Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

BRPI0807318B1 - "microrna associado a exossomos como marcador diagnóstico" - Google Patents

"microrna associado a exossomos como marcador diagnóstico" Download PDF

Info

Publication number
BRPI0807318B1
BRPI0807318B1 BRPI0807318A BRPI0807318A BRPI0807318B1 BR PI0807318 B1 BRPI0807318 B1 BR PI0807318B1 BR PI0807318 A BRPI0807318 A BR PI0807318A BR PI0807318 A BRPI0807318 A BR PI0807318A BR PI0807318 B1 BRPI0807318 B1 BR PI0807318B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
mir
hsa
mirnas
cancer
exosomes
Prior art date
Application number
BRPI0807318A
Other languages
English (en)
Inventor
Douglas D. Taylor
Cicek Gercel-Taylor
Original Assignee
University Of Louisville Research Foundation, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Louisville Research Foundation, Inc. filed Critical University Of Louisville Research Foundation, Inc.
Publication of BRPI0807318A2 publication Critical patent/BRPI0807318A2/pt
Publication of BRPI0807318B1 publication Critical patent/BRPI0807318B1/pt
Publication of BRPI0807318B8 publication Critical patent/BRPI0807318B8/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G07—CHECKING-DEVICES
    • G07F—COIN-FREED OR LIKE APPARATUS
    • G07F17/00—Coin-freed apparatus for hiring articles; Coin-freed facilities or services
    • G07F17/32—Coin-freed apparatus for hiring articles; Coin-freed facilities or services for games, toys, sports, or amusements
    • G07F17/3202—Hardware aspects of a gaming system, e.g. components, construction, architecture thereof
    • G07F17/3204—Player-machine interfaces
    • G07F17/3211—Display means
    • G—PHYSICS
    • G07—CHECKING-DEVICES
    • G07F—COIN-FREED OR LIKE APPARATUS
    • G07F17/00—Coin-freed apparatus for hiring articles; Coin-freed facilities or services
    • G07F17/32—Coin-freed apparatus for hiring articles; Coin-freed facilities or services for games, toys, sports, or amusements
    • G07F17/3244—Payment aspects of a gaming system, e.g. payment schemes, setting payout ratio, bonus or consolation prizes
    • G07F17/3258—Cumulative reward schemes, e.g. jackpots
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

(54) Título: MICRORNA ASSOCIADO A EXOSSOMOS COMO MARCADOR DIAGNÓSTICO (73) Titular: UNIVERSITY OF LOUISVILLE RESEARCH FOUNDATION, INC.. Endereço: OFFICE OF TECHNOLOGY TRANSFER, MED CENTER TREE, 201 E. JEFFERSON STREET, SUITE 215, LOUISVILLE, KY 40202, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: TAYLOR, DOUGLAS D.; GERCEL-TAYLOR, CICEK.
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 13/11/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 13/11/2018
Assinado digitalmente por:
Liane Elizabeth Caldeira Lage
Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
MICRORNA ASSOCIADO A EXOSSOMOS COMO MARCADOR
DIAGNÓSTICO
DESCRIÇÃO
PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica prioridade dos Pedidos
Provisórios Norte-Americanos Série Nos.
60/951.812 depositado em de julho de 2007, e 61/050.438 depositado em 5 de maio de 2008, cujas revelações completas encontram-se incorporadas à presente como referência.
CAMPO TÉCNICO
O material presentemente revelado se refere a métodos para o diagnóstico e o prognóstico de câncer e resultados adversos de gestações. Em particular, a matéria ora revelada se refere a métodos diagnósticos e prognósticos baseados na 15 determinação de quantidades de um ou mais microRNAs derivados de exossomos correlacionados com o câncer ou com resultados adversos de gestações em uma amostra biológica de um indivíduo.
Figure BRPI0807318B1_D0001
HISTÓRICO
A identificação de biomarcadores de câncer adequados para a detecção prévia e o diagnóstico de câncer contêm uma grande promessa para a melhoria do resultado clínico de indivíduos. É especialmente importante para os indivíduos que apresentam alguns sintomas ou nenhum sintoma, ou com tumores que já estejam relativamente inacessíveis ao exame físico. Apesar dos 25 consideráveis esforços direcionados para a detecção prévia, foram desenvolvidos alguns exames confiáveis e com boa relação custobenefício de triagem que podem diagnosticar o câncer em estágio primário.
Figure BRPI0807318B1_D0002
Como um exemplo, o câncer de ovário permanece sendo o sexto câncer mais comum em mulheres em todo o mundo, causando aproximadamente 125.000 mortes anualmente (Sankaranarayanan & Ferlay, 2006). Muitas mulheres com câncer de 5 ovário são diagnosticadas em estágio avançado, com 75% diagnosticadas com doença extraovariana (Berek et ai., 2003). Em comparação com outros cânceres associados às mulheres, 73% dos cânceres endometriais, 55% dos cânceres de mama e 50% dos cânceres cervicais são diagnosticados no Estágio I da doença (Menon &
Jacobs, 2000). Apesar da sobrevida de 5 anos das sobreviventes com câncer de ovário de Estágio I ultrapassar 90%, somente 21 % das pacientes com câncer de ovário em estágio avançado sobrevivem por nos após o diagnóstico inicial (Berek et al., 2003). Como a sobrevida de longo prazo não se alterou de forma significativa nas últimas poucas décadas, a melhor perspectiva de uma maior sobrevida de câncer de ovário reside no diagnóstico precoce (Menon & Jacobs,
2000) ...
único biomarcador atualmente aprovado para a detecção do câncer de ovário é o CA125, e sua quantificação por
ELISA foi o padrão de ouro da detecção do câncer de ovário desde sua introdução em 1983. A avaliação do CA125 é comumente utilizada para no tratamento da doença, tanto na detecção da doença como no monitoramento da recorrência da doença; entretanto, o uso do CA125 é limitado aos estágios iniciais da detecção do câncer (sensibilidade de 50-60%). A quantificação do CA125 é somente aprovada e consistentemente aprovada no monitoramento da remissão.
O CA125 nem é sensível nem específico para a detecção do câncer de ovário de novo, já que este é elevado em >50% das mulheres com a doença no estágio I, apesar de ser elevado em mais de 80% das pacientes com câncer de ovário de estágio avançado. O CA125 tem má especificidade, que é demonstrada por sua elevação em associação à doença de mama e cólon benigna e maligna, irritantes peritoneais e doenças ginecológicas benignas, entre outras.
Foram introduzidas novas estratégias que facilitam a análise proteômica simplificando muito a separação da amostra pré-analitica e acoplando com espectrometria de massa (MS)
Figure BRPI0807318B1_D0003
massa na pesquisa para a descoberta do biomarcador. A espectrometria de do tipo
SELDI-TOF [Surface-enhanced laser desorption/ionízation time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOFMS) ] recebeu muita atenção por seu uso na resolução de proteínas em corpos biológicos de prova pela ligação arranjos de chips protéicos bioquimicamente distintos. Em uma tecnologia, são 15 examinadas quatro proteínas séricas por ELISA, enquanto outra tecnologia usa espectrometria de massa de sete componentes séricos específicos ou padrões gerais de peptídeos no soro do paciente
Figure BRPI0807318B1_D0004
para definir a presença de câncer. O perfilamento SELDI-TOF-MS tem sido utilizado com sucesso para diferenciar o câncer de ovário, de mama, de próstata e de fígado dos controles.
O perfilamento SELDI-TOF-MS sérico tem demonstrado ser significativamente melhor que o atual biomarcador sérico padrão CA125 em diferentes pacientes com câncer de ovário daquelas com doença ovariana benigna e dos controles hígidos. Os 25 estudos demonstraram que a seleção de uma combinação de múltiplas proteínas solucionada por SELDI-TOF-MS pode ter o potencial de uma abordagem diagnostica. Um exame eficaz de triagem de câncer de ovário deve obter uma alta sensibilidade e especificidade e atualmente, diferentes tecnologias proteômicas, assim como ferramentas analíticas de computação utilizadas para discernir picos gerados de diferentes achados. Esses estudos iniciais sobre o perfilamento
SELDI-TOF-MS são promissores, e o conceito é reproduzível em uma série de diferentes fundos;
entretanto, a tradução desta abordagem em exames diagnósticos de rotina permanece difícil.
Foi calculado que para ser um exame eficaz de
Figure BRPI0807318B1_D0005
triagem, um ensaio deve obter um mínimo de
99,6% de especificidade. Para obter esse nível de especificidade, vários componentes das características do tumor deverão ser incorporadas sem novos exames diagnósticos para a detecção eficaz, devido à natureza multifatorial do câncer de ovário, assim como de outros cânceres. Uma desvantagem das técnicas de espectrometria de massa é que algumas amostras de importância podem ser mascaradas por proteínas mais abundantes na MS, assim como na análise da produção
Figure BRPI0807318B1_D0006
espectrométrica. A pré-purificação por várias técnicas como de cromatografia líquida de alto desempenho e a seleção positiva ou negativa por ligação de afinidade podem remover alguns determinados grupos de proteínas. O maior desafio na maioria das atuais abordagens de espectrometria de massa é a faixa dinâmica ao invés da sensibilidade. Apesar da remoção de proteínas ou peptídeos prevalentes poder aumentar muito o teor de informações que pode ser obtido de determinadas amostras, importantes 25 proteínas como a albumina podem funcionar como transportadores de subarranjos protéicos de significância diagnostica. São necessários outros estudos com amostras de maior tamanho e com modo cego cuidadoso dos conjuntos de validação independentes antes
V de qualquer consideração da aplicação desta plataforma para a triagem do câncer de ovário ou que qualquer outra indicação seja considerada.
Assim, persiste a necessidade do desenvolvimento de melhores biomarcadores em quase todos os cânceres e demais distúrbios, incluindo o maior risco de resultados adversos de gestações.
Os ensaios sanguíneos permanecem sendo um objetivo atrativo, devido à disponibilidade e â facilidade da coleta de
Figure BRPI0807318B1_D0007
amostras.
Diagnósticos defintivos precoces de câncer e maior risco de resultados adversos de gestações facilitariam o tratamento precoce e potencialmente mais eficazes dos pacientes. Assim, existe uma falta de biomarcadores que possam, individualmente em combinação ou com outros biomarcadores ou modalidades diagnosticas, conferir sensibilidade e especificidade necessários para a detecção e prognóstico precoces do câncer e resultados adversos de gestações. Em particular, são necessários simples exames de biomarcadores de câncer e de resultados adversos de gestações realizados em fluidos biológicos de rápido acesso.
SUMÁRIO
Este Sumário lista várias configurações da matéria revelada na presente podendo, em muitos casos listar variações e permutações dessas configurações. Este Sumário é somente um exemplo das numerosas e várias configurações. A menção de uma ou mais características representativas de uma determinada configuração é da mesma forma exemplar. Esta configuração pode existir tipicamente com ou sem a(s) característica(s) mencionada(s); também, essas características podem se aplicar a outras configurações da matéria revelada na presente, estejam ou não listadas neste Sumário. Para evitar a repetição excessiva, este Sumário não lista ou sugere todas as possíveis combinações de tais características.
