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CH676600A5 - - Google Patents

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CH676600A5
CH676600A5 CH2240/87A CH224087A CH676600A5 CH 676600 A5 CH676600 A5 CH 676600A5 CH 2240/87 A CH2240/87 A CH 2240/87A CH 224087 A CH224087 A CH 224087A CH 676600 A5 CH676600 A5 CH 676600A5
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CH
Switzerland
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cells
cell
bcgf
ligand
proliferation
Prior art date
Application number
CH2240/87A
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English (en)
Inventor
Jeffrey A Ledbetter
Edward A Clark
Original Assignee
Oncogen
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Publication date
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Description

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Beschreibung
Die vorliegende Erfindung ist auf Liganden gerichtet, nämlich auf Antikörper-Moleküle oder Fragmente von Antikörper-Molekülen oder andere Liganden, wie Lymphokine, welche in der Lage sind, einen B-Zellenoberflächenmarker mit einem Molekulargewicht 50 kDa zu binden, welcher nachstehend als Bp50 bezeichnet wird, welcher in der B-Zell-Proliferation eine Funktion besitzt, jedoch nicht in der frühen B-Zellaktivierung. Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls auf das Bp50-B-Zellantigen selbst gerichtet. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, wird der monoclonale Antikörper G28-5 beschrieben, welcher das Bp50 definiert und eine Rolle bei der Proliferation von aktivierten B-Zellen zu spielen scheint, jedoch keinen nachweisbaren Effekt auf die Proliferation der verbleibenden B-Zellen ausübt.
Die erfindungsgemässen Liganden, wie die Antikörper, die Lymphokine und die Fragmente davon, können zur Steuerung und Regulierung der humanen B-Zell-Proliferation und/oder zur Differenzierung verwendet werden. Zusätzlich können die erfindungsgemässen Liganden modifiziert werden, indem sie mit anderen Verbindungen verknüpft werden, welche bei der Behandlung und/oder beim Nachweis von bösartigen Zellen, welche das Bp50-Antigen exprimieren, verwendet werden können.
Die Aktivierung der verbleibenden B-Zellen von der Go- zur Gi-Phase des Zellzyklus und die anschliessende Einleitung der aktivierten B-Zellen zum Proliferieren sind verschiedene Stufen, welche verschiedene Regulationsmechanismen erfordern. Einige Wirkstoffe, einschliesslich die B-Zellen von Mäusen, welche den Faktor-p1 (BSF-p1) stimulieren (Rabin, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei, USA 82, 2935-2939) oder niedere Dosen von Anti-Immunoglobulin (Anti-Ig) (DeFranco, et al., 1985, J. Immuno!. 135. 87-94; Wetzel, et al., 1984, J. immunol. 133. 2327-2332; DeFranco, et al., 1982, J. Exp. Med. 155. 1523-1536; Muraguchi, et al., 1984, J. immunol. 132.176-180), sind «Aktivierungs»- oder «Kompetenz»-Faktoren. Das heisst, sie induzieren B-Zellen zur Vergrösserung, zur Synthese von mehr RNA und treten im Gì ein, allein können sie jedoch die DNA-Synthese in B-Zellen nicht einleiten. Andere «Wachstums»-Faktoren, wie der humane B-Zellwachstumsfaktor (BCGF) und Interleukin-2 (IL-2) bewirken, dass aktivierte B-Zelten den Zellzyklus durchqueren und in die S-Phase eindringen, wobei jedoch die restlichen B-Zellen nicht aufgelöst werden (Kehrl, et al., 1984, Immunol. Rev. 18; 75-96; Muraguchi, etat., 1984, J. Immunol. 132:176-180; Zubler, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1170-1183; Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1597-1604).
Eine Anzahl von Faktoren, welche das Wachstum von B-Zeilen fördern, sind nun von Forschern sowohl im Mäuse- wie auch im humanen System beschrieben worden. Diese umfassen B-Zellwachstumsfaktoren (BCGF), welche von verschiedenen Quellen, einschliesslich T-Zellinien oder Hybrodoma, B-Zelli-nien oder dendritische Zellen, abgeleitet wurden. Obschon sowohl Interleukin (IL-1) und Interleukin-2 (IL-2) eine Verbesserung des B-Zellwachstums gezeigt haben, unterscheiden sie sich offensichtlich von gewissen BCGF. Beispielsweise blockieren monoclonale Antikörper (mAb) gegen Mäuse-BGGF (O'Hara, et al., 1985, Nature (London) 315:333) oder gegen humanen BCGF (Ambrus, et al., 1985, J. Exp. Med. 162: 1319) die BCGF-Aktivität, jedoch nicht die IL-1- oder IL-2-Aktivität. Obschon verschieden von IL-1 oder IL-2, erscheinen die BCGF selbst auf Basis der biochemischen Daten und verschiedenen Aktivitäten auf verschiedene B-Zellteilmengen oder von Kosfimulationstests heterogen zu sein. Es wurde beispielsweise ein 60 Kiiodalton (kDa) hochmolekularer humaner BCGF, BCGF (hoch), identifiziert, welcher sich von einer 12 kDa Niedermolekulargewichtsform, BCGF (nieder) unterscheidet (Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75: 732). Die cDNA, welche einen Mäuse-BCGF mit einem Molekulargewicht von 20 kDa codiert, wurde kürzlich geclont und sequeniert (Noma, et al., 1986, Nature, 319: 640). Das rekombinante Lymphokin hat nicht nur BCGF-Aktivität, sondern kann ebenfalls die verbleibenden B-Zel-len aktivieren und die Differenzierung von IgGi-produzierenden Zellen induzieren; demzufolge unterscheidet es sich vom humanen BCGF (hoch) und BCGF (nieder), sowohl in seinem Molekulargewicht und in seinem Aktivitätsbereich.
Diese Aktivierungs- und Wachstumssignale regulieren vermutlich die Zellen, indem sie mit spezifischen B-Zelloberflächenstrukturen in Wechselwirkung treten. Zusätzlich zum antigenspezifischen Signal durch das Obeflächen-Ig, sind andere B-Zellen-Oberflächenpolypeptidkandidaten identifiziert worden, welche in gewisser Weise eine Funktion bei der Aktivierung oder beim Wachstum der B-Zellen besitzen. Beispielsweise wurde der Zelloberflächenrezeptor für IL-1 (Dower, et al„ 1985, J. Exp. Med. 160: 501) und für IL-2 (Robb, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1126) charakterisiert und kürzlich sind funktionelle IL-2-Rezeptoren auf B-Zellen identifiziert worden (Zubler, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1170; Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1597; Muraguchi, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:181). Rezeptoren für das B-Zellwachstum und Aktivationsfaktoren wurden jedoch nicht vollständig charakterisiert. Verschiedene mögliche B-Zelloberflächenpolypeptide sind identifiziert worden, welche in gewisser Weise eine Funktion bei der Aktivierung oder beim Wachstum von B-Zellen besitzen könnten. Beispielsweise haben Sub-barao und Mos'rer (Subbarao, et al., 1983, Immunol. Rev. 69:81-97) gefunden, dass monoclonale Antikörper (mAb) gegen das Mäuse-B-Zellenantigen Lyb2 B-Zellen aktiviert und kürzlich wurde der Beweis erbracht, dass Lyb2 den Rezeptor für BSF-pl, darstellen kann (Yakura, 1985, Fed. Proc. 44: 1532). In ähnlicher Weise wurde gefunden, dasss zweckmässige mAb (1F5) gegen ein 35 kDa Polypeptid, Bp35 humane B-Zellen von Go in Gt aktiviert (Clark, et al., 1985, Proc. nat. Acad. Sei. USA 82: 1766-1770; Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801). Aggregiertes C3d oder Antikörper gegen den 140 kDa
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C3d-Rezeptor, Bp140, bewirken eine Proliferation von B-Zeilen, welche T-Zellen-abhängig sind (Melchers, et al., 1985, Nature 317:264-267; Nemerow, et al., 1985, J. Immunol. 135:3068-3073; Frade, et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15: 73-76). Obschon BCGF sowohl bei Mäusen, wie auch bei Menschen identifiziert worden sind, sind die Rezeptoren für diese Faktoren noch nicht isoliert worden. Wang und Mitarbeiter (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149: 1424-1433) stellten ein polyclonales Antiserum her, welches ein 54-kDA-PoIypeptid (gp54) auf humanen B-Zeilen identifizierte und zeigten, dass das Kanin-chen-Antiserum gegen gp54 tonsillare B-Zellen zur Teilung induzierte. Kürzlich isolierten Jung und Fu (Jung, et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1919-1924) ein mAb (AB-1) gegen ein 55-kDA-Antigen, welches auf aktivierte B-Zellen eingeschränkt war, welches die BCGF-abhängige Proliferation blockierte. Ob jedoch ein Anti-gp54 oder AB-1 einen BCGF-Rezeptor erkennt, ist noch nicht bekannt.
Die vorliegende Erfindung ist auf die in den Patentansprüchen definierten Gegenstände gerichtet. Die erfindungsgemässen Liganden binden Bp50, ein B-zellenspezifisches Öberflächenpolypeptid von einem Molekulargewicht von 50 ku (kDA) haben die Fähigkeit die Proliferation von aktivierten B-Zellen zu erhöhen.
Die Erfindung ist ebenfalls auf das Bp50-Antigen selbst gerichtet, welches durch den monoclonalen Antikörper G28-5 definiert ist und bei der Proliferation von aktivierten B-Zeilen eine Rolle spielt. Zusätzlich ist die Erfindung auf Liganden gerichtet, welche Bp50 binden, jedoch keine biologische Wirkung oder Funktion, wie die Erhöhung der Proliferation von aktivierten B-Zelien aufweisen.
Die erfindungsgemässen Liganden umfassen Antikörpermoleküle, monoclonale Antikörper und Fragmente dieser Antikörpermoleküle, welche die antigen-kombinierende Stelle oder chemisch modifizierte Antikörper und Fragmente enthalten; solche Fragmente umfassen FV, Fab, F(ab')2, Fab' und dergleichen. Zusätzlich umfassen die erfindungsgemässen Uganden Lymphokine, welche humane B-Zellwachstumsfaktoren einschliessen können, ebenso wie chemisch modifizierte Lymphokine. Die erfindungsgemässen Liganden können chemisch modifiziert sein, beispielsweise durch Verbinden bzw. Kuppeln einer Verbindung mit einem Liganden. Solche Verbindungen sind beispielsweise cytotoxische Mittel, therapeutische Mittel, chemotherapeutische Mittel, Markiersubstanzen, wie Radiolabels, Farbstoffe, Enzyme, radioopake Verbindungen und dergleichen. Die erfindungsgemässen Uganden können in ihrer modizier-ten oder unmodifizierten Form zur Steuerung, Regulierung und Modifikation der humanen B-Zellproliferation und/oder Differenzierung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass zwei humane B-Zelldifferenzierungs-An-tigene, Bp35 und das hier beschriebene B-Zeliantigen, Bp50 offensichtlich unterschiedliche Rollen als Signalerezeptoren in der B-Zellaktivation spielen. Monoclonale Antikörper (mAb) gegen Bp35 und Bp50 zeigen positive Zeichen für B-Zellen, welche ihren Übergang durch den Zellzyklus stimulieren. mAb gegen Bp35, wie Anti-Ig-Antikörper, funktioniert prinzipiell durch Aktivierung der verbleibenden B-Zeilen, welche fähig werden, in die Gi-Phase des Zellzyklus einzudringen. Im Gegensatz dazu funktioniert ein hier beschriebener monoclonaler Antikörper oder sein F(ab')2-Fragment gegen Bp50 ein 50-kDa-PoIy-peptid, welches durch alle B-Zellen exprimiert wird, indem es die aktivierten B-Zeilen für die Traversie-rung des Zellzyklus stimuliert und die Proliferation der aktivierten B-Zellen verbessert. Monoclonale Antikörper gegen Bp35, wie Anti-Ig-Antikörper, aktivieren tonsillare B-Zelien und leiten niedere Stufen einer B-Zellproliferation ein. Im Gegensatz dazu aktivieren Anti-Bp50-monoclonale Antikörper allein weder B-Zellen noch induzieren sie B-Zellen zur Proliferation, jedoch zusammen mit Anti-Bp35-oder Anti-Ig-Antikörpem verbessern sie die B-Zellproliferation. In dieser Hinsicht gleicht die Wirkung des Anti-Bp50-Antikörpers der Aktivität des B-Zellwachstumsfaktors (BCGF). Es werden nur 0,05 (xg/ml des An-ti-Bp50 benötigt, um die Proliferation zu verbessern, und wie BCGF ist Anti-Bp50 sogar wirksam, wenn es 12-24 Std. nach der Aktivierung der B-Zellen mit Anti-lg oder Anti-Bp35 zugesetzt wird. Ohne zusät-ziche exogene Signale induzieren Anti-Bp35- und Anti-Bp50-Antikörper zusammen eine starke Proliferation von gereinigten verbleibenden B-Zellen. Diese Resultate führen zum Schluss, dass die Bp35- und die Bp50-0berflächenmo!eküle bei der regulatorischen Kontrolle der B-Zellaktivierung und der Fortschreitung durch den Zellzyklus mitwirken. Wegen der Bedeutung von Anti-Bp35 und ähnlichen Molekülen bezüglich des Effektes und der Wirkung der erfindungsgemässen Uganden, wird ausdrücklich auf die Publikation von Clark, et al., 1985, in Proc. Nati. Acad. Sei (USA) 82:1766-1770 verwiesen.
