的第四方面中，保护化合物是叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物。
第八实施方案涉及制备SP-4或RP-4的方法，所述方法包含：a)使丙氨酸异丙酯A、二-LG-苯基磷酸酯B、2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷3和碱反应，以获得包含SP-4和RP-4中的任何一种的第一混合物
其中X是酸的共轭碱，n是0或1，和LG是离去基团；和b)任选地将第二混合物结晶、层析、或萃取以获得纯化的SP-4或RP-4。
用于制备RP-4的第八实施方案的第一方面另外包括通过以下进一步纯化第二混合物或纯化的RP-4：在溶剂中溶解或悬浮第二混合物或纯化的RP-4混合物；任选地接着以结晶RP-4引晶；和加入足量的反溶剂以获得结晶RP-4。
用于制备SP-4的第八实施方案的第二方面另外包括通过以下进一步纯化第二混合物或纯化的SP-4：d)在溶剂中溶解或悬浮第二混合物或纯化的SP-4，接着在约室温下以结晶SP-4引晶；收集第一固体，其绝大部分包含SP-4；将第一固体在其回流温度下溶解在溶剂中；和冷却或加入反溶剂以获得第二固体。
用于制备SP-4的第八实施方案的第三方面另外包括通过以下进一步纯化SP-4：d)将第二混合物或纯化的SP-4混合物溶解或悬浮在第一溶剂中，接着加入反溶剂以获得第一组合物，其中通过倾析除去残余的溶剂/反溶剂以获得残余物；用含有第一溶剂和反溶剂的溶液处理残余物以产生第二组合物，由此减压获得第一固体；使用第二溶剂溶解或悬浮第一固体以获得第三组合物；加入SP-4的种晶到第三组合物；收集第二固体；将第二固体溶解或悬浮在第三溶剂中，任选地加热至第三溶剂的回流温度，以获得第四组合物，和，如果必要，冷却第四组合物以获得包含SP-4的第三固体，其通过过滤收集。
在用于制备SP-4的第八实施方案的第四方面中，SP-4通过以下由第二混合物或纯化的SP-4进一步纯化：d)加入硅胶到第二混合物或纯化的SP-4，接着溶剂蒸发以获得干燥浆状物；在第一溶剂/反溶剂组合中搅拌干燥浆状物以获得第一湿润浆状物；从第一湿润浆状物倾析第一溶剂/反溶剂组合以获得第二湿润浆状物和第一组合物；向第二湿润浆状物加入第二溶剂/反溶剂组合，接着搅拌；从第二湿润浆状物倾析第二溶剂/反溶剂组合以获得第三湿润浆状物和第二组合物；任选地对第三湿润浆状物或其他湿润浆状物重复步骤g)-h)；从第二组合物和任选地从任选的步骤i)获得的任何其他组合物蒸发溶剂以获得第一固体；将第一固体溶解或悬浮在含有第三溶剂和任选地第四溶剂的溶液中以获得第三组合物；任选地向第三组合物加入SP-4的种晶；从第三组合物获得包含SP-4的第二固体；和任选地使用第三溶剂重结晶第二固体以获得包含SP-4的第三固体。
普通技术人员将理解，化合物可通过传统的萃取、传统的结晶或传统的层析技术分离。传统的层析技术包括但不限于在硅胶上层析(使用，如于DCM中的3-5％甲醇或于DCM中的4-6％异丙醇)以产生一种异构体的增强水平(50-100％)，然后将其结晶。可选地，技术人员可使用反相层析(使用，如，1-30％乙腈-含水流动相)。此外，化合物可通过超临界流体层析SFC分离，以二氧化碳作为主溶剂和醇类诸如甲醇作为改性剂，优选地使用适当的手性介质，诸如Daicel Chiralpack IA。可选地，可采用SMB层析，优选地使用适当的手性介质，诸如Daicel Chiralpack IA，使用溶剂的混合物诸如己烷/异丙醇或单一溶剂诸如乙酸乙酯。
第九实施方案涉及制备SP-4的方法，所述方法包含：a)使异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯与3’-O-经保护的或未经保护的3、和碱性试剂反应以获得包含经保护的或未经保护的SP-4的组合物
其中异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯主要由由以下结构表示的非对映体的混合物构成：
其中C:C’的比值是约1:1。
在第一方面中，碱性试剂是氯化叔丁基镁和C:C’的比值是大于或等于约1:1。
在第二方面中，碱性试剂是氯化叔丁基镁和C:C’的比值大于约1:1。
在第三方面中，碱性试剂是氯化叔丁基镁和C:C’的比值是至少约1.5:1、约2.3:1、约4:1、约5.7:1、约9:1、约19:1、约32.3:1、约49:1、或约99:1。
在第四方面中，LG’选自2,4-二硝基苯氧化物、4-硝基苯氧化物、2-硝基苯氧化物、2-氯代-4-硝基苯氧化物、2,4-二氯苯氧化物、和五氟苯氧化物，碱性试剂是氯化叔丁基镁且C:C’的比值是至少约1.5:1、约2.3:1、约4:1、约5.7:1、约9:1、约19:1、约32.3:1、约49:1、或约99:1。
制备SP-4的第五方面包含：a)使异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯(C)与3’-O-经保护的或未经保护的3、和碱性试剂反应以获得包含经保护的或未经保护的SP-4的组合物
其中Z是保护基团或氢；LG’是离去基团；和b)任选地将获得的经保护的或未经保护的SP-4进行层析、萃取、或结晶以获得纯化的经保护的或未经保护的SP-4。在子实施方案中，LG’是甲苯磺酸酯、樟脑磺酸酯、或被至少一个吸电子基团取代的芳族醚；更优选地，LG’选自2,4-二硝基苯氧化物、4-硝基苯氧化物、2-硝基苯氧化物、2-氯代-4-硝基苯氧化物、2,4-二氯苯氧化物、或五氟苯氧化物。在另外的子实施方案中，当SP-4是经保护的，即Z不是氢时，第九实施方案的方法还涉及将经保护的SP-4去保护。在另外的子实施方案中，反应在以下中进行：极性非质子溶剂(诸如四氢呋喃)或另一醚溶剂，单独或彼此组合或与C2至C7腈(诸如乙腈)组合。
第九实施方案的方法还包含1)使(LG’)P(O)(LG)2，其中独立于LG’的LG为离去基团，与(i)丙氨酸异丙酯和第一碱反应，以获得(LG’)P(O)(LG)(NHAla-iPr)，接着使(LG’)P(O)(LG)(NHAla-iPr)与苯酚和第二碱反应，以获得包含C和C’的混合物，(ii)苯酚和第一碱反应，以获得(LG’)P(O)(LG)(OPh)，接着使(LG’)P(O)(LG)(OPh)与丙氨酸异丙酯和第二碱反应，以获得包含C和C’的混合物，或(iii)组合的丙氨酸异丙酯、苯酚、和至少一个碱反应，以获得包含C和C’的混合物；或2)使(PhO)P(O)(LG)2(其中LG是离去基团)与(i)丙氨酸异丙酯和第一碱反应，以获得(PhO)P(O)(LG)(NHAla-iPr)，接着使(PhO)P(O)(LG)(NHAla-iPr)与离去基团前体(LG’H)和第二碱反应，以获得包含C和C’的混合物，
并将混合物进行层析或将混合物结晶以获得C。在第九实施方案的方面中，丙氨酸异丙酯以其盐酸盐存在，其优选地是大致无水的。
第十实施方案涉及制备RP-4的方法，所述方法包含：a)使异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯与3’-O-经保护的或未经保护的3、和碱性试剂反应以获得包含经保护的或未经保护的RP-4的组合物
其中异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯主要由由以下结构表示的非对映体的混合物构成：
其中C’:C的比值是约1:1。
在第一方面中，碱性试剂是氯化叔丁基镁和C’:C的比值是大于或等于约1:1。
在第二方面中，碱性试剂是氯化叔丁基镁和C’:C的比值是大于约1:1。
在第三方面中，碱性试剂是氯化叔丁基镁和C’:C的比值是至少约1.5:1、约2.3:1、约4:1、约5.7:1、约9:1、约19:1、约32.3:1、约49:1、或约99:1。
第四方面，LG’是对硝基苯氧化物，碱性试剂是氯化叔丁基镁，和C’:C的比值是至少约1.5:1、约2.3:1、约4:1、约5.7:1、约9:1、约19:1、约32.3:1、约49:1、或约99:1。
制备RP-4的第五方面包含：a)使异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯(C’)与3’-O-经保护的或未经保护的3、和碱性试剂反应以获得包含经保护的或或未经保护的RP-4的组合物
其中Z是保护基团或氢；LG’是离去基团；和b)任选地将获得的经保护的或未经保护的RP-4进行层析、萃取、或结晶以获得纯化的经保护的或未经保护的RP-4。在子实施方案中，LG’是甲苯磺酸酯、樟脑磺酸酯、或被至少一个吸电子基团取代的芳族醚；更优选地，LG’选自对硝基苯氧化物、2,4-二硝基苯氧化物、和五氟苯氧化物。在另外的子实施方案中，当RP-4是经保护的，即Z不是氢时，第九实施方案的方法还涉及将经保护的RP-4去保护。在另外的子实施方案中，反应在以下中进行：极性非质子溶剂(诸如四氢呋喃)或另一醚溶剂，单独或彼此组合或与C2至C7腈(诸如乙腈)组合。
第十实施方案的方法还包含1)使(LG’)P(O)(LG)2，其中独立于LG’的LG为离去基团，(i)与丙氨酸异丙酯和第一碱反应，以获得(LG’)P(O)(LG)(NHAla-iPr)，接着使(LG’)P(O)(LG)(NHAla-iPr)与苯酚和第二碱反应以获得包含C和C’的混合物，(ii)与苯酚和第一碱反应以获得(LG’)P(O)(LG)(OPh)，接着使(LG’)P(O)(LG)(OPh)与丙氨酸异丙酯和第二碱反应，以获得包含C和C’的混合物，或(iii)与组合的丙氨酸异丙酯、苯酚、和至少一个碱反应，以获得包含C和C’的混合物；或2)使(PhO)P(O)(LG)2(其中LG’独立于LG是离去基团)与(i)丙氨酸异丙酯和第一碱反应以获得(PhO)P(O)(LG)(NHAla-iPr)，接着使(PhO)P(O)(LG)(NHAla-iPr)与离去基团前体和第二碱反应，以获得包含C和C’的混合物
并将混合物进行层析或将混合物结晶以获得C’。在第九实施方案的方面中，丙氨酸异丙酯以其盐酸盐存在，其优选地是大致无水的。。
第十一实施方案涉及通过第七实施方案、第八实施方案、第九实施方案或第十实施方案以及其各自的方面中所述的方法获得的组合物。第十一实施方案的方面涉及通过以下公开的任一示例性实施方案获得的组合物。如此获得的组合物可以是结晶的、晶体样的、无定形的、或其组合。
第十二实施方案涉及化合物3
其中Z是保护基团或氢；其对于制备RP-4或SP-4是有用的。
第十二实施方案的第一方面选自具有以下结构的化合物
第十三实施方案涉及由以下结构表示的化合物、其盐、水化物、溶剂化物、或其组合
其中LG’是离去基团，其对于制备RP-4或SP-4是有用的。
在第十三实施方案的第一方面中，LG’是甲苯磺酸酯、樟脑磺酸酯、芳族醚、或被至少一个吸电子基团取代的芳族醚。
在第十三实施方案的第二方面中，LG’选自2,4-二硝基苯氧化物、4-硝基苯氧化物、2-硝基苯氧化物、2-氯代-4-硝基苯氧化物、2,4-二氯苯氧化物、或五氟苯氧化物。
在第十三实施方案的第三方面中，LG’是五氟苯氧化物或4-硝基-苯氧化物。
第十三实施方案的第四方面涉及化合物C，其中LG’是2,4-二硝基苯氧化物、4-硝基苯氧化物、2-硝基苯氧化物、2-氯代-4-硝基苯氧化物、2,4-二氯苯氧化物、或五氟苯氧化物。
第十三实施方案的第五方面涉及化合物C，其中LG’是4-硝基苯氧化物或五氟苯氧化物。
第十三实施方案的第六方面涉及化合物C，其中LG’是4-硝基苯氧化物。
第十三实施方案的第七方面涉及结晶化合物C，其中LG’是4-硝基苯氧化物。
第十三实施方案的第八方面涉及化合物C，其中LG’是五氟苯氧化物。
第十三实施方案的第九方面涉及结晶化合物C，其中LG’是五氟苯氧化物。
第十四实施方案涉及制备由以下结构式表示的化合物的方法
将该化合物从组合物中结晶，该组合物包含
a)第一组合物；
b)第二离去基团前体；
c)非亲核性碱；和
d)液体组合物；
其中第一组合物包含该化合物和其相应的P基非对映体。
在第十四实施方案的第一方面中，化合物的摩尔量和所述其P基非对映体的摩尔量是相同的或不同的。
在第十四实施方案的第二方面中，化合物的摩尔量大于所述其P基非对映体的摩尔量或反之亦然。
在第十四实施方案的第三方面中，第二离去基团前体是2,4-二硝基苯酚、4-硝基苯酚、2-硝基苯酚、2-氯代-4-硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、或五氟苯酚。
在第十四实施方案的第四方面中，LG’是五氟苯氧化物。在第一子方面中，第二离去基团前体是五氟苯酚。在第二子方面中，五氟苯酚的量在相对于所述化合物和其P基非对映体的摩尔量约0.01摩尔当量至约10摩尔当量和其间的所有摩尔当量范围内。在第三子方面中，五氟苯酚的量在相对于所述化合物和其P基非对映体的摩尔量约0.1摩尔当量至约1摩尔当量和其间的所有摩尔当量范围内。
在第十四实施方案的第五方面中，结晶发生在约-10℃至约+40℃范围内的温度和其间的所有温度值下。在第一子方面中，结晶发生在约室温下。
在第十四实施方案的第六方面中，非亲核性碱选自碳酸钾、碳酸铯、二异丙胺、二异丙基乙胺、三乙胺、奎宁环、萘-1,8-二胺、2,2,6,6-四甲基哌啶、1,8-二氮杂双环十一-7-烯、4-二甲基氨基-吡啶、吡啶、2,6-二-C1-6-烷基-吡啶、2,4,6-三-C1-6-烷基-吡啶、和其混合物。在第一子方面中，非亲核性碱是三乙胺或1,8-二氮杂双环十一-7-烯。在第二子方面中，非亲核性碱是三乙胺。
在第十四实施方案的第七方面中，非亲核性碱以相对于所述化合物和其P基非对映体的总摩尔量约0.01摩尔当量至约10摩尔当量和其间的所有摩尔当量范围内的量存在。在第一子方面中，非亲核性碱以相对于所述化合物和其P基非对映体的总摩尔量约0.1摩尔当量至约1摩尔当量和其间的所有摩尔当量范围内的量存在。
在第十四实施方案的第八方面中，化合物的溶解度低于其相应的P基非对映体在液体组合物中的溶解度或反之亦然。
在第十四实施方案的第九方面中，液体组合物包含溶剂和反溶剂中的至少一种。在第一子方面中，液体组合物包含C1至C8醇、C2至C8醚、C3至C7酮、C3至C7酯、C1至C2氯碳化合物、C2至C7腈、C5至C12饱和烃、和C6至C12芳香烃中的至少一种。在第二子方面中，液体组合物包含C2至C8醚、C3至C7酯、C5至C12饱和烃、和C6至C12芳香烃中的至少一种。在第三子方面中，液体组合物包含C2至C8醚、C3至C7酯、和C5至C12饱和烃中的至少一种。在第四子方面中，液体组合物包含乙酸乙酯、叔丁基甲醚、和己烷中的至少一种。在第五子方面中，液体组合物包含乙酸乙酯和己烷。在第六子方面中，液体组合物包含叔丁基甲醚和己烷。
在第十四实施方案的第十方面中，液体组合物对于每克所述第一组合物在约1mL至约10mL和其间的所有mL/g值范围内。
第十四实施方案的第十一方面还包含向组合物加入结晶化合物。第一子方面还包含向第一组合物加入约0.1至约1wt.％和其间的所有wt.％值的结晶化合物。
第十四实施方案的第十二方面还包含
a)使PhOP(O)(LG)2和iPr-Ala-NH2·HCl在第一碱存在下反应以获得(PhO)P(O)(LG)(NHAla-iPr)；
b)使(PhO)P(O)(LG)(NHAla-iPr)与第一离去基团前体(LG’H)在第二碱存在下反应以获得包含所述化合物和其P基非对映体的组合物；
其中LG和LG’彼此独立地是离去基团；
其中第一离去基团前体和第二离去基团前体是相同的或不同的；和
其中第一碱和第二碱是相同的或不同的。
第十五实施方案涉及制备具有以下结构的结晶(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的方法，
所述方法包含:
将(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯从第二组合物中结晶，第二组合物包含
a)第一组合物；
b)五氟苯酚；
c)非亲核性碱；和
d)液体组合物；
其中第一组合物包含(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯和(S)-2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯。
在第十五实施方案的第一方面中，(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的摩尔量和(S)-2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的摩尔量是相同的或不同的。
在第十五实施方案的第二方面中，(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的摩尔量大于(S)-2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的摩尔量。
在第十五实施方案的第三方面中，五氟苯酚的量在相对于(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯和(S)-2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的摩尔量的约0.01摩尔当量至约10摩尔当量范围内(和其间的所有摩尔当量值)。在第一子方面中，五氟苯酚的量在相对于(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯和(S)-2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的摩尔量的约0.1摩尔当量至约1摩尔当量范围内(和其间的所有摩尔当量值)。
在第十五实施方案的第四方面中，结晶发生在约-10℃至约+40℃范围内的温度和其间的所有温度值下。在第一子方面中，结晶发生在约室温下。
在第十五实施方案的第五方面中，非亲核性碱选自碳酸钾、碳酸铯、二异丙胺、二异丙基乙胺、三乙胺、奎宁环、萘-1,8-二胺、2,2,6,6-四甲基哌啶、1,8-二氮杂双环十一-7-烯、4-二甲基氨基-吡啶、吡啶、2,6-二-C1-6-烷基-吡啶、2,4,6-三-C1-6-烷基-吡啶、和其混合物。在第一子方面中，非亲核性碱是三乙胺或1,8-二氮杂双环十一-7-烯。在第二子方面中，非亲核性碱是三乙胺。
在第十五实施方案的第六方面中，非亲核性碱以相对于(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯和(S)-2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的总摩尔量约0.1至约1摩尔当量范围内(和其间的所有摩尔当量值)的量存在。