Em algumas configurações da matéria ora revelada, 5 é provido um método para o diagnóstico de câncer em um indivíduo.
Em algumas configurações, o método compreende o provimento de uma amostra biológica de um indivíduo; o isolamento dos exossomos derivados de câncer compreendendo microRNAs (miRNAs) da amostra
Figure BRPI0807318B1_D0008
biológica; a determinação de uma quantidade de um ou mais dos miRNAs; e a comparação da quantidade do um ou mais miRNAs com um ou mais níveis de controle miRNA. 0 indivíduo é então diagnosticado como tendo o câncer caso exista uma diferença mensurável na quantidade . do um ou mais miRNAs dos exossomos derivados de câncer quando comparados com um ou mais níveis de controle miRNA. Em algumas configurações, método ainda compreende uma seleção de um tratamento ou da modificação de um tratamento para o câncer baseado na quantidade do um ou mais miRNAs determinados.
Figure BRPI0807318B1_D0009
Em outras configurações da matéria ora revelada, é provido um método para a avaliação da eficácia e/ou da progressão do tratamento de um câncer em um indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende o provimento de uma série de amostras biológicas de um indivíduo em um período de tempo; o isolamento dos exossomos derivados de câncer compreendendo miRNAs 25 da série de amostras biológicas; a determinação de uma quantidade de um ou mais dos miRNAs em cada uma das amostras biológicas da série; e a determinação de qualquer ação mensurável nas quantidades do um ou mais miRNAs em cada uma das amostras biológicas da série, para assim avaliar a eficácia e/ou a progressão do tratamento do câncer no indivíduo.
Em ainda outras configurações da matéria ora revelada, é provido um método para a caracterização de um câncer em um indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende o provimento de uma amostra biológica de um indivíduo;
o isolamento de exossomos derivados de câncer compreendendo miRNAs da amostra biológica; a determinação de uma quantidade de um ou mais dos miRNAs; e a comparação da quantidade do um ou mais miRNAs com um ou mais níveis de controle miRNA.
O câncer é então caracterizado com base na diferença mensurável da quantidade do um ou mais miRNAs dos exossomos derivados de câncer quando comparados com o um ou mais níveis de controle miRNA.
Em algumas configurações, a caracterização do câncer compreende a determinação de um tipo, classe e/ou estágio do câncer.
Além disso, em algumas configurações, a determinação da quantidade do um ou mais miRNAs compreende a determinação da quantidade total do miRNA nos exossomos derivados de câncer.
Em algumas configurações desses métodos, o câncer é um câncer selecionado do grupo que consiste de câncer de ovário, câncer cervical, câncer de mama, câncer endometrial, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de pulmão, melanoma e câncer de pâncreas.
Além disso, em alguns desses métodos, isolamento dos exossomos derivados de câncer ainda compreende isolamento dos exossomos derivados de câncer compreende uso de cromatografia de exclusão por tamanho para isolar os exossomos derivados de câncer.
Em algumas configurações, o
centrifugação de uma fração cromatográfica compreendendo os exossomos derivados de câncer. A fração cromatográfica pode ser em algumas configurações uma fração de volume vazio.
Ainda em algumas configurações, os exossomos derivados de câncer são separados dos exossomos não derivados de câncer pela captura imunoabsorvente utilizando um anticorpo antigeno anticâncer como, por exemplo, um anticorpo (anti-EpCAM) de molécula de adesão celular antiepitelial.
Em alguns desses métodos, a determinação da quantidade do um ou mais miRNAs compreende a marcação do um ou mais miRNAs, e em algumas configurações, capturar então o um ou mais miRNAs com uma ou mais sondas polinucleotideas que ligam seletivamente o um ou mais miRNAs. Em outras configurações desses métodos, a determinação da quantidade do um ou mais miRNAs compreende o uso de uma reação de cadeia polimerase em tempo real para quantificar a quantidade do um ou mais miRNAs. Além disso, em algumas configurações desses métodos, os miRNAs são um ou mais miRNAs apresentados na
Tabela incluindo, por exemplo, um ou mais miRNAs selecionados do grupo que consiste de miR-21, miR-141, miR20
200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-205 e miR-214.
Em ainda outras configurações da matéria ora revelada, é provido um método para o diagnóstico de resultados adversos de gestações em um indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende o provimento de uma amostra biológica de um indivíduo; o isolamento de exossomos compreendendo miRNAs da um ou mais níveis de controle miRNA. O indivíduo é diagnosticado amostra biológica; a determinação de uma quantidade de um ou mais dos miRNAs; e a comparação da quantidade do um ou mais miRNAs com com o resultado de gestação adversa se houver uma diferença mensurável na quantidade de um ou mais miRNAs dos exossomos quando comparados ao um ou mais níveis de controle miRNA. Em algumas configurações, o resultado de gestação adversa é um distúrbio selecionado do grupo que consiste da ruptura prematura de membranas, pré-eclâmpsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intrauterino e perda recorrente de gestação.
Em algumas das configurações ora apresentadas, indivíduo é humano. Além disso, em algumas das configurações reveladas na presente, a amostra biológica compreende leite, sangue, soro, plasma, ascite, fluido cístico, fluido pleural, fluido peritoneal, fluido cérebroespinhal, lágrimas, urina, saliva, catarro ou suas combinações.
Também, trata-se de um objetivo da matéria ora revelada utilizar os miRNAs associados a exossomos como marcadores diagnósticos. Este objetivo é alcançado no total ou em parte pela matéria ora revelada.
Tendo sido declarado acima um objetivo da matéria revelada na presente, e que é alcançado de forma total ou parcial pela matéria revelada na presente, outros objetivos e vantagens se tornarão evidentes para os técnicos no assunto após um estudo da seguinte descrição da matéria, figuras e dos exemplos não limitativos revelados na presente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 é um diagrama esquemático mostrando a quantidades do miRNA por técnica de microarranjo, e analisando os metodologia exemplar do isolamento cromatográfico dos exossomos derivados de câncer e miRNA dos exossomos, determinando dados para determinar se o câncer está presente no indivíduo examinado.
A Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando a metodologia exemplar para o isolamento dos exossomos derivados de câncer e miRNA dos exossomos, determinando quantidades do miRNA por PCR em tempo real, e analisando os dados para determinar se o câncer está presente e o estágio do câncer no indivíduo examinado.
A Figura 3A é um gráfico mostrando exossomos circulantes derivados do tumor comparados os níveis dos com o estágio do câncer de ovário. Os exossomos foram isolados dos soros obtidos dos controles femininos de idades combinadas (n-10) mulheres de mesma idade com doença ovariana benigna (n=10), e mulheres diagnosticadas com câncer de ovário (n=10 para cada níveis de exossomos apresentados como concentrações protéicas.
Figura 3B é um micrográfico eletrônico dos exossomos circulantes isolados por contas magnéticas. Foram cortadas seções ultrafinas (65 nm) e coloridas com acetato de uranil e citrato de chumbo de Reynold.
As seções foram examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão Jeol 1210.
A Figura 4A é um gráfico mostrando a presença de pequenos RNA associados aos exossomos circulantes EpCAM positivos das pacientes com câncer de ovário. É mostrada uma análise representativa do RNA isolado dos exossomos do tumor utilizando o Bioanalisador Agilent 2100.
A Figura 4B é uma fotografia de uma separação de gel agarose (1 %) de RNA total dos exossomos circulantes e tumores correspondentes. Este RNA total foi utilizado como material de partida para o perfilamento miRNA.
A Figura 5 é uma série de gráficos mostrando as intensidades dos miRNAs específicos obtidos dos tumores de ovário de estágio avançado (□) e dos exossomos EpCAM positivos () isolado do soro dessas mesmas pacientes. miR-21, miR-141, miR5 200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214 demonstraram ser marcadores regulados para cima do câncer de ovário. Cada barra apresenta as intensidades médias de amostras em duplicata com os resultados de quatro pacientes representativas apresentadas.
Figure BRPI0807318B1_D0010
A Figura 6 é um gráfico mostrando as intensidades dos miRNAs específicos obtidos dos exossomos EpCAM-positivos isolados do sangue periférico (2,5 mL) das pacientes com doença ovariana benigna e das pacientes com câncer de ovário. As pacientes com câncer de ovário foram separadas entre os Estágios I, II e III. As barras representam o desvio padrão ± médio das intensidades normalizadas de cada grupo de pacientes (n=10 para cada grupo).
As Figuras 7A e
7B são gráficos mostrando uma comparação dos miRNAs exossomais específicos obtidos do soro de uma paciente com câncer de ovário, imediatamente após a coleta do sangue ou 24, 48 e 96 horas após o armazenamento do soro a 4°C
Os exossomos tumorais foram isolados por MACS utilizando antiEpCAM.
A Figura 8 é um diagrama esquemático mostrando a metodologia exemplar para o isolamentos dos exossomos derivados de câncer e miRNA dos exossomos, determinando quantidades do miRNA por técnica de microarranjo, e analisando os dados para determinar se existe câncer no indivíduo examinado.
A Figura 9 é uma série de gráficos mostrando as intensidades dos miRNAs específicos obtidos de tumores de pulmão em estágio avançado (cinza claro) e dos exossomos EpCAM-positivos (cinza escuro) isolados do soro dessas mesmas pacientes. Cada 5 barra apresenta as intensidades médias de amostras em duplicata com os resultados de quatro pacientes representativas apresentadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Os detalhes de uma ou mais
Figure BRPI0807318B1_D0011
configurações da matéria revelada na presente são apresentados na descrição de acompanhamento abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da matéria revelada na presente ficarão aparentes a partir da especificação, Figuras e Reivindicações. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e demais referências anotadas na presente estão incorporadas por referência na totalidade. Em caso de conflito, terá controle a presente especificação, incluindo as definições.
Figure BRPI0807318B1_D0012
A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados na presente têm o mesmo significado de compreensão comum pelos técnicos no assunto ao qual pertence a matéria revelada na presente. Apesar de poder ser utilizados quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes aos descritos na prática ou nos testes da matéria revelada na presente, serão agora descritos métodos e materiais 25 representativos.
Observando a duradoura convenção de leis de patentes, os termos um, uma, e o/a se referem a um ou mais quando utilizados neste pedido, incluindo as reivindicações.
Assim, por exemplo, a referência a um peptideo inclui uma pluralidade de tais peptideos, e assim por diante.
A menos que indicado de outra forma, todos os números que expressam quantidades de princípios, condições de 5 reações e outros utilizados na especificação e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os exemplos pelo termo cerca de. Assim, a menos que parâmetros numéricos indicados nesta reivindicações anexas são aproximações que indicado contrário, os especificação e nas podem variar dependendo das propriedades desejadas e buscadas pela matéria revelada na presente.