Obschon die Aktivität des Anti-Bp50 derjenigen von BCGF (nieder) gleicht, da sowohl Anti-Bp50 und BCGF (nieder) kostimulatorisch mit den gleichen Wirkstoffen sind, jedoch nicht miteinander und sowohl Anti-Bp50 als auch BCGF (nieder) nur auf aktivierte B-Zellen einen Einfluss haben und in einer löslichen Form wirksam sind, kann die Aktivität von Anti-Bp50 von der Aktivität des BCGF (nieder) unterschieden werden, da die Proliferation von B-Zellen, welche mit optimalen Anteilen von Anti-Bp50 und An-ti-Bp35 (oder Anti-Ig) stimuliert sind, durch BCGF (nieder) verbessert werden kann und sowohl Blut-B-Zellen als auch gewisse B-Zellymphome verschieden gegen Anti-Bp50 gegenüber BCGF reagieren. Für eine optimale Aktivität sollte Anti-Bp50 innerhalb von 12 Std. nach der B-Zellaktivierung zugegeben werden, während BCGF (nieder) seine optimale Aktivität beibehält, sogar 24 Std. nach der Aktivierung. Zusätzlich wird Bp50 auf allen B-Zellen exprimiert, während die Rezeptoren oder BCGF (nieder) auf aktivierte B-Zellen eingeschränkt sind. Demzufolge kann Anti-Bp50 und BCGF (nieder) koordinativ das B-Zellwachstum regulieren, jedoch offensichtlich durch verschiedene Signale.
Erfindungsgemäss können die Liganden, welche Bp50 binden und die Proliferation von aktivierten B-Zellen verbessern, zur Erhöhung einer Immunantwort verwendet werden. Beispielsweise können diejeni3
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gen Liganden, welche Bp50 bilden als «Adjuvans» verwendet werden, um eine Immunantwort gegen einen Impfstoff zu verbessern. Alternativ können diese Liganden zur Erhöhung einer Immunantwort eines im-munosuppressiven Individuums verwendet werden.
In einer andern Ausführungsform können die erfindungsgemässen Liganden chemisch modifiziert werden, so dass die Zellen, an welche die Liganden gebunden sind, abgetötet werden. Da alle B-Zellen das Bp50-Antigen exprimieren, würde dieser Versuch eine Suppression einer Immunantwort bewirken. Beispielsweise kann ein cytotoxisches Mittel, welches an einen erfindungsgemässen Liganden gebunden ist, in vivo verwendet werden, um eine Immunosuppression zu bewirken, um Histokompatibilitätsschran-ken bei Transplantationspatienten zu überwinden; alternativ können diese modifizierten Liganden zur Kontrolle von Autoimmunitätsleiden eingesetzt werden.
Im weiteren können erfindungsgemässe Liganden verwendet werden, um bösartige Zellen, wie Tumorzellen, welche BpSO exprimieren, zu behandeln, wobei ein chemotherapeutisches Mittel, welches nützlich zur Behandlung von solchen neoplastischen Leiden ist, an den Liganden gebunden ist. Diese modifizierten Liganden können in vivo verwendet werden, um das Chemotherapeutikum gegen bestimmte Typen von bösartigen Zellen zu richten, welche das Bp50-Antigen exprimieren, einschliesslich Zellen, welche nicht B-Zellen sind, jedoch Bp50 exprimieren. Bei der Verwendung von erfindungsgemässen Liganden, welche die B-Zellproliferation verbessern, kann ein besonderer Vorteil wahrgenommen werden, wenn die bösartigen B-Zellen mit Liganden behandelt werden, an welche ein Chemotherapeutikum gebunden ist, das wirksamer bei der Abtötung von proliferierenden Zellen ist. In diesem Fall sollte eine Potenzierung der Wirkung des Mittels beobachtet werden.
Alternativ können die erfindungsgemässen Liganden in vitro verwendet werden, um Zellen, welche das Bp50-Antigen exprimieren, zu identifizieren oder zu trennen und/oder um Körperflüssigkeit auf die Gegenwart des Bp50-Antigens zu testen, welches abgestossen oder nicht abgestossen wird. Zusätzlich können die erfindungsgemässen Liganden in vivo verwendet werden, um Zellen oder Tumore abzubilden, welche das Bp50-Antigen exprimieren.
Das erfindungsgemässe, gereinigte Bp50-Antigen kann verwendet werden, um Antikörper herzustellen und um andere erfindungsgemässe Liganden herzustellen oder zu konstruieren. Zusätzlich könnte Bp50-Antigen in Tests eingesetzt werden, wie in diagnostischen Immunoassays, Zusätzlich könnte das Bp50 in vitro oder in vivo als Mediator für Zellimmunität verwendet werden.
In der vorliegenden Beschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet, deren Bedeutung nachstehend angegeben ist;
AO = Acridinorange BCGF = B-Zellwachstumsfaktor
BCGF (hoch) = humaner BCGF mit einem Molekulargewicht von 60 kDa BCGF (nieder) = humaner BCGF mit einem Molekulargewicht von 12 kDa
Bp35 == B-zellspezifisches Oberflächenpolypeptid (CD20) mit einem Molekulargewicht von 35 kDa, welches durch den mAb IF5 definiert ist
Bp50 = B-zellspezifisches Oberflächenpolypeptid mit einem Molekulargewicht von 50 kDa, welches durch den mAb G28-5 definiert ist
Fv = Variables Gebiet oder antigen-kombinierende Stelle eines Antikörper-Moleküls, Dies kann jedes
Fragment sein, welches den Idiotypen eines der nachstehenden Moleküle enthält, jedoch nicht darauf eingeschränkt ist: Fab, F(ab')2, Fab', und dergleichen.
IF = Immunofluoreszenz lg = Immunoglobulin
IL-1 = Interleukin 1
IL-2 = Interleukin 2
kDa = Kilodalton mAb = Monoclonaler Antikörper
SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel-Elektrophorese TPA = 12-O-TetradecanoyIphorbol-l 3-acetat.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1 Die Expression von Bp50 ist auf Bp35± B-Zellen eingeschränkt. Die Zweifarben-Fliess-Cytometeranalyse von 50 000 Zellen wurde wie durch Clark beschrieben durchgeführt (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:1766-1770). Die Daten sind als Zellnummer gegen den log der grünen Fluoreszenz und gegen den log der roten Fluoreszenz aufgetragen, wobei 4-5 Punkte ungefähr eine Verdoppelung der Fluoreszenz bedeutet. Die Daten sind angegeben, um die Autofluoreszenz von negativen Zellen zu zeigen. PE (rot)-Anti-Bp35 (IF5) gegen FITC (grün)-Anti-Bp50 (G28-5)-Färbung zeigt, dass alle Bp50+-Zellen ebenfalls Bp35+ sind.
Fig. 2 zeigt den biochemischen Vergleich des Bp50-Polypeptides mit anderen B-Zelloberflächenanti-genen. Die Immunopräcipitation des Bp50 von der Oberfläche von tonsillaren Zellen, welche mit 125l markiert waren, wurde wie beschrieben durchgeführt. Die isolierten Antigene wurden einer Elektrophorese unterworfen, wobei 10% SDS-Gelblöcke ohne Reduktion verwendet wurden. Die Geie wurden durch Au-toradiographie und Intensivierungsschirme sichtbar gemacht. Platte A: Spur 1, Anti-Bp5Ö (G28-5); Spur
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2, Anti-Bp95 (G28-8); Spur 3, Sepharose-Geissen-Antimäuse-Ig allein, Aussetzungszeit: 4 Tage. Platte B: Spur 1, Anti-Pb50 (G28-5); Spur 2, Anti-Bp45 (BLAST-2); Spur 3, Anti-Bp39 (G28-1); Spur 4, Anti-Bp39 (41-H16); Spur 5, Sepharose-Geissen-Antimäuse-Ig allein. Es wurde eine Aussetzungszeit von 2 Tagen ausgewählt, damit die Banden in den Spuren 2-4 nicht zu lange ausgesetzt waren und gegenüber Bp50 klar unterschieden werden konnten. Eines von 3 Experimenten.
Fig. 3 zeigt eine Zweifarben-Immunofluoreszenz-Analyse der Bp50-Expression. Peripherale Blutoder tonsillare mononukleare Zellen wurden durch Zentrifugation auf Ficoll isoliert und gefärbt mit PE (rot)-konjugiertem G28-5 (Anti-Bp50) in Kombination mit Fluoreszein (grün)-konjugierten Referenz-Antikörpern, einschliesslich 2C3 (Anti-lgM); 1F5 (Anti-Bp35); HB10a (Anti-DR); und 9,6 (Anti-CD2, E-Re-zeptor). Die Zellen wurden mit einem FACS IV analysiert, welches mit 4 Dekaden log-Verstärkern in der roten und der grünen Dimension versehen war. Es wurde eine vorwärts gerichtete und eine rechtwinklige Lichtstreuung verwendet, um die Monocyten hinauszusperren. Ungefärbte Zeilen waren auf der Hinterseite des Gitters vorhanden; rote Fluoreszenz auf der rechten Seite und grüne Fluoreszens auf der linken Seite.
Fig. 4 zeigt die Dosis-Antwortkurven für eine Verbesserung der Proliferation von dichten tonsillaren Er-B-Zellen durch Anti-Bp50-Antikörper wie angegeben: Medium allein; Anti-Bp50 allein; Anti-Bp35 (5 (ig/ml) allein; BCGF allein; Anti-Bp35 plus BCGF; Anti-Bp35 plus abgestufte Dosen von Anti-Bp50. Die Hauptproliferation ± die Standardabweichung von vierfachen Proben wurde am Tag 3 gemessen.
Fig. 5 zeigt, dass Anti-Bp50-mAb am wirksamsten für die Verbesserung der Proliferation war, wenn er nach einem B-Zellaktivlerungszeichen zugegeben wurde. Dichte tonsillare Er-B-Zellen wurden während 4 Tagen nur mit Medium inkubiert, dann wurde Anti-Bp5Q (0,5 ng/ml) nach verschiedenen Zeiten nach der Inkubation zugegeben, Anti-Bp35 (5 jig/ml) wurde zu verschiedenen Zeiten nach der Inkubation zugegeben. Das Anti-Bp50 wurde konstant gehalten, zu welchem später Anti-Bp35 zu verschiedenen Zeiten zugegeben wurde; Anti-Bp35 wurde konstant gehalten und Anti-Bp50 wurde zu den Kulturen nach verschiedenen Zeiten zugegeben. Während den letzten 10 Std. wurde 3H-Thymidin zugegeben und sein Einbau gemessen.
Fig. 6 zeigt den Vergleich der Fähigkeit von Anti-Bp35 und Anti-Bp50, bleibende tonsillare B-Zellen zu induzieren, um die Go-Stufe des Zellzyklus zu verlassen. Am Tag 3 nach der Behandlung wurde Medium allein (—), Anti-Bp35 allein (—-); und Ig allein (....), A, keine zusätzlichen Additive; B, Anti-Bp50 (0,5 ng/ml) zu jeder Gruppe; C, 5% BCGF zu jeder Gruppe zugegeben. Die Daten wurden als relative Zellzahl gegen den log der roten Fluoreszenz des AO (RNA) aufgezeichnet.