在第十五实施方案的第七方面中，(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的溶解度低于(S)-2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯在液体组合物中的溶解度。
在第十五实施方案的第八方面中，液体组合物包含溶剂和反溶剂中的至少一种。在第一子方面中，液体组合物包含C1至C8醇、C2至C8醚、C3至C7酮、C3至C7酯、C1至C2氯碳化合物、C2至C7腈、C5至C12饱和烃、和C6至C12芳香烃中的至少一种。在第二子方面中，液体组合物包含C2至C8醚、C3至C7酯、C5至C12饱和烃、和C6至C12芳香烃中的至少一种。在第三子方面中，液体组合物包含C2至C8醚、C3至C7酯、和C5至C12饱和烃中的至少一种。在第四子方面中，液体组合物包含乙酸乙酯、叔丁基甲醚、和己烷中的至少一种。在第五子方面中，液体组合物包含乙酸乙酯和己烷。在第六子方面中，液体组合物包含叔丁基甲醚和己烷。
在第十五实施方案的第九方面中，液体组合物的量对于每克第一组合物在约1至约10mL(和其间的所有mL/g值)范围内。
第十五实施方案的第十方面还包含向第二组合物加入结晶(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯。
第十五实施方案的第十一方面还包含在第一组合物中基于(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的总重量加入约0.1至约1wt.％(和其间的所有wt.％值)的结晶(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯。
第十六实施方案涉及通过第十五实施方案的方法获得的结晶(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯。
第十七实施方案涉及制备(S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的方法，所述方法包含：
使(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯从第二组合物中结晶，第二组合物包含
a)第一组合物；
b)五氟苯酚；
c)非亲核性碱；和
d)液体组合物；
其中第一组合物包含(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯和(S)-2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯。
第十七实施方案的第一方面涉及制备(S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的方法，所述方法包含:
使(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯与通过使卤化叔丁基镁与1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-(羟基甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮与卤化叔丁基镁反应获得的产物接触。
在第十七实施方案的第二方面中，接触发生在具有约0℃至约40℃和其间的所有温度值范围内的温度的介质中。
在第十七实施方案的第三方面中，接触发生在具有约0℃至约30℃和其间的所有温度值范围内的温度的介质中。
在第十七实施方案的第四方面中，卤化叔丁基镁与1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-(羟基甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮的摩尔比在约2至约2.2范围内。在第一子方面中，卤化叔丁基镁与1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-(羟基甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮的摩尔比是约2.1。
在第十七实施方案的第五方面中，卤化叔丁基镁是氯化叔丁基镁。
第十八实施方案涉及制备大致纯的(S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的方法，所述方法包含:
根据本文公开的任何相关实施方案获得(S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯，和
将如此形成的(S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯结晶。
第十九实施方案涉及RP-4或SP-4的同位素标记的类似物。术语“同位素标记的”类似物指为“氘化类似物”、“13C-标记的类似物、”或“氘化/13C-标记的类似物”的RP-4或SP-4类似物。术语“氘化类似物”意指本文描述的化合物，其中1H-同位素(即氢(H))被2H-同位素(即氘(D))取代。氘取代可以是部分的或完全的。部分氘取代意指至少一个氢被至少一个氘取代。例如，对于RP-4或SP-4，普通技术人员可预见至少以下部分氘化类似物(其中“dn”表示氘原子的n数，诸如，对于异丙基基团，n＝1-7，而对于苯基基团，n＝1-5)，以及下面描绘的那些。
虽然以上描绘的甲基基团显示为被完全氘化，技术人员将理解，部分氘化变异也是可能的，诸如、-CDH2和-CD2H。还预见呋喃糖和碱基上的同位素标记。相似地，术语“13C-标记的类似物”和”氘化/13C-标记的类似物”指本文所述的化合物，其中碳原子富集13C-同位素，意指富集程度超过约1.1％的通常的自然丰度。
实施例
不限于以举例的方式，以下实施例是为了便于更好地理解本公开内容。
合成方面
为了制备尿苷核苷，技术人员可以在3的某些3’,5’-二酰基化类似物(参见下文)合成中利用先进的三苯甲酰基化胞苷中间体，该类似物已经在中试工厂规模有效生产(参见WO2006/031725或US2006/0122146，二者均通过引用整体并入)。发现以下方法是规模可调且经济的。
3’,5’-O-二苯甲酰基-2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基-N4-苯甲酰基胞苷(1)通过WO2006/031725和WO2008/045419(二者均通过引用整体并入)中公开的方法获得。用70％乙酸水溶液处理1以形成3’,5’-O-二苯甲酰基-2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基-尿苷(2)。苯甲酰基酯也可通过大量方法水解，如，醇溶剂中的醇盐(诸如甲醇中的甲醇钠、甲醇中的碳酸钾，或乙醇类似物)、烷基胺类(诸如甲醇中的甲基胺，丁基胺等)。对于更大规模的工作，选择甲醇氨。尿苷产物(3)可通过结晶纯化，以获得自三苯甲酰基化胞苷(1)的70％收率。
许多文献程序详细描述了利用数倍当量的试剂制备氨基磷酸酯的不同路径和条件。参见，例如，McGuigan等人，J.Med.Chem.2005,48,3504-3515和McGuigan等人，J.Med.Chem.2006,49,7215。对于方法规模工作，目前仅有一个已知实例，其公开于Lehsten等人,Org.Process Res.Dev.2002,6,819-822(“Lehsten”)。在该参考文献中，作者介绍了“一锅法(one-pot procedure)”的概念，其中氨基酸盐酸盐和苯基二氯磷酸酯与N-甲基咪唑在二氯甲烷中一起反应。随后，加入核苷以形成期望的5’-O-氨基磷酸酯产物，其在本发明情况下将产生由式4表示的化合物。遗憾的是，Lehsten法具有限制。例如，Lehsten法利用超出必需的大大过量的试剂，这增加了成本和层析纯化的难度。此外，Lehsten表明，与通过使用较低的温度和缓慢加入核苷的文献参考相比，技术人员可以控制对5’-羟基超过3’-羟基的反应选择性。
对于本文的化合物，使用Lehsten法提供约1-5％的单取代的3’-O-氨基磷酸酯非对映体(5)和约10-30％的双取代的产物(6)。由于3’-非对映体的极性与期望的5’-非对映体(4)非常相似，层析分离非常困难。如果不丢弃相当部分的极性5’-非对映体(4)或接受3’-非对映体(5)的较高水平的污染，将该方法放大几乎是不可能的。在初步的50g放大中，所得的产物含有约3％的3’-非对映体(5)污染，其与较低极性的5’-非对映体(4)共洗脱。
本文公开利用更少量的试剂的反应条件和用更容易的层析分离选择性去除杂质3’-O-氨基磷酸酯非对映体(5)，由此以高得多的纯度获得期望的5’-O-氨基磷酸酯非对映体(4)的方法。
对于试剂化学计量，已进行了系统地改变试剂的化学计量的研究，并如Lehsten所报告的通过粗反应物的磷NMR监测结果。在较成功的运行中，比较期望产物的分离收率和纯。观察到伯5’-羟基以比仲3’-羟基更快的速率反应。这产生考虑所有起始核苷的反应进程和将5’-和3’-单取代的产物(4和5)转化为5’,3’-双取代的产物(6)之间的竞争情形。3’-单取代的产物以比5’-单取代的产物更快的速率转化为双产物，所以通过推动反应更多地向双取代的产物进行来降低3’-非对映体污染水平是可能的。然而，对于除去3’-非对映体的有效途径，可以优化反应以产生更多的期望的5’-非对映体而没有损失，因为很多5’-非对映体被转化为双取代的(6)。还观察到氨基酸盐酸盐是非常吸湿的。因为存在的任何水将消耗等同量的苯基二氯磷酸酯试剂，必须小心保持氨基酸大致无水，或在使用前应使其是大致无水的。简言之，Lehsten报告氨基酸比苯基二氯磷酸酯比核苷的最优比值分别是3.5:2.5:1。发现约1.6比约1.3比约1的氨基酸比苯基二氯磷酸酯比核苷的最优比值在其中可有效去除3’-非对映体和当氨基酸盐酸盐是大致无水的时的条件下是最优的。通过使用较小量的试剂，可以实现成本节约，同时伴有期望产物与试剂副产物和与降低水平的双非对映体的层析分离的简化。
在一种可选的程序中，使用叔丁基二甲基甲硅烷基封端基团以两个步骤制备3的3’-羟基-封端的衍生物。然后将其转化为其5’-氨基磷酸酯衍生物。期望甲硅烷基基团可被随后除去，且将不存在3’异构体(5)或3’,5’-双氨基磷酸酯(6)。Borch和Fries(美国专利5,233,031)展示了具有低的烷基氨基磷酸酯总收率的相似方法。
另一种可选方法是使用直接合成，然后使用帮助区分3’-非对映体杂质5与期望的5’-非对映体4的化学来帮助分离。与期望的5’-O-氨基磷酸酯4的游离仲羟基相比将选择性地与3’-O-氨基磷酸酯杂质5的游离伯羟基反应的基团是期望的。还期望封端基团显著改变从期望的5’-O-氨基磷酸酯4得到的5’-O-封端的3’-O-氨基磷酸酯产物的极性。这将不需要额外的步骤来去除封端基团，因为期望的5’-非对映体4将不被改变。然后化学改变的3’-非对映体将允许更容易的层析分离或通过特殊的清除支持物或通过萃取的分离。
具体而言，封端基团叔丁基二甲基甲硅烷基(tBDMS)符合这些标准，并且是第一个被证实并随后用于数千克规模使用的。在某些条件(诸如在吡啶作为溶剂和碱的条件)下，tBDMS基团以与3’仲羟基位置相比在伯羟基位置高选择性地反应。氨基磷酸酯反应使用N-甲基咪唑(NMI)作为碱。在NMI存在下，甲硅烷基化选择性较低。优选地，应降低NMI的量。这可通过在氨基磷酸酯反应后用1N盐酸洗涤反应溶液容易地实现。除去NMI和剩余的起始核苷，留下单和双取代的产物和试剂副产物的粗混合物。然后将其溶解在吡啶中并用叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物处理。3’-单取代的产物5在数小时或更短时间内转化为5’-O-tBDMS-3’-O-氨基磷酸酯7。可通过HPLC监测反应进程。此甲硅烷基化产物7的极性低于双氨基磷酸酯6，且可通过层析容易地去除。使用该方法，将3’-单氨基磷酸酯5的水平降低至低于5’-产物4的0.1％是可能的，相比之下，无甲硅烷基处理时为1-3％。相似地，在相同条件下用二甲氧基三苯基甲基氯化物(DMT-Cl)处理也一样起作用。还更容易地通过TLC鉴定DMT反应产物，这是因为含有DMT的分子在加热或暴露于酸时染成亮橙色。技术人员还可设想许多其他封端基团，如以上所述的。
反应条件和3’-杂质的清除二者都是一般方法，并可应用于大多数具有游离3’羟基的核苷氨基磷酸酯。氨基磷酸酯部分可以是氨基酸酯和芳香醇的任何组合。核苷部分可以是其中5’氨基磷酸酯将导致5’-单磷酸酯并可进一步被代谢为5’-三磷酸酯形式的任何核苷。
以下方案是例证用于制备2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷的L-丙氨酸苯基氨基磷酸异丙酯的主反应方案，主产物为期望的5’-O-氨基磷酸酯(4，两种非对映体)和副产物为3’-O-氨基磷酸酯(5，两种非对映体)和3’,5’-双-O-氨基磷酸酯(6，四种非对映体)。按制备方法部分的描述以化学计量比例添加试剂。允许反应进行至当通过UV观察在薄层层析(TLC)上判断时，剩余约5％的起始材料。UPLC/MS还显示，与期望的5’-产物相比，形成了大约10％的3’,5’-双氨基磷酸酯6。猝灭和酸性水溶液后处理后，来自有机层的粗残余物被准备用于甲硅烷基化。在所述的反应条件下，甲硅烷基基团优先与3’-O-氨基磷酸酯的游离5’-羟基反应形成7。反应继续进行，直至不再有UPLC/MS可检测的3’-O-氨基磷酸酯。
在后处理甲硅烷基化反应后，将期望产物在硅胶上进行层析，并用在二氯甲烷中的甲醇(1-4％)梯度洗脱。期望的5’-单氨基磷酸酯4最后洗脱。
制备方法
实施例1：2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷(3)的制备
在10L烧瓶中，加入3’,5’-O-二苯甲酰基-2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基-N4-苯甲酰基胞苷(500g,0.874mol)和70％乙酸水溶液(7.5L)。将溶液加热至回流(110℃)持续20h。TLC指示完全反应(Rf0.6，在含5％甲醇的二氯甲烷(DCM)中)。将混合物冷却至环境温度并用水(2L)稀释。搅拌2h后，通过过滤收集得到的沉淀物，将固体用水(5L)漂洗并在大气中在环境温度下干燥12h以获得360g(88％)。该二苯甲酰基尿苷中间产物通过在0℃将其全部加至新鲜制备的甲醇氨(5.4L,约25％)而直接用于下一步骤。维持这一温度3h，然后升温至15℃持续24h。TLC指示完全反应(Rf0.4，在含10％甲醇的DCM中)。将反应混合物滤过Celite床并在减压下浓缩以得到粗产物(216g)。在环境温度下将粗产物与乙酸乙酯(325mL)搅拌3h。所得固体通过过滤收集并用乙酸乙酯(216mL)洗涤。在环境温度下在真空中干燥固体4h以获得160g(78％)期望产物，98.7％HPLC纯度。1H-NMR(DMSO-d6)δ11.44(br s,1H,NH),7.95(d,1H,C-6H),5.97(d,1H,C-1’H),5.64(d,1H,C-5H),3.84-3.77(m,3H,C-5’-Ha,C-3’H.C-4’H),3.63-3.60(m,1H,C5’-Hb),1.23(d,3H,C-2’-CH3).ES-MS M-1259。
实施例2：(S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-(R)-氟代-3-羟基-4-甲基-四氢-呋喃-2-基甲氧基]-苯氧基-磷酰基氨基}-丙酸异丙酯(4)的制备
别名：5’-O-(异丙基-L-丙氨酸酯,苯基氨基磷酰基)-2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基-尿苷非对映体混合物。
5L3-颈烧瓶配有机械搅拌子、盐水冰浴、内部温度计、和氮气气氛。向烧瓶充入L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(82.0g,0.490mol)和无水二氯甲烷(0.80L)。在将此搅拌的同时，一次性加入苯基二氯磷酸酯(85.0g,0.40mol)并搅拌。维持内部温度在-5至5℃，历经半小时的时段加入N-甲基咪唑(NMI,250g,3.07mol)在二氯甲烷(250mL)中的溶液。在此温度范围内搅拌溶液1h。在0℃一次性加入2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基-尿苷(3,80.0g,0.307mol)，然后让反应烧瓶在盐水浴中缓慢升温。1h时，内部温度上升至-2℃。1h时的TLC(5％甲醇于DCM中)显示多于50％的核苷被消耗。除去盐水浴，并使反应烧瓶在又1h内达到环境温度。3h后和5h时的TLC显示95％的起始核苷被消耗。通过加入甲醇(100mL)和搅拌反应物5分钟猝灭反应物混合物。
将反应混合物在1N HCl(2×500mL)接着是饱和碳酸氢钠溶液(2×500mL)中洗涤。分离的有机层经无水硫酸钠(50g)干燥并过滤。在减压然后是高真空下蒸发溶液至干燥，以得到为粘性油状物的粗产物(170g)。进行粗产物的NMR(31P和1H)。31P-NMR指示约1％的总磷整合(integration)是由于3’异构体5的存在。
向粗产物加入无水吡啶(1700mL)。在减压然后高真空下蒸发溶剂以通过共蒸发降低粗混合物中的水含量。将得到的油状物重新溶解在无水吡啶(500ml)中，然后加入过量叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(9.0g,60mM)。在环境温度下搅拌反应物。通过UPLC/MS监测反应进程。3小时后，不会再检测到3’杂质5，并通过加入甲醇(50mL)猝灭反应物。
在减压下将反应物蒸发为油状物。将残余物溶解在乙酸乙酯(1.5L)中，并用1NHCl(2×500mL)、接着是饱和碳酸氢钠溶液(2×500mL)洗涤。有机层经无水硫酸钠(50g)干燥、过滤和在减压下蒸发，以得到为浅黄色油状物的粗产物。