Como utilizado na presente, o termo cerca de, quando referindo-se a um valor ou a uma quantidade de massa, peso, tempo, volume, concentração ou porcentagem significa englobar variações, em algumas configurações, de ±20%, em algumas configurações de ±10%, em algumas configurações de ±5%, em algumas configurações de ±1%, em algumas configurações de ±0,5% e, em
Figure BRPI0807318B1_D0013
algumas configurações de ±0,1% da quantidade especificada, como essas variações sendo adequadas para a realização dos métodos revelados.
Nos últimos 5 anos, a tecnologia de perfilamento de expressão identificou novos biomarcadores com aplicações diagnosticas. Um desses grupos biomarcadores é uma classe de pequenos RNAs não codificadores, denominados microRNAs (miRNAs) (lorio et al. 2007; De Cecco et al., 2004; Calin & Croce, 2006).
Os microRNAs, pequenos (22-25 nucleotídeos de comprimento) RNAs não codificadores, suprimem a tradução dos mRNAs alvo ligando-se às suas regiões não traduzidas 3' (Esquela-Kerscher & Slack, 2006;
Bartel, 2004). Pode ocorrer o silenciamento pós-transcripcional dos genes alvo por miRNA seja por divagem do mRNA homólogo ou pela inibição especifica da síntese protéica.
Todos os tumores analisados por perfilamento de miRNA demonstraram assinaturas miRNA significativamente distintas, comparadas às das células normais do mesmo tecido (lorio et al. 2007; Calin & Croce, 2006a; Calin & Croce, 2006b). Lu et al. (2005) fizeram uma análise de leucemias e de cânceres sólidos e
Figure BRPI0807318B1_D0014
determinaram que os perfis de expressão miRNA poderiam classificar os cânceres humanos por linhagem desenvolvimental e estado de diferenciação. As expressões das assinaturas dos miRNAs individuais e dos miRNA específicos estariam agora ligadas ao diagnóstico e ao prognóstico de muitos cânceres humanos.
Utilizando amostras de tecidos, lorio et al.
(2007) demonstraram que, em comparação com' o ovário normal, os miRNAs específicos foram expressos de forma aberrante no câncer de ovário, com miR-141, miR-200a, miR-200b e miR-200c sendo expressos excessivamente de forma mais significativa. Ainda demonstraram a
Figure BRPI0807318B1_D0015
hipometilaçâo nos tumores de ovário como resultado da modulação para cima de miR-21, miR-203 e miR-205, comparada ao ovário normal. Foram ressaltados dois desses miRNAs, miR-200a e miR-200c modulados para cima em todos os três tipos histológicos examinados (seroso, endometrióide e células claras), considerando que a modulação para cima do miR-200b e do miR-141 foi compartilhada pelos tipos histológicos endometrióides e seroso. Em geral, as assinaturas miRNA obtidas pela comparação dos diferentes tipos histológicos de cânceres de ovário (seroso, endometrióide, células claras e misto) com o tecido normal foram sobrepostas na maioria dos casos. Suas análises dos tumores de ovário também demonstraram a ausência de miRNAs diferencialmente expressos com relação ao estágio ou à classe do tumor, que pudessem ter resultado de seus conjuntos de amostras sendo obtidas primariamente de tumores em estágios avançados.
Entre os miRNAs mais significativamente regulados para cima, o miR-200a e o miR-141 pertencem à mesma família, o miR-200b está localizado no cromossomo 1 p36.33 na mesma região que o miR-200a e o miR-200c está localizado no cromossomo 12pl3.31 na mesma região que o miR-141 (lorio et al. (2007)). Esta associação estaria em conformidade com os achados de Zhang et al.
(2006) que propôs que a modulação para cima dos miRNAs específicos pudesse ser a amplificação dos genes miRNA.
Utilizando hibridização genômica de alta resolução baseada em arranjo, uma proporção aberrantemente alta de loci contendo genes miRNA exibiu alterações no número de cópias de DNA. No câncer de ovário, 37,1% dos loci genômicos contendo genes miRNA estiveram associados às alterações no número de cópias de DNA (Zhang et al., 2006). No câncer de mama e melanoma, uma proporção ainda maior desses loci exibe números de cópias de
DNA alteradas (72,8% e 85,9%, respectivamente) (Zhang et
2006). Como resultado, os padrões de expressão ou assinaturas miRNA parecem ser mais característicos das origens do desenvolvimento de tumores que os padrões de expressão miRNA e podem estar associados ao diagnóstico, estadiamento, progressão, prognóstico e resposta ao tratamento.
Entretanto, como ferramentas diagnosticas do câncer, antes da matéria revelada na presente, as análises das assinaturas miRNA estiveram limitadas às biópsias de tecidos.
Uma característica recentemente descrita das células de câncer é a capacidade de liberar ou do shed intacto, porções vesiculares da membrana plasmática (denominada na presente exossomos, e também conhecida na técnica como fragmentos de 5 membranas, vesículas membranosas ou microvesículas). São revelados na presente dados que identificam, de forma surpreendente pela primeira vez, os miRNAs associados aos exossomos originados das células de câncer (isto é, exossomos derivados de câncer). A
Figure BRPI0807318B1_D0016
matéria revelada na presente ainda revela pela primeira vez que o miRNA isolado dos exossomos derivados de câncer demonstra níveis de expressão em indivíduos que sofrem de câncer e que diferem dos níveis de expressão miRNA (por exemplo, aumentado ou diminuído) medidos em indivíduos livres de câncer (denominados no presente de níveis de controle miRNA). Além disso, a matéria revelada na 15 presente provê o isolamento dos exossomos derivados de câncer dos fluidos biológicos de pronto acesso de um indivíduo examinado.
Assim, a matéria revelada na presente proporciona, pela primeira vez, métodos para o diagnóstico e prognóstico do câncer com base na coleta e na medição dos níveis miRNA exossomais derivados do câncer das amostras biológicas de pronto acesso, sem precisar da amostragem direta das células de câncer.
Exossomos são microvesículas liberadas de uma variedade de diferentes células, incluindo células de câncer (isto é, exossomos derivados de câncer). Essas pequenas vesículas (50— lOOnm de diâmetro) provêm de maiores endossomos multivesiculares e são secretadas no meio extracelular. O exato mecanismo da liberação/shedding de exossomos permanece obscuro; entretanto, esta liberação é um fenômeno que exige energia, modulada pelos sinais extracelulares. Parecem se formar pela invaginação e brotamento da membrana limitadora dos últimos endossomos, resultando em vesículas que contêm citossol e que expõem o domínio extracelular das proteínas celulares ligadas por membranas em sua superfície. Utilizando microscopia eletrônica, estudos mostraram os perfis de fusão dos endossomos multivesiculares com a membrana plasmática, levando à secreção das vesículas internas no ambiente extracelular. A taxa de liberação de exossomos é
Figure BRPI0807318B1_D0017
significativamente aumentada na maioria das células neoplásicas e ocorre continuadamente. A crescente liberação de exossomos e sua acumulação parecem ser importantes no processo de transformação maligna. Além das células de câncer, a liberação de exossomos também demonstrou estar associada às células de origem embriônica (como a placenta) e células linfóides ativadas.
Apesar do shedding extracelular dos exossomos ocorre em outros tipos de células, em condições fisiológicas específicas, o acúmulo de exossomos das células neoneoplásicas é
Figure BRPI0807318B1_D0018
raramente observado in vivo. Em contraste, os exossomos liberados pelas células tumorais se acumulam nos fluidos biológicos, incluindo no soro, nos fluidos de ascite e pleurais. Os exossomos liberados e seu acúmulo parecem ser importantes características da transformação maligna. Exossomos shed derivados de câncer não refletem a composição geral da membrana plasmática da célula tumoral de origem, mas representam micromapas com maior 25 expressão de antígenos tumorais.
A liberação de exossomos parece ser uma importante característica da comunicação intercelular. Como os exossomos liberados expressam moléculas com atividade biológica (como o Fas ligando, PD-1, MICA/B, mdrl, MMPs, CD44 e antigenos autorreativos), foi analisada em vários modelos a capacidade dessas microvesículas em modular as funções linfócito e monócito.
Teorizou-se que esses exossomos liberados modulam as funções linfócito imitando a morte celular induzida por ativação (AICD).
As células linfóides parecem liberar exossomos após a ativação e parecem desempenhar um papel essencial na immunorregulação, evitando respostas imunes excessivas e o desenvolvimento de
Figure BRPI0807318B1_D0019
células tumorais autoimunidade.
Foi postulado que a liberação de exossomos pelas é uma reexpressão dos exossomos celulares fetais e que ambos constituem caminhos para a imunovigilância circundante.
Os microRNAs são pequenos RNAs não codificadores de ocorrência natural que têm comprimentos de cerca de 17 a cerca de 25 bases nucleotídeas (nt) em suas formas biologicamente ativas. Os miRNAs regulam pós-transcripcionalmente a expressão genética reprimindo a tradução do mRNA alvo. Acredita-se que a
Figure BRPI0807318B1_D0020
função dos miRNAs como reguladores negativos, isto é, maiores quantidades de um miRNA especifico estarão correlacionadas com menores níveis de expressão do gene alvo.
Existem três formas de miRNAs existentes in vivo, miRNAs primários (pri-miRNAs) , miRNAs prematuros (pre-miRNAs) e miRNAs maduros. Os miRNAs primários (pri-miRNAs) são expressos como transcripções estruturadas em stem-loop de cerca de algumas 25 poucas centenas de bases até 1 kb. As transcrições pri-miRNA são clivadas no núcleo por uma endonuclease RNase II denominada Drosha, que cliva ambas as fitas da haste perto da base do stemloop. A Drosha cliva o RNA duplex com cortes escalonados, deixando um 5' fosfato e 2 nt pendente na 3' extremidade. 0 produto de divagem, o miRNA prematuro (premiRNA) tem comprimento cerca de 60 a cerca de 110 nt com uma estrutura em grampo formada dobrada para trás. O pré-miRNA é transportado do núcleo para o citoplasma por
Ran-GTP e Exportin-5. Os pré-miRNAs são ainda processados no citoplasma por outra endonuclease RNase II denominada Dicer. A
Dicer reconhece o 5' fosfato e 3' pendente e cliva o loop para o exterior da ligação stem-loop e forma miRNA duplexos. 0 duplex
Figure BRPI0807318B1_D0021
miRNA liga ao complexo silenciador induzido por RNA (RISC), onde a fita antisenso é preferencialmente degradada e o miRNA maduro de fita senso direciona o RISC para seu sitio alvo. É o miRNA maduro a forma biologicamente ativa do miRNA tendo cerca de 17 a cerca de nt de comprimento.