Fig. 7 zeigt die Kinetik der B-Zellproliferation nach der Stimulation mit Anti-Bp50 gegen BCGF. Dichte tonsillare E-B-Zellen wurde stimuliert mit Medium allein; 10% BCGF allein; Anti-Bp35 allein; Anti-Bp50 allein; Anti-Bp35 + 10% BCGF; Anti-Bp35 + Antî-Bp50 und Anti-Bp35 + Anti-Bp50 + 10% BCGF. Es wurde die Proliferation an den angegeben Tagen durch einen 18-Std -Puis mit 3H-Thymidin gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und es wurde die Standardabweichung angegeben. Eines von 3 Experimenten.
Fig. 8 zeigt die Zeiten nach der Anti-Bp35-Stimulierung, wo Anti-Bp50 (A) oder BCGF (B) die Proliferation optimal verbessert. Dichte tonsillare E-B-Zellen wurden wie angegeben stimuliert und die Prolifération wurde durch einen 18-Std.-Puls von 3H-Thymidin am Tag 3 gemessen. Medium; Anti-Bp35 wurde nur an den angegebenen Zeiten zugefügt; Anti-Bp50 oder BCGF allein; Anti-Bp35 wurde zu Beginn der Kultur zugegeben, wonach Anti-Bp50 oder BCGF zu den angegebenen Zeiten zugefügt wurde; Anti-Bp50 oder BCGF wurde zu Beginn der Kultur zugefügt, wonach Anti-Bp35 folgte. Eines von 2 Experimenten. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardabweichungen sind angegeben. Verwendete Dosen: Anti-Bp35, 5 ng/ml; Anti-Bp50, 0,2 ng/ml; BCGF (nieder), 5%. Konzentrationen wurde wie folgt verwendet: Anti-Bp35,5 (xg/ml; Anti-Bp50,0,2 ng/ml; BCGF, 5%.
Fig. 9 zeigt, dass Anti-Bp50 und BCGF additive Wirkungen auf die B-Zellproliferation besitzen. Es wurden dichte tonsillare E-B-Zellen mit abgestuften Dosen von BCGF (nieder) stimuliert, zusammen mit Anti-Bp50 allein; Anti-Bp35 allein; Anti-Ig-Kügelchen allein; Anti-Bp35 und Anti-Bp50; oder Anti-Bp50 und Anti-Ig. Die Proliferation wurde nach 3 Tagen nach Stimulation mit einem 18-Std.-Puls von 3H-Thymi-din gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardabweichungen sind angegeben. Eines von 4 Experimenten. Dosen, welche für 106-Zellen verwendet wurden: Anti-Bp35, 5 jxg/ml; Anti-Bp50, 0,2 fig/ml; Anti-Ig-Kügelchen, 50 jtg/ml.
Fig. 10 zeigt vergleichende Wirkungen von Anti-Bp50 und BCGF auf normale und bösartige B-Zellen. Periphere E-B-Zellen von Blut (A) oder dichte tonsillare E-B-Zellen (C) wurden mit oder ohne TPA (75 ng/ml) in Gegenwart von 10% BCGF oder 1 ng/ml Anti-Bp50 stimuliert. Zwei separate B-Zellymphome (Platte B und D) wurden auf gleiche Weise stimuliert. Die Proliferation wurde am Tag 3 durch Einverleibung von 3H-Thymidin während einem 12-Std,-Puis gemessen. Die Proliferation wurde vierfach gemessen und die Standardabweichungen sind angegeben.
Die vorliegende Erfindung ist auf Liganden gerichtet, welche a) Bp50, ein B-zellspezifisches Oberflächenpolypeptid mit einem Molekulargewicht von 50 kDa binden und b) die Proliferation von aktivierten B-Zellen verbessert.
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Die Erfindung ist ebenfalls auf das Bp50-Antigen selbst gerichtet, welches durch mAb-G28-5 definiert ist und bei der B-Zellproliferation funktioniert. Die Erfindung Ist ebenfalls auf Uganden gerichtet, welche Bp50 binden, jedoch keinen biologischen Effekt oder eine Funktion, wie beispielsweise zur Verbesserung der Prolifération von aktivierten B-Zellen aufweisen.
Die erfindungsgemässen Uganden umfassen Antikörpermoleküle, monoclonale Antikörpermoleküle und Fragmente von diesen Antikörpermolekülen, welche die antigen-kombinierende Stelle aufweisen, welche den Bp50-Rezeptor, einschliesslich modifizierter Antikörper und Fragmente davon bindet; solche Fragmente umfassen beispielsweise Fv, Fab, F(ab')2 oder Fab'. Zusätzlich umfassen die erfindungsgemässen Uganden ebenfalls Lymphokine, die vom Bp50-Rezeptor gebunden werden. Diese umfassen beispielsweise BCGF ebenso wie chemisch modifizierte Lymphokine und dergleichen. Die erfindungsgemässen Liganden können in ihrer modifizierten oder nicht modifizierten Forni zum Modulieren und Regulieren von Immunantworten und für die Therapie von bösartigen Zellen, welche das Bp50-Anti-gen exprimieren, verwendet werden. Die Verwendungen sind Im einzelnen weiter unten diskutiert.
Falls der Llgand ein monoclonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist, können die monoclonalen Antikörper gegen Bp50 unter Verwendung jeder Technik hergestellt werden, welche die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kulturen umfasst. Beispielsweise kann die Origi-nalhybridomtechnik von Köhler und Milstein (1975, Nature 256: 495-497) ebenso wie andere jüngere Techniken verwendet werden, beispielsweise die Human-B-Zell-Hybridomtechnik (Kozborm et al, 1983, Immunology Today 4:72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung von humanen monoclonalen Antikörper (Cole, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77-96). Auf die obenerwähnten Publikationen wird für die vorliegende Erfindung ausdrücklich Bezug genommen.
Antikörper-Fragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken gebildet werden. Beispielsweise sind solche Fragmente das F(ab')2-Fragment, welches durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Pepsin gebildet werden kann; die Fab'-Fragmente, welche durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragmentes gebildet wird; das F(ab')2-Fragment, welches durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Papain erhalten werden kann; und die 2Fab oder Fab-Fragmente, welche durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel zur Reduktion der Disulfidbrücken gebildet werden können.
Wenn der Ligand, welcher Bp50 bildet, ein Lymphokin ist, kann das Lymphokin von natürlichen Quellen erhalten werden oder wenn seine Aminosäuresequenz bekannt oder abgeleitet ist, kann das Lymphokin durch chemisch-synthetische Methoden hergestellt werden. Alternativ können, wenn die Gensequenz bekannt ist, rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, um das Gen in einen Expressionsvektor zu clonen, welcher dann für die Transkription und Translation der Gensequenz in einer zweckmässigen Wirtszelle eingesetzt werden kann.
Je nach der beabsichtigten Verwendung kann der Ligand oder zweckmässige Fragmente des Uganden, chemisch modifiziert werden, indem eine beliebige Verbindung durch bekannte Verfahren mit dem Liganden gekuppelt wird. Solche Techniken umfassen beispielsweise die Verwendung von Carbodiimid, Cyanbromid, bifunktionellen Reagenzien, wie Glutaraldehyd, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyIdithio)proprio-nat (SPDP), Reaktionen mit Schiffschen Basen, Bindungen an Sulfhydrilreste, die Verwendung von Iso-thiocyanat oder enzymatische Bindungsverfahren, um nur einige zu nennen. Falls ein Radioisotop an den Uganden gebunden werden muss, kann dies ebenfalls mit enzymatischen Mitteln, oxidativer Substitution, Chelatierung usw. bewerkstelligt werden. Für einen Überblick auf die chemischen Reagenzien, welche für die Proteinmodifikation verwendet werden können, sei auf Lundblad and Ijloyes, Chemical Reagents for Protein Modification, Volume III, CRD Press, Inc., Boca Raton, Florida, Ch. 5, Seiten 123-139,1984, verwiesen.
Die chemische Bindung oder die Kupplung einer Verbindung an einen Liganden, könnte auf eine Stelle am Liganden gerichtet sein, welcher nicht an der Bindung mit Bp50 teilnimmt. Dies könnte durchgeführt werden, indem die Bindungsstelle des Uganden vor der Kupplungsreaktion geschützt würde. Beispielsweise kann der Ligand zuerst an Bp50 gebunden werden, um die Bp50-Bindungsstelle zu schützen, dann kann die Kupplungsreaktion durchgeführt werden, um die gewünschte Verbindung an verfügbare, reaktive Stellen am Liganden-Bp50-Komplex durchzuführen. Nach Beendigung der Kupplungsreaktion kann der Komplex wieder auseinandergetrennt werden, wobei ein modifizierter Ugand gebildet wird, an welchen die gewünschte Verbindung in solcher Weise gebunden ist, dass die Bp50-Bindungsstelle des Moleküls minimal beeinflusst wird. Wenn der Ligand einen monoclonalen Antikörper enthält, wie G28-5, worin der Fc-Bereich des Moleküls nicht erforderlich ist, damit der Ligand seine Wirkung ausüben kann (vgl, weiter unten) kann es vorteilhaft sein, die Kupplung der gewünschten Verbindung auf einen Fc-Bereich des Moleküls zu richten.
In den nachstehenden Abschnitten werden der neue 50-kDa-B-Zellenoberflächenmarker, Bp50, welcher offensichtlich Funktionen bei der B-Zellproliferation besitzt und ebenso Liganden, welche den neuen 50-kDa-Rezeptor binden und ihre Verwendungen beschrieben. Als Beispiel für erfindungsgemässe Uganden dient ein monoclonaler Antikörper, welcher Bp50 und seine F(ab')2-Fragmente definiert, welcher wie BCGF, die B-Zeliproliferation erhöht. Im Gegensatz zu Anti-Bp35 mAb, welcher die ruhenden B-Zellen induzieren kann, um von Go in Gt überzugehen, kann Anti-Bp50 mAb die ruhenden B-Zellen nicht aktivieren. Anti-Bp35 und Anti-Bp50 mAb zusammen ohne zusätzliche exogene Signale leiten eine starke Aktivierung und Proliferation von gereinigten B-Zellen ein.
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Die nachstehend beschriebenen Versuche demonstrieren ebenfalls, dass die Anti-Bp50-Aktivität der BCGF-Aktivität gleicht, jedoch dass das Anti-Bp50 verschieden von einem BCGF ist, da Anti-Bp50 und Niedermolekulargewichts-BCGF klar additiv sind und verschieden auf unterschiedliche B-Zellun-termengen oder bösartige Zellen reagiert. Bp50 kann einen Rezeptor für einen bestimmten BCGF darstellen oder für ein Transmembransignal, welches die BCGF-Produktion oder die BCGF-Rezeptorex-pression moduliert.
Verfahren zur Charakterisierung des Bp50-Rezeptors Zellpräparate:
Mononukleare Zellen wurden aus normalem oder leukämischem, heparanisiertem, peripheren Blut durch Ficoll-Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Piscataway, NJ) isoliert. Es wurden mononukleare Zellen aus tonsillarem Gewebe nach dem von Clark beschriebenen Verfahren erhalten (Clark, et a!., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82: 1766-1770). Die T-Zellen wurden entleert mit AET-behandelten Scha-ferythorcyten unter Rosettenbildung und Gradiententrennung mit Ficoll-Hypaque. In einigen Experimenten wurden die Blut-B-Zellen angereichert, indem die an Nylonwolle anhaftenden Zellen isoliert wurden. Die Monocyten wurden durch ein- oder zweimalige Inkubation auf Petri-Schalen bei 37°C während 45 Min. entfernt, wenn nichts anderes erwähnt wird. Schwimmende oder dichte tonsillare B-Zellfraktionen wurden isoliert, mittels Percoll-Stufengradienten, wie durch Clark beschrieben (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82: 1766-1770). Dichte tonsillare B-Zellpräparate hatten durchwegs mehr als 95% slg+ Bp35+-Zellen. Die Präparationen, welche mit Blut-B-Zellen angereichert waren, hatten 60 bis 85% sIg+-Zellen. Die B-Zellymphomzellen wurden isoliert, indem Lymphomzellen sanft im Medium gezupft wurden und anschliessend einer Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation unterworfen wurden.