将粗油状物用相同体积的二氯甲烷稀释，并在100psi空气压力下以径向压缩模块装载到2.5Kg硅胶筒。使用60psi和400mL/min流速的梯度泵，用二氯甲烷(4L)接着用在二氯甲烷(48L)中的1-4％甲醇梯度洗涤筒。大多数主要杂质(二-(异丙基丙氨酰基)苯基磷酸酯、3’,5’-双氨基磷酸酯(6)、3’-氨基磷酸酯-5’-TBDMS加成物(7))以～3％梯度洗脱。期望产物在3％和4％甲醇之间洗脱。将含有产物的级分分成两批。第一批含有少量上部杂质，而第二批为纯产物。第一组级分含有少量较低极性杂质(上部杂质)诸如3’,5’-双氨基磷酸酯和二-丙氨酰基苯基磷酸酯和大部分的RP非对映体，并且需要第二柱纯化。(相对术语上部与下部是指在正相硅胶层析中的洗脱。其中“上部异构体”意指首先洗脱的异构体)。第二组级分没有显著量的杂质—仅有剩余的RP和大部分的SP非对映体。稍后将两次过柱的级分重新合并。在减压下蒸发溶剂，并将得到的白色泡沫进一步干燥(0.20mmHg)1h，以得到42g的杂质批(4:1上部:下部异构体，基于31P-NMR)和38g纯化批(1:3上部:下部异构体)。将杂质批以相似的方式重新过柱，以得到3.8g的97％纯度的上部异构体(留出的级分)和4:1比例的36g纯产物。将两个主批次溶解在DCM中，合并，在减压下蒸发和干燥(50℃，0.2mmHg，24h)，以获得74g(45.7％)纯产物4，非对映体比值为48:51，其为白色泡沫，mp为约75-85℃。
为了产生非对映体混合物的无定形固体，将74g白色泡沫在叔丁基甲基醚(750mL)中搅拌，得到部分溶液和胶状固体残余物。在搅拌的同时，缓慢加入庚烷(750mL)，并机械搅拌悬浮液1小时，直至大多数胶状物转化为白色固体。用刮刀刮起固体，并过滤得到的浆液。将固体用庚烷(4×50mL)洗涤并在真空下干燥(50℃,0.2mmHg,24h)，以得到白色、无定形的粉末(64g)，其具有约70-80℃的宽熔化范围。1H和31P NMR符合结构和HPLC显示99.8％的纯度，非对映体比值为46:54(也通过31P NMR确认)。
制备4的固体混合物的可选方法。层析后，将残余物与二氯甲烷共蒸发两次(5mL/g)且在35-40℃、35-45mTorr下干燥24h。将泡沫残余物通过250微米筛过筛，并且在相同条件下进一步干燥，直至残余二氯甲烷跌至通过顶空GC测量低于400ppm。得到的精细的灰白色至白色的无定形粉末具有53.7至63.5℃的玻璃转化温度范围。
异构体(4)的混合物的表征：1H-NMR(CDCl3)δ10.05(br s,1H,NH,SP),10.00(br s,1H,NH,RP),7.49(d,1H,C6-H,SP),7.36(m,5H,C6-H,RP,芳族的),7.23-7.14(m,6H,RP/SP,芳族的),6.18(br d,2H,C1’-H,RP/SP),5.63(d,1H,C5-H,SP),5.58(d,1H,C5-H,RP),5.01(m,2H,CH-(CH3)2,RP/SP),4.46-4.33(m,8H,C-5’-H2,ala-NH,C3’-OH,RP/SP),4.12(m,2H,ala-CH-CH3,RP/SP),4.01-3.85(m,4H,C3’-H,C4’-H,RP/SP),1.39-1.22(m,12H,所有CH3,RP/SP)。
31P-NMR(CDCl3)δ3.60(RP),3.20(SP)，相对于三苯基磷酸酯在17.80ppm处。ES-MS M+1 530.2。元素分析：计算值％(包括0.29％水，如Karl Fisher分析所发现的)C,49.75；H,5.54；N,7.90,F,3.58,P,5.84。实测值％：C,49.50；H,5.44；N,7.85；F,3.62；P,6.05。
关于异构体分离的讨论
化合物4由于磷的手性而由两种非对映体构成，其命名为SP-4和RP-4。化学计量分配是基于SP-4的单晶X-射线分析作出的。RP-4和SP-4二者均产生结晶产物。
结晶的程序在下面列出。
实施例3：RP-4异构体的结晶。将含有首先洗脱的、极性较低的RP-4异构体(3.8g,97％纯)的层析级分溶解在异丙醇(36g)中，并用庚烷稀释至混浊(72g)。对溶液引晶，并在环境温度下搅拌5h。获得的固体通过真空过滤收集、用庚烷(2×20mL)洗涤并干燥(50℃,0.2mm,24h)至2.3g非常小的白色针状结晶体，mp136.2-137.8℃。发现所得材料的HPLC纯度为99.02％。
RP-4：1H-NMR(CDCl3)δ9.10(br s,1H,NH),7.36(m,2H,邻-芳族的),7.26-7.16(m,4H,C6-H,间,对-芳族的),6.16(br d,1H,C1’-H),5.58(d,1H,C5-H),5.01(sept,1H,CH-(CH3)2),4.52-4.47(m,2H,C-5’-H2),4.10(d,1H,C3’-H),4.02-3.76(m,4H,ala-NH,C3’-OH,C4’-H,ala-CH-CH3),1.37-1.20(m,12H,所有CH3)。
实施例4：SP-4的制备和结晶
方法1：直接从粗制的4沉淀：在室温下向搅拌的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(10.5g,61.5mmol,共沸干燥，两次，每次用50mL甲苯)在二氯甲烷(100mL)中的溶液加入苯基二氯磷酸酯(7.5mL,50mmol)。将混合物冷却至-10℃，然后历经30min时段加入NMI(30.5mL,384.3mmol)在30mL二氯甲烷中的溶液。加入完成后，将混合物在-10和-15℃之间搅拌1h。向上述混合物一次性加入2’-脱氧-2,-氟代-2’-C-甲基尿苷(3)(10g,38.4mmol)，并将混合物在低于-10℃下搅拌3h，然后缓慢升温至20℃(6h)。在此温度下搅拌混合物过夜(15h)，然后用10mL甲醇猝灭。蒸发溶剂，并将残余物重新溶解在EtOAc(200mL)中。EtOAc层用水(100mL)、1N HCl(3×75mL)、2％NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥、过滤和浓缩。残余物在高真空下干燥2h，以获得白色泡沫物(22g)。
将以上泡沫物溶解在33mL DCM中，然后加入65mL IPE(异丙基醚)以获得饱和溶液。将溶液滤过小的Celite垫，并将滤液与SP-4晶种在环境温度下(约22℃-注意，将悬浮液冷却至0℃导致粗产物油析)搅拌72h。将白色固体过滤、用IPE(20mL)洗涤并干燥，以获得4.58g(SP-4:RP-4分别为～85:15的混合物，如通过31P NMR测定的)白色粉末。将以上固体悬浮在23mL DCM中，然后回流3h。将混合物冷却到室温并搅拌15h。将白色固体过滤、用4.5mL冷DCM洗涤并在45℃在高真空下干燥，获得纯SP-4，mp93.9-104.7℃，HPLC纯度99.74％(3.11g,15.2％来自尿苷核苷)。
SP-41H-NMR(CDCl3)δ8.63(br s,1H,NH),7.47(d,1H,C6-H),7.30(m,2H,邻-芳族的),7.26-7.18(m,3H,间,对-芳族的),6.18(br d,1H,C1’-H),5.70(d,1H,C5-H),5.02(sept,CH-(CH3)2),4.53(m,2H,C-5’-H2),4.11(d,1H,C3’-H),3.97(m,3H,C3’-OH,C4’-H,ala-CH-CH3),3.77(br s,1H,ala-NH),1.39(d,3H,C2’-CH3),1.37(d,3H,ala-CH3),1.24(d,6H,CH-(CH3)2)。
方法2：从粗制的4油析：在室温下向搅拌的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(20.6g,123mmol,共沸干燥，两次，每次用75mL甲苯)在二氯甲烷(200mL)中的溶液加入苯基二氯磷酸酯(14.9mL,100mmol)。将混合物冷却至-10℃，然后历经30min时段加入NMI(61.3mL,769mmol)在60mL二氯甲烷中的溶液。加入完成后，将混合物在-10和-15℃之间搅拌1h。向上述混合物一次性加入2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷(3)(20g,76.9mmol)，并将混合物在低于-10℃下搅拌3h，然后缓慢升温至20℃(6h)。在此温度下搅拌混合物过夜(15h)，然后用10mL甲醇猝灭。蒸发溶剂，并将残余物重新溶解在EtOAc(400mL)中。EtOAc层用水(200mL)、1N HCl(3×100mL)、2％NaHCO3水溶液(100mL)和盐水(50mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥、过滤和浓缩。残余物在高真空下干燥2h，以获得白色泡沫物(43g)。在配有机械搅拌子的两颈圆底烧瓶中将以上泡沫物溶解在86mL EtOAc中。在搅拌的同时，缓慢加入100mL庚烷，并将悬浮液搅拌1h。滗去上层，并将残余物再次与50mL2:3EtOAc/庚烷溶液搅拌10min，然后滗去。将残余物在高真空下干燥，以获得白色泡沫物(31g)。
将以上泡沫物溶解在46mL DCM中，然后加入95mL IPE以获得饱和溶液。将溶液滤过小的Celite垫，并将滤液与SP-4晶种在环境温度下搅拌72h。将白色固体过滤、用IPE(30mL)洗涤并干燥，以获得7.33g(SP-4:RP-4分别为～85:15的混合物，如通过31P NMR测定的)白色粉末。将以上固体悬浮在36mL DCM中，然后回流3h。将混合物冷却到室温并搅拌15h。将白色固体过滤、用7.5mL冷DCM洗涤和在45℃在高真空下干燥，以获得>99％纯SP-4，(4.78g,11.6％来自尿苷核苷)。
方法3：粗制的4的硅胶加载：在临进行柱层析步骤之前，以大约2.5g2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷(3)起始按照相同的方式产生作为非对映体混合物的5.0g粗制的4。将该粗制物溶解在10mL DCM中，并向溶液中加入10g硅胶。蒸发溶剂以获得干燥浆状物，将浆状物与40mL50％EtOAc/己烷一起搅拌15min然后过滤。将硅胶用另外的10mL50％EtOAc/己烷洗涤。然后将硅胶用15％MeOH/DCM(100mL)洗涤并单独收集。蒸发溶剂，并在高真空下干燥以获得4.0g残余物(泡沫物)。将残余物溶解在DCM(6mL)中然后加入～9mL IPE以制备饱和溶液。然后将混合物与SP-4晶种在环境温度下温和搅拌过夜。将白色固体过滤并用IPE(5mL)洗涤，以获得1.28g产物。31P NMR揭示以上产物含有SP-4:RP-4分别为77:23的混合物。将这从20mL DCM中重结晶以获得0.75g>99％纯SP-4(约12％来自尿苷核苷)。SP-4的这一制剂不像混合物那样需要甲硅烷基化步骤，所以完整的反应程序在以上显示。SP-4的单结晶和多晶型形式在以下呈现。
方法4：将4的40.0g1:1混合物溶解在90mL二氯甲烷中。向以上溶液加入二异丙醚(70mL)以获得饱和溶液。(二异丙醚的量可根据产物的纯度而变化。)将溶液以纯SP-4(>99％)引晶，并将混合物在室温下用搅拌子温和搅拌20h(2h后观察到固体形成)。将固体过滤、用40mL二异丙醚/二氯甲烷(1:1)的混合物洗涤并干燥，以获得白色固体(16.6g,通过NMR为89.35％纯SP-4)。将这一固体悬浮在83mL二氯甲烷中并回流3h。将悬浮液冷却至室温并搅拌过夜。将固体过滤并用10mL冷DCM洗涤。将固体在真空下干燥，以获得SP-4(13.1g,通过HPLC为99.48％纯)。在热条件下将11g该固体重新溶解在330mL DCM中。将溶液冷却至室温并在此温度下放置过夜。将结晶产物过滤和干燥，获得10.5g SP-4(通过HPLC为99.74％)。
可选地，可根据第九或第十实施方案通过使核苷(经保护的或未经保护的)3与异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯(C和C’的混合物、C或C’)反应制备SP-4和RP-4，如以下反应式所示。
P.D.Howes等人Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids2003,Vol.22,Nos.5-8,pp.687-689(“Howes”)公开了通过使用氯化叔丁基镁的反应获得的2’-和5’-氨基磷酸酯。其中，Howes公开当使3’-脱氧-胞苷核苷与(S)-2-[氯代-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸甲酯在1.2当量的氯化叔丁基镁存在下反应时，在2’-位置上发生选择性磷酸化，但是使用另一当量的氯化叔丁基镁，在5’-位置上发生选择性磷酸化。本公开内容应该与Howes的方案1中公开的形成对比。
实施例5-1：(S)-2-[(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯的制备
在-78℃下历经20min时段，向搅拌的4-硝基苯基二氯磷酸酯12.8g,50mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液加入苯酚和三乙胺(7.7mL,55mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液。将混合物在此温度下搅拌30min，然后转移至0℃的含有在二氯甲烷(100mL)中的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(8.38g,50mmol)的另一圆底烧瓶。历经15min时段向该混合物加入第二部分三乙胺(14.6mL,105mmol)。将混合物在0℃搅拌1h，然后蒸发溶剂。将残余物与乙酸乙酯(150mL)研磨，并过滤掉白色固体。将滤液在减压下浓缩，以获得浅黄色油状物。将粗化合物使用0-20％乙酸乙酯/己烷梯度层析，获得的产物(17g,83％收率)为约1:1比值的非对映体混合物。31P NMR(162MHz,DMSO-d6)：δ-0.31,-0.47；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.31-8.27(m,2H),7.51-7.37(m,4H),7.27-7.19(m,3H),6.70-6.63(m,1H),4.85-4.78(m,1H),3.97-3.86(m,1H),1.21-1.19(m,3H),1.11-1.09(m,6H)；MS(ESI)m/z407(M-1)+。31PNMR(162MHz,CDCl3)：δ-2.05,-2.10；1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.22(d,J＝9.2Hz,2H),7.41-7.33(m,4H),7.26-7.18(m,3H),5.05-4.96(m,1H),4.14-4.05(m,1H),3.93-3.88(m,1H),1.38(d,J＝6.8Hz,3H),1.22(dd,J＝6.2&3.0Hz,6H)；MS(ESI)m/z407(M-1)+。
实施例5-2：SP-4/RP-4的制备。
在室温下历经5min时段，向搅拌的1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(130mg,0.5mmol)在无水THF(1.5mL)中的溶液加入氯化叔丁基镁(1.05mL,1.05mmol,2.1当量))的1.0M溶液。30min后，历经5min时段逐滴加入(S)-2-[(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(异构体的1:1混合物,408mg,1mmol)在THF(1.5mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌48h，然后用NH4Cl饱和水溶液(20mL)猝灭。将混合物在乙酸乙酯(50mL)和水(20mL)之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥、过滤并在减压下浓缩，以获得浅黄色残余物。使用0-2％MeOH/二氯甲烷梯度的残余物的柱层析获得白色泡沫状固体(125mg,47％收率，SP-4/RP-4为约3.05:1.0比值的混合物)。
实施例6：(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基磷酰基氨基]丙酸异丙酯的制备和非层析分离
L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(330g,1.97mol)通过在减压下与甲苯(2x400mL)共蒸发然后在真空炉中干燥(50℃,0.2mmHg,17h)进行预干燥。在-60℃内部温度下历经3小时时段，向搅拌的4-硝基苯基二氯磷酸酯(500.0g,1.953mol)在无水二氯甲烷(3.0L)中的溶液加入苯酚(183.8g,1.953mol)和三乙胺(300mL,2.15mol)在二氯甲烷(900mL)中的溶液。将混合物在此温度下搅拌另外30min，然后允许经2.5小时升温至-5℃。在-5～0℃下在氮气气氛下经10min加入预干燥的氨基酸酯。将加成烧瓶中的氨基酯盐残余物经由用二氯甲烷(2×100mL)漂洗而转移至反应混合物。将混合物在0℃搅拌40min，且在0℃下历经40min时段加入第二部分三乙胺(571mL,4.10mol)。将混合物在0～10℃搅拌3h，然后将白色固体(三乙胺盐酸盐)过滤掉，并用二氯甲烷(3×300mL)漂洗。将滤液在减压下浓缩，并将残余物与甲基叔丁基醚(MTBE,4L)一起研磨。将由此形成的另外的固体盐过滤掉并用MTBE(3×150mL)漂洗。将滤液在减压下浓缩，以得到透明的浅棕色油状物。将残余物与己烷(2×140mL)共蒸发以除去任何残余的MTBE并在40℃在真空下进一步干燥2小时。将干燥的残余物与二异丙醚(IPE,1.1L)混合并在5℃在冰-水浴中搅拌。将少量的产物的期望的SP-异构体的晶种加入溶液中并将混合物在5℃搅拌超过22h以形成中等浓稠的浆状物。让其在冰箱(-10℃)中静置44h。沉淀的产物经由过滤收集并用预冷却的IPE和己烷混合溶剂(1:1,3×190mL)漂洗。将固体在在真空下(0.5mm Hg)在环境温度下干燥，直至获得恒重，以获得227.23g(收率：28.5％)白色粉末固体。基于31PNMR(162MHz,DMSO-d6,δ-0.31(SP),-0.47)，两种非对映体的比值SP:RP为9.65/1。将产物通过溶解在IPE(840mL)中同时在60℃浴中加热而重结晶。将以上溶液在室温搅拌1h，然后加入少量的结晶SP异构体晶种。白色粉末固体在2小时内形成，将烧瓶在冰箱(-10℃)中储存16小时。将获得的白色且细小的结晶固体过滤、用预冷却的IPE(3×50mL)洗涤和在真空下(环境,0.5mm Hg)干燥至恒重，以获得白色松散的固体(177.7g,22％总收率，或基于SP异构体的理论收率，44％总收率)，基于31P-NMR，非对映体比值为48/1。Mp62-66℃。