Os microRNAs funcionam acoplando-se em pares base (perfeitos ou imperfeitos) a sequências específicas em suas mensagens de genes alvo (mRNA). O miRNA degrada ou reprime a tradução do mRNA, fazendo com que a expressão dos genes alvo seja pós-transcripcionalmente regulada para baixo, reprimida ou silenciada. Em animais, os miRNAs não têm necessariamente homologias perfeitas com seus sítios alvo, e as homologias parciais levam à repressão translacional, considerando que nas plantas, onde os miRNAs tendem a mostrar homologias completas aos seus sítios alvo, prevalece a degradação da mensagem (mRNA).
Os microRNAs estão amplamente distribuídos no genoma, dominam a regulação genética e participam ativamente de muitos processos fisiológicos e patológicos. Por exemplo, determinou-se que a modalidade reguladora de determinados miRNAs controla a proliferação, a diferenciação e a apoptose celular; e que perfis miRNA anormais estão associados à oncogênese. Além disso, sugeriu-se que a infecção viral provoca um aumento dos miRNAs destinados a silenciar os genes de sobrevida pró-celular, e uma redução dos miRNAs que reprimem os genes associados à apoptose (morte celular programada), desequilibrando assim na direção da obtenção da sinalização da apoptose.
Milhares de mRNA estão sob esta pressão de seleção por centenas de espécies de miRNA até o momento identificadas.
Este processo de seleção é instrumental no amortecimento de grupos específicos de expressões genéticas que, por exemplo, podem não mais ser necessários, para permitir que as células canalizem suas direções de programas fisiológicos para um novo caminho de expressão genética. O amortecimento miRNA dependente de grupos alvos de expressão genética é uma regulação robusta e rápida para permitir que as células passem de um programa antigo e façam a transição para um novo. Um exemplo típico deste fato é demonstrado durante o desenvolvimento
Figure BRPI0807318B1_D0022
embrional, quando um determinado grupo de células é direcionado para se tornar tipos celulares especializados exclusivos como neurônios, cardiomiócitos, músculos, etc.
Acredita-se que os níveis de expressão de aproximadamente um terço dos genes humanos seja regulado por miRNAs, e que a regulação miRNA das expressões de genes exclusivos esteja ligada ao caminho particular de sinalização de cada tipo específico de células. Por exemplo, o caminho de sinalização da apoptose pode ser ditado por um grupo de miRNAs direcionados à desestabilização das mensagens genéticas pró-sobrevida, permitindo que genes pró-apoptose alternativos tenham dominância e que assim ativem o programa de morte. Outro exemplo é o controle do crescimento do câncer; um recente achado mostrou que os miRNAs também podem ser essenciais para evitar que as células se tornem neoplásicas. Por exemplo, descobriu-se que dois oncogenes, cMyc e cRas, compartilham o controle de uma espécie miRNA, cuja expressão é regulada para baixo no câncer. Em outras palavras, a falta deste miRNA permite a expressão não verificada de cMyc e cRas, permitindo assim que esses dois genes se tornem abundantemente
Figure BRPI0807318B1_D0023
presentes nas células de câncer, permitindo que estas adquiram uma capacidade de proliferação celular descontrolada e que acionem o estágio do crescimento neoplásico. Além disso, foi comunicado que uma mutação de miRNA é responsável por um fenótipo de muscularidade em ovelhas de origem belga, sugerindo que possam ser encontradas mutações associadas a distúrbios genéticos em miRNAs, 15 onde não foram encontradas evidências de mutações em regiões promotoras, áreas de codificação e sítios de fatiamento.
É possível que uma orquestração coordenada de
Figure BRPI0807318B1_D0024
múltiplos caminhos sirva para controlar um determinado estado celular, caracterizado pelo fato de que possam estar envolvidos determinados hubs moleculares, que são manipulados funcionalmente por ordens hierárquicas e redundância de controle molecular. Na verdade, dúzias de miRNAs podem operar para garantir que esses hubs possam exercer grandes ou pequenas funções nas células, simplesmente reprimindo a expressão de si mesmas ou de seus 25 oponentes funcionais. Assim, um produto genético pode funcionar como um hub principal para um caminho de sinalização em um tipo de célula, podendo ser em outro tipo de célula um hub secundário, ou pode mesmo não ser utilizado. O controle microRNA das expressões genéticas do hub pode então ser um mecanismo expediente para prover essa versatilidade para que várias moléculas sirvam tanto como hubs principais como secundários, ou de nenhuma forma para diferentes tipos de modalidades operacionais celulares.
Dado o papel dos miRNAs na regulação genética, e em muitos processos fisiológicos e patológicos, é desejável a obtenção de informações sobre seus modos interativos e sobre seus padrões de expressão. Os sistemas e métodos para a quantificação e
Figure BRPI0807318B1_D0025
a identificação de quais grupos de supostos miRNAs estão em operação em um determinado tipo celular, ou em associação a um determinado processo ou condição de interesse, podem fornecer informações úteis para a compreensão de como cada estado celular evolui e é mantido e como a manutenção disfuncional é incitada por reduções ou aumentos inadequados de arranjos exclusivos de miRNAs 15 para a regulação da expressão dos genes principais. Esta compreensão pode provar-se útil no diagnóstico e na caracterização de vários distúrbios, incluindo câncer e resultados adversos de
Figure BRPI0807318B1_D0026
gestações...
Como potenciais ferramentas de diagnóstico clínico, os miRNAs demonstraram ser importantes e precisos determinantes para muitos, senão para todos os cânceres.
Crescentes evidências mostram que a expressão dos genes miRNA é desregulada no câncer humano.
A expressão dos miRNAs é altamente específica para tecidos e estágios de desenvolvimento, tendo 25 recentemente permitido a classificação molecular de tumores. Até o presente, todos os tumores analisados por perfilamento miRNA demonstraram perfis miRNA significativamente diferentes quando comparados a células normais do mesmo tecido. O perfilamento dos miRNA por citometria de fluxo demonstrou que os perfis de expressão miRNA classificam os cânceres humanos de acordo com a linhagem desenvolvimental e o estado de diferenciação dos tumores.
A expressão excessiva ou a baixa expressão específica demonstrou ter correlação com determinados tipos de tumores. A expressão excessiva microRNA pode resultar em uma regulação para baixo dos genes supressores do tumor, considerando que suas subexpressões poderíam levar à regulação para cima do oncogene.
Utilizando análise de microarranjo de grande escala, as células de câncer mostraram distintos perfis miRNA quando comparadas a células normais com 36 dos 228 genes miRNA expressos excessivamente e 21 regulados para baixo nas células de câncer versus células normais.
As análises hierárquicas de agrupamentos mostraram que esta assinatura miRNA permitiu que amostras de tumores fossem agrupadas com base em seus tecidos de origem. Foram feitos estudos de perfilamento de varredura genômica em vários tipos de câncer, incluindo CLL, câncer de mama, glioblastoma, carcinoma papilar tireoideano, carcinoma hepatocelular, câncer de ovário, câncer de
Figure BRPI0807318B1_D0027
cólon e tumores pancreáticos endócrinos. Em um estudo de 104 pares combinados de tecido ovariano canceroso e não canceroso, foram observados miRNAs expressos diferencialmente; 28 foram regulados para baixo e 15 foram expressos excessivamente nos tumores.
As análises estatísticas de dados de microarranjo obtidas por dois métodos diferentes, análise de significância de microarranjos (SAM) e análise de predição de microarranjos (PAM) de seis tumores sólidos (carcinomas de ovário, de mama, de cólon, gástrico e de próstata e tumores pancreáticos endócrinos) , demonstraram uma assinatura comum composta de 21 miRNAs expressos diferencialmente em pelo menos três tipos de tumores. No topo da lista estavam o miR-21, que foi expresso excessivamente em seis tipos de células de câncer, e o miR-17-5p e miR-191, que foram 5 expressos excessivamente em cinco. Como a origem embriológica dos tumores analisados era diferente, a significância desses achados podería ser que esses miRNAs comuns participassem dos caminhos fundamentais de sinalização alterados em muitos tipos de tumores.
Figure BRPI0807318B1_D0028
Em suporte da função desses genes na tumorigênese, foi achado que os alvos previstos dos miRNAs expressos diferencialmente são significativamente enriquecidos por aqueles que visam supressores e oncogenes do tumor conhecido. Também, o miR-21, o único miRNA expresso excessivamente em todos os seis tipos de cânceres analisados demonstrou visar diretamente o supressor de tumor PTEN, que codifica uma fosfatase que inibe os caminhos de crescimento e/ou de sobrevida. A função do PTEN é alterada em tumores avançados de vários tipos, incluindo de mama, ovário, gástrico e de próstata.
Figure BRPI0807318B1_D0029
Em algumas configurações da matéria revelada na presente, é provido um método para o diagnóstico de câncer em um indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende fornecer uma amostra biológica de um indivíduo; isolar os exossomos derivados de câncer compreendendo miRNAs da amostra biológica; determinar uma quantidade de um ou mais dos miRNAs; e comparar a 25 quantidade do um ou mais miRNAs com um ou mais níveis de controle miRNA. O indivíduo pode então ser diagnosticado como tendo o câncer caso exista uma diferença mensurável na quantidade dos um ou mais miRNAs dos exossomos derivados de câncer na amostra comparada com um ou mais níveis de controle. É fornecida uma lista ilimitada de miRNAs exemplares que podem ser medidos nas Tabelas 1 e 2. Em algumas configurações, os miRNAs medidos são selecionados dos miRNAs listados na Tabela 2, e em algumas configurações
particulares, os miRNAs medidos são miRNAs selecionados do grupo
que consiste de miR—21, miR-141, miR—2 0 0a, miR-200b, miR-20uc,
miR-203, miR-205 e miR-214.
0 termo câncer se refere a todos os tipos de
câncer ou neoplasmas ou tumores malignos encontrados em animais, incluindo leucemias, carcinomas e sarcomas. Os exemplos de cânceres são câncer do cérebro, bexiga, mama, cérvice, cólon, cabeça e pescoço, dos rins, pulmões, de pulmão de células não pequenas, melanoma, mesotelioma, de ovário, pâncreas, de próstata, sarcoma, do estômago e do útero.