Monoclonale Antikörper:
Der G28-5-Antikörper gegen Bp50 wurde durch Immunisieren von BALB/c-Mäusen mit humanen E-tonsillaren Lymphocyten gebildet und indem Immuno-Milzzellen mit NS-1-Myelom fusioniert wurden (Köhler, et al., 1975, Nature 256:495-497; Ledbetter, et al., 1979, Immunol. REv. 47: 63-82). Hybridzell-Kulturen, welche Antikörper ausschieden, welche mit tonsillaren B-Zellen reaktiv waren, jedoch nicht mit T-Zellen, wurden unter Verwendung der indirekten Immunofluoreszent (IF) und Analyse mit einem FACS IV-Zellsortierer identifiziert; Kulturen mit Antikörpern, welche ein Histogrammuster ergaben, welches den bekannten mAb gegen Pan-B-Zellmarker (z.B. Bp35) ähnlich waren, wurden geclont und für weitere Studien ausgewählt. Das G28-5-Clon produzierte ein IgGt-mAb, welcher nur mit normalen oder bösartigen B-Zellen oder B-Zeliinien reagierte. Andere mAb, welche in dieser Studie verwendet werden, wurden im einzelnen durch Clark beschrieben (Clark, et a!., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:1766-1770; Clark et al., 1986, Human Immunol. 16:100; Ledbetter, etal., 1986, Human Immunol. 15:30-44; Ledbetter, et al., 1985, in Per spectives in Immunooenetics and Histocompatibilitv. ASHl, New York, 6, Seiten 325-340). Diese umfassen 1F5 (lgG2a) AntiBp35, HB10a (lgG2a), Anti-HLA-DR, 2C3 (IgGi} Anti-u-Kette, G19-4 (IgGi) Anti-CD3, FC-2 (IgGsa) Anti-Fc-Rezeptor CD16 und 9,6 (IgGga) Anti-CD2 (E-Rezeptor) zur Verfügung gestellt durch Dr. Paul Martin (Martin, et al., 1983, J. Immunol. 131:180). Die IgGi-mAb wurden durch Ausfällen gereinigt, wobei 45% bis 50% gesättigtes Ammoniumsulfat verwendet wurde und eine DEAE-Sephacryl-Säulenchromatographie durchgeführt wurde und die IgGsa-mAb unter Verwendung von Protein A-Sepharosesäulen gereinigt wurden. Die F(ab')2-Fragmente von G28-5 wurden gemäss dem Verfahren von Parham hergestellt (Parham, et al., 1983, J. Immunol. 131: 2895), wobei sie auf einer 2 Meter langen Sephacryl S200 Säule gereinigt wurden und auf Einheit durch SDS-PAGE getestet wurden (Ledbetter, etal., 1985, J. Immunol. 135:1819). Der2C3-mAb gegen u-Ketten wurde mit Se-pharose 4B-Kügetchen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) kombiniert, wobei mit Cyanbromid gekuppelt wurde.
Fluoreszein und Phycoerythrinkonjugationen:
Gereinigte mAb wurden entweder direkt mit Fluoreszein konjugiert, wobei Fluoreszein-Isothiocyanat eingesetzt wurde (FITC; Molekularproben) (grün) nach dem Verfahren von Goding (Goding, et al., 1976, J. Immunol. Meth. 13: 215-226) oder mit R-Phycoerythrin (PE) (rot) konjugiert unter Verwendung von SPDP (Pharmacia) nach dem Verfahren, welches im einzelnen in Ledbetter, et al., 1985 in Perspectives in Immunooenetics and Histocompatibilitv. ASHl, New York, 6, 119-129. Es wurden Lymphoidzellen in Rundboden-Mikrotiterplatten während 30 Min. mit einer zweckmässigen Verdünnung von grünem und/oder rotem mAb inkubiert, zweimal gewaschen und dann auf einem FACS IV-Zellsortierer analysiert.
Zweifarben-Immunofluoreszent:
Die Zweifarben-Studien wurden mittels eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers durchgeführt (FACS IV: Becton-Dickinson, Mountain View, CA), wobei ein 560 nm dichroistischer Spiegel zur Spal-
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tung des Strahls und ein 580 Filter mit langem Durchgang und ein 540 Filter mit kurzem Durchgang (Ditric Optics, Hudson, MA) vorn an der roten bzw. grünen Fotomultiplier-Röhre verwendet wurden. Zusätzlich wurde ein Zweifarben-Kompensator (T. Nozaki, Stanford University) für die Korrektur von kleineren Abweichungen der grünen und roten Signale verwendet. Für jede Zweifarben-Färbung wurden Daten von 40 000 Zellen gesammelt und auf Floppy Disks gespeichert. Die Daten sind als Zellnummern (vertikal) gegen den log der grünen Fluoreszenz gegen den log der roten Fluoreszens auf einem 64 x 64 Punktegitter dargestellt. Ungefähr 4,5 Punkte stellen eine Verdoppelung der Fluoreszenz dar. Nicht gefärbte Zellen befinden sich in der hinteren Ecke des Gitters; rote Fluoreszenz ist auf der rechten und grüne Fluoreszenz ist auf der linken. Das verwendete cytometrische System für die Zweifarben-1F mit Fluoreszein und Phycoerythrin wurde im einzelnen von Ledbetter beschrieben (Ledbetter, er al., 1985, in Perspectives in Immunooenetics and Histocompatibilitv. ASHl, New York, 6,119-129 und 325-340).
Zellkultur:
Blut oder tonsillare Lymphoidzellen wurden vierfach in 5-10 x 105 ml 96-Loch-Mikrotiterplatten, die 200 nl RPMI-1640-Medium mit 15% bovinem Serum, Antibiotika, Glutamin und Pyruvat (R15) enthielten, kultiviert. Nach 1 bis 7 Tagen wurden die Zellen mit 0,5 |xCi 3H-Thymidin pro Loch pulsiert (New England Nuclear, 6,7 Ci/mmol; 1 Ci = 37) während 18 Std. Die Zellen wurden dann auf Glasfaserfiltern mit einem Zellernter geerntet und die Radioaktivität wurde auf einem Scintillationszähler gemessen. In einigen Experimenten wurden Antikörper oder Faktoren nach verschiedenen Zeitintervallen nach Beginn der Kulturen zugegeben; die Prolifération dieser Experimente wurde am Tag 3 gemessen.
Kostimulatorische Faktoren:
Gereinigter BCGF wurde von Cytokine Technology geliefert (Buffalo, New York) und enthielt keine nachweisbare IL-1-, IL-2- oder Interferon-Aktivität. Dieser BCGF wurde nach dem Verfahren von Mai-zel und Mitarbeitern hergestellt (Maizel, et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79: 5998), welche gezeigt haben, dass die Haupt-BCGF-Aktivität dieses Materials in einem 12-kDa-Molekül vorhanden war, welches nachstehend als «BCGF (nieder)» bezeichnet wird (Mehta, et al., 1985, J. Immunol. 135:3298). Der Reinigungsschritt umfasste eine DEAE-Affinitätschromatographie in präparativem Massstab, gefolgt durch eine Hydroxylapatit-Säulenchromatographie. Das bis zur Homogenität gereinigte IL-1 war eine grosszügige Gabe von Dr. Steven Dower (Dower, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:501). Das rekombi-nante IL-2 wurde freundlicherweise durch Cetus Corporation zur Verfügung gestellt. TPA (12-0-Tetra-deconoyl-phorbol-13-acetat) wurde von Sigma geliefert.
Nachweis der Zellaktivierung:
Änderungen im Zellvolumen, welche durch mAb und/oder Faktoren induziert wurden, konnten gemessen werden, indem ein Zellsortierer und ein vorwärts gerichteter Winkel-Lichtslreuer verwendet wurde. Änderungen des Zellzyklus im cellulären RNA- und DNA-Niveau wurde gemessen, indem aktivierte Zellen mit Acridin orange gefärbt und der relative cellulare RNA-(rot)- und DNA-(grün)-Gehalt mit einem Zellsortierer nach dem Verfahren von Darzynkiewicz et al. gemessen wurden (Darzynkiewicz, et al., 1980, Proc. Nat. Acad, Sei. USA 77: 6697-6702). Änderungen des relativen Gehaltes an Zelloberflä-chenantigen wurde verfolgt unter Verwendung von mAb, weiche direkt mit Fluoreszein konjugiert waren und dann durch direkte IF-Fluoreszenz-Intensitäten mit einem Epics V-Zellsortierer quantifiziert
Biochemische Charakterisierung Bp50:
Die Immunopräcipitation von Bp50 von Oberflächen mit tonsillaren Zellen, welche durch 125l markiert waren, wurde wie durch Ledbetter beschrieben durchgeführt (Ledbetter, et al., 1985, J, Immunol. 134: 4250-4254). Isolierte Antigene wurden auf 10% SDS Polyaciylamid-Gelblöcken einer Elektrophorese unterworfen. Die Gele wurden unter Verwendung der Autoradiographie bei -70°G und unter Verwendung eines Cronex Lightening plus Verstärkungsschirms (Dupont) visualisiert.
Charakterisierung des BoSO-Rezeptors
Nachstehend werden die Resultate der Versuche angegeben, welche unter Verwendung der obigen Verfahren erhalten wurden.
Identifikation einer B-zellspezifischen Oberflächenmarkieruna mit einem Molekulargewicht von 50 kDa. Bp50
Ein mAb gegen Bp50 wurde hervorgerufen, indem BALB/c-Mäuse mit humanen tonsillaren Lymphocyten immunisiert wurden und immune Milzzellen mit einem NS-1-Myelom verschmolzen wurden. Ein Clon, G28-5, produzierte ein IgGt mAb, welches die leichte NS-1-Kette nicht enthielt. Nach einer ge-
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nauen Untersuchung durch IF-Analyse wurde gefunden, dass G28-5 nur mit normalen oder bösartigen B-Zellen- oder Zellinien reagiert. Ein umfassendes Screening von normalem Gewebe durch bewährte Methoden (Clark, et al, 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:1766-1770; Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15: 30-44; Ledbetter, 1985, in Perspectives in Immunooenetics and Histocompatibilitv. ASHl, New York, 6, Seiten 325-340) zeigte, dass der Antikörper G28-5 mit E-rosettennegativen (Er-)-ZelIen aus Blut oder Tonsillen reagiert, jedoch nicht mit T-Zellen, welche sich nicht an Nylonwolle anlagerten, PHA-induzierte T-Zellblasten oder mit Blutgranuiocyten, Monocyten, roten Zellen oder Plättchen. Er reagierte stark mit allen 7 getesteten B-Lymphoblastoid-Zellinien und mit 3 Burkitt-Lymphomlinien (Raji, Daudi, Namalwa), jedoch nicht mit 4 T-Zellinien (CEM, HSB-2, JURKAT und HPB-ALL). Alle getesteten chronischen lymphocytischen Leukämien (3/3) und 90% (9/10) der getesteten B-Lymphoma exprimierten den Bp50-Marker, während nur 28% (2/7) von nicht-T-, nicht-B-CALLA+-akuten lymphocytischen Leukämien exprimierten Bp50.
Die eingeschränkte Verteilung von Bp50 auf normalen Geweben wurde weiter durch quantitative Zweifarben-Immunofluoreszenz (Zweifarben-IF)-Analysen bestätigt. Unter Verwendung eines R-Phy-coerythrin (PE)-konjugierten Antikörper (rot) gegen das Pan B-Zellantigen Bp35 (Bl, CD20) und Fluor-eszein-konjügierter Anti-Bp50-Antikörper (grün), wurde gefunden, dass Bp50 nur auf Bp35+ B-Zellen (Fig. 1) in Blut oder Tonsillen exprimiert wurde. B-Zellen aus Blut exprimierten konstant etwas kleinere Mengen Bp50 als tonsillare B-Zellen; dies ist ähnlich der HLA-DR-Expression (Ledbetter, et al., 1986, Human Immunol. 15:30-44) der gp54-Expression (Wang, et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1424—1433), welche ebenfalls niedriger an Blut B-Zellen sind. Bp50 wurde in ähnlichen Mengen- an tonsillaren B-Zellenuntergruppen exprimiert, welche durch Percoll-Gradienten in schwimmende und dichte Fraktionen aufgetrennt wurden. Unter Verwendung der PE-konjugierten mAb gegen den T-Zellmarker, CD3 (T3) und NK-Zell-assoziierter Marker, CD16 (Fc-Rezeptor) (Ledbetter, et al., 1979, Immunol. Rev. 47: 63-82), wurde gefunden, dass Bp50 auf T-Zellen oder NK-Zellen nicht exprimiert wird. Unter Verwendung von Zweifar-ben-IF wurde ebenfalls gefunden, dass CD3+ PHA-Blasten, welche hohe Mengen des IL-2-Rezeptors exprimierten das Bp50 nicht exprimieren.