31P NMR(162MHz,DMSO-d6)：δ-0.31；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.30-8.27(m,2H),7.49(d,J＝8.8Hz,2H),7.41-7.37(m,2H),7.23-7.19(m,3H),6.66(dd,J＝13.6,10.0Hz,1H),4.86-4.78(m,1H),3.97-3.86(m,1H),1.19(d,J＝7.2Hz,3H),1.10(d,J＝6.4Hz,6H)；
31P NMR(162MHz,CDCl3)：δ-2.05；(162MHz,DMSO-d6)：δ-0.31；1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.22(d,J＝9.2Hz,2H),7.41-7.33(m,4H),7.26-7.18(m,3H),5.05-4.96(m,1H),4.14-4.05(m,1H),3.93-3.88(m,1H),1.38(d,J＝6.8Hz,3H),1.22(dd,J＝6.2&3.0Hz,6H)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.30-8.27(m,2H),7.49(d,J＝8.8Hz,2H),7.41-7.37(m,2H),7.23-7.19(m,3H),6.66(dd,J＝13.6,10.0Hz,1H),4.86-4.78(m,1H),3.97-3.86(m,1H),1.19(d,J＝7.2Hz,3H),1.10(d,J＝6.4Hz,6H)
MS(ESI)m/z407(M-1)+。
8(SP-异构体)的立体化学已通过单晶X-射线晶体学确认，参见下文提供的细节。
实施例7：非对映体混合物(S)-2-[(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯通过SFC的分离
将富集RP-异构体的非对映体混合物样品(4.8g)进行SFC，使用ChiralPak AD-H(2×15cm)柱和用35％异丙醇在二氧化碳中在100巴下洗脱。使用17mg/mL甲醇浓度的4mL样品注射上样。RP-异构体[(S)-2-[(R)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯]首先洗脱。合并多次运行的适当级分并在减压下浓缩，以获得为浅黄色粘性油状物的2.9gRP-异构体[(S)-2-[(R)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯]，和为白色固体的1.9g SP-异构体[(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯]。RP-异构体的分析数据与通过以上结晶方法分离的产物相似。
(S)-2-[(R)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,RP-异构体)的分析数据：31P NMR(162MHz,DMSO-d6)：δ-0.47；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.30-8.27(m,2H),7.46-7.38(m,4H),7.27-7.20(m,3H),6.68(dd,J＝13.8,10.2Hz,1H),4.86-4.77(m,1H),3.97-3.86(m,1H),1.20(d,J＝7.2Hz,3H),1.10(dd,J＝6.2,2.2Hz,6H)；
MS(ESI)m/z407(M-1)+。
实施例8-1：外消旋2-[(4-氯代-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(±)的制备：
在-78℃下历经20min时段，向搅拌的4-氯代-苯基二氯磷酸酯(2.45g,10.0mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液加入苯酚(0.94g,10mmol)和三乙胺(1.56mL,11mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液。将混合物在此温度下搅拌30min，然后转移至0℃的含有在二氯甲烷(50mL)中的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.67g,10mmol)的另一圆底烧瓶。历经15min时段向混合物加入第二部分三乙胺(2.92mL,21mmol)。将混合物在0℃搅拌1h，然后蒸发溶剂。将残余物与乙酸乙酯(30mL)一起研磨并将白色固体过滤掉。将滤液在减压下浓缩，以得到浅黄色油状物。对粗化合物使用10-20％乙酸乙酯/己烷梯度进行层析，得到的产物(2.0g,50％收率)为约1:1比值的非对映体混合物。31PNMR(162MHz,CDCl3)：δ-1.58,-1.62；1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.06-7.51(m,8H),7.15-7.28(m,2H),7.29-7.47(m,2H),4.0-4.10(m,1H),3.82-3.88(m,3H),1.35-1.36(dd,6H)；1.19-1.22(m,3H).MS(ESI)m/z398(M-1)+。将得到的产物通过萃取、结晶、或层析纯化，如以上所述。
实施例8-2：(S)-2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)-磷酰基氨基)丙酸异丙酯(4)的制备。
在室温下历经15min时段，向搅拌的1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(3,2.6g,10mmol)在无水THF(50mL)中的溶液加入1.7M的氯化叔丁基镁溶液(12.4mL,21mmol,2.1当量))。30min后，历经10min时段逐滴加入外消旋(2-[(4-氯代-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(4.08g,10mmol)在THF(15mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌72。与基准产物的TLC共点样显示与起始核苷相比形成5％左右的期望产物。
实施例9-1：外消旋2-[(2-氯代-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(±)的制备。
在-78℃历经20min时段，向搅拌的2-氯代-苯基二氯磷酸酯(9.8g,40mmol)在二氯甲烷(80mL)中的溶液加入苯酚(3.76g,40mmol)和三乙胺(6.16mL,44mmol)在二氯甲烷(80mL)中的溶液。将混合物在此温度下搅拌30min，然后转移至0℃的含有在二氯甲烷(150mL)中的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(6.7g,40mmol)的的另一圆底烧瓶。历经15min时段，向混合物加入第二部分三乙胺(11.6mL,84mmol)。将混合物在0℃搅拌1h，然后蒸发溶剂。将残余物与乙酸乙酯一起研磨(100mL)并将白色固体过滤掉。将滤液在减压下浓缩，得到浅黄色油状物。将粗化合物使用10-20％乙酸乙酯/己烷梯度进行层析，获得的产物(11.3g,72％收率)为约1:1比值的非对映体混合物。31PNMR(162MHz,CDCl3)：δ-1.58,-1.61；1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.06-7.51(m,8H),5.02-5.94(m,1H),4.10-4.16(m,1H),3.31-3.94(m,1H),1.18-1.35(m,3H),1.38-1.40(dd,6H)；MS(ESI)m/z398(M-1)+。将得到的产物通过萃取、结晶、或层析纯化，如以上所述。
实施例9-2：(S)-2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)-磷酰基氨基)丙酸异丙酯的制备。
在室温下历经15min时段，向搅拌的1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(3,2.6g,10mmol)在无水THF(50mL)的溶液加入1.7M的氯化叔丁基镁溶液(12.4mL,21mmol,2.1当量))。30min后，历经10min时段逐滴加入(2-[(2-氯代-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(外消旋4.08g,10mmol)在THF(15mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌72h。与基准产物的TLC共点样显示与起始核苷相比形成5-10％左右的期望产物。
实施例10-1：外消旋2-[(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(±)的制备。
在-78℃历经20min时段，向搅拌的五氟苯基二氯磷酸酯(6.0g,20mmol)在二氯甲烷(40mL)中的溶液加入苯酚和三乙胺(3.08mL,22mmol)在二氯甲烷(40mL)中的溶液。将混合物在此温度下搅拌30min，然后转移至0℃的含有在二氯甲烷(100mL)中的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(3.35g,20mmol)的另一圆底烧瓶。历经15min时段，向混合物加入第二部分三乙胺(5.84mL,42mmol)。将混合物在0℃搅拌1h，然后蒸发溶剂。将残余物与乙酸乙酯一起研磨(60mL)并将白色固体过滤掉。将滤液在减压下浓缩，得到的浅黄色油状物为约1：1比值的非对映体混合物。31P NMR(162MHz,CDCl3)：δ-0.49,-0.58。将得到的产物通过萃取、结晶、或层析纯化，如以上所述。
实施例10-2：非对映体混合物(S)-2-[(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯的制备和经由具有多次收获的结晶诱导的动态解析的单一非对映体(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯的分离。
向配有机械搅拌子和低温温度计的2L三颈圆底烧瓶加入60g(284mmol)苯基二氯磷酸酯和300mL无水二氯甲烷。将溶液在氮气气氛下冷却至0℃，并快速加入为固体的丙氨酸异丙酯盐酸盐(真空下炉干燥,47.7g,284mmol)。搅拌混合物并在干冰-丙酮浴中冷却至-55℃。经70分钟通过加成漏斗加入60.32g三乙胺(596mmol)在300mL二氯甲烷中的溶液。将白色混浊混合物在-55℃下搅拌半小时，然后经1.5h将温度缓慢升高至-5℃。经1h在0℃经由加成漏斗向该混合物加入预冷却的(室温)五氟苯酚(52.42g,284mmol)和三乙胺(32.11g,317mmol)在180mL二氯甲烷中的混合物，将得到的混合物在0℃下搅拌4小时。将白色沉淀物(TEA·HCl)滤出，并以二氯甲烷(3×50mL)漂洗。将滤液在减压下浓缩，并将白色固体残余物在880mL叔丁基甲基醚(TBME)中在室温下研磨一小时。将白色悬浮液过滤，并将固体用TBME(3×150mL)漂洗。将固体在乙酸乙酯(600mL)和水(150mL)的混合物中分配。分离有机层并用水(3×100mL)洗涤。将有机层经MgSO4干燥和浓缩，以获得为白色羽毛状固体的29.92g(66mmol)产物(SP-异构体，通过X-射线晶体学，同上)。
将来自以上TBME研磨的滤液在减压下浓缩成白色固体残余物，并将固体在450mL混合的乙酸乙酯和己烷(20:80,v/v)中在室温下研磨75分钟。固体(固体1)通过过滤收集并用于己烷中的20％乙酸乙酯(75mL,2×30mL)漂洗。将母液浓缩以提供灰白色固体，将该固体在于己烷中的20％乙酸乙酯(185mL)中在室温下研磨17小时。白色固体(固体2)通过过滤收集并用于己烷中的20％乙酸乙酯(2×10mL)漂洗。将固体1和固体2合并且溶解在1.2L乙酸乙酯中。将溶液用水(3×150mL)、盐水(50mL)洗涤并经MgSO4干燥。将溶液在减压下浓缩，以获得72.8g(161mmol)纯产物。产物的总量为102.72g(226mmol,80％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:.7.38-7.33(m,2H),7.27-7.24(m,2H),7.23-7.19(m,1H),5.04(hept,1H),4.18-4.09(m,1H),4.01-3.96(m,1H),1.45(d,3H),1.25(dd,6H).31P NMR(CDCl3,162MHz)δ:-0.50。
实施例10-3：非对映体混合物(S)-2-[(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯的制备和经由单次收获的结晶诱导的动态解析的单一非对映体(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯的分离。
向配有低温温度计和机械搅拌子的1L干燥三颈烧瓶加入苯基二氯磷酸酯(25g,118.5mmol)。加入无水二氯甲烷(125mL)，并将溶液冷却至0℃。在搅动的同时在N2下快速加入丙氨酸酯盐(烘干的)(19.86g,1当量)。将溶液冷却至约-50℃(内部温度(在丙酮/干冰浴中在N2下)。经0.5h在-50℃下经由加成漏斗滴加三乙胺(25.2g,2.1当量)在DCM(125mL)中的溶液，并将得到的白色浆状物在约-50℃下搅拌0.5h.。经1.5h将混合物升温至0℃，然后经0.5h在0℃下经由加成漏斗加入五氟苯酚(21.82g,1当量)和TEA(13.2g,1.1当量)(小心：在混合五氟苯酚和TEA时释放热)在75mL DCM中的预混合冷却溶液。将混合物在0℃下搅拌另外4h。
将混合物滤过布氏漏斗，并将收集的固体三乙胺盐酸盐用DCM(3×40mL)漂洗。滤液通过31P-NMR(约1.14:1的比值有利于SP-非对映体低磁场峰)确认，并将其分成等重量的两部分。其中的一部分在减压下浓缩。将白色固体残余物(31g)在EtOAc和己烷(150mL,20:80,v/v)的混合物中在室温下研磨17h，以允许较低溶解性的SP异构体的动态解析。将白色浆状物过滤，并将固体用于己烷中的20％EtOAc(2×25mL)漂洗。固体(22.58g)通过1H-NMR和31P-NMR确认，其含有被三乙胺盐酸盐污染的一种异构体产物。将固体在310mLEtOAc和100mL水中溶解和分配。分离有机层后，用EtOAc(50mL)反萃取水层。合并的有机层用水(3×80mL)、盐水(50mL)洗涤并经MgSO4干燥。将溶液在减压下浓缩，然后在高真空下在室温下干燥至恒重，以从一半反应物中提供17.36g为白色固体的产物。收率为64％。将来自以上的母液浓缩成胶状残余物(7.89g)，基于31P-NMR，该胶状残余物含有比值为1:1.2(期望/不期望)的试剂。
实施例10-4：(S)-2-[(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯的制备
将DCM(11.5L)充入清洁和干燥的玻璃反应器中。在氮气下将苯基二氯磷酸酯(2.3kg,10.9mol)充入该反应器中。然后将溶液冷却至0℃。然后一次性加入L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.83kg,10.9mol)并继续搅拌30min。通过使用干冰/丙酮浴将反应物冷却至-50℃内部温度。历经8h时段向以上反应溶液缓慢地加入TEA(2.1当量,3.17L)在DCM(11.5L)中的混合物，以保持内部温度在-40至-50℃。加入完成后，在相同温度范围内保持反应约1h。让混合物历经约4h升温至0℃。
同时，在另一反应器中充入DCM(6.9L)，然后在氮气下加入五氟苯酚(2.0Kg,10.9mol)。将溶液冷却至0℃，然后历经约2h时段向五氟苯酚溶液加入TEA(1.1当量,1.65L)(放热)。继而历经约7h时段向得到的溶液缓慢加入含有苯基二氯磷酸酯和氨基酸酯的第一溶液，同时保持温度在0至5℃。加入完成后，继续在该温度范围搅拌约4h。反应进程通过HPLC监测。当剩余少于5％五氟苯酚时，停止反应。注意到手性HPLC指示此时的产物为非对映体的相等混合物。
将反应悬浮液通过滤过器过滤以除去大多数悬浮的三乙胺盐酸盐。盐饼用过量DCM(9L)洗涤，并将这一洗液加入主滤液。将滤液在减压下在35℃浓缩以获得固体残余物。将固体残余物与己烷(4L)共蒸发以进一步降低残余的DCM的水平。向这一残余的固体加入20％MTBE/己烷6L，并将悬浮液在环境温度下搅拌约17hr，且通过HPLC监测。溶液的pH由于残余的TEA而保持碱性。。在此过程中，发生动态解析，其中沉淀的固体是期望的SP-非对映异构体，而上清液在SP-非对映体和RP-非对映体之间保持平衡。
将悬浮液通过滤过器，将仍被TEA盐酸盐污染的期望的产物固体用5％MTBE/己烷(1L)洗涤。将固体溶解在乙酸乙酯(35L)中，并将溶液用水(3×35L)和盐水(10L)洗涤，然后将溶液经固体硫酸钠干燥、过滤、保持反应器温度低于44℃在减压下浓缩。将固体残余物与己烷(4L)共蒸发。使反应器达到环境温度，并加入5％MTBE/己烷(5L)。将稠厚的悬浮液搅拌15min，然后通过过滤收集固体。收集的固体用己烷(2.5L)洗涤，并在高真空下在环境温度下干燥至恒重，获得的终产物(SP-非对映体)为白色固体,2.6kg(53％)；通过HPLC为99.5％纯，0.4％为其他RP-非对映体。
实施例10-5：(S)-2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)-磷酰基氨基)丙酸异丙酯的制备。