-----------------Por— leucemia-—s-ign-i-f iea—a—incl-us-ãe—ampla—de doenças progressivas, malignas dos órgãos de formação de sangue, sendo geralmente caracterizada por uma proliferação descontrolada e do desenvolvimento de leucócitos e de seus precursores no sangue e na medula óssea. As doenças leucêmicas incluem, por exemplo, a leucemia não linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crônica, leucemia promielocítica aguda, leucemia adulta de células T, leucemia aleucêmica, a leucemia leucocitêmica, leucemia basofílica, leucemia de células blásticas, leucemia bovina, leucemia mielocítica crônica, leucemia cutis, leucemia embrional, leucemia eosinofílica, Gross' leucemia [leucemia murina transmissível], leucemia de células pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células primordiais, leucemia monocitica aguda, leucemia leucopênica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfogênica, leucemia linfóide, leucemia de células de linfossarcoma, leucemia de mastócitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocitica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocitica, leucemia granulocítica mielóide, leucemia mielomonocítica, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia de células plasmáticas, leucemia
Figure BRPI0807318B1_D0030
plasmacítica, leucemia promielocítica, leucemia de células de
Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células primordiais, leucemia subleucêmica e leucemia de células indiferenciadas.
termo carcinoma se refere a um novo crescimento maligno composto de células epiteliais que tendem a se infiltrar nos tecidos circundantes e disparar metástases. Os ‘15 c a r c inomas exempicrre~s inuirreinç por—exempdrr,---ca-rci-nOma—a-ci-n-a-r-7 carcinoma acinoso, carcinoma adenóide cístico, carcinoma adenocístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de córtex adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de
Figure BRPI0807318B1_D0031
células basais, carcinoma basocelular, carcinoma basalóide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma broncoalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogênico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriônico, carcinoma colóide, comedocarcinoma, carcinoma do corpo do útero, carcinoma cribriforme, carcinoma em couraça, carcinoma cutâneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de duto, carcinoma durum, carcinoma embrional, carcinoma encefalóide, carcinoma epienóide, carcinoma adenóide epitelial, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma da matriz do pelo, carcinoma hematóide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefróide, carcinoma embrionário infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de
Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de
Figure BRPI0807318B1_D0032
células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermóide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatose, carcinoma nasofaringeano, carcinoma de células de
Γ5 aveia, carcinoma ossificans, carcinoma osteóider Ccfrciiroma papilar, carcinoma periportal, e carcinoma preinvasivo, carcinoma espinocelular, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renais do
Figure BRPI0807318B1_D0033
rim, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatodes, carcinoma schneideriano, carcinoma cirroso, carcinoma dos escrotos, carcinoma de células em anel de sinete, carcinoma simplex, carcinoma de células pequenas, carcinoma solanóide, carcinoma de células esferoidais, carcinoma de células fusiformes, carcinoma spongiosum, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, string carcinoma, carcinoma telangiectático, carcinoma telangiectóide, carcinoma de células transicionais, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrucoso e carcinoma de saco vitelino.
O termo sarcoma se refere geralmente a um tumor que é composto de uma substância semelhante ao tecido conectivo embriônico, sendo geralmente composto por células proximamente empacotadas integradas em uma substância fibrilar ou homogênea. Os sarcomas incluem, por exemplo, condrossarcoma, fibrosarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixossarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, lipossarcoma, sarcoma alveolar de partes moles, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrióide, sarcoma cloroma, cório carcinoma, sarcoma embrional,
Figure BRPI0807318B1_D0034
sarcoma tumor de Wilms, sarcoma sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, endometrial, sarcoma estromal, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocitico, sarcoma de sarcoma idiopático hemorrágico múltiplo pigmentado,
Hodgkin, sarcoma imunoblástico de células B, linfoma, sarcoma imunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de
-1-5— —cé±u±a'S----de----Kup-ffe/r;----arrgro-s-SBTcroina;----l-errcO-s-s-a-rcoma.-;----sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocitico, sarcoma de Rous, sarcoma serocistico, sarcoma sinovial e sarcoma
Figure BRPI0807318B1_D0035
telangiectásico.
O termo melanoma significa um tumor que surge do sistema melanocitico da pele e de outros órgãos. Os melanomas incluem, por exemplo, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, 25 melanoma subungal e melanoma de alastramento superficial.
Em algumas determinadas configurações, o câncer é um câncer selecionado do grupo que consiste de câncer de ovário, câncer cervical, câncer de mama, câncer endometrial, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de pulmão, melanoma e câncer de pâncreas.
termo amostra biológica utilizado na presente se refere a uma amostra que compreende uma biomolécula e/ou que é 5 obtida de um indivíduo. As biomoléculas representativas incluem, entre outros, o DNA total, amostra biológica pode ser
RNA, miRNA, mRNÃ e os polipeptídeos. A utilizada para a detecção da presença e/ou do nível de expressão de um miRNA de interesse associado aos exossomos derivados de câncer.
Qualquer célula, grupo de células, fragmento celular ou produto celular pode ser utilizado com os métodos da matéria reivindicada pela presente, apesar de serem melhor indicados os fluidos biológicos e órgãos que seriam previstos como contendo exossomos derivados de câncer e que exibem a expressão diferencial de miRNAs quando comparados aos controles t5--normaTsv—Em—afgumas—con-fi-gu-raçõesv—a—amostra—b-todóg-i-ca—é—tuna amostra biológica de obtenção relativamente fácil, como, por exemplo, sangue ou um de seus componentes. Em algumas
Figure BRPI0807318B1_D0036
configurações, a amostra biológica compreende leite, sangue, soro, plasma, ascite, fluido cístico, fluido pleural, fluido peritoneal, fluido cérebroespinhal, lágrimas, urina, saliva, catarro ou suas combinações.
Em algumas configurações, pode ser utilizada cromatografia de exclusão por tamanho para isolar os exossomos derivados de câncer. Vide, por exemplo, as Figuras 1 e 2. As técnicas de cromatografia de exclusão por tamanho são bem conhecidas. São fornecidas técnicas exemplares e não limitativas nos presentes Exemplos. Em algumas configurações, é isolada uma fração de volume vazio e compreende os exossomos de interesse.
Além disso, em algumas configurações, os exossomos derivados de câncer podem ainda ser isolados após a separação cromatográfica por técnicas de centrifugação (de uma ou mais frações cromatográficas), como geralmente conhecido na técnica. Em algumas 5 configurações, por exemplo, pode ser utilizada centrifugação por gradiente de densidade para melhor isolar os exossomos. Ainda em algumas configurações, pode ser desejado separar ainda mais os exossomos isolados derivados do câncer dos exossomos de outras origens.
Por exemplo, os exossomos derivados de câncer podem ser separados dos exossomos não derivados de câncer por captura imunoabsorvente utilizando um anticorpo antigeno anticâncer. Vide, por exemplo, Figura 8.
Os anticorpos exemplares de antigeno anticâncer incluem, entre outros, os anticorpos da molécula de adesão celular antiepitelial (anti-EpCAM), utilizados, por
T5 exemplo, como indicado nos presentes Exemplos.
Os termos diagnosticar e diagnóstico utilizados na presente se referem a métodos pelos quais os técnicos no assunto podem estimar e até determinar se um indivíduo está sofrendo de uma dada doença ou problema.
Os técnicos no assunto geralmente fazem um diagnóstico com base em um ou mais indicadores diagnósticos, como, por exemplo, um biomarcador (por exemplo, um nível de expressão miRNA), a quantidade (incluindo a presença ou a ausência) daquilo que é indicativo de presença, gravidade ou de ausência da doença.
Junto com o diagnóstico, o prognóstico clínico do câncer é também uma área de grande preocupação e interesse. É importante conhecer a agressividade das células de câncer e a probabilidade de recorrência do tumor para poder planejar a terapia mais eficaz. Alguns cânceres, por exemplo, são tratados com várias estratégias alternativas. Em certos casos, é utilizada terapia de radiação local-regional e sistêmica, enquanto em outros casos são empregadas a intervenção cirúrgica e/ou a quimioterapia.
As decisões atuais de tratamentos para indivíduos com câncer podem ser baseadas (1) no número de nódulos linfáticos envolvidos na tamanho do diagnóstico.
na condição do(s) tumor primário, e marcador (es) de câncer, (3) (4) no estágio da doença no no
Entretanto, mesmo com esses fatores, não é possível a exata predição do curso da doença para todos os indivíduos com câncer. Caso puder ser feito um prognóstico mais exato, pode ser escolhida a terapia apropriada e, em alguns casos, escolhida a terapia menos severa para o paciente. A medição dos níveis miRNA exossomais derivados do câncer revelados na presente pode ser útil
1’5 pa_r_a ca_t_ego_rí“z'a~r o_s ind±vtduO~s de atro-rdo eom o avanço do cânccr' que se beneficiem de determinadas terapias e se diferenciem dos demais indivíduos, nas quais terapias alternativas ou adicionais possam ser mais adequadas.
Assim, em algumas configurações da matéria revelada na presente, provido um método para categorizar o câncer em um indivíduo.
Em algumas configurações, o método compreende fornecer uma amostra biológica de um indivíduo; isolar os exossomos derivados de câncer compreendendo micro-RNAs (miRNAs) da amostra biológica;
determinar a quantidade de um ou mais dos miRNAs; e comparar a quantidade do um ou mais miRNAs com um ou mais níveis de controle miRNA. Nessas configurações, o câncer pode ser caracterizado com base em uma diferença mensurável na comparados com um ou mais níveis de controle miRNA. Em algumas quantidade do um ou mais miRNAs dos exossomos derivados de câncer configurações, a caracterização do câncer compreende a determinação de um tipo, classe e/ou estágio do câncer.
Fazer um diagnóstico ou diagnosticar, como utilizado na presente, é ainda mais consistente do que um 5 prognóstico, podendo fazer a prediçâo de um resultado clinico (com ou sem tratamento médico), selecionar um tratamento adequado (ou se o tratamento seria eficaz), ou monitorar um tratamento em curso e potencialmente alterar esse tratamento, com base na medida dos
Figure BRPI0807318B1_D0037
níveis diagnósticos miRNA exossomais derivados do câncer. Além disso, em algumas configurações da matéria revelada na presente, pode ser feita a múltipla determinação das quantidades de um ou mais miRNAs no tempo para facilitar o diagnóstico (incluindo o prognóstico), avaliar a eficácia do tratamento, e/ou a progressão de um câncer. Pode ser feita uma mudança temporal em um ou mais
-1-5----n-í-v-e-i-s—d-i-a-g-n-ó-s-t-i-eos—m-i-R-NA— ex-o-s-s-oma-i-s—de-r-i-v-a-do-s—do—eâ-n-ee-r—(-ts-to—éy quantidades de miRNA na amostra biológica) para prever um resultado clínico, monitorar a progressão do câncer, e/ou a eficácia das terapias administradas de câncer. Nessa configuração, por exemplo, é possível observar uma redução da quantidade de determinados miRNAs na amostra biológica no tempo do curso de uma terapia, indicando assim a eficácia do tratamento.