Der G28-5-Antikörper reagierte mit einem einzigen Polypeptid an tonsillaren Lymphocyten, welche bei etwa 50 Kd unter nicht reduzierenden Bedingungen wanderten (Fig. 2A). Dieses Molekül ist grösser als frührer geschilderte B-Zellmarker im gleichen Molekuiargewichtsbereich, wie Bp39 oder Bp45 (Zipf, et al., 1983, J. Immunol. 131:3064-3072; Kitner, et al., 1981, Nature 194,458-460; Clark, et al., 1986, in Leu-koevte Tvoina II. Herausgeber Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Kap. 12, Vol. 2,155-167; Slovin, et al. 1982, Proc. Nat Acad. Sei. USA 79: 2649-2653; Thorley-Lawson, et al., 1985, J, Immunol. 134: 3007-3012 und Fig. 2B). Die Aussetzzeit für dieses Gel wurde so ausgewählt, dass die Molekulargewichte der andern B-Zellmarker leicht mit Bp50 verglichen werden konnten. Im Unterschied zu Bp50 wird der Bp39-Marker auf Granulocyten und Bp45 exprimiert und ebenfalls im Unterschied zu Bp50 ist er auf B-Zellblasten eingeschränkt. Antikörper gegen Bp39 (41-H16) und Bp45 (MNM6, BIast-1, Blast-2), welche durch einen Internationalen Workshop zugänglich gemacht wurden (Clark, et al., 1986, in Leukocvte Tvoino II. Herausgeber Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Kap. 12, Band 2, 155-167) blockierten die Bindung von fluoreszeinierten Anti-Bp50-Antikörper gegen B-Zellen nicht. Demzufolge erkennt der monoclonale Antikörper G28-5 auf Basis der Gewebeverteilung von biochemischen Analysen und Blockierungsstudien die 50 Kd-Struktur im einzelnen von anderen B-Zellantigenen.
Die Expression von Bp50 ist auf B-Zellen eingeschränkt
Sowohl blutbildende Gewebe, wie Zellinien-Verteilungsstudien und ausführliche Zweifarben-cytome-trische Fliessanalysen zeigten, dass Bp50 nur auf B-Lymphocyten exprimiert wird. Wie in Fig. 3 illustriert, wird Bp50 auf einer kleinen Teilmenge der Blutlymphocyten und auf einer grossen Population von tonsillaren Lymphocyten exprimiert. Im wesentlichen exprimierten alle Bp50-t~Zellen sowohl im Blut und in den Tonsillen ebenfalls Bp35 und HLA-DR, jedoch exprimierten kein CD2 (Fig. 1) oder CD3, T-Zellmole-küle oder die IgG-Fc-Rezeptoren, welche an den NK-Zellen gefunden werden. Weiter exprimierten ConA-aktivierte CD3+ T-Zellblasten 11-2-Rezeptoren, exprimieren jedoch nicht Bp50.
Die cytometrische Zweifarben-Fliessanalyse erlaubt die quantitative Messung der Dichtebeziehung zwischen zwei Oberflächenantigenen. Es wurde vorher gezeigt, dass die dichten ruhenden B-Zellen in der Manteizone von sekundären Follikeln IgM und kleine Mengen Bp35 exprimieren, während die schwimmenden aktivierten B-Zellen im germinalen Zentrum IgM-negativ sind und erhöhte Mengen von Bp35 exprimieren (Ledbetter, et al., Human Immunol. 15: 30). Fig. 3 zeigt, dass sowohl IgM-positive und IgM-negative B-Zelluntermengen Bp50 in gleichen Mengen exprimierten, was zeigt, dass bp50 sowohl in ruhenden B-Zellen und in in vivo-aktivierten B-Zellen exprimiert wird.
Verbesseruno der B-Zeiloroliferation mit Anti-Bp50-Antikörpern
Wie vorher erklärt, können B-Zellen mit niederen Dosen von Anti-u-Ketten-spezifischen Antikörpern aktiviert werden. Es wurde kürzlich gefunden, dass der B-zellspezifische Marker bp35 (Bl) ein 35-kDa-Polypeptid ebenfalls in der frühen B-Zellaktivierung funktionieren kann. Die 1F5 mAb gegen Bp35, wie niedere Dosen von Anti-u-Antikörpern, aktivierten B-Zellen indem sie das Zellvolumen und den
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RNA-Gehalt erhöhen und reaktiv gegen BCGF werden (Ciark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad, Sei. USA 82:1766-1770; Gollay, et al., 1985, J. Immunol, 135:3795-3801). Demzufolge war es von Interesse, den Effekt von Anti-Bp50 mAb bei der Proliferation von unbehandelten B-Zellen oder aus B-Zellen, welche entweder mit Anti-Bp35 oder mit Anti-u-Antikörpern aktiviert waren, (Tabelle 1) zu vergleichen. Anti-Bp35 in Lösung oder Anti-u-Antikörper, welche an Sepharosekügelchen gebunden waren, unter zweckmässigen Bedingungen allein, konnten die B-Zellproliferation etwas stimulieren (Tabelle 1, Zeile 1); die Anti-BpSO hingegen allein konnten die Prolifération nicht stimulieren (Tabelle 1, Zeile 2).
Anti-Bp50 mAb hingegen verbesserte die Proliferation beträchtlich, wenn sie mit Anti-u-Kügelchen oder mit Anti-Bp35 kultiviert wurden. In dieser Hinsicht glich Anti-Bp50 BCGF (Tabelle 1, Zeile 3). Demzufolge war es wichtig, zu bestimmen, ob Anti-Bp50 und BCGF zusammen die B-Zellenproliferation induzieren konnten. Wie in Tabelle 1, Zeile 4, illustriert, induzierten Anti-Bp50 und BCGF zusammen keine Proliferation, jedoch erhöhten sie die Proliferation von Anti-u- oder Anti-Bp35-aktivierten Zellen etwas mehr, als wenn sie allein stimuliert wurden. BCGF über einen Dreiloch-Bereich, falls mit Anti-BpSO ohne andere Signale verwendet, hatte keine Wirkung auf die Proliferation von dichten B-Zellen, sogar wenn Anti-Bp50 im Dosisbereich von 0,1 bis 10 fig/ml verwendet wurde.
Tabelle 1
Verbesserung der Anti-lg- oder Anti-Bp35-induzierten B-Zellproliferation mit Anti-Bp50-Antikörpern Mittlere Proliferation+S.E, von B-Zellen kultiviert mit:
Linie
Kostimulant
Medium
Anti-u-Kügelchen
Anti-Bp35
1
keines
1,212 ±547
10,219 ±462
5,539 ±308
2
Anti-Bp5Q
7194718
38,792± 1,329
25,465 ±616
3
BCGF
456 ±217
14,217±445
9,443 ±343
4
Anti-Bp50 + BCGF
1,456± 126
54,393 ±2,537
46,488± 3,387
Die Proliferation von dichten Er-tonsillaren B-Zellen (95% Oberflächen-lgM+-Zellen) wurde wie beschrieben am Tag 3 gemessen. Kurz geschildert, wurden 2 x 105 Zellen/200 nl/Loch vierfach während 48 Std, mit RPMI 1640-Medium, welches 15% fötales bovines Serum plus Additive ohne Antikörper oder mit 2C3 monoclonalem Antikörper gegen u-Ketten, welches an Sepharose-Kügel-chen gebunden war («Anti-u-Kügelchen» 50 jxg/ml) oder freier 1F5 Anti-Bp35-Antikörper (5 (ig/ml) kultiviert. Die Kulturen, welche das Medium «Anti-u-Kügelchen» oder Anti-Bp35 enthielten, wurden allein oder mit BCGF (5% finale Konzentration, Cytokine Technology, Buffalo, New York, ohne nachweisbare IL-1- oder IL-2-Aktivität) mit Anti-BP50 (1:1000 Verdünnung der Ascites) als Kosti-mulant kultiviert. Nach 40 Std. wurden die Zellen mit 3H-Thymidin pulsiert und die einverleibten Counts wurden nach 18 Std. gemessen.
Anti-BP50-mAb verbessert die Proliferation nur, nachdem die B-Zellen durch Anti-Bp35- oder Anti-u-Antiköroer aktiviert wurden
Die Resultate von Tabelle 1 führen zum Schluss, dass Anti-BpSO-mAb die Proliferation selbst nicht induzieren könnte. Wie in Tabelle 4 gezeigt, hatten Dosen von 0,05 g bis 2,0 ng/ml von Anti-BpSO keinen Effekt auf die 3H-Thymidin-Aufnahme. In Gegenwart von optimalen Mengen von Anti-Bp35-mAb, nur 0,1 bis 0,5 ng/ml Anti-BpSO-Antikörpern erhöhten die Proliferation wesentlich. Mengen von 50 000 bis 70 000 cpm waren nachweisbar bei einer optimalen Proliferationszeit, wenn hoch gereinigte B-Zellen nur Anti-Bp35 plus Anti-Bp50 kultiviert wurden. Eine konsequente Beobachtung zeigte, dass höhere Dosen von Anti-Bp50 (grösser als 2 bis 5 fig/ml) weniger wirksam waren, als Dosen im Bereich von 100 bis 200 ng.
Diese Resultate führen zum Schluss, dass Anti-Bp50 nur funktionierten, nachdem die B-Zellen durch andere Signale aktiviert waren. Die in Fig. 5 dargestellten Daten lassen schliessen, dass dies in der Tat der Fall ist. Wenn B-Zellen zuerst mit Anti-Bp35 aktiviert waren, konnte das Anti-BpSO bis zu 24 bis 48 Std. später zugegeben werden, wobei die Proliferation am Tag 4 immer noch verbessert wurde. Wenn hingegen die Zellen zuerst mit Anti-Bp50 behandelt wurden, war Anti-Bp35 nur wirksam, wenn es innerhalb von wenigen Stunden nach Beginn der Kulturen zugegeben wurde. Ähnliche Resultate wurden gefunden, wenn Anti-u anstelle von Anti-Bp35 verwendet wurde.
Anti-Bp50-mAb aktiviert B-Zellen nicht aus Gn. iedoch induziert aktivierte B-Zellen zur Durchschrei-tuna des Zellzvklus
Früher wurde bereits gefunden, dass Anti-Bp35 wie niedere Dosen von Anti-u-Antikörpern, ruhende tonsillare B-Zellen in Go zur Vergrösserung anregen (Clark, et al., 1986, Leukocvte Typing II. Herausgeber Reinherz, et al., Springer Verlag, Berlin, Band 2, 455-462) und in die Gi-Phase des Zellzyklus
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übergehen (Gollay, et al., 1985, J. Immunol. 135:3795-3801 ). Es war demzufolge von Interesse die Fähigkeit von Anti-Bp50-mAb mit Anti-Bp35-mAb auf ihre Wirkungen im Zusammenhang mit B-Zellaktivierung zu vergleichen. Wie in Fig. 6A dargestellt, besassen nicht-stimulierte, dichte tonsillare B-Zellen sogar nach 3 bis 4 Tagen in der Kultur ein einheitliches RNA-Profil, welches für Zellen in Go charakteristisch ist (Darzynkiewicz, 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77: 6697-6702). Etwa 15-30% der Zellen, welche mit Anti-Bp35 oder Anti-u stimuliert wurden, besassen jedoch einen erhöhten RNA-Gehalt, was den Eintritt in Gì anzeigte. Im Gegensatz dazu induzierte weder Anti-Bp50 (Fig. 6B) noch BCGF (Fig. 6C) allein eine signifikante Anzahl von B-Zellen zum Übergang in Gì. 2 Tage nach der Aktivierung induzierten beispielsweise Anti-Bp35 bzw. Anti-Ig-mAb 13,5% bzw. 20,9% der tonsillaren Zellen zum Übertritt in Gi, während Zellen, welche nur mit Anti-Bp50 (2,7%) oder mit BCGF (3,2%) behandelt wurden, auf dem Niveau des Kontrollmediums (2,2%) blieben. Wenn jedoch, sowohl Anti-Bp50 als BCGF zusammen mit Anti-Bp35 oder Anti-u-Antikörpern zusammen zugegeben wurden, vergrösserte sich die Anzahl von Zellen, welche in Gi übergingen, dramatisch. In ähnlicher Weise zeigten Anti-Bp50 und BCGF allein keine Induktion von B-Zellen zum Übertritt in die S-Phase (Tabelle 2) zusammen jedoch, entweder mit Anti-Bp35 oder Anti-u erhöhte sich die Anzahl der S-Phasen-Zellen zwei- bis dreifach.