在室温下历经15min时段，向搅拌的1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(3,2.6g,10mmol)在无水THF(50mL)中的溶液加入1.7M的氯化叔丁基镁溶液(12.4mL,21mmol,2.1当量))。30min后，历经10min时段逐滴加入粗制外消旋(2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(4.08g,10mmol)在THF(15mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌72h。与基准产物的TLC共点样显示与起始核苷相比形成40-50％期望产物。
实施例10-6：使用(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯制备(S)-2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸异丙酯(SP-4)和仅通过结晶的纯化。
历经20min时段，在保持烧瓶在冷水浴(5℃)中在氮气气氛下，向搅拌的3(10g,38.46mmol,在真空下在50℃干燥20h)在无水THF(165mL)中的溶液加入氯化叔丁基镁在THF中的1.7M溶液(47.5mL,80.77mmol)。加入完成后，除去冷浴，并将白色悬浮液在室温(20℃)搅拌30min。然后历经30min时段向反应混合物中加入(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基磷酰基氨基]丙酸异丙酯(20.9g,46.11mmol)在无水THF(165mL)中的溶液。将混合物在室温(20℃)搅拌3.5h。继续搅拌另外1.5h，在此阶段，TLC指示>95％转化，且3’,5’-双-氨基磷酸酯杂质强度与2h时没有显著差异。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(10mL)猝灭，然后在25℃蒸发溶剂。残余物在乙酸乙酯(400mL)和饱和氯化铵(60mL)/水(20mL)混合物之间分配。分离有机层、用饱和氯化铵(80mL)和水(3×60mL)洗涤。将此时的水层单独放置。有机层用5％碳酸钠水溶液(3×50mL)和水(2×60mL)洗涤。用另外的乙酸乙酯(100mL)萃取第一水层，用水(2×20mL)洗涤，然后将得自碳酸钠洗涤的水层用同一乙酸乙酯萃取物萃取。有机层用水(2×20mL)洗涤，并与主批次合并。合并的有机层经无水硫酸钠干燥、过滤和浓缩，得到泡沫状固体(19.32g)。将残余物溶解在60mL二氯甲烷(白色固体沉淀出来，在约五分钟后形成饼)中，然后加入25mL IPE。将悬浮液在室温搅拌2h，将白色固体过滤、用冷(0℃)IPE/二氯甲烷的1:1混合物(20mL)洗涤并干燥，以得到11.77g(58％收率)产物，为无定形的白色固体。将以上固体重新溶解在二氯甲烷(350mL)中、过滤和在大气压下蒸发(45℃浴温)至～120mL体积。将溶液在室温(21℃)静置20h。白色结晶固体(二氯甲烷溶剂化物)通过过滤收集、用冷(0℃)二氯甲烷(10mL)洗涤和在高真空下在环境温度下干燥4h，以得到纯的非溶剂化产物(10.62g,52％收率)，为白色针状。HPLC纯度99.8％。光谱性质与本文报告的那些值相符。
实施例10-7：使用(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯制备(S)-2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸异丙酯(SP-4)、修改的反应条件和后处理和仅通过结晶的纯化。
使用加成漏斗历经30min时段在-5℃下，向搅拌的1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-(羟基甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(3,5.0g,19.1mmol,在真空下在50℃干燥20h)在无水THF(75mL)的悬浮液中加入氯化叔丁基镁在THF(23.7mL,40.35mmol)中的1.7M溶液。将白色悬浮液在此温度下搅拌30min，然后升温至环境温度(20℃)，在该温度下搅拌另外30min。将反应混合物冷却至5℃，然后历经30min时段加入(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基磷酰基氨基]丙酸异丙酯(10.45g,23.06mmol)在THF(50mL)中的溶液。将混合物在5℃搅拌18h，冷却至-5℃，然后用2N HCl(25mL)猝灭。向混合物中加入甲苯(100mL)，并升温至室温。20min后，分离各层。将有机层用1N HCl(2×10mL)、水(10mL)、5％Na2CO3水溶液(4×10mL)、水(2×10mL)和盐水(10mL)洗涤。将所有水层用甲苯(20mL)重新萃取，用5％Na2CO3水溶液(2×5mL)、水(10mL)和盐水(5mL)洗涤。合并的有机层经无水硫酸钠干燥、过滤和蒸发至大约20mL体积。向溶液中加入二氯甲烷(20mL)，将混合物在室温搅拌18h。将固体过滤、用1:1MTBE/DCM混合物(2×10mL)洗涤和在高真空下干燥以获得白色固体(7.7g)。此时固体的HPLC指示98.21％SP-4、0.18％未反应的3和0.67％3’,5’-双-氨基磷酸酯杂质。将以上SP-4固体重新溶解在二氯甲烷(77mL,在压力容器中在55℃加热)中，并在室温静置20h。将结晶固体过滤、用冷二氯甲烷(5mL,0℃)洗涤和在高真空下干燥，得到纯产物，为白色固体(6.9g,68％收率,通过HPLC为99.79％纯)。
C或C’的制备和纯化提供了获得SP-4或RP-4的直接途径，如以下实施例中所例证。
实施例11：SP-4的制备(32mg-规模)：在室温历经3min时段，向搅拌的1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮3(32mg,0.12mmol)在无水THF(1mL)中的溶液加入1M氯化叔丁基镁的溶液(0.26mL,0.26mmol,2.1当量)。30min后，历经3min时段逐滴加入(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,SP-异构体)在THF(0.5mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌42h，然后用饱和NH4Cl水溶液(10mL)猝灭。混合物在乙酸乙酯和水之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥和浓缩。残余物使用0-4％甲醇/二氯甲烷梯度层析，获得的SP-4为泡沫状固体(29mg,44.5％收率)。1H和31P NMR与本文公开的一致。
实施例12：SP-4的制备(2.6g-规模，不使用层析)：在室温下历经15min时段，向搅拌的1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(2.6g,10mmol)在无水THF(50mL)中的溶液加入1.7M的氯化叔丁基镁(12.4mL,21mmol,2.1当量))溶液。30min后，历经10min时段逐滴加入(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,S-异构体,4.08g,10mmol)在THF(15mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌60h，然后用饱和NH4Cl水溶液(20mL)猝灭。将混合物在乙酸乙酯(150mL)和顺序地10％Na2CO3水溶液(3×20mL)和水(20mL)之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩，获得浅黄色残余物(3.8g)。将残余物溶解在二氯甲烷(7.6mL)中，然后在室温搅拌20h。将白色固体过滤、用1:1IPE/二氯甲烷(5mL)洗涤和在真空下干燥，获得纯产物，为白色固体(1.85g,35％收率)。
实施例13：使用NaHMDS制备SP-4：在-78℃历经2min时段，向搅拌1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(71mg,0.27mmol)在无水THF(2.0mL)中的溶液加入2.0M的双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠(NaHMDS)在THF(270μL,0.54mmol)中的溶液。30min后，向混合物加入(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]-丙酸异丙酯(8,SP-异构体,111mg,0.27mmol)在THF(1mL)中的溶液。将反应混合物在此温度下搅拌2h，然后升温至-20℃，在该温度下搅拌另外20h。TLC指示～30％未反应的核苷起始材料。因此，向反应混合物加入另外0.5当量的在THF(0.5mL)中的试剂(55mg,0.14mmol)，并搅拌另外6h。将反应混合物用饱和氯化铵水溶液猝灭，然后在乙酸乙酯和水之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥和浓缩，获得浅棕色残余物。使用0-5％甲醇/二氯甲烷梯度的粗产物柱层析获得SP-4(22mg,15％收率)、3’-氨基磷酸酯(5,SP-异构体,11.5mg,16％收率)和双氨基磷酸酯(6,SP,SP-异构体,12.6mg)。
实施例14：RP-4的制备(260mg-规模)：在室温历经5min时段，向搅拌的1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(260mg,1mmol)在无水THF(6mL)中的溶液加入1.7M的氯化叔丁基镁溶液(1.23mL,2.1mmol,2.1当量))。30min后，历经3min时段逐滴加入(S)-2-[(R)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,RP-异构体)在THF(3mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌96h，然后用饱和NH4Cl水溶液(10mL)猝灭。将混合物在乙酸乙酯(50mL)和水(2×20mL)之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩，获得浅黄色残余物(490mg)。残余物使用0-5％甲醇/二氯甲烷梯度层析，获得的产物为白色固体(160mg,30％收率)。
SP-4或RP-4的制备还可通过使3’-经保护的3与适当的试剂C或C’或含有C和C’的混合物反应来制备，如以下实施例所例证的。
实施例15：以3a为合成中间产物制备SP-4
实施例15-1：合成5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷(9):
历经45min时段在环境温度下，向搅拌的2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷(3,81.1g,312mmol)在无水吡啶(750mL)的溶液中逐滴加入TBDMSCl(103.19g,685.6mmol)在无水吡啶(500mL)中的溶液。将反应在环境温度下搅拌24h。向反应混合物加入甲醇(85mL)，将其搅拌10min，然后在减压下将溶剂蒸馏出去。向反应物质加入热水(45℃)(1L)，将混合物用乙酸乙酯(2×500mL)萃取、用水(1×500mL)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥。将乙酸乙酯蒸馏出去，将获得的残余物与甲苯(2×500mL)共蒸发，获得为白色泡沫的粗制的9。产量＝116.9g(定量).1H NMR(CDCl3,300MHz)：δ0.1(s,6H),0.91(s,9H),1.22(d,3H,J＝21Hz),2.50(s,2H),3.75-4.05(m,4H),5.54(d,1H,J＝9Hz),5.73(s,1H),6.0(d,1H,J＝18Hz),7.81(d,1H,J＝9Hz),8.57(br,s,1H),11.1(s,1H)。
实施例15-2：5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3’-乙酰丙基-2’-脱氧-2’-氟2’-C-甲基-尿苷(10)的合成：
向搅拌核苷9(116.9g,312.1mmol)在DCM(1L)中的溶液加入DMAP(30.5g,249.7mmol)，将其在室温下搅拌20min。向混合物中加入乙酰丙酸酐(133.6g,642.3mmol)在DCM(200mL)中的溶液，将其搅拌24h。混合物的TLC指示反应完全。加入冷水(500mL)，将混合物搅拌20min。分离各层，将有机层用饱和碳酸氢钠溶液(2×250mL)洗涤、经无水硫酸钠干燥，然后在减压下蒸馏溶剂，获得黄色油状物。粗产量：197.6g(135％)。将材料原样用于下一步。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ0.11(s,6H),0.94(s,9H),1.34(d,3H,J＝21Hz),2.22(s,3H),2.6-2.89(m,4H),3.72(m,1H),4.01(d,1H,J＝12Hz),4.23(d,1H,J＝9Hz),5.33(dd,1H,J＝15Hz),5.73(d,1H,J＝6Hz),6.26(d,1H,J＝15Hz),8.12(d,1H,J＝12Hz),8.72(br,s,1H)。
实施例15-3：3’-O-乙酰丙基-2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基-尿苷(3a)的合成：
将粗制的10(197.6g～312.1mmol)溶解在DCM(1L)中，向其加入TEA.3HF(50.3g,312.1mmol)，并在环境温度下搅拌过夜。混合物的TLC指示反应完成约50％。加入另一当量TEA.3HF(50.3g,312.1mmol)，将反应混合物搅拌6h。此时的TLC指示约10％未反应的起始材料。加入另外0.25当量TEA.3HF(12.5g,78.0mmol)，将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干燥，获得黄色油状物。来自所有批次的粗制物通过硅胶(0-2％MeOH，于DCM中)柱层析纯化，以获得为白色泡沫固体的124.1g3’-乙酰丙酸酯(从2’-脱氧-2’-氟代-2’-C-甲基尿苷经三步的纯化收率为90％)。1H NMR：(CDCl3,400MHz)δ1.55(d,3H,CH3,J＝20Hz),2.36(s,3H,CH3),2.8-3.03(m,5H,CH2CH3),3.91-3.96(dd,1H,CH”),4.2-4.25(m,1H,CH’),4.34(dd,1H,CH,J＝8Hz),5.25(dd,1H,J＝16Hz),5.93(d,1H,J＝8Hz),8.20(d,1H,J＝8Hz),9.18(s,1H)。
实施例15-4：(S)-2-{[(lR,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-(R)-氟代-3-(4-氧戊酰基)-4-甲基-四氢-呋喃-2-基甲氧基]-苯氧基-磷酰基氨基}-丙酸(S)-异丙酯(11)的立体选择性合成：
向核苷(3a,1.00mmol,358mg)在冷却至0℃的5ml无水THF中的溶液加入tBuMgCl(1.7M，于THF中，2当量)，使其升温至环境温度，并搅拌半小时。一次性向此混合物加入试剂(约97％手性纯度)(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,SP-异构体)(408mg,1.00mmol,1.00当量)，并在室温搅拌。16h后，剩余～30％的起始材料。反应混合物用饱和NH4Cl溶液10ml猝灭，用乙酸乙酯(3×25ml)萃取水相。合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并蒸发至干燥，获得浅黄色泡沫(500mg)。将其使用在二氯甲烷中的2-5％甲醇通过硅胶层析纯化，获得的产物为约97％P手性纯度的白色泡沫物(275mg)和未反应的起始材料(162mg)。基于消耗的起始材料，收率为76％。31P NMR(CDCl3,162MHz)：3.7ppm；1HNMR(CDCl3,400MHz)：δ1.22(dd,6H,J＝6.4Hz),1.37(s,3H),1.58(s,3H),2.18(s,3H),2.63-2.9(m,4H),4.0(d,1H,J＝8Hz),4.2-4.33(m,1H),4.57(d,1H,J＝8Hz),4.96-5.00(sept,1H),5.2(dd,1H,J＝9Hz),5.42(d,1H,J＝8Hz),6.19(d,1H,J＝18Hz),7.15-7.35(m,5H),7.5(d,1H,J＝5.6Hz),8.2(br,s,1H)。
实施例15-5：(S)-2-{[(lR,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-(R)-氟代-3-羟基-4-甲基-四氢-呋喃-2-基甲氧基]-苯氧基-磷酰基氨基}-丙酸(S)-异丙酯(SP-4)的合成
亚硫酸钠溶液通过在水(25mL)中加入Na2S2O3(1.51g)和Na2S2O5(0.57g)制备。向乙酰丙酸酯(11,250mg,0.40mmol)在无水THF(2.5mL)中的溶液加入1.0ml亚硫酸钠溶液。将其在室温搅拌4h。将反应混合物倾注到水(15mL)中，用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，干燥和蒸发，以获得大量约97％P手性纯度的白色固体产物，其与直接从未经保护的核苷产生的SP-4的物理和光谱性质匹配。
实施例16：从3a制备SP-4的可选程序。