A matéria revelada na presente ainda provê em algumas configurações um método para a avaliação da eficácia e/ou da progressão do tratamento de um câncer em um indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende a coleta de uma série de amostras biológicas em um período de tempo de um indivíduo;
série de amostras biológicas;
determinar uma quantidade de um ou isolar os exossomos derivados de câncer compreendendo miRNAs da mais dos miRNAs em cada uma das amostras biológicas da série; e determinar qualquer ação mensurável nas quantidades do um ou mais miRNAs em cada uma das amostras biológicas da série, para assim avaliar a eficácia e/ou a progressão do tratamento do câncer no 5 indivíduo. Quaisquer mudanças nas quantidades dos miRNAs medidos no período de tempo podem ser utilizadas para prever o resultado clínico, determinar o início ou a continuação da terapia do câncer, e se a terapia em curso está efetivamente tratando o
Figure BRPI0807318B1_D0038
câncer. Por exemplo, pode ser selecionado um primeiro timepoint antes do início de um tratamento e um segundo timepoint algum tempo após o início do tratamento. Os níveis miRNA podem ser medidos em cada amostra tomada em diferentes pontos do tempo, sendo notadas as diferenças qualitativas e/ou quantitativas. Uma mudança nas quantidades de um ou mais dos níveis miRNA medidos da
1’5 pTrimerra e da—segunda—amostras—pode—se—co-rre-l-a-c-i-on-ar—com—o prognóstico, determinando a eficácia do tratamento, e/ou a progressão da doença no indivíduo.
Os termos correlacionados e correlacionando
Figure BRPI0807318B1_D0039
como utilizados na presente com referência ao uso de níveis miRNA diagnósticos e prognósticos associados ao câncer, se referem à comparação da presença ou à quantidade dos níveis miRNA em um indivíduo com sua presença ou quantidade em indivíduos que comprovadamente sofrem de câncer, ou em indivíduos sabidos como isentos de câncer, isto é indivíduos normais ou indivíduos de 25 controle. Por exemplo, um nível de um ou mais miRNAs na amostra biológica pode ser comparado a um nível miRNA para cada um dos miRNAs específicos testados e determinados como em correlação com um câncer. Os níveis miRNA de uma ou mais amostras são correlacionados com um diagnóstico; isto é, os técnicos no assunto podem utilizar o(s) níveis miRNA para determinar se o indivíduo sofre do câncer e se responde de acordo. De maneira alternativa, o(s) níveis miRNA da amostra podem ser comparados ao(s) níveis 5 miRNA de controle conhecidos como associados a um bom resultado (por exemplo, a ausência do câncer) , como um nível médio encontrado em uma população de indivíduos normais.
Em certas configurações, um nível miRNA
Figure BRPI0807318B1_D0040
t5-
Figure BRPI0807318B1_D0041
diagnóstico ou prognóstico está correlacionado com um câncer simplesmente pela presença ou pela ausência.
Em outras configurações, pode ser estabelecido um nível limite de um nível miRNA diagnóstico ou prognóstico, e o nível do miRNA em uma amostra do indivíduo pode ser simplesmente comparado com o nível limite.
Comro iirdTcactoç—em—a-l-gumars—con-f-i-g-u-r-a-çõe-s->—podemser feitas múltiplas determinações de um ou mais níveis miRNA diagnósticos ou prognósticos, e pode ser utilizada uma mudança temporal dos níveis para determinar um diagnóstico ou prognóstico. Por exemplo, podem ser determinados níveis específicos miRNA em um tempo inicial, e depois em um segundo tempo. Nessas configurações, um aumento do(s) nível(is) miRNA a partir de um tempo inicial com relação ao segundo tempo pode ser um diagnóstico de câncer, ou um dado prognóstico. Da mesma forma, uma redução do(s) nível(is) miRNA de um tempo inicial com relação ao segundo tempo pode ser 25 indicativa do câncer ou de um dado prognóstico. Além disso, o grau de alteração de um ou mais níveis miRNA pode estar relacionado com a gravidade do câncer e/ou com a progressão da doença e de futuros eventos adversos.
Os técnicos no assunto compreenderão que, enquanto em certas configurações podem ser feitas medições comparativas do(s) mesmo(s) níveis miRNA em múltiplos pontos no tempo, é também possível medir certo (s) níveis miRNA em um timepoint, segundo(s) níveis miRNA em um segundo timepoint, sendo que uma comparação desses níveis pode prover informações diagnosticas.
A frase determinar o prognóstico como utilizada • .0 na presente se podem prever o refere a métodos pelos quais os técnicos no assunto curso ou o resultado de uma doença em um indivíduo.
O termo prognóstico não se refere à capacidade de prever o curso ou o resultado de uma doença com 100% de precisão, ou mesmo que o dado curso ou resultado tenha mais ou menos probabilidade de ocorrer com base na presença, na ausência ou nos níveis de um
T5 b'ÍOma'rca'do'ir;—Ao—invés—di-s~so~,—o-s—té-en-i-eo-s—no—a-s-s-u-n-to—eomp-ree-nde-rão· que o termo prognóstico se refere a uma maior probabilidade de ocorrência de um determinado curso ou resultado; isto é, que um curso ou resultado tenha maior probabilidade de ocorrência em um indivíduo que demonstra uma determinada condição, quando comparado com indivíduos que não exibem a condição. Por exemplo, nos indivíduos que não exibem a condição (por exemplo, que não expressam o (s) miRNA ou que expressam o(s) miRNA em nível reduzido), a probabilidade de um dado resultado (por exemplo, sofrer de câncer) pode ser muito pequena (por exemplo, < 1%) ou mesmo nula. Em contraste, em indivíduos que relação ao nível de controle), a probabilidade de um dado exibem a condição (por exemplo, que expressam o(s) níveis miRNA ou que expressam o(s) níveis miRNA em nível muito aumentado com resultado (por exemplo, sofrer de uma forma/estágio de câncer) pode ser alta. Em certas configurações, um prognóstico tem cerca de 5% de probabilidade de um dado resultado esperado, cerca de 7%
Figure BRPI0807318B1_D0042
de probabilidade, cerca de 10% de probabilidade, cerca de 12% de
5 probabilidade, cerca de 15% de probabilidade, cerca de 20% de
probabilidade, cerca de 25% de probabilidade, cerca de o r» o, □ U'O de
probabilidade, cerca de 40% de probabilidade, cerca de 50% de
probabilidade, cerca de 60% de probabilidade, cerca de 75% de
probabilidade, cerca de 90% de probabilidade ou cerca de 95% de
10 probabilidade...
Os técnicos no assunto compreenderão que a
associação de um indicador prognóstico com uma predisposição a um resultado adverso é uma análise estatística. Por exemplo, níveis miRNA (por exemplo, quantidade de um ou mais miRNAs em uma 15 amostra) maiores ou menores que um nível de ccnfrcrleç em airguma-sconfigurações, podem sinalizar que um indivíduo tem mais probabilidade de sofrer de um câncer que os indivíduos com um
Figure BRPI0807318B1_D0043
nível inferior ou igual ao do nível de controle, como determinado por um nível de significância estatística. Além disso, uma mudança do(s) nível (is) miRNA a partir dos níveis basais pode refletir o prognóstico de um indivíduo, e o grau de mudança no nível marcador pode estar relacionado com a gravidade de eventos adversos. A significância estatística é geralmente determinada comparando duas ou mais populações, e determinando um intervalo de confiança e/ou 25 um valor p. Vide, por exemplo, Dowdy and Wearden, Statistics for
Research, John Wiley & Sons, New York, 1983, incorporado à presença por referência na totalidade. Os intervalos de confiança exemplares da presente matéria são 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%,
99,5%, 99,9% e 99,99%, enquanto os valores p exemplares são 0,1,
0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 e 0,0001.
Em outras configurações, pode ser estabelecido um
grau limite de mudança de nível de um ou mais níveis miRNA
5 prognóstico ou diagnóstico, e o grau de mudança no nível do
indicador em uma amostra biológica pode ser simplesme nte comparado
ao grau limite da mudança de nível. Uma mudança preferida de
limite do(s) nível(is) miRNA da matéria revelada na presente é
Figure BRPI0807318B1_D0044
cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de
25%, cerca de 30%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 75%, cerca de 100%, e cerca de 150%. Em ainda outras configurações pode ser estabelecido um nomograma, pelo qual o nível de um indicador prognóstico ou diagnóstico pode estar diretamente relacionado a uma disposição associada direcionada a um dado resultado. Os 15 técnicos no assunto estão familiarizados com o uso de tais nomogramas que relacionam dois valores numéricos com a compreensão de que a incerteza nesta medição é a mesma que a incerteza na concentração do marcador, porque as medições da amostra individual são referenciadas, não sendo médias de população.
A identidade e a quantidade relativa de miRNAs na amostra podem ser utilizadas para prover perfis miRNA para uma determinada amostra. Um perfil miRNA para uma amostra inclui as informações sobre as identidades dos miRNAs contidos na amostra, os níveis quantitativos dos miRNAs contidos na amostra e/ou mudanças nos níveis quantitativos dos miRNAs relativos a uma outra amostra. Por exemplo, um perfil miRNA de uma amostra inclui informações sobre as identidades, níveis quantitativos e/ou mudanças dos níveis quantitativos dos miRNAs associados a um determinado câncer.
Ainda com relação aos métodos diagnósticos da matéria revelada na presente, um indivíduo preferido é um indivíduo vertebrado. Um vertebrado preferido tem sangue quente;
um vertebrado preferido de sangue quente é um mamífero. Um mamífero preferido é preferivelmente humano. Como utilizado na presente, o termo indivíduo inclui tanto indivíduos humanos como animais. Assim, são providos usos terapêuticos veterinários de
Figure BRPI0807318B1_D0045
acordo com a matéria revelada na presente.
Assim, a matéria revelada na presente fornece o diagnóstico de mamíferos como humanos assim como de mamíferos de importância por estarem em perigo de extinção como os tigres siberianos; de importância econômica, como os animais criados em fazendas para consumo humano; e/ou animais de importância social para os humanos, como animais de estimação ou que estão em zoológicos. Exemplos desses animais incluem, entre outros:
carnívoros como gatos e cães; suínos, incluindo porcos, capões e j avalis;
ruminantes e/ou ungulados como gado, bois, ovelhas,
Figure BRPI0807318B1_D0046
girafas, veados, bodes, bisões e camelos; e cavalos.
É também provido tratamento de aves, incluindo o tratamento dos tipos de aves em perigo de extinção e/ou mantidas em zoológicos, assim como aves comestíveis, e mais particularmente aves domesticadas, isto é, aves domésticas, como perus, galinhas, patos, gansos, galinhas d'angola e similares, já que também têm importância econômica para os humanos. Assim, também está provido o tratamento da criação, incluindo, entre outros, porcos domesticados, ruminantes, ungulados, cavalos (incluindo cavalos de corrida), aves domésticas e similares.
Como indicado acima, a matéria revelada na presente provê a determinação da quantidade de miRNAs exossomais derivados do câncer correlacionados com o câncer dentro dos fluidos biológicos de um indivíduo e, em particular, de amostras sorológicas de um indivíduo como, por exemplo, de sangue.
Isto dá uma vantagem para os testes de amostras biológicas que são facilmente obtidas de um indivíduo. A quantidade de um ou mais miRNAs de determinada interesse utilizando na amostra biológica pode ser então qualquer número de metodologias geralmente conhecidas na técnica e comparadas aos níveis de controle miRNA.