Tabelle 2 _____
Wirkung von Anti-Bp50 und BCGF auf den Fortschritt des Zellzyklus in tonsillaren Lymphocyten Kompetenz-Signal Progressions-Signal % Zellen
Go Gt S/G2/M
Medium keines
89,9
7,1
2,5
Anti-Bp35
keines
80,4
14,5
3,7
Anti-lg keines
65,6
27,6
5,7
Medium
Anti-Bp50
83,6
12,0
3,3
Anti-Bp35
Anti-Bp50
54,1
35,5
9,7
Anti-lg
Anti-Bp50
43,6
36,2
16,2
Medium
BCGF
85,4
11,7
2,2
Anti-Bp35
BCGF
56,6
32,6
11,6
Anti-lg
BCGF
48,4
36,1
14,1
Prozentsatz von Zellen in Go, Gi oderS und G2, bestimmt unter Verwendung des Acridin-orange-Färbungsverfahrens (Darzynkiewicz etal., 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77:6697-6702); 1 x 106 dichte tonsillare Lymphocyten mit Anti-Bp35 (5 jig/ml), Anti-u auf Kügeichen (50 ng/ml), Anti-Bp50 (0,4 ng/ml), BCGF (5%) oder Kombinationen wie angegeben.
Optimale Bedingungen für die Verbesserung der B-Zell-Proliferation mit Anti-Bp50-Antikörpern
Antikörper gegen Bp50 selbst haben keinen oder keinen nachweisbaren Effekt auf dichte ruhende B-Zellen (Tabelle 3). In Gegenwart von Mitteln, welche B-Zellen aktivieren können, beispielsweise Anti-lg, Anti-Bp35 und TPA, Anti-Bp50-mAb wurde die Proliferation klar verbessert. Anti-Bp50 kostimulierte nicht mit einigen Interleukinen, einschliesslich gereinigtem IL-1, rekombinantem IL-2 und BCGF (nieder). Ein Vergleich der Wirkungen von Anti-BpSO mit denjenigen von BCGF (nieder) zeigte, dass einige Wirkstoffe, welche mit Anti-Bp50 kostimularisch waren, ebenfalls eine Kostimulation mit BCGF (nieder) zeigten (Tabelle 3). Von besonderem Interesse war die Erkenntnis, dass BCGF und Anti-Bp50 zusammen für ruhende Zellen keine Kostimulation zeigten.
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re:
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Tabelle 3
Verbesserung der B-Zi sllproliferata'on mit j
^nti-Bp50 Antikörpern oder B-Zellwachsiumsfaktoren
Mittlere Prolifération ± S.E. von B-Zelien kultiviert mit:
Kostimuians
Medium
Anti-Bp50
BCGF
(200 ng/ml)
(5%)
keines
96 ±1
267±15
285 ±74
Anti-lg
5,833 ±391
41,634± 2,103
25,094 ±61
Anti-Bp35 (5 ng/ml)
457±45
8,143 ±280
1,733 ±32
TPA (2 ng/ml)
7,361 ±537
21,163 ±871
13,064± 1,030
IL-1 (10 U/ml)
264 ±2
308 ±23
221+8
IL-2 (100 (U/ml)
204 ±34
350 ±7
220 ±11
BCGF (5%)
220 ±7
851 ±28
270 + 18
Dichte Er-tonsillare B-Zellen (mehr als 95% slgM+-Zellen) wurden während 48 Std. mit 2 x 105-Zel-len/Loch kultiviert und anschliessend 24 Std. mit 3H-Thymidin pulsiert, bevor gezählt wurde.
Die Kinetik der Prolifération, welche durch Antl-Bp50 verbessert wurde, ist in Fig. 7 dargestellt. Die Spitze der Proliferation fand am Tag 4 statt und nahm dann ab, ungeachtet dessen, ob die Zellen mit Anti-Bp35 oder anderen Aktivatoren, wie Anti-lg oder TPA, aktiviert wurden. Die Kinetik der Proliferation, welche durch BCGF oder durch Anti-Bp50 verbessert wurde, war ähnlich.
Es genügten 0,05 (ig Anti-Bp50-Antikörper, um die Proliferation zu verbessern. Als optimale Dosis wurde in den nachfolgenden Studien 0,3 ng/ml verwendet. Eine andauernde Beobachtung zeigte, dass bei der Verwendung von ganzen Antikörper-Molekülen höhere Dosen von Anti-Bp50 (grösser als 2-5 ng/ml) weniger wirksam waren, als Dosen im Bereich von 0,1-0,5 ng/ml.
Humane B-Zellen waren vortrefflich empfindlich gegen Hemmungseffekte, welche durch Fc-Rezepto-ren von Antikörpern, welche an das Oberflächen-ig gebunden waren, vermittelt wurden (Parker, 1980, Immunoi. Rev. 52:115; Bijsterbosch, et al., 1985, J. Exp. Med. 162:1825). Es war demzufolge wichtig, die Wirksamkeit der ganzen Anti-Bp50-mAb mit derjenigen von Anti-Bp50-F(ab')2-Fragmenten zu vergleichen. Über einem hundertfachen Dosisbereich waren F(ab')a-Fragmente klar ebenso wirksam oder sogar wirksamer als ganze Antikörper bei der Verbesserung der B-Zellproliferation (Tabelle 4). Demzufolge ist der Fc-Bereich der Anti-Bp50-mAb nicht erforderlich, damit Anti-Bp50 seine Wirkung ausüben kann, und wenn etwas hemmend sein kann. In anderen Worten kann Anti-Bp50 wie BCGF offensichtlich als löslicher Mittler ohne Hilfe der Fc-Rezeptor-vermittelten Hitfszellfunktion agieren,
Tabelle 4
Der Fc-Bereich von Anti-Bp50-Antikörpern ist für die Verbesserung der B-Zellproliferation nicht erforderlich
Mittlere Proliferaiion von B-Zellen kultiviert mit:
Anti-Bp50 Dosis Medium Anti-Bp35
(ug/mt)
keines
—
295 ±16
269 ±27
ganze Ab
0,125
278 ±32
5,140 ±20
1,25
275 ±24
4,686 ±342
12,5
163 ±15
3,852 ±203
F(ab02
0,125
594 ±21
10,635 ±449
1,25
531 ±3
10,893 ±575
12,5
179±8
9,411 ±870
Die Zellkulturbedingungen waren gleich, wie sie in Tabelle 3 beschrieben sind.
Unterschiede zwischen der Anti-Bp50- und der BCGF-fniederi-Aktivität
Anti-Bp50 und BCGF (nieder) hatten einen ähnlichen Effekt auf B-Zellen und zeigten eine Kostimulie-rung mit den gleichen Wirkstoffen (Tabelle 3). Gewisse Nachweise jedoch zeigen, dass Anti-Bp50 und BCGF, welche in dieser Studie verwendet wurden, offensichtlich durch unterschiedliche Signale operieren. Erstens werden im Unterschied zu BCGF (nieder) die Bp50-Moleküle (Bijsterbosch, et al., 1985, J.
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Exp. Med. 162:1825) auf ruhenden B-Zeilen aus Blut exprimiert (Fig. 3). Zweitens, obschon sowohl Anti-Bp50 und BCGF (nieder) am wirksamsten funktionieren, wenn sie nach dem Anti-Bp35 oder Anti-lg zugefügt werden, war das Anti-Bp50 klar am optimalsten wirksam, wenn es 12 Std. nach Kulturbeginn zugefügt wurde (Fig. 8A). BCGF (nieder) hingegen konnte bis 24 Std. nach dem Kulturbeginn zugegeben werden und verbesserte immer noch die Prolifération optimal (Fig. 8B). Diese kinetischen Experimente, welche nach den Angaben von Howard und Paul geformt wurden (1983, Ann. Rev. Immunol. 1: 307) führen zum Schluss, dass ein Bp-50-abhängiges Signal normalerweise seine Wirkung vor dem BCGF ausübt.
Sowohl Anti-Bp50 und BCGF (nieder) verbesserten die Proliferation von B-Zeilen, welche mit Anti-Bp35 oder Anti-lg (Tabelle 3) aktiviert waren. Die Wirkungen von Anti-Bp 50 und BCGF (nieder) waren jedoch in vielen Versuchen additiv (Fig. 7). Fig. 9 zeigt eine Titration von BCGF (nieder) in einem Experiment, worin Anti-Bp50 in seiner optimalen Konzentration (0,2 ng/ml) verwendet wurde. BCGF (nieder) konnte weiter die Proliferation der ruhenden B-Zellen in Gegenwart von Anti-Bp50 nach der Aktivierung durch Anti-lg oder Anti-Bp35 verbessern. Optimale Konzentration von BCGF (nieder) waren 5-20%, während 25% hemmend waren. Wenn demzufolge, Anti-Bp50 und BCGF (nieder) beide in ihren optimalen Konzentrationen verwendet wurden, zeigten sie immer noch additive Wirkungen auf die B-Zellproliferation.
Schliesslich unterschieden sich sowohl normale, wie auch bösartige B-Zelluntereinheiten in ihrer Antwort auf Anti-Bp50 und auf BCGF (nieder). Beispielsweise antworteten einige Blut-B-Zellen auf BCGF (nieder), jedoch nicht auf Anti-Bp50 (Tabelle 5). Ein zusätzliches Aktivierungssignal, wie Anti-Bp35 (Tabelle 5) oder TPA (Fig. 10) war durchwegs erforderlich, damit die Blut-B-Zellen auf Anti-Bp50 antworteten. Während dichte tonsillare B-Zeilen im allgemeinen weder auf BCGF, noch auf Anti-Bp50 antworteten, bewirkten die schwimmenden B-Zeilen eine Antwort (Tabelle 5). Die bösartigen B-Zellen unteschie-den sich ebenfalls in ihrer Antwort auf Anti-Bp50 gegen BCGF. Beispielsweise antworteten einige B-Zelllymphome gegen TPA plus BCGF (nieder), jedoch nicht gegen TPA plus G28-5-Anti-BP50 (Fig. 10B und D). Im Gegensatz dazu antworteten dichte tonsillare B-Zellen und periphere Blut-B-Zellen auf TPA plus sowohl BCGF (nieder) ais auch Anti-Bp50 (Fig. 10A und C).
Tabelle 5
B-Zelluntereinheiten unterscheiden sich in ihrer Antwort auf Anti-Bp50 oder BCGF Mittlere Proliferation (± S.E.M.) von Lymphocyten aus:
Stimulation Blut Tonsillen (Mandeln)
Exp 1 Exp 2 Exp 3 dicht schwimmend keine
527 ±70
650 ±133
906 ±106
385 ±43
387±12
BCGF (5%)
13,918 ± 1,082
37,594 ±2,023
3,347 ±174
332 ±33
1,451 ±57
Anti-Bp50 (0,5 ng/ml)
519 ±28
1,013 ±81
1,151 ±28
472 ±8
1,543 ±20
Anti-Bp35 (5 ng/ml)
554± 90
645 ±89
665±115
2,415 ±80
1,129±68
Anti-BpSO+Anti-Bp35
-
12,274±546
15,667 ±333
36,589 ±1,335
4,843 ±136
Anti-Bp50 + BCGF
-
-
3,943 ±115
1,342±19
2,899 ±91
Die Zellkulturbedingungen entsprechen denjenigen von Tabelle 1. An Nylonwolle haftende Blut-Lympho-cyten (B-Zellen plus Monocyten) wurden von den Monocyten befreit, indem sie auf Platikteilern über Nacht vor der Stimulation inkubiert wurden (Exp 1+2). In Exp 3 wurden die Blut-E-Lymphocyten von den Monocyten befreit, durch Inkubation auf Platikteilern während 1 Std. vorder Stimulation. Die tonsillaren Er-Lymphocyten wurden unter Verwendung eines Percoll-Gradienten in dichte (pellet) oderschwim-mende (Fraktion 1) Untermengen (32).
Verwendung von Anti-BD50-Lioanden und Bo50
Die erfindungsgemässen Uganden können in vivo und in vitro in ihrer unmodifizierten oder modifizierten Form verwendet werden, um Immunantworten zu modulieren. Beispielsweise können die Uganden selbst als ein «Adjuvans» zur Erhöhung einer Immunantwort auf einen Impfstoff oder zur Erhöhung der Immunantwort auf ein Individuum mit Immunosuppression verwendet werden. Alternativ können, wenn Cytotoxine oder anti-proliferative Mittel an die Liganden gekuppelt werden, diese zur Verminderung einer Immunantwort verwendet werden, z.B. bei Autoimmunleiden oder bei Transplantationspatienten, um die Pfropfabweisung zu lindern. Diese modifizierten Liganden könnten ebenfalls verwendet werden, um Bösartigkeiten zu behandeln, welche Zellen oder Tumore umfassen, welche das Bp50-Antigen exprimieren, unabhängig davon, ob die Bösartigkeit ursprünglich von einer B-Zeile kommt.