在室温历经2min时段，向搅拌的4-氧代-戊酸(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-氟代-2-羟基甲基-4-甲基-四氢-呋喃-3-基酯(3a,210mg,0.59mmol)在无水THF(1.5mL)中的溶液加入1.7M的氯化叔丁基镁溶液(1.07mL,1.82mmol)。最初，观察到白色沉淀物，10min后，反应混合物变为暗黄色溶液。30min后，历经3min时段逐滴加入(S)-2-[(S)-(4-硝基苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]-丙酸异丙酯(8(5p-异构体),382mg,0.94mmol)在THF(1.5mL)中的溶液。将混合物加热至40℃持续5h，此时TLC和1H NMR指示低于2％的未反应的起始材料。将反应物用饱和氯化铵水溶液猝灭，然后在乙酸乙酯和水之间分配。合并的有机层用10％Na2CO3水溶液(3×10mL)、接着是水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥和浓缩，以获得棕色残余物(410mg)。将粗产物溶解在四氢呋喃(1.0mL)中，然后加入亚硫酸钠(37mg,0.295mmol)和亚硫酸氢钠(224mg,1.18mmol)的混合物在1mL水中的水溶液。将混合物在45℃加热20h，在此阶段通过TLC观察到仅约10％转化，因此，加入另外的亚硫酸钠(74mg)和亚硫酸氢钠(448mg)，并继续加热另外52h。此时通过TLC观察到约40％转化。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配。合并的有机层经无水硫酸钠干燥和浓缩，以获得棕色残余物(210mg)。使用0-5％MeOH/DCM梯度的残余物柱层析获得未反应的起始材料(89mg)和SP-4(57mg,18％收率,基于回收的起始材料为24％)。
实施例17：以3c为合成中间产物制备SP-4
实施例17-1.1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧)-3-氟代-5-羟甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮,12的制备。
向3(10.0g,38.43mmol)在吡啶(50mL)中的溶液加入二氯甲烷(50mL)。将溶液冷却至0℃。向溶液加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(14.32g,42.27mmol)，并将溶液在0℃搅拌5h。加入甲醇(5mL)以猝灭反应物。将溶液在减压下浓缩至干燥，将残余物在乙酸乙酯(500mL)和水(50mL)之间分配。有机溶液用盐水(50mL)洗涤和干燥(硫酸钠,4g)。在减压下除去溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷(100mL)中。向该溶液加入咪唑(7.83g,115mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(8.68g,57.6mmol)。将溶液在环境温度下搅拌16h。加入甲醇以猝灭反应物(5mL)，在减压下除去溶剂，并将残余物在乙酸乙酯(500mL)和水(50mL)之间分配。将有机溶液干燥(硫酸钠,4g)和在减压下蒸发。将残余物通过柱层析(10-40％EtOAc，于己烷中)纯化，获得5’-O-DMT-3’-O-tBDMS中间产物产物。这继而用在二氯甲烷(200mL)中的1％三氟乙酸处理。将溶液在环境温度下搅拌1h。加入水(20mL)，并将溶液在环境温度下搅拌另外1h。缓慢加入甲醇(5mL)，并将溶液在环境温度下搅拌另外1h。加入氢氧化铵以将溶液pH调至7。分离有机溶液、干燥(硫酸钠,4g)和在减压下蒸发至干燥。残余物通过硅胶柱层析(1-5％甲醇，于二氯甲烷中)纯化，获得7.5g为白色固体的12，经三步为50％收率。1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm)11.48(br s,1H,NH),7.94(d,1H,H-6),6.00(d,1H,Η-1’),5.69(d,1H,H-5),4.06(dd,1H,3’-H),3.85(m,2H,H-5’a,H-4’),3.58(br d,1H,H-5’b),1.27(d,3H,2-CH3),0.89(s,9H,C(CH3)3),0.12(s,6H,Si(CH3)2)。
实施例17-2：使用1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧)-3-氟代-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮(3c)制备SP-4。
在室温历经2min时段，向搅拌的l-[(2R,3R,4R,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧)-3-氟代-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮(12,374mg,1mmol)在无水THF(3mL)的溶液加入1.7M的氯化叔丁基镁溶液(1.8mL,3.1mmol))。最初，观察到白色沉淀物，10min后，反应混合物变为透明的暗黄色溶液。30min后，历经3min时段逐滴加入(S)-2-[(S)-(4-硝基苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]-丙酸异丙酯(8,SP-异构体,653mg,1.6mmol)在THF(2.5mL)中的溶液。将混合物在40℃加热20h，此时TLC和1H NMR指示低于5％的未反应的起始材料。将反应混合物用饱和氯化铵水溶液猝灭，然后在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层用10％Na2CO3水溶液(3×10mL)、接着是水(20mL)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥和浓缩，获得含有3c的棕色残余物(850mg)。将粗产物溶解在四氢呋喃(2mL)中，并在室温加入0.8mL80％甲酸水溶液。将反应混合物在50℃加热96h。通过TLC观察到约70％转化。将反应混合物倾注到冷饱和碳酸氢钠水溶液，然后在乙酸乙酯和水之间分配。合并的有机层经无水硫酸钠干燥和浓缩，以获得棕色残余物(220mg)。使用0-5％MeOH/DCM梯度的残余物柱层析获得未反应的起始材料(21mg)和SP-4(77mg,35％收率,基于回收的起始材料为39％收率)。
实施例18：以3d作为合成中间产物制备SP-4
实施例18-1：3d的制备
历经15min时段，在0℃下向搅拌的3在吡啶(20mL)中的溶液逐滴加入TIPDS-Cl。将混合物缓慢升温至室温，在该温度下搅拌16h。蒸发吡啶，并将残余物与甲苯(50mL)共蒸发。然后将残余物与己烷一起研磨，并使用Celite垫将白色沉淀物过滤掉。将滤液在减压下浓缩，获得泡沫状固体(12.97g)。将粗产物(13)重新溶解在四氢呋喃(75mL)中，并在0℃历经20min时段加入TFA水溶液(75mL,1:1TFA/水)。将混合物在此温度下搅拌6h。TLC指示～5％的起始材料。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液猝灭，直至pH8，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取物用水洗涤、干燥和浓缩，获得白色结晶固体。进一步研磨固体与己烷(30mL)获得白色固体，将其过滤和在高真空下干燥，获得3d(10.1g,经2步骤为84％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.83(bs,1H),7.94(bd,J＝6.0Hz,1H),6.10(bd,J＝18.4Hz,1H),5.71(d,J＝8.2Hz,1H),4.43(bs,1H),4.36(dd,J＝22.6,9.0Hz,1H),4.27(bs,1H),4.10(d,J＝13.2Hz,1H),4.03(d,J＝9.2Hz,1H),3.92(d,J＝13.2Hz,1H),1.39(d,J＝22.0Hz,3H),1.11-0.92(m,28H)。
实施例18-2：SP-4的制备
在室温下历经15min时段，向搅拌的3d(520mg,1mmol)在无水THF(5mL)中的溶液加入1.7M的氯化叔丁基镁溶液(1.8mL,3.1mmol,3.1当量))。30min后，历经3min时段逐滴加入(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,SP-异构体,653mg,1.6mmol)在THF(1mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌60h。粗样品的1H和31P NMR指示约1:0.76的非对映体混合物。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(20mL)猝灭。将混合物在乙酸乙酯(150mL)和顺序地10％Na2CO3水溶液(3×20mL)和水(20mL)之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩，以获得浅黄色残余物(14,878mg)。
将以上化合物14重新溶解在四氢呋喃(3mL)中，然后加入80％甲酸水溶液。将混合物在55℃加热20h。将反应混合物冷却至0℃，然后用饱和碳酸氢钠水溶液(pH7.0)猝灭。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。合并的有机层经硫酸钠干燥和浓缩，以获得560mg残余物。将残余物使用0-5％甲醇/二氯甲烷梯度层析，获得未反应的起始材料(14,242mg)和SP-4(80mg,15％收率)的白色固体。
实施例19：同位素标记的SP-4的制备
实施例19-1：1-((6aR,8R,9R,9aS)-9-羟基-2,2,4,4-四异丙基四氢-6H-呋喃并[3,2-f][l,3,5,2,4]三氧二硅氧烷(trioxadisilocin)-8-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,16的制备
将尿苷(15,100.0g,409.5mmol)与无水吡啶(600mL)共蒸发至干燥，并重新悬浮于无水吡啶(700mL)。历经60min在环境温度下向此搅拌的精细悬浮液加入1,3-二氯代-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(135.7g,482.5mmol)。将此精细悬浮液在环境温度下搅拌17h后，通过加入甲醇(20mL)猝灭反应物，然后在减压下浓缩。将残余物在乙酸乙酯(1.5L)和水(2L)之间分配。有机层用5％盐酸(2×1L)、盐水(500mL)进一步洗涤，经固体硫酸钠(50g)干燥，过滤和在减压下浓缩为约250g的粗产物。将残余物提交至使用硅胶(1.75kg)和于己烷中20-65％的乙酸乙酯梯度的过滤柱。将通过均相TLC(Rf0.55，于1:1己烷-乙酸乙酯中)判断的纯产物级分合并，并在减压下浓缩和干燥(40℃,0.2mm Hg,24h)，以获得为白色泡沫固体的145.5g(76％)16.还收集略微带杂质的16的另外级分(35g)。1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm)11.35(s,1H,NH),7.66(d,1H,J＝7.6Hz,H-6),5.57(d,1H,J＝4.8Hz,2’-OH),5.50-5.49(m,2H,1’-H和H-5),4.14-4.18(m,3H,2’,3’,4’-H),3.97-3.87(m,2H,5’-Ha和Hb),1.02-0.95(m,28Η,CH(CH3)2)。
实施例19-2：1-((6aR,8R,9aR)-2,2,4,4-四异丙基-9-氧四氢-6H-呋喃并[3,2-f][l,3,5,2,4]三氧二硅氧烷-8-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,17的制备
向干燥的三颈圆烧瓶加入无水DCM(600mL)和DMSO(30.82g,394.5mmol)。将溶液在干冰/丙酮浴中在氮气气氛下冷却至-78℃。历经40min经由注射器加入三氟乙酸酐(纯的,77.7g,369.8mmol)，获得混浊的混合物。历经75min在-78℃经由加成漏斗向混合物逐滴加入尿苷衍生物16在DCM(600mL)中的溶液。将此非均相混合物在-78～-65℃搅拌2h，然后经由注射器快速加入无水三乙胺(92mL)，形成透明的浅黄色溶液。在低温下1h后，反应完成，如TLC(30％EtOAc，于己烷中)所显示的。除去冷却浴，使反应混合物历经1h缓慢升温至环境温度。通过加入饱和NH4Cl(180mL)猝灭反应物。加入水(200mL)，并分离有机层。用DCM(300mL)再次萃取水层。合并的有机层用水(3×400mL)、盐水(150mL)洗涤，并经Na2SO4干燥。除去溶剂获得粘性棕色残余物。
粗油状物残余物(含有痕量DCM)在冰箱中储存过夜。过夜后，在油状物中观察到一些结晶固体。在环境温度下将油状物溶解在500ml己烷中。将溶液在冰箱中储存24小时，形成更多固体。固体经由过滤收集，并用冷的含10％DCM的己烷(1L)漂洗，以除去大部分橙色。将固体(17)在真空下干燥2h，然后空气干燥24h。在50℃在真空干燥后，固体重21g。浓缩滤液，并将残余物经由柱层析(10-70％乙酸乙酯，于己烷中)纯化，以获得另外37g(合并收率为97％)的为浅橙色固体的17。
实施例19-3：1-((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-3-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,18的制备
将用5％盐酸水溶液洗涤和干燥(50℃,0.2mm Hg,24h)的镁(3.53g,147mmol)置于配有磁力搅拌子和冷凝器的两颈圆底烧瓶。向烧瓶充入氩气，然后加入无水醚(80mL)。向在醚中的镁缓慢加入全氘-13C甲基碘(15.06g,110.3mmol)，其产生放热反应。在反应混合物冷却后，在-50℃历经20min将上清液转移至无水的化合物17(50℃,0.2mmHg,15h)(10.0g,20.63mmol)在无水THF(1L)中的溶液。让温度上升至-40℃，并将混合物在-40至-25℃之间搅拌4h。反应完成后，将混合物用-50℃的EtOAc(1L)稀释，然后缓慢加入盐水(300mL)。分离有机层，然后用饱和氯化铵溶液(300mL×2)洗涤和用硫酸钠干燥。过滤和在减压下浓缩后，将残余物溶解在MeOH(250mL)中。加入氟化铵(12g)和TBAF(400mg)。将得到的混合物在90℃搅拌7h，然后与硅胶(20g)一起在减压下浓缩。彻底真空干燥后，将获得的残余物通过快速硅胶柱层析(MeOH:CH2Cl2＝1:20至1:10)纯化，获得为白色固体的化合物18(5g,46％)。1HNMR(DMSO-d6)δ(ppm)11.26(s,1Η,ΝΗ),7.65(d,1H,J＝8.4Hz,H-6),5.77(d,1H,J＝2.4Hz,H-1’),5.57(d,1H,J＝8.0Hz,H-5),5.46(d,1H,J＝5.2Hz,HO-3’),5.24(d,1H,J＝2.4Hz,HO-2’),5.14(t,1H,J＝5.6Hz,HO-5’),3.74-3.56(m,4H,H-3’,4’,5’,5”)。
实施例19-4：乙酸((2R,3R,4S,5R)-3-乙酰氧-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-羟基-4-,3C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)甲酯，19的制备
在环境温度下，向化合物18(5.00g,19.1mmol)在无水吡啶(100mL)中的溶液加入乙酸酐(3mL)。将得到的混合物在环境温度下搅拌15h，用EtOAc(250mL)稀释，用水(50mL×3)洗涤，和用硫酸钠干燥。过滤和浓缩后，将残余物通过快速柱层析(MeOH0至5％，于CH2Cl2中)纯化，以获得为灰色固体的化合物19(4.0g,68％)。
实施例19-5：乙酸((2R,3R,4R,5R)-3-乙酰氧-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-4-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)甲酯，20的制备
在-78℃向化合物19(2.33g,6.73mmol)在无水CH2Cl2(60mL)中的溶液缓慢加入DAST(1.33mL,10.1mmol)。暴露于环境温度后，将得到的混合物搅拌30min。以完全相同的方式进行另外两次2.33g规模反应和一次1.00g规模反应。合并所有四次的反应混合物，用CH2Cl2(300mL)稀释，并用冰-水(100mL×2)、然后是冷NaHCO3水溶液(100mL×2)洗涤。干燥、过滤、和浓缩后，将残余物通过快速硅胶柱层析(EtOAc0％至50％，于己烷中，化合物在48％左右出来)纯化，以获得为白色固体的化合物20(2.0g,自总7.99g化合物19计24％)。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)8.27(s,1H,NH),7.55(d,1H,J＝8.4Hz,H-6),6.17(d,1H,J＝18.8Hz,Η-),5.78(dd,1H,J＝1.2,8.4Hz,H-5),5.12(dd,1H,J＝9.6,21.6Hz,H-3’),4.40-4.31(m,3H,H-4’,5’,5”),2.19(s,3H,CH3),2.15(s,3H,CH3)。
实施例19-6：1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟代-4-羟基-5-(羟基甲基)-3-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,21的制备
向化合物20(2g,5.74mmol)在甲醇(20mL)中的溶液加入正丁胺(6mL)。将得到的混合物在室温搅拌15h和与硅胶在真空浓缩。获得的残余物通过快速硅胶柱层析(MeOH0至10％，于CH2Cl2中)纯化，以获得为白色固体的化合物21(1.3g,85％)。1H NMR(CD3OD)δ(ppm)8.08(d,1H,J＝8.0Hz,H-6),6.13(d,1H,J＝18.4Hz,H-1’),5.70(d,1H,J＝8.0Hz,H-5),3.99(d,1H,J＝13.6Hz,H-5’),3.97-3.91(m,2H,H-3’,4’),3.80(dd,1H,J＝2.0,12.8Hz,H-5”),ESMS(M+l)估计值为265,实测值为265。