A quantidade de um ou mais miRNAs determinados se refere a uma medição qualitativa (por exemplo, presente ou não na amostra medida) e/ou quantitativa (por presente) de um ou mais miRNAs. O nível exemplo, quanto está de controle é uma quantidade (incluindo a presença ou ausência qualitativa) ou faixa de quantidades de um ou mais miRNAs encontrados em uma amostra biológica comparável em indivíduos que não sofrem de câncer. Como exemplo não limitativo de cálculo do nível de controle, pode ser calculada a quantidade de um ou mais miRNAs de interesse presentes em uma amostra biológica normal (por exemplo, sangue) e extrapolada para todos os indivíduos.
Uma metodologia exemplar para a medição dos níveis de miRNA dos exossomos em uma amostra biológica é a técnica de mícroarranjo, que é uma potente ferramenta aplicada aos estudos de expressão genética. A técnica fornece muitos polinucleotídeos com informação sequencial conhecida como sondas para encontrar e capturar as fitas complementares por ligação seletiva. As Figuras hibridizar com as fitas complementares em uma amostra, para assim e 8 diagramas de fluxo de protocolos exemplares para a isolação e medição dos miRNAs com derivação exossomal por microarranjo.
O termo ligação seletiva como utilizado na presente se refere a uma medida da capacidade de uma sonda para 5 hibridizar em um polinucleotideo alvo com especificidade. Assim, a sonda compreende uma sequência polinucleotidea complementar, ou essencialmente complementar, em pelo menos uma parte da sequência do polinucleotideo alvo. As sequências de ácidos nucléicos que são
Figure BRPI0807318B1_D0047
complementares são aquelas com pareamento de bases de acordo com as regras padrão de complementaridade de Watson-Crick. Como utilizado na presente, o termo sequências complementares significa sequências de ácidos nucléicos que são substancialmente complementares, como podem ser avaliadas pela mesma comparação de nucleotideos indicada acima, ou conforme definidas como sendo capazes de hibridizar o segmento do ácido nucléico em questão em condições relativamente rígidas, como as ora descritas. Um exemplo particular de um segmento contemplado de ácido nucléico complementar é um oligonucleotídeo antisenso.
Com relação às sondas reveladas na presente tendo afinidade de ligação com os miRNAs, a sonda pode ser 100% complementar com a sequência do polinucleotideo alvo. Entretanto, a sonda não precisa ser necessariamente completamente complementar ao polinucleotideo alvo ao longo de todo o comprimento do polinucleotideo alvo enquanto a sonda possa ligar ao polinucleotideo alvo com especificidade e 25 capturá-lo da amostra.
A hibridização do ácido nucléico será afetada por condições como concentração salina, temperatura ou solventes orgânicos, além da composição base, comprimento das fitas complementares e o número de não combinações de base nucleotidea entre os ácidos nucléicos hibridizantes, como será prontamente apreciado pelos técnicos no assunto. As condições rígidas de temperaturas geralmente incluem temperaturas maiores que
30°C, tipicamente maiores que 37 °C e preferivelmente maiores que
45°C.
As condições salinas rígidas serão inferiores a mM, tipicamente inferiores a 500 mM e preferivelmente inferiores a
200 mM. Entretanto, a combinação de parâmetros é muito mais importante que a medida de qualquer parâmetro simples. A determinação das condições adequadas de hibridização para identificar e/ou isolar seqüências contendo altos níveis de homologia é bem conhecida na técnica. Com o propósito de especificação de condições de alta estringência, as condições preferidas são uma concentração salina de cerca de
00 mM e uma temperatura de cerca de 45°C.
O trabalho de pesquisa de dados é completado pela bioinformática, incluindo chips de varredura, aquisição de sinais, processamento de imagens, normalização, tratamento estatístico e comparação de dados, assim como a análise de caminho. Assim, técnica de microarranjo pode perfilar centenas e milhares de polinucleotídeos simultaneamente com alto desempenho.
A análise de perfilamento de microarranjo da expressão mRNA tem provido com sucesso valiosos dados para os estudos de expressão genética em pesquisa básica.
E a técnica tem sido ainda colocada em prática na indústria farmacêutica e no diagnóstico clínico. Com crescentes quantidades de dados miRNA tornando-se disponíveis, e com o genética, a técnica de microarranjo se torna útil nos estudos acúmulo de evidências da importância dos miRNA na regulação miRNA de alto desempenho.
A análise do miRNA correlacionado ao câncer pode ser feita separada ou simultaneamente com múltiplas sondas polinucleotídeas dentro de uma amostra de teste. Por exemplo, 5 podem ser combinadas várias sondas em um teste para o processamento eficiente de múltiplas amostras e para prover potencialmente maior precisão diagnostica e/ou prognostica. Além disso, os técnicos no assunto reconheceríam o valor dos testes de
Figure BRPI0807318B1_D0048
múltiplas amostras (por exemplo, em sucessivos pontos no tempo) do mesmo indivíduo. Esses testes de amostras em série podem permitir a identificação de alterações nos níveis miRNA no tempo. Os aumentos ou as reduções dos níveis miRNA, assim como a ausência de alteração nos níveis, podem fornecer úteis informações sobre a condição da doença.
Em algumas configurações, pode ser construído um painel que consiste de sondas polinucleotídeas que ligam seletivamente miRNAs exossomais derivados do câncer correlacionados a um ou mais cânceres para o fornecimento de
Figure BRPI0807318B1_D0049
relevantes informações relacionadas ao diagnóstico ou prognóstico do câncer e ao tratamento de indivíduos com câncer. Esse painel pode ser construído, por exemplo, utilizando 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400,
500 ou 1.000 sondas polinucleotídeas individuais. A análise de uma única sonda ou de subconjuntos de sondas compreendendo um maior 25 painel de sondas pode ser feita por técnicos no assunto de maneira a otimizar a sensibilidade ou a especificidade clínica em vários cenários clínicos. Estas incluem, entre outros, unidades ambulatoriais, de tratamentos urgentes, de tratamentos críticos, de tratamento intensivo, de unidades de monitoramento, de hospitalização de indivíduo, ambulatória de indivíduo, de consultório médico, de clínica médica e unidades de triagem de saúde.
Além disso, os técnicos no assunto podem utilizar uma única sonda ou um subconjunto de outras sondas, compreendendo um maior painel de do limite diagnóstico em cada uma das unidades supramencionadas para aperfeiçoar a sensibilidade e a especificidade clínicas. A sensibilidade clínica de um ensaio é definida como a porcentagem daqueles com a doença prevista corretamente pelo ensaio, e a especificidade de um ensaio é definida como a porcentagem daqueles sem a doença prevista corretamente pelo ensaio.
Em algumas configurações, a determinação da quantidade do um ou mais miRNAs compreende a marcação de um ou mais miRNAs. Os miRNAs marcados podem então ser capturados com uma ou mais sondas polinucleotideas que ligam seletivamente o um ou mais miRNAs.
Como utilizados na presente, o termos rótulo e marcado se referem à anexação de um meio capaz da detecção por métodos espectroscópicos, radiológicos ou outros métodos a uma sonda molecular. Assim, os termos rótulo ou marcado se referem à incorporação ou à anexação, opcionalmente de forma covalente ou não covalente, de um marcador detectável dentro/sobre uma molécula, como de um polinucleotídeo. São conhecidos na técnica 25 vários métodos de marcação de polipeptídeos que podem ser utilizados. Exemplos de rótulos de polinucleotídeos incluem, entre outros, os seguintes: radioisótopos, rótulos fluorescentes, átomos pesados, rótulos enzimáticos ou genes repórter, grupos quimioluminescentes, grupos biotinil, epítopos polipeptídeos predeterminados reconhecidos sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação de anticorpos, domínios de ligação metálica, identificadores de epítopos, etc.). Em algumas configurações, os rótulos estão anexos por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir a potencial impedimento estérico.
Também pode ser feita a análise dos níveis miRNA utilizando sondas polinucleotídeas em vários formatos físicos.
Por exemplo, pode ser feito o uso de placas de microtítulo ou de automação para facilitar o processamento de um grande número de amostras de testes.
De maneira alternativa, poderíam ser desenvolvidos formados de amostras simples para facilitar o tratamento imediato e o diagnostico dentro de um prazo.
Em algumas configurações, a pluralidade de sondas polinucleotídeas é ligada a um substrato. Em algumas configurações, o substrato compreende uma pluralidade de endereços. Cada endereço pode estar associado a pelo menos uma das sondas polinucleotídeas do arranjo. Um arranjo é endereçável quando tiver múltiplas regiões de diferentes meios sequências polinucleotídeas) de maneira que uma uma característica ou spot do arranjo) em determinada localização em particular (isto é, um endereço) no arranjo detectará um determinado alvo ou classe de alvos (apesar de uma característica poder incidentalmente detectar não alvos daquela comumente, mas não precisam ser, separadas por espaços de intervenção. No caso de um arranjo, o alvo miRNA pode ser referenciado como um meio em uma fase móvel (comumente fluida), a ser detectada por sondas (sondas alvo) que são ligadas ao substrato em várias regiões.
Podem ser fabricados arranjos de biopolímeros (ex. microarranjos de polinucleotídeos) depositando biopolímeros obtidos previamente (como a partir de síntese ou de fontes naturais) sobre um substrato, ou por métodos de síntese in situ.
Os métodos para a deposição dos biopolímeros obtidos incluem, entre outros, o carregamento depois o toque de um pino ou de um capilar em uma superfície, como descrito na
Patente norte10 americana No. 5.807.522 ou a deposição por disparo a partir de um jato de pulso, como por uma cabeça de jato de tinta, como descrito nas publicações PCT WO
95/25116 e WO 98/41531 e em outros locais.
Os métodos de fabricação in situ incluem aqueles descritos na
Patente norte-americana No.
5,449,754 para a sintetização de arranjos de peptídeos e na Patente norte-americana No. 6.180.351 e
WO 98/41531 e as referências nelas citadas para polinucleotídeos, podendo também utilizar jatos de pulso para o depósito dos reagentes. Outros detalhes da fabricação de arranjos de biopolímeros por depósito, sejam biopolímeros obtidos previamente ou pelo método in situ são revelados nas
Patentes norte-americanas
Nos. 6.242.266, 6.232.072,
6.180.351 e
6.171.797. Na fabricação por depósito de biopolímeros previamente obtidos ou pelos métodos in situ, tipicamente cada região na superfície do substrato em que o arranjo será ou que foi formado (regiões completamente exposta a um ou mais reagentes.