Sowohl die erfindungsgemässen Liganden und/oder Bp50 selbst kann in vitro verwendet werden. Solche Anwendungen umfassen in vitro-Tests wie Immunoassays für den Nachweis von Zellen, welche das Bp59-Antigen exprimieren und/oder für den Nachweis der Ausschüttung des Bp50-Antigens in Körper13
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flüssigkeiten, sofern vorhanden. In diesen Fällen könnte der Ligand oder das BpSO mit einem Radiolabel, Fluor, einem Enzym, einem Enzymsubstrat, einem Farbstoff usw. markiert werden. Zusätzlich können die Liganden verwendet werden, um Zellen abzutrennen und/oder zu identifizieren, welche das Bp50-An-tigen exprimieren, in welchem Fall der Ligand an einen immobilen Träger gekuppelt werden kann oder an Fluor gebunden werden kann, welches in einem FACS verwendet werden kann (Fiuoreszens aktivierter Zellsortierer).
Diezahlreichen Anwendungen der erfindungsgemässen Liganden und Bp5Q werden im einzelnen nachstehend diskutiert.
Der BoSO-Rezeptor und die Verwendung von Lioanden. wie Anti-Bp50 zur Verbesserung der B-Zellproliferation
Vorhergehende Studien führten zum Schluss, dass die Faktoren, welche bei der Induktion von B-Zel-len von der Go- in die Gt-Phase des Zellzyklus involviert werden, verschieden sind, von den Aktoren oder den Erfordernissen in die S-Phase. Dieses Modell basiert prinzipiell auf Studien, welche zeigen, dass Mittel, wie niedere Dosen von Anti-Ig-B-Zellaktivationsfaktoren oder Anti-Bp35 allein keine oder nur kleine Wirkungen auf die B-Zellproliferation besitzen. Dennoch können die gleichen Mittel die B-Zel-Ien zu einem Punkt in der Zellaktivierung steuern, wo sie empfänglich für Wachstumsfaktoren sind. Im Gegensatz dazu haben Wachstumsfaktoren, wie BGGF oder IL-2 allein keine Wirkung auf ruhende B-Zellen, verbessern jedoch das Wachstum von aktivierten B-Zellen.
Während sich die vorliegende Erfindung nicht auf eine Theorie oder Erklärung beschränken will, stellen die hier dargestellten Resultate eine zusätzliche Stützung für ein Modell einer bestimmten Regulierung der B-Zellaktivierung und der Wachstumsstufen. Es wurde hier gezeigt, dass die Aktivierungsund Proliferationssignale in humanen B-Zellen über bestimmte Zelloberflächenstrukturen übermittelt werden können. Obschon Anti-Bp35-mAb B-Zellen aktivierte, um in die Gi-Phase des Zellzyklus einzudringen, induzierte er nur eine schwache oder keine Proliferation. Anti-BpSO-rnAb hatte den gegenteiligen Effekt. Er konnte die B-Zellen nicht aktivieren; wenn er aber bereits 12 bis 24 Std. naGh der Aktivierung zugegeben wurde, konnte er das B-Zellwachstum induzieren.
Das BpSO-MoIekül kann vermutlich normal, entweder als Rezeptor für einen Uganden, z.B. als löslicher Wachstumsfaktor oder als Signal, welches durch Zell-Zellkontakt vermittelt wird, funktionieren (d.h. ein Ligand wird auf der Oberfläche einer anderen Zelle gefunden). Frühere Studien führten zur Identifikation von verschiedenen von T-Zellen abgeleiteten BCGF, welche wie Anti-Bp50 die B-Zellproli-feration verbessern. Die B-Zellwachstumsfaktoren von niederem und hohem Molekulargewicht sind identifiziert worden und verschiedene Typen zeigten additive Effekte (Kehrt, et âl., 1984, Immunol. Rev. 18:75-96; Kishimoto, 1985, Ann. Rev. Immunol. 3:133-157; Swaïn, etal., 1983, J. Exp. Med. 158:822-835; Howard, et al., 1984, Immunol. Rev. 78:185-210; Ambrus, et al., J. Clin. Invest. 75: 732-739; Ambrus, 1985, J. Exp. Med. 162:1319-1335). Demzufolge könnte Bp50 ein Rezeptor für einen dieser Faktoren darstellen.
Mit der Ausnahme von IL-2-Rezeptoren und dem C3D-Rezeptor wurden die Rezeptoren auf den B-Zellen für Wachstumssignale noch nicht identifiziert. Der mAb-AB-1 reagiert mit einem B-Zellmarker, welcher nur auf aktivierten B-Zellen exprimiert wird und blockiert die BCGF-abhängige Proliferation und könnte demzufolge den BCGF-Rezeptor oder eine verwandte Struktur erkennen. Bp50 scheint verschieden vom AB-1-Marker zu sein, da der AB-l-mAb die Bindung des G28-5-Anti-Bp50-Antikörpers nicht blockiert und im Unterschied zum G28-5-mAb nur mit aktivieren B-Zellen reagiert (Jung, et al., 1984, J. Exp, Med. 160:1919-1924). Bp50 ist auf allen B-Zellen, was auf Basis von Absorptionsanalysen und Direktbindungs-Tests für BCGF-Rezeptoren nicht der Fall zu sein scheint. Die vorliegenden Daten zeigen, dass Bp5Ö und der Rezeptor für den Niedermolekulargewichts-BCGF verschiedene Strukturen sind. Unter Verwendung eines Kaninchen-Heteroantiserums, beschrieben Wang und Mitarbeiter (Wang, 1979, J. Exp. Med. 149: 1424-1433) ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 54 kDa gp54, weiches wie Bp50 auf allen B-Zellen exprimiert wird, jedoch in kleineren Mengen auf Blut-B-Zellen als auf tonsillaren B-Zelten. Es ist wahrscheinlich, jedoch unwahrscheinlich, dass das Kaninchen-Hete-roantiserum und Anti-Bp50 die gleichen oder verwandte Strukturen besitzen: im Unterschied zum Anti-Bp50-mAb war das Kaninchen-Antiserum gegen gp54 allein genügend, um die B-Zellproliferation zu stimulieren.
Anti-Bp35 allein, im Unterschied zu Anti-Bp50 kann B-Zellen von Go auf Gi aktivieren und kann demzufolge als «Aktivierungs»-Signal bezeichnet werden. Ob Bp35 nur in der frühen B-Zeltaktivierung funktioniert, ist noch nicht klar, dass Anti-Bp35-Antikörper einige B-Zellen zur Teilung stimulieren können (Clark, et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:1766-1770). In ähnlicher Weise kann Bp50 strenggenommen nicht nur als «Wachstums»-Signal funktionieren: Anti-Bp50-Antikörper zusammen mit Aktivierungssignalen (Anti-Bp35 oder Anti-u) verbessert nicht nur die Proliferation, sondern erhöht ebenfalls die gesamte Anzahl von B-Zellen, welche in Gi eintreten (Tabelle 2). Anders gesagt, reagiert Anti-Bp59 als Kostimulans zur Förderung der Progression der Aktivierung (Go in Gi) und der Wachstumsphasen (G zu S) des Zellzyklus. Der BCGF, welcher in diesen Studien verwendet wurde, hatte ebenfalls eine ähnliche Aktivität (Fig. 6C). Demzufolge scheint Anti-Bp35 und Anti-BpSO (oder BCGF) die grösste Analogie zu den «Kompetenz»- und «Progressions»-Faktoren, welche in den Studien über die Fibrobla-
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sten-Wachstumsregulierung beschrieben wurden. Wie die B-Zellen auf Anti-Bp35 oder Anti-Bp50 reagieren, hängt in klarerWeise von ihrem Zustand der Differenzierung oder der Aktivierung ab.
Hier wurde gezeigt, dass zwei mAb, Anti-Bp35 (ein «Kompetenz»-Signal) und Anti-Bp50 (ein «Progressions»-SignaI) zusammen eine wesentliche Proliferation von hoch-gereinigten B-Zellen in Abwesenheit von Antigenen oder anderen bekannten Faktoren induzieren können. Die natürlichen Uganden für diese Strukturen sind noch nicht bekannt. Da jedoch mAb gegen zweckmässige Epitope sowohl lösliche Faktoren und Signale, welche durch Zell-Zellwechselwirkungen vermittelt werden, nachahmen kann, ist es möglich, zweckmässige Kombination von mAb zur Steuerung und Regulierung der humanen B-Zellproliferation oder Differenziation zu verwenden. Dies wird demnach die Entwicklung von in vivo-Strategien für die Kontrolle von humanen Leiden, beispielsweise von B-Zell-Bösartigkeiten von Immunschwächen und gewissen Autoimmunleiden, unterstützen. Der neue monoclonale Antikörper G28-5, welcher mit einem Einzelketten-Polypeptid von etwa 50 Kd, welches an der Oberfläche von humanen B-Zellen exprimiert wird, ist nur eine besondere Ausführungsform von Uganden der vorliegenden Erfindung, welche die Proliferation von aktivierten B-Zellen verbessern kann. Da die humane B-Zellproliferation in ähnlicher Weise durch T-Zellderivierte BCGF einschliesslich Nieder- und Hoch-Molekulargewichts-BCGF verbessert werden kann, wurde die Aktivität von Anti-Bp50 G28-5 mit derjenigen von BCGF-Präparaten, welche vorwiegend Nieder-Molekulargewichts-BCGF enthalten, verglichen. Anti-Bp50 G28-5 und BCGF (nieder), waren insofern sehr ähnlich, als dass sie mit den gleichen Aktivierungsmitteln kostimulatorisch wirkten (Anti-lg, Anti-Bp35 und TPA), jedoch nicht kostimulatorisch mit anderen, wie IL-1 oder IL-2 waren. Im weitern war die Aktivität von Anti-Bp50 G28-5 nicht abhängig von seinem Fc-Bereich, da die F(ab')2-Fragmente von G28-5 funktionell aktiv waren. Dies führt zum Schluss, dass lösliches Anti-Bp50, wie lösliches BCGF Fc-Rezeptor-tragende Zusatzzellen zur Ausübung eines Effektes nicht benötigen. Im weiteren sind sowohl Antl-Bp50 als auch BCGF nur in Gegenwart eines Akti-vations-Stimulus wirksam. In anderen Worten, sind Anti-Bp50 und BCGF nicht «Kompetenz»-Faktoren, sondern promovieren die «Progression» von B-Zellen durch den Zellzyklus.
Während es möglich ist, dass Bp50 als Rezeptor für einen Uganden, wie für einen B-Zellwachstumsfaktor funktionieren kann, lassen einige Resultate den Schluss zu, dass Bp50 nicht der Rezeptor zumindest für den BCGF (nieder), welcher in der vorliegenden Studie verwendet wird, darstellt: er wird auf Blut-B-Zellen exprimiert, während BCGF (nieder)-Rezeptoren dies offensichtlich nicht werden. Mögliche Strukturen für den BCGF (nieder)-Rezeptor im Unterschied zu Bp50 werden ebenfalls auf aktivierten B-Zellen exprimiert. Überdies unterscheiden sich die normalen und bösartigen B-Zellpopulationen in ihrer Empfindlichkeit gegen Anti-Bp50 gegen BCGF (nieder) (Tabelle 5 und Fig. 10). Beispielsweise proliferieren einige B-Lymphome als Reaktion auf BCGF (nieder), jedoch nicht als Reaktion auf Anti-Bp50. Schliesslich induzierten in einer Anzahl von Versuchen optimale Konzentrationen von Anti-Bp50 und BCGF zusammen mehr Proliferation, als jedes allein. Anti-Bp50 ahmt die Aktivität von anderen BCGF nach, wie von BCGF (hoch), welches kostimulatorisch mit Anti-lgM wirkt (Ambrus, et al., 1985, J. Exp. med. 162:1319; Ambrus, et al., 1985, J. Clin. Invest. 75: 732). Dies führt zum Schluss, dass Bp50 eine Funktion als Rezeptor für BCGF (hoch) ausüben könnte.