实施例19-7：(S)-2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸异丙酯,22的制备
在0℃向未经保护的核苷21(207mg,0.783mmol)和N-甲基咪唑(0.4ml,5mmol)在THF(4mL)中的溶液逐滴加入预制的在THF中的磷酸氯酯(1.0M,2.35ml,2.35mmol)。历经1h将反应物缓慢升温至环境温度，然后加入水(1mL)和EtOAc(5mL)。有机溶液用饱和柠檬酸二钠水溶液(2×2ml)、饱和NaHCO3水溶液(1×2ml)洗涤，干燥(MgSO4)和在减压下浓缩。粗制物通过硅胶柱层析使用在CH2Cl2中的0至5％iPrOH作为洗脱剂纯化，获得为白色固体的氨基磷酸酯,22(216mg,52％,1:1的P-非对映体混合物)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),7.56(d,J＝6.8Hz,1H),7.40-7.35(m,2H),7.23-7.18(m,3H),6.14-5.96(m,2H),5.89(dd,J＝5.6,25.6Hz,1H),5.55(t,J＝8.4Hz,1H),4.85(dq,J＝1.6,6.0Hz,1H),4.44-4.32(m,1H),4.25(m,1H),4.06-3.98(m,1H),3.86-3.70(m,2H),1.30-1.08(m,9H)；31PNMR(162MHz,DMSO-d6)δ4.90,4.77；LRMS(ESI)[M+H]+计算值为C21 13CH27D3FN3O9P534.5,实测值为534.4。
实施例19-8：(2S)-2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟代-3-羟基-4-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(羟基)磷酰基)氨基)丙酸,23的制备
将氨基酸磷酸酯22(147mg,0.276mmol)悬浮在三乙胺(2mL)和水(0.5mL)中，在60℃加热30h。然后在减压下蒸发挥发性组分。粗制物通过硅胶柱层析通过用在CH2Cl2中的50-70％iPrOH，然后在iPrOH中的0至20％NH4OH洗脱而纯化，获得为白色固体的23(95mg,83％)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.00(d,J＝8.4Hz,1H),5.98(d,J＝19.2Hz,1H),5.52(d,J＝8.4Hz,1H),4.02-3.81(m,4H),1.10(d,J＝6.8Hz,3H)；31P NMR(162MHz,-OMSO-d6)δ8.12；LRMS(ESI)[M+H]+计算值为C12 13CH17D3FN3O9P416.3,实测值为416.4。
RP-4、4、和SP-4样品的性质
通过以下分析RP-4、4、和SP-4的样品：X-射线粉末衍射(XRPD)、核磁共振(NMR)光谱学、傅里叶变换红外(FT-IR)光谱学、差示扫描量热法(DSC)、热重量分析(TGA)、重量蒸汽吸收(GVS)、热动力学水溶解度和高效液相层析(HPLC)。
实施例20：X-射线粉末衍射
根据以下方案通过X-射线粉末衍射(XRPD)分析RP-4、4、和SP-4样品。
a.Bruker AXS/Siemens D5000
使用以下在Siemens D5000衍射仪上收集X-射线粉末衍射模式：Cu Kα辐射(40kV,40mA)、θ-θ测角计、V20散度和接收狭缝、石墨二级单色仪和闪烁计数器。使用认证的Corundum标准(NIST1976)检查仪器性能。用于数据采集的软件是Diffrac Plus XRPDCommanderv2.3.1，并使用Diffrac Plus EVA v11.0.0.2或v13.0.0.2分析和呈现数据。
环境条件
环境条件下的样品运行制备为利用收到的粉末的平板样本。将大约35mg样品轻轻装到切割成磨光的、零背景(510)硅晶片的腔中。在分析过程中，使样品在其自身平面中旋转。数据采集的详细内容为：角范围：2至42°2θ；步长：0.05°2θ；和采集时间：4s.步-1。
b.Bruker AXS C2GADDS
使用以下在Bruker AXS C2GADDS衍射仪上收集X-射线粉末衍射模式：Cu Kα辐射(40kV,40mA)、自动XYZ平台、用于样品自动定位的激光视频显微镜和HiStar2-维区域探头。X-射线光学由与0.3mm针孔准直管耦合的单一多层镜组成。
束流散度，即X-射线束在样品上的有效大小，为大约4mm。用20cm的样品-探头距离进行θ-θ连续扫描模式，这产生3.2°-29.7°的有效2θ范围。通常将样品暴露于X-射线束120秒。用于数据采集的软件是用于WNT4.1.16的GADDS并使用Diffrac Plus EVA v9.0.0.2或v13.0.0.2分析和呈现数据。
环境条件
环境条件下的样品运行使用收到的粉末、无需研磨制成平板样本。将大约1-2mg样品轻轻压到玻片以获得平坦表面。
X-射线粉末衍射(XRPD)
通过XRPD发现4是无定形的(参见图1)。根据实施例3制备的RP-4的高分辨率XRPD分析确认展现与SP-4(根据实施例4，方法4制备)不同的粉末模式的结晶固体，SP-4也被确认为结晶固体。RP-4和SP-4的XRPD结果表显示于表1，排除展现≤5％(RP-4)和≤3％(SP-4)的强度的所有峰。
表1.RP-4和SP-4的XRPD数据。
用研杵和研钵研磨SP-4样品，然后接连穿过500和250μm筛，以产生为精细粉末的样品。通过高分辨率XRPD再次分析样品，确认未发生形式改变。
实施例21：SP-4的结晶研究。
结晶SP-4展现出多晶型性。因此，一方面涉及结晶SP-4和其各种多晶型形式。SP-4可以至少五种多晶型形式存在，命名为形式1-5。此外，还可制备无定形的SP-4。典型的结晶提供约100mg SP-4在适当体积的结晶溶剂(乙腈(5vol)、氯仿(5vol)、乙酸正丁酯(7vol)、二氯甲烷(50vol)、茴香醚(7vol)、和1:1MTBE/庚烷(50vol))中的溶解，然后将溶液在5℃蒸发。获得各种结晶形式，但是每种形式在过滤和/或干燥后均获得形式1。
形式1、2和3分别是非溶剂化形式、1:1DCM溶剂化物和1:1氯仿溶剂化物，如通过单晶X-射线和XRPD分析所确认的。形式4和5分别获自SP-4从乙腈和茴香醚溶液的结晶。未收集到足够的数据来确定形式4和5是非溶剂化的、水化的或溶剂化的，原因是未获得足够质量的单晶。形式4和5经过滤转化为形式1。在从乙酸正丁酯(“BuAc)和含有甲基叔丁基醚(MTBE)和庚烷的溶液结晶SP-4时，获得另外两种结晶形式；过滤后，这两种结晶形式均转化为形式1。形式2和3也经分离转化为形式1。形式1是展现出广泛的熔化吸热的非溶剂化形式，熔化吸热的开始温度是94.3℃和ΔHfus为24.0kJ mol-1。SP-4形式1的另外的XRPD模式描绘于图4。
SP-4的形式1至SP-4的形式6的转变
形式1可以至少两种方式转变为形式6。
首先，通过使形式1的精细晶体暴露于大气湿度几天，产生具有固化胶外观的形式1的一水化物。将一水化物固体研磨成精细粉末后，XRPD模式保持与形式1一致。在开放容器中静置6-10周后，研磨的材料缓慢地变成为无水固体的形式6。形式1在密封容器中稳定至少2年。
可选地，可在环境温度下将形式1以5-50mg/mL悬浮于水中，历经几小时后，其转化为形式6。水转化过程的效率可通过加热水至溶解更多形式1和将SP-4的不混溶部分的流动性从硬胶状增加至相当于悬浮的油状物或以上的程度而改进。随时间流逝，形式6可在50℃开始结晶析出。将悬浮液进一步冷却至0-10℃导致固体的更高回收。从水中结晶还除去了极性更高的痕量杂质，导致总纯度提高。
将形式6重新溶解到有机溶剂(诸如二氯甲烷或乙腈)中接着结晶提供形式1，即使在以结晶形式6引晶时也如此。
向干燥的100mL配有橡胶隔板和磁力搅拌棒的一颈圆底烧瓶装入1.04克SP-4，形式1。HPLC纯度99.7％。装入40mL去离子水。在加热至50℃的同时开始剧烈搅拌悬浮液。一旦温度达到50℃，将大致均匀的溶液保持60min，在这一过程中，固体开始从溶液中沉淀，形成稀薄的浆状物。历经90min将浆状物冷却至20℃，并在20℃保持16小时，接着历经30min进一步冷却至0-5℃并在0-5℃保持2.5小时。将浆状物在中等孔度的玻璃烧结漏斗上过滤，并用10mL冰冷过的水洗涤。将湿饼抽吸干燥2小时，然后在真空炉中在50℃过夜干燥23小时。分离到0.88g(84.6％回收率)SP-4，形式6。
形式6具有约124.5-126℃的观察熔点。
实施例21-1：SP-4形式1
SP-4形式1的峰列表呈现于表2。
角 强度％
2-θ° ％
5.0 74.8
7.3 100.0
7.8 2.2
8.2 6.8
8.8 9.3
9.4 23.5
10.0 8.4
11.4 4.2
13.3 3.0
14.2 6.1
14.9 3.5
16.1 7.9
16.6 13.2
角 强度％
2-θ° ％
17.3 15.4
17.7 10.1
18.1 42.6
18.4 7.6
18.7 11.4
18.9 5.7
19.3 5.0
19.6 2.9
20.2 8.5
20.5 11.5
20.8 3.6
21.8 7.2
22.0 14.5
22.4 9.6
23.2 5.3
23.4 5.8
23.5 4.6
23.8 7.4
24.0 3.1
24.7 2.5
25.0 13.0
25.5 3.1
26.6 4.5
27.2 3.2
27.5 2.2
28.1 2.9
30.0 3.2
实施例21-2：SP-4形式2
SP-4形式2的XRPD模式描绘于图5。
SP-4形式2的峰列表呈现于表3。
角 强度％
2-θ° ％
4.9 44.1
5.1 19.1
6.9 62.1
8.7 6.8
9.8 28.6
10.1 10.4
13.7 7.0
16.7 3.1
19.5 8.9
19.8 45.5
20.1 18.6
20.4 3.6
20.6 25.6
20.9 15.9
21.1 10.9
22.1 3.4
24.6 38.7
24.7 100.0
25.1 61.2
26.1 53.3
39.0 6.3
实施例21-3：SP-4形式3
SP-4形式3的XRPD模式描绘于图6。
SP-4形式3的峰列表呈现于表4。
角 强度％
2-θ° ％
5.0 10.0
6.9 23.3
9.8 22.6
19.7 34.8
20.6 100.0
21.8 10.5
24.6 65.3
34.7 4.1
实施例21-4：SP-5形式4
SP-4形式4的XRPD模式描绘于图7。
SP-4形式4的峰列表呈现于表5。
角 强度％
2-θ° ％
5.0 29.8
6.8 100.0
8.2 4.8
8.7 5.2
9.9 3.8
13.7 1.7
14.9 4.8
19.9 22.5
20.4 2.1
20.6 20.0
20.9 20.0
24.7 3.4
24.9 29.9
25.1 1.5
36.8 3.1
实施例21-5：SP-4形式5
SP-4形式5的XRPD模式描绘于图8。
SP-4形式5的峰列表呈现于表6。
角 强度％
2-θ° ％
5.2 52.9
6.6 100.0
7.1 25.9
9.7 12.1
10.4 16.4
13.4 11.4
15.7 25.8
19.1 31.1
19.9 12.9
20.0 9.0
21.3 3.5
25.0 22.3
25.6 2.3
26.3 5.9
26.9 2.0
31.7 2.1
实施例21-5：SP-4形式6
SP-4形式6的XRPD模式描绘于图21。
SP-4形式6的峰列表呈现于下表中。
实施例21-7：SP-4(无定形的)
无定形的SP-4的XRPD模式描绘于图9。
实施例22：SP-4和其溶剂化物的单晶X-射线晶体学
实施例22-1：SP-4(形式1)的单晶X-射线晶体学
图10显示SP-4形式1的X-射线晶体结构。其中，该图从晶体结构显示了形式1的分子的视图，显示了所用的编号方案。非氢原子的各向异性原子位移椭圆面以50％概率水平显示。氢原子以任意的小辐射线显示。
结构解决方案通过直接方法获得：对F2的全矩阵最小二乘完善，权重w-1＝σ2(Fo 2)+(0.0592P)2+(0.6950P)，其中P＝(Fo 2+2Fc 2)/3，各向异性位移参数(使用球面谐波的经验吸收校正)在SCALE3ABSPACK定标算法中执行。最终wR2＝{Σ[w(Fo 2-Fc 2)2]/Σ[w(Fo 2)2]1/2}＝0.0871，这是对于所有数据，7090反射的F值的常规R1＝0.0329且Fo＞4σ(Fo)，对于所有数据S＝1.016和870参数。最终Δ/σ(最大)0.001，Δ/σ(平均)，0.000。最终差异图在+0.534和之间。
表7.形式1的单晶参数
实施例22-2：SP-4(形式2)的单晶X-射线晶体学
图11显示SP-4形式2的X-射线晶体结构。其中，该图从晶体结构显示了形式2的分子的视图，显示了所用的编号方案。由于数据非常微弱，以各向同性解析杂原子。氢原子未显示。
结构解决方案通过直接方法获得：对F2的全矩阵最小二乘完善，权重w-1＝σ2(Fo 2)+(0.0975P)2+(10.6969P)，其中P＝(Fo 2+2Fc 2)/3，各向异性位移参数，使用球面谐波的经验吸收校正，在SCALE3ABSPACK定标算法中执行。最终wR2＝{Σ[w(Fo 2-Fc 2)2]/Σ[w(Fo 2)2]1/2}＝0.1883，这是对于所有数据，2525反射的F值的常规R1＝0.0741且Fo＞4σ(Fo)，对于所有数据S＝1.05和158参数。最终Δ/σ(最大)0.000，Δ/σ(平均)，0.000。最终差异图在+1.388和之间。
表8.形式2的单晶参数
实施例22-3：SP-4(形式2)的单晶X-射线晶体学
图12描绘SP-4(形式2)的X-射线晶体结构(ORTEP-各向异性)。SP-4(形式2)的二氯甲烷溶剂化物C23H31N3PO9FCl2的晶体结构产生单斜晶空间群P21(系统消光0k0：k＝奇数)， Z＝2和dcalc＝1.449g/cm3。X-射线强度数据在Rigaku Mercury CCD区域检测器上采用石墨-单色Mo-Kα辐射()在143K温度下采集。从一系列十二个0.5°旋转图像以30秒曝光进行初步索引。总共采集648个旋转图像，晶体与检测器距离为35mm，2θ旋角为-12°，旋转宽度为0.5°和30秒曝光：第1号扫描为以ω＝10°和χ＝20°进行的从315°至525°的-扫描；第2号扫描为以χ＝-90°和进行的从-20°至5°的ω-扫描；第3号扫描为以χ＝-90°和进行的从-20°至4°的ω-扫描；第4号扫描为以χ＝-90°和进行的从-20°至5°的ω-扫描；第5号扫描为以χ＝-90°和进行的从-20°至20°的ω-扫描。旋转图像使用CrystalClear(CrystalClear：Rigaku Corporation，1999)处理，产生未平均的F2和σ(F2)值的列表，然后将其传递至CrystalStructure(CrystalStructure：CrystalStructure Analysis Package，Rigaku Corp.Rigaku/MSC(2002))程序包用于进一步处理，和Dell Pentium III计算机上的结构解决方案。在5.48≤2θ≤50.04°、-14≤h≤15、-7≤k≤6、-19≤l≤21范围测量了总共7707次反射，产生4253次独特反射(Rint＝0.0180)。校正强度数据以用于洛伦兹(Lorentz)和偏振效应和用于使用REQAB(最小和最大透射0.824、1.000)的吸收。
结构通过直接方法解析(SIR97，SIR97：Altomare,A.,M.Burla,M.Camalli,G.Cascarano,C.Giacovazzo,A.Guagliardi,A.Moliterni,G.Polidori&R.Spagna(1999).J Appl.Cryst.,32,115-119)。通过全矩阵最小二乘基于F2使用SHELXL-97(SHELXL-97:Sheldrick,G.M.(2008)ActaCryst,A64,112-122)进行完善。在完善过程中使用所有反射。所用的权重方案为其中。各向异性地完善非氢原子，而使用“搭乘(riding)”模型完善氢原子。完善收敛于R1＝0.0328和wR2＝0.0817，对于4046次反射，其F>4σ(F)和R1＝0.0348、wR2＝0.0838和GOF＝1.056，对于4253次独特的、非零反射和358个变量(R1＝Σ‖Fo|-|Fc‖/Σ|Fo|； 其中n＝反射数量和p＝完善的参数的数量)。最小二乘的最终循环中的最大Δ/σ为0.000和最终差异傅里叶中两个最凸出的峰是+0.312和Flack绝对结构参数完善于-0.06(6)，因此确证了标题化合物的立体化学。
表1列出了晶胞信息、数据采集参数、和完善数据。最终的位置和等同的各向同性热力学参数在表2中给出。各向异性热力学参数在表3中。(“ORTEP-II：A Fortran ThermalEllipsoid Plot Program for晶体Structure Illustrations”.C.K.Johnson(1976)ORNL-5138.)展示了具有30％概率热力学椭圆面的分子的代表。
表9.化合物SP-4·CH2Cl2结构确定概述。
晶胞常数：
实施例22-4：SP-4(形式3)的单晶X-射线晶体学
图13显示SP-4形式3的X-射线晶体结构。其中，该图从晶体结构显示了形式3的分子的视图，显示了所用的编号方案。非氢原子的各向异性原子位移椭圆面以50％概率水平显示。氢原子以任意的小辐射线显示。
结构解决方案通过直接方法获得：对F2的全矩阵最小二乘完善，权重w-1＝σ2(Fo 2)+(0.0512P)2+(0.6810P)，其中P＝(Fo 2+2Fc 2)/3各向异性位移参数(使用球面谐波的经验吸收校正)在SCALE3ABSPACK定标算法中执行。最终wR2＝{Σ[w(Fo 2-Fc 2)2]/Σ[w(Fo 2)2]1/2}＝0.0796这是对于所有数据，2486反射的F值的常规R1＝0.0294且Fo＞4σ(Fo)，对于所有数据S＝1.068和377参数。最终Δ/σ(最大)0.001，Δ/σ(平均)，0.000。最终差异图在+0.211和之间。
表10.形式3的单晶参数
实施例23：在较高温度和相对湿度下的稳定性
将RP-4样品在湿化室中在40℃和75％相对湿度下储存一周，并通过XRPD重新分析样品。获得的RP-4粉末模式显示实验过程中无显著变化，表明没有观察到固体形式的变化。这应与4的样品形成对比，4的样品在40℃和75％相对湿度下储存时在约16小时潮解。事实上，4的潮解性质的例证是通过以下例证的。使4的样品穿过250μm筛，然后在40℃/75％RH和25℃/53％相对湿度下储存，定期进行目测观察。结果在表4中给出。
表11.4对较高的相对湿度的稳定性。
在40℃和75％相对湿度下储存时，SP-4在16小时内潮解。例如，用研杵和研钵研磨SP-4的样品，然后接连穿过500和250μm筛，产生样品的精细粉末。将此材料样品储存在40℃和75％相对湿度和25℃和53％RH下，定期精细目测观察。结果在表5中给出。
表12.SP-4对较高的相对湿度的稳定性。
在25℃和53％RH下储存104小时后样品的XRPD分析显示产生的衍射图没有显著改变，表明没有发生形式变化。
实施例24.傅里叶变换-红外(FT-IR)光谱法
在配有通用Attenuated Total Reflectance(ATR)采样附件的Perkin-ElmerSPectrum One上采集数据。使用Spectrum v5.0.1软件采集并分析数据。
获得的4、RP-4、和SP-4的IR光谱分别显示于图5-7。下面陈述了以波数(cm-1)显示的选定峰：
4：～1680、～1454、～1376、～1205、～1092、～1023(图14)；
RP-4：～1742、～1713、～1679、～1460、～1377、～1259、～1157、～1079(图15)；和
SP-4(形式1)：～1743、～1713、～1688、～1454、～1378、～1208、～1082(图16)。
实施例25：差示扫描量热法(DSC)热重量分析(TGA)
DSC数据在配有50位自动采样器的TA Instruments Q2000上采集。热容的校准使用蓝宝石校准。能量和温度的校准使用认证的铟进行。
调节温度的DSC通常以0.8-1.2mg每种样品、在有针孔的铝盘中、使用2℃.min-1的基础加热速率以及±0.2℃.min-1和40秒的温度调节参数。样品上方保持50ml.min-1的干燥氮气清扫。
仪器控制软件是Advantage for Q Series v2.8.0.392和Thermal Advantagev4.8.3，并使用Universal Analysis v4.3A分析数据。
DSC数据在配有34位自动采样器的Mettler DSC823e上采集。使用认证的铟校准仪器的能量和温度。通常将在有针孔的铝盘上的0.8-1.2mg每种样品以10℃.min-1从25℃加热至250℃。在样品的上方保持50ml.min-1的氮气清扫。仪器控制和数据分析软件是STARev9.20。
SP-4(形式6)的DSC数据使用DSC仪器(TA Q2000)、使用10℃/min的加热速率在干燥的氮气的连续气流(100ml/min)中采集。准确称重大约2.2mg样品，将其在非全密封的具有松散配合的盖的‘Tzero’盘中加热。仪器用(焓和温度)铟标准和(热容)蓝宝石标准校准。不确定性估计是温度为±0.1℃和测量的焓为±5％。采用TA Universal Analysis软件测量起始温度。
TGA数据在配有34位自动采样器的Mettler TGA/SDTA851e上采集。使用认证的铟校准仪器的温度。通常将8-12mg每种样品加载到预称重的铝坩埚上，并以10℃.min-1从环境温度加热至350℃。在样品上方保持50ml.min-1的氮气清扫。仪器控制和数据分析软件是STARe v9.20。
4的DSC分析显示起始于58.7℃的单一宽吸热峰(ΔΗ14J.g-1)，通过进一步的调节DSC分析证实是由于玻璃转变过程中的分子弛豫(图17)。4的TGA分析显示在高于240℃分解之前没有重量损失，证实该材料是非溶剂化的。因为4的XRPD分析证实该材料是无定形的，进行调节DSC分析以试图计算玻璃转化温度，发现该温度为57℃。
DSC分析显示显示起始于136.2℃的单一窄吸热峰(ΔΗ76J.g-1)，通过热台显微术证实为熔体。参见图18。RP-4的TGA分析显示在高于240℃分解之前没有重量损失，证实该材料是非溶剂化的。
SP-4的DSC分析显示起始于93.9℃的单一宽吸热峰(ΔΗ43J.g-1)，通过热台显微术证实为熔体。参见图19。SP-4的TGA分析显示在高于240℃分解之前没有重量损失，证实该材料是非溶剂化的。
SP-4(形式6)显示的DSC分析显示起始于120.7℃的单一宽吸热峰(ΔΗ79J.g-1)。
实施例26：重量蒸汽吸收(GVS)
SMS DVS固有
吸收等温线使用由SMS Analysis Suite软件控制的SMS DVS固有水分吸收分析仪获得。通过仪器控制保持温度在25℃。通过混合干湿氮气气流控制湿度，总流速为200ml.min-1。通过位于样品附近的校准的Rotronic探头(动态范围1.0-100％RH)测量相对湿度。通过微天平(精确度±0.005mg)不断地监测为％RH的函数的样品重量变化(质量弛豫)。
通常在环境条件下将5-20mg样品置于去了皮重的网状不锈钢篮。在40％RH和25℃(典型的室内条件)装载和卸载样品。以下面所列进行水分吸收等温线(2次扫描给出1个完整循环)。标准等温线在25℃下以10％RH间隔在0.5-90％RH范围内进行。
表13.SMS DVS固有实验的方法参数
参数 数值
吸收-扫描1 40-90
解吸/吸收-扫描2 90–0,0–40
间隔(％RH) 10
扫描数 2
流速(ml.min-1) 200
温度(℃) 25
稳定性(℃.min-1) 0.2
吸收时间(小时) 6小时停止
完成等温线后回收样品，并通过XRPD重新分析。
GVS分析显示RP-4是非吸湿的，展现出从0至90％相对湿度大约0.2wt％的水的可逆吸收。GVS实验后通过XRPD对样品的重新分析显示形式未改变。
用研杵和研钵研磨SP-4的样品，然后接连穿过500和250μm筛，产生样品的精细粉末，然后使用修改的单循环方法分析。使样品从40％RH(大约环境的)至60％RH，而不是标准方法的90％，然后循环至0％并回到40％RH。此分析显示SP-4是在高达60％RH下非吸湿的，具有从0至60％RH按重量计～0.2％的水的可逆吸收。
实施例27：热动力学水溶解度
通过将足量的化合物悬浮在水中产生化合物母体游离形式的≥10mg.ml-1的最大终浓度来测定水溶解度。将悬浮液在25℃平衡24小时，然后测量pH。然后将悬浮液滤过玻璃纤维C过滤器至96孔板中。然以101系数稀释滤液。通过HPLC参考在DMSO中的大约0.1mg.ml-1标准溶液进行定量。注射不同体积的标准、稀释和未稀释样品溶液。使用通过在与标准注射中的主峰相同的保留时间发现的峰的积分确定的峰面积计算溶解度。
表14.溶解度测量的HPLC方法参数
在以上所述条件下在配有二极管阵列检测器的Agilent HP1100系列系统上和使用ChemStation软件vB.02.01-SRI进行分析。
表15.RP-4、4、和SP-4的水溶解度结果。
实施例28：通过HPLC确定化学纯度
可使用各种HPLC条件来确定本文公开的化合物的化学纯度。一个此类实例是以上关于热动力学水溶解度研究所公开的。另一实例是以下所公开的。
HPLC条件：
LC：Waters Alliance2695分离模块、Waters2996PDA检测器和Waters Empower2软件(版本6.00)
柱：Phenomenex Luna CI8(2)；4.6x50mm；3μm
流速：1.2mL/min
注射体积 10μL
流动相：溶剂A：95％水和5％甲醇和10mM乙酸铵；pH～5.3
溶剂B：MeOH和10mM乙酸铵
在这些条件下，确定4、RP-4、和SP-4的纯度分别为～99.6、～99％、和～99.5％。应注意，通过优化以上公开的方法，可以实现更高的纯度。
检查XRPD衍射图显示两种结晶单一非对映体产生截然不同的XRPD模式。另外，两种结晶非对映体的熔点也截然不同，RP-4具有比SP-4高出相当多的起始温度(136℃对94℃)。
实施例29：另外的分离方法
以下SFC分离(条件列于下面)产生非对映体RP-4和SP-4的混合物的充分分离。
制备方法： 分析方法：
ChiralPak AS-H(2×25cm)SN#07-8656 ChiralPak AS-H(2×0.46cm)
20％甲醇/CO2(100巴) 20％甲醇/CO2(100巴)
50ml/min，220nm. 3ml/min，220nm.
浓度：260mg/30ml甲醇；注射体积：1.5ml
以下SFC分离(条件列于下面)产生非对映体RP-4和SP-4的混合物的充分分离。
制备方法： 分析方法：
ChiralPak IA(2×15cm)802091 ChiralPak IA(15×0.46cm)
30％异丙醇(0.1％DEA)/CO2，100巴 40％甲醇(DEA)/CO2，100巴
60ml/min，220nm. 3ml/min，220nm.
注射体积：2mL，20mg/mL甲醇
表16.RP-4、4、和SP-4分批表征结果概述
实施例30：8(SP-异构体)的X-射线晶体学
化合物8(SP-异构体)，C18H21N2PO7，以单斜晶空间群P21(系统消光0k0：：k＝奇数)，β＝92.891(3)°，Z＝4，和dcalc＝1.397g/cm3。X-射线强度数据在Bruker APEXII CCD区域检测器上采用石墨-单色Mo-Kα辐射()在100(1)K温度下采集。图20A和20B分别显示不对称单元的编号为1和2的分子。
从一系列36个0.5°旋转帧(rotation frames)进行初步索引，曝光为30秒。总共采集3608帧，晶体与探测器距离为70.00mm，旋转宽度为0.5°和曝光为20秒：
使用SAINT(Bruker(2009)SAINT.Bruker AXS Inc.，Madison，Wisconsin，USA.)对旋转帧积分，产生未平均F2和σ(F2)值的列表，然后将其传至SHELXTL(Bruker(2009)SHELXTL.Bruker AXS Inc.，Madison，Wisconsin，USA.)程序包用于进一步处理和DellPentium4计算机上的结构解决方案。在1.58≤θ≤25.09°、-6≤h≤6、-18≤k≤18、-28≤l≤28范围测量了总共6909次反射，产生6909次独特反射(Rint＝0.0581)。校正强度数据以用于洛伦兹和偏振效应和用于使用SADABS(Sheldrick,G.M.(2007)SADABS.University ofGottingen，Germany.)(最小和最大透射0.6093、0.7452)的吸收。
通过直接方法解析(SHELXS-97(Sheldrick,G.M.(2008)Acta Cryst.A64,112-122.))结构。通过全矩阵最小二乘基于F2使用SHELXL-97(Sheldrick,G.M.(2008)ActaCryst.A64,112-122.)进行完善。在完善过程中使用所有反射。所用的权重方案为w＝1/[σ2(Fo 2)+(0.0000P)2+14.0738P]其中P＝(Fo 2+2Fc 2)/3。各向异性地完善非氢原子，而使用“搭乘”模型完善氢原子。完善收敛于R1＝0.0847和wR2＝0.1899，对于6173次观察到的反射，其F>4σ(F)和R1＝0.0963和wR2＝0.1963和GOF＝1.119，对于所有6909次独特的、非零反射和512个变量(R1＝Σ‖Fo|-|Fc‖/Σ|Fo|；wR2＝[Σw(Fo 2-Fc 2)2/Σw(Fo 2)2]1/2；GOF＝[Σw(Fo 2-Fc 2)2(n-p)]1/2；其中n＝反射数量和p＝完善的参数的数量)。最小二乘的最终循环中的最大Δ/σ为0.000和最终差异傅里叶中两个最凸出的峰是+0.402和图20A和20B是不对称单元的分子1和2的ORTEP(30％概率热椭圆面)。
表17.化合物8(SP-异构体)结构测定概述
实施例32：(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯的X-射线晶体学
(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)-氨基)丙酸异丙酯，C18H17NPO5F5，以三斜晶空间群P1结晶， α＝74.960(4)°，β＝83.959(4)°，γ＝80.275(4)°，Z＝2，和dcalc＝1.520g/cm3。X-射线强度数据在Bruker APEXII CCD区域检测器上采用石墨-单色Mo-Kα辐射()在143(1)K温度下采集。从一系列36个0.5°旋转帧进行初步索引，曝光为20秒。总共采集3593帧，晶体与探测器距离为37.600mm，旋转宽度为0.5°和曝光为20秒：
使用SAINT(Bruker(2009)SAINT.Bruker AXS Inc.，Madison，Wisconsin，USA.)对旋转帧积分，产生未平均F2和σ(F2)值的列表，然后将其传至SHELXTL(Bruker(2009)SHELXTL.Bruker AXS Inc.，Madison，Wisconsin，USA.)程序包用于进一步处理和DellPentium4计算机上的结构解决方案。在1.77≤θ≤25.12°、-6≤h≤6、-14≤k≤14、-19≤l≤19范围测量了总共17880次反射，产生6897次独特反射(Rint＝0.0212)。校正强度数据以用于洛伦兹和偏振效应和用于使用SADABS(Sheldrick,G.M.(2007)SADABS.University ofGottingen，Germany.)(最小和最大透射0.6887、0.7452)的吸收。
通过直接方法解析(SHELXS-97(Sheldrick,G.M.(2008)Acta Cryst.A64,112-122.))结构。通过全矩阵最小二乘基于F2使用SHELXL-97(Sheldrick,G.M.(2008)ActaCryst.A64,112-122.)进行完善。在完善过程中使用所有反射。所用的权重方案为w＝1/[σ2(Fo 2)+(0.0344P)2+0.1102P]，其中P＝(Fo 2+2Fc 2)/3。各向异性地完善非氢原子，而使用“搭乘”模型完善氢原子。完善收敛于R1＝0.0259和wR2＝0.0609，对于6527次观察到的反射，其F>4σ(F)和R1＝0.0284和wR2＝0.0621和GOF＝1.040，对于所有6897次独特的、非零反射和548个变量。(R1＝Σ‖Fo|-|Fc‖/Σ|Fo|；wR2＝[Σw(Fo 2-Fc 2)2/Σw(Fo 2)2]1/2；GOF＝[Σw(Fo 2-Fc 2)2/(n-p)]1/2；其中n＝反射数量和p＝完善的参数的数量)。最小二乘的最终循环中的最大Δ/σ为0.001和最终差异傅里叶中两个最凸出的峰是+0.254和图22A和22B是不对称单元的分子1和2的ORTEP(30％概率热椭圆面)。
表18.(S)-2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯结构测定概述
实施例33：生物活性
将含有复制子的细胞以3,000细胞/孔(50μL)接种在96-孔白色/不透明板中，或以1,500细胞/孔(25μL)接种在384-孔白色/不透明板中。将50μL2X化合物加入96孔板或将25μL2X化合物加入384孔板。将板在37℃在潮湿的5％CO2气氛中孵育4天。孵育后，加入Bright-Glo试剂(50μL用于96-孔板，或25μL用于384-孔板)以测量HCV复制的萤火虫荧光素酶报告基因。针对无药物对照计算抑制百分比。
已证实RP-4和SP-4具有广泛的基因型覆盖。例如，二者均显示针对丙型肝炎病毒基因型1-4的活性。
本申请是2010年5月20日提交的美国专利申请第12/783,680号的部分继续申请案，该申请要求2009年5月20日提交的美国临时专利申请第61/179,923号和2010年3月31日提交的美国临时专利申请第61/319,513号的优先权，其主题通过引用整体并入本文。
美国专利申请第12/783,680和12/053,015号和2009年5月20日提交的美国临时专利申请第61/179,923和2010年3月31日提交的美国临时专利申请第61/319,513号的主题通过引用整体并入本文。所有引用的参考文献的主题通过引用并入本文。在并入的术语的含义与本文定义的术语的含义冲突的情况下，以本公开中包含的术语的含义为准。

Claims (5)

1.一种制备由下式表示的结晶的2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸(S)-异丙酯的方法，
所述方法包括：
使2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸(S)-异丙酯从第二组合物中结晶，所述第二组合物包含
a)第一组合物；
b)五氟苯酚；
c)非亲核性碱，其选自二异丙胺、二异丙基乙胺、三乙胺、奎宁环、萘-1,8-二胺、2,2,6,6-四甲基哌啶、1,8-二氮杂双环十一-7-烯、4-二甲基氨基-吡啶、吡啶、2,6-二-C1-6-烷基-吡啶、2,4,6-三-C1-6-烷基-吡啶、l,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷和其混合物；和
d)液体组合物；
其中所述第一组合物包含2-(((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸(S)-异丙酯和2-(((R)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸(S)-异丙酯，并且其中所述液体组合物包含C2至C8醚、C3至C7酯、和C5至C12饱和烃中的至少一种。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述结晶发生在-10℃至+40℃范围内的温度下。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述结晶发生在室温下。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述非亲核性碱是三乙胺。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述液体组合物包含乙酸乙酯、叔丁基甲醚、和己烷中的至少一种。
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