Obschon Bp50 ein Rezeptor für einen löslichen Liganden sein könnte, kann alternativ Bp50 als Rezeptor für ein Zell-Zell-vermitteltes Signal dienen, welches die BCGF-Rezeptormenge und/oder autokrine Produktion reguliert. Die Präzedenz für die Differenzierung von Antigenen, welche als Verstärker für eine Autokrin-Rezeptorbahn dienen, kommt aus Studien mit T-Zellen. mAb gegen das gewöhnliche Leu-kocyten-Antigen, Lp 220, verbessert die Proliferation durch Erhöhung der IL-2-Rezeptorexpression auf aktivierten T-Zellen (Ledbetter, et al., 1985, J. Immunol. 135:1819). Ein analoger Mechanismus kann mit Anti-Bp50 und der Expression von gewissen BCGF-Rezeptoren operieren. Bp50 und BCGF (nieder) sind offensichtlich unter einer gewissen koordinierten Kontrolle, wie die IL-1 und IL-2-Rezeptoren, verbessert BCGF die Expression von Bp50 an gewissen leukämischen Zellen. Das Bp50-Mo!ekül teilt ebenfalls Ähnlichkeiten mit dem Tp44-Molekül, welches bei der Beeinflussung der lL-2-Produktion funktioniert. Die Erfinder und andere haben gezeigt, dass der 9.3 Anti-Tp44-Antikörper die Proliferation von T-Zellen, welche durch Anti-CD3 oder TPA aktiviert sind, verbessert (Ledbetter, et al„ 1985, J. Immunol. 135: 2331; Hara, et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1513). In ähnlicher Weise verbessert Anti-Bp50 die Proliferation von B-Zellen, welche durch Anti-Bp35 oder TPA aktiviert sind. Das Tp44-Signal funktioniert, indem es die IL-2-Produktion und weniger durch die Stimulation des T-Zellwachstums. Das Bp50-Signal könnte vermutlich in analoger Weise durch die B-Zell-Autokrinproduktion funktioneren (Gordon, et al., 1984, Nature, London, 310:145).
Modifizierte Liaanden. welche für die Immunosuppression oder die Behandlung von Bösartigkeiten verwendet werden
Dazu kann der erfindungsgemässe Ligand modifiziert werden, indem ein anti-proliferatives Mittel gebunden wird, so dass das resultierende Molekül zur Abtötung von Zellen, welche das Bp50-Antigen exprimieren, verwendet werden kann. Auf diese Weise modifizierte Liganden, können bei der Behandlung von Autoimmunleiden verwendet werden, um die Proliferation von B-Zellen zu unterdrücken und dabei die Autoimmunantwort zu unterdrücken. Diese modifizierten Uganden können ebenfalls bei der Immunosuppression eines Transplantationspatienten verwendet werden, um einer Abweisung der Pfropfstelle
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vorzubeugen. Demzufolge können cytotoxische Mittel, welche für die Suppression von Immunantworten verwendet werden, an den erfindungsgemässen Liganden gebunden werden. Wenn Liganden, welche die Prolifération von B-Zellen erhöhen, verwendet werden, sollte ein verbesserter Effekt bewirkt werden, da das Mittel gegen die proliferierenden B-Zellen gerichtet ist.
Weiter können erfindungsgemässe Liganden, die durch die Bindung eines anti-proliferativen Mittels modifiziert sind, zur Behandlung von Bösartigkeiten verwendet werden, weiche Tumore oder Zellen umfassen, welche das Bp50-Antigen exprimieren. Die Befestigung dieser chemotherapeutischen Mittet an erfindungsgemässe Liganden, sollte eine grössere Spezifität des Mittels gegen die bösartigen Zellen bewirken. Überdies sollte ein besonderer Vorteil erhalten werden, wenn eine B-Zellbösartigkeit mit einem Liganden behandelt wird, an welchen ein Cytotoxin gekoppelt ist, welches wirkungsvoller bei der Abtö-tung von proliferativen Zeilen als bei nicht-proliferativen Zellen ist. Die Behandlung mit einem solchen Liganden sollte eine Potenzierung der Wirkung des Cytotoxins zur Folge haben.
Demzufolge umfassen die chemotherapeutischen Mittel oder die anti-proliferativen Mittet, welche an die erfindungsgemässen Uganden gekuppelt werden können, die Mittet, welche in der nachstehenden Tabelle 6 aufgelistet sind, und welche von Goodman und Gilman, the Pharmacologîcal Basis of Therapeu-tics, Sixth Edition, MacMillan Publishing Co., Inc., New York, Seiten 1249-1313,1980, entnommen ist. Die möglichen Wirkstoffe sind jedoch nicht auf die nachstehend angegebenen eingeschränkt.
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Tabelle 6
Chemotherapeutische Mittel, die an Anti-Bp50-Liganden gekuppelt werden können Klasse Typ Mittel
Alkylierungsmittel
N-Lost
Mechlorethamin
Cyclophosphamid
Melphalan
Uracil-Lost
Chlorambucii
Ethylenimin-Derivate
Thiotepa
Alkylsulfonate
Busulfan
Nitrosoharnstoff
Carmustln Lomustin Semustin Streptozocin
Triazenderivate
Dacarbazin
Antimetabolit
Foisäure-Analoge
Methotrexat
Pyrimidin-Analoge
Fluorouracil
Cytarabin
Azaribin
Purin-Anaioge
Mercaptopurin Thioguanin
Naturprodukte
Vinca-Alkaloid
Vinblastin Vincristìn
Antibiotika
Dactinomycin
Daunorubicin
Doxorubicin
Bleomycin
Mithramycin
Mitomycin
Enzyme
L-Asparaginase
Verschiedene Mittel
Platin-Koordinationskomplexe
Cisplatin
Substituierte Harnstoffe
Hydroxyharnstoff
Methyl
Hydrazin
Derivate
Procarbazin
Adrenocorticai-Suppressant
Mitotan
Hormone und Antagonisten
Adrenocorticosteroide
Prednison
Pragestine
Hydroxyprogesteroncaproat
Medroprogesteronacetat
Megestrolacetat
Estrogene
Diethylstilbestrot Ethinylestradiol
Antiestrogen
Tamoxifen
Androgen
Testosteronproprionat Fluoxymesteron
Radioaktive Isotope
Phosphorderivate
Natriumphosphat 32p
iod
Natriumiodid 1311
Zur Kupplung der Uganden mit den chemotherapeutischen oder anti-proliferativen Mitteln können sämtliche Verfahren des Standes der Technik verwendet werden. Beispiele solcher Verfahren sind in der vorliegenden Beschreibung erwähnt.
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Andere Verwendungen von Liaanden und Bp50
Zusätzlich zu den therapeutischen Anwendungen der Uganden und Bp50 selbst, existieren andere Anwendungen, sowohl in vitro wie auch in vivo-Diaonosetests. Trennverfahren usw. Der Bp50-Rezep-tor kann bei der Herstellung und/oder beim Design der erfindungsgemässen Uganden verwendet werden. Bp50 kann ebenfalls mit den erfindungsgemässen Liganden in in vitro-Tests verwendet werden, welche als Referenz für das nachgewiesene Bp50 in der Probe dienen. Schliesslich kann Bp50 selbst nützlich als löslicher Faktor zur Vermittlung der Immunität sein, z.B. ein Lymphokin.
Zusätzlich zur therapeutischen Behandlung und zu diagnostischen Tests können die erfindungsgemässen Liganden ebenfalls für die Identifizierung oder Trennung von Zellen dienen, welche das Bp50-Antigen exprimieren. Ebenso können zweckmässige Radiolabels oder radioopake Verbindungen an den Liganden gebunden werden, wobei der Ligand für in vivo-Abbildunoen von Tumoren, welche das Bp50-Antigen exprimieren, verwendet werden könnte. Andere Verwendungszwecke gehen für den Fachmann aus der vorliegenden Beschreibung hervor.
Hinterlegung der Zellinien
Das vorliegende Hybridom wurde am 22. Mai 1986 bei der American Type Culture Collection, Rock-ville, MD, hinterlegt und besitzt die nachstehende Hinterlegungsnummer:
Hybridom
ATCC-Hinterlegungsnr.
G28-5
HB9110
Die vorliegende Erfindung soll nicht durch den Umfang des hinterlegten Hybridoms begrenzt sein, da die hinterlegte Ausführungsform nur als eine einzelne Erläuterung dient und einen Aspekt der Erfindung darstellt und andere Zelllinien, welche äquivalent funktionieren, liegen innerhalb der Erfindungsdefinition. Zahlreiche Modifikationen der Erfindung sind für den Fachmann naheliegend, wenn ihm die vorliegende Beschreibung und die beiliegenden Zeichnungen zur Verfügung stehen.

Claims (21)

Patentansprüche
1. Ligand, welcher Bp50, ein B-Zellenoberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 50 ku (Kilodalton), welches durch den monoclonalen Antikörper G28-5 definiert wird, bindet.
2. Ligand gemäss Anspruch 1, welcher a) Bp5Q bindet und b) nach seiner Bindung an eine aktivierte B-Zelle, die aktivierte B-Zelle stimuliert, den Zellzyklus so traversiert, dass die Proliferation der B-Zelle vergrössert wird.
3. Ligand gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Antikörper-Molekül oder einen Fv-, Fab-, F(ab')2- oder Fab'-Teil des Antikörper-Moleküls umfasst.
4. Ligand gemäss Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikörper-Molekül aus einem monoclonalen Antikörper-Molekül oder einem Fv-, Fab-, F(ab')2- oder Fab'-Teil des monoclonalen Antikörpers besteht.
5. Ligand gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das monoclonale Antikörper-Molekül den monoclonalen Antikörper G28-5 oder einen Fv-, Fab-, F(ab')2- oder Fab'-Teil davon darstellt.
6. Ligand gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Lymphokin, inbesondere ein Lymphokin, welches einen B-Zellwachstumsfaktor darstellt, enthält.
7. Ligand gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Lymphokin an der Zelloberfläche ist.
8. Ligand nach einem Ansprüche 1-3 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einer Verbindung gekuppelt ist.
9. Ligand gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein anti-proliferatives Mittel, ein Alkylierungsmittel, ein Antimetabolit, ein Antibiotikum, ein Vinca-Alkaloid, ein Enzym, ein Platin-Koordinationskomplex, ein Radioisotop oder eine fluoreszierende Verbindung ist.
10. Verfahren zur Herstellung des Liganden gemäss Anspruch 5 in Form des monoclonalen Antikörpers G28-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungsnr. ATCC HB 9110 oder eine Mutante davon gezüchtet wird und der monoclonale Antikörper gewonnen wird,
11. B-Zellenoberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 50 ku (Kilodalton), welches durch den monoclonalen Antikörper G28-5 gemäss Anspruch 5 definiert wird.
12. B-Zellenoberflächenantigen gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polypeptid umfasst.
13. Verfahren zur Verbesserung der in vitro-Proliferation von B-Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass B-Zellen mit einer wirksamen Dosis eines Liganden gemäss Anspruch 1, in solcher Weise behandelt werden, dass die aktivierten B-Zellen den Zellzyklus traversleren und die Proliferation verbessert wird.
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14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die B-Zellen aktiviert werden, indem sie mit einer wirksamen Dosis eines zweiten Liganden behandelt werden, welcher Bp35, ein B-Zellenoberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 35 ku (Kilodalton) bindet, in solcher Weise, dass die B-Zelle von der Go- zur Gi-Stufe des Zellzyklus fortschreitet.
15. Verfahren gemäss Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ligand gemäss einem der Ansprüche 3-9 verwendet wird.
16. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Ligand ein Antikörper-Molekül enthält, welches Bp35 bindet.
17. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper, welcher Bp35 bindet, ein monoclonaler Antikörper ist.
18. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die aktivierten B-Zeilen mit dem Liganden, welcher Bp50 bindet, innerhalb von 12 Std. nach der Aktivierung durch den zweiten Liganden, welcher Bp35 bindet, behandelt werden.
19. Verfahren zur Unterdrückung der in vitro-Proliferation von Zellen, welche Bp50, ein B-Zellen-oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 50 ku (Kilodalton), welches durch den monoclonalen Antikörper G28-5 definiert wird, exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, welche Bp50 exprimieren, mit einer effektiven Dosis eines Liganden gemäss Anspruch 1, behandelt werden, wobei der Ligand mit einem anti-proliferativen Mittel gekuppelt ist.
20. Verfahren gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, die Bp50 exprimieren, B-Zellen oder bösartige Zellen enthalten.
21. Verfahren gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ligand gemäss einem der Ansprüche 3 bis 9 verwendet wird.
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