Por exemplo, em adequada na superfície que se liga tanto ao substrato e o qualquer dos métodos as regiões de arranjo estarão geralmente expostas a um ou mais reagentes para a formação de uma camada biopolímero ou ao biomonômero. Na fabricação in situ as regiões de arranjo também ficarão normalmente expostas à oxidação, ao desbloqueamento e aos reagentes opcionais de capeamento. De forma similar, particularmente na fabricação pelo depósito de biopolimeros obtidos previamente, também pode ser desejável expor as regiões de arranjo a um reagente adequado de bloqueamento para o bloqueio dos características de locais na superfície em que não existam ligação não específica ao alvo.
determinação da quantidade de miRNAs exossomais derivados do câncer pode, de maneira alternativa, ou além da análise de microarranjo, compreender o uso de reação de cadeia polimerase em tempo real (PCR) , por exemplo, da maneira revelada em detalhes nos presentes Exemplos. 0 PCR de tempo real (RT-PCR) pode fornecer dados precisos e rápidos como da presença e da quantidade de miRNAs existentes em uma amostra.
A Figura 2 fornece um fluxograma de um protocolo exemplar para o isolamento e a medição de miRNAs exossomais por RT-PCR. Outros detalhes das metodologias exemplares são indicados nos presentes Exemplos.
Em algumas configurações da matéria revelada na presente, é provido um método para diagnosticar potenciais resultados adversos de gestações em um indivíduo. A metodologia supramencionada em detalhes para o isolamento de exossomos compreendendo miRNAs e a determinação da quantidade de miRNAs também pode ser aplicada para a quantificação de determinados miRNAs associados aos resultados adversos de gestações, com algumas modificações que serão agora descritas.
Para a previsão de resultados adversos de gestações, os exossomos circulantes obtidos da placenta podem ser isolados da amostra biológica como, por exemplo, sangue ou seus componentes. A placenta, apesar de derivada do feto, é o único tecido fetal realmente em contato com o sistema maternal. Assim, os exossomos produzidos pelas células placentárias podem circular 5 no fluxo sanguíneo da mãe. Para o isolamento dos exossomos derivados da placenta, podem ser utilizados tanto os anticorpos anti-EpCAM (como utilizados para a isolação dos exossomos do tumor) como os anticorpos de fosfatase alcalina do tipo
Figure BRPI0807318B1_D0050
Figura 8) .
i antiplacentário (PLAP) afixados a contas magnéticas (vide, ex.
Por exemplo, em algumas configurações, o método compreende o provimento de uma amostra biológica de um indivíduo e o isolamento de exossomos compreendendo micro-RNAs (miRNAs) da amostra biológica.
É então determinada uma quantidade de um ou mais dos miRNAs e comparada com um ou mais níveis de controle miRNA. O indivíduo pode então ser diagnosticado como estando em risco de um resultado de gestação adversa, caso exista uma diferença mensurável na quantidade dos um ou mais miRNAs dos exossomos quando comparados ao um ou mais níveis de controle miRNA. Em algumas configurações, o resultado de gestação adversa é um distúrbio selecionado do grupo que consiste de pré-eclâmpsia, nascimento prematuro parto antes de 32 semanas de gestação), ruptura prematura de membranas, restrição de crescimento intrauterino e perda recorrente da gestação.
A prática da matéria revelada na presente pode molecular, biologia transgênica, microbiologia,
DNA recombinante e empregar, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia imunologia, e que estão inseridas na técnica. Essas técnicas são completamente explicadas na literatura. Vide, por por exemplo,
Molecular Cloning Ά Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., ed. by
Figure BRPI0807318B1_D0051
Sambrook,
Fritsch and Maniatis, eds. , Cold Spring Harbor
Laboratory
Figure BRPI0807318B1_D0052
Figure BRPI0807318B1_D0053
Patente norte-americana
I
Figure BRPI0807318B1_D0054
ONA Cloning, Volumes
II, Glovide, ed., 1985;
Oligonucleotide Synthesis, M.
J.
Gait, ed.,
1984;
Nucleic Acid
Hybridization, D. Hames & S. J.
Higgins, eds. ,
1984;
Transcription
Figure BRPI0807318B1_D0055
and Translation, B. D.
Hames &
S. J. Higgins, eds . ,
1984; Culture
Of Animal Cells, R.
Freshney, Alan
R.
Liss,
Inc., 1987;
Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press
1986; Perbal (1984), A
Practical Guide To Molecular Cloning; Ver Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian
Cells, J. H. Miller and Μ. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor 15 Laboratory, 1987; Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155, Wu et al., eds., Academic Press Inc., N.Y.; Immunochemical Methods In
Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic
Press, London, 1987; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes
Figure BRPI0807318B1_D0056
I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986.
EXEMPLOS
Os seguintes Exemplos foram incluídos para ilustrar os modos da matéria revelada na presente. À luz da presente revelação e no nível geral da técnica atual, os técnicos no assunto apreciarão que os seguintes Exemplos têm somente a 25 função exemplar e que numerosas alterações, modificações e alterações podem ser feitas sem abandonar o escopo da matéria revelada na presente.
A matéria revelada na presente revela que o miRNA pode ser encontrado e isolado dos exossomos nos fluidos biológicos. 0 miRNA isolado pode ser utilizado como ferramenta diagnostica do câncer e de resultados adversos de gestações. Os presentes Exemplos dão suporte a essas aplicações.
MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 1-5
Amostras do paciente e linhas celulares
Estes Exemplos utilizados como fluidos biológicos exemplares derivados de soro de mulheres diagnosticadas com adenocarcinoma papilar seroso do ovário (n=50; n=10 para estágio
Figure BRPI0807318B1_D0057
I, n=10 para estágio II, n=20 para estágio III e n=10 para estágio
IV), mulheres de mesma idade com adenoma de ovário benigno (n=10), e mulheres de mesma idade sem evidências de doença ovariana (n=10). Foram selecionados os controles, pacientes com doença ovariana benigna e de câncer de ovário nos estágios III e IV com 15 base na combinação de idades de pacientes com câncer de ovário de estágio precoce. Esses Exemplos ainda incluem dados de investigações de culturas de células tumorais primárias, estabelecidas a partir de 6 mulheres com adenocarcinoma cisto de
Figure BRPI0807318B1_D0058
ovário de Estágio IIIc e suas correspondentes amostras de soro pré-cirúrgico.
Todos esses materiais foram obtidos com consentimento informado aprovado pelo University Human Studies
Committee da Universidade de Louisville.
As culturas celulares de tumores de ovário primários foram feitas em nosso laboratório e denominadas UL-1,
UL-2, UL-3, UL-6, UL-B e UL-O. As UL-2 e UL-3 foram obtidas de cânceres de ovário hereditários, enquanto as UL-1, UL-6, UL-B e
UL-0 foram obtidas de cânceres espontâneos. Essas células tumorais ovarianas foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal (por ultrafiltraçâo) isento de exossomos, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, 200 mM de L-glutamina, 100 mg/mL de estreptomicina e 100 UI/mL de penicilina em atmosfera de CO2 umidificada a 5%. A viabilidade 5 celular foi avaliada por exclusão de azul tripano e todas as culturas utilizadas foram >95% viáveis.
Isolação dos exossomos circulantes
Os exossomos derivados de tumores foram
Figure BRPI0807318B1_D0059
especificamente isolados por um procedimento modificado de escolha celular de ativação magnética (MACS), utilizando molécula de adesão celular antiepitelial (EpCAM). Nossos estudos anteriores demonstraram que os exossomos de tumores epiteliais expressam
EpCAM em suas superfícies e podem ser utilizados para suas isolações seletivas. As amostras séricas (2,5 ml) de controles 15 normais, de pacientes com doenças benignas e de pacientes com câncer de ovário de estágio precoce foram incubadas com anti-EpCAM acoplado a microcontas magnéticas (50 μΐ) . Foram misturadas e
Figure BRPI0807318B1_D0060
incubadas por 2 horas a 4°C. Uma microcoluna LD foi colocada no campo magnético de um Separador MACS e a coluna foi enxaguada com
500 μΐ de tampão Tris-salino (TBS). Os complexos magnéticos imunes foram aplicados na coluna e o material não ligado (não marcado) passou através e foi descartado. A coluna foi lavada quatro vezes com 500 μΐ de TBS. Os exossomos especificamente selecionados foram recuperados removendo a coluna do separador e colocando-os em um tubo de coleta. Foi adicionado TBS (1 ml) à coluna, sendo obtidos tampão de eluição IgG (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) e o os exossomos marcados magneticamente aplicando o êmbolo fornecido com a coluna. Os exossomos/microcontas isolados foram diluídos em complexo foi centrifugado a 10.000 rpm para separar as microcontas dos exossomos (sobrenadantes). O sobrenadante foi então centrifugado a lOO.OOOg por 1 hora a 4°C. Os exossomos peletados foram ressuspensos em 250μ1 em soro salino tamponado com fosfato (PBS) sendo exossomos derivados do tumor ensaiados com relação à proteína total. A quantidade de proteína foi determinada pelo método de microensaio de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA), utilizando albumina sérica bovina (BSA)como padrão.
Figure BRPI0807318B1_D0061
Microscopia eletrônica de transmissão
Para a microscopia eletrônica de transmissão, os exossomos peletados foram fixados em 2,5% (p/v) de glutaraldeído em PBS, desidratado e integrado em Epon. Foram cortadas seções ultrafinas (65 nm) e manchadas com acetato de uranil e citrato de chumbo de Reynold. As seções foram examinadas em um microscópio 15 eletrônico de transmissão Jeol 1210.
Isolação e perfilamento de miRNA
O RNA total foi isolado das células e dos
Figure BRPI0807318B1_D0062
exossomos do tumor utilizando o kit de isolação mirVana miRNA de acordo com as instruções do fabricante (Ambion, Austin, TX) . A qualidade do RNA, a produção e o tamanho das frações de miRNA foram analisadas utilizando o Bioanalisador Agilent 2100 (Agilent
Technologies, Foster City, CA) . Os miRNAs isolados foram marcados com Cy3 na extremidade 3' utilizando o Kit mirVana miRNA Array Labeling Kit (Ambion) e o kit Post Labeling Reactive Dye (Amersham 25 Bioscience, Pittsburgh, PA) . O perfilamento microRNA foi feito em duplicata por Ocean Ridge Biosciences (Júpiter, FL) utilizando microarranjos contendo sondas para 467 miRNAs humanos maduros. Esta análise usou arranjos miRNA desenvolvidos especialmente cobrindo os 467 miRNAs presentes no Sanger Institute mirBASE v9.0, que consiste de oligonucleotídeos 35-44-mer, fabricados pela
Invitrogen e marcados em duplicata. Após a hibridização, os arranjos miRNA foram varridos utilizando um scanner GenePix 4000A array (Axon
Instruments,
Union City, CA) e os dados não processados normalizados e analisados utilizando GeneSpring
7.0
Software (Silicon
Genetics,
Redwood City, CA) . A normalização foi feita expressando cada replicata miRNA com relação ao miRNA de controle
Figure BRPI0807318B1_D0063
(Ambion) adicionado a cada amostra, permitindo comparação entre arranjos. Foram calculados o limite
952 percentil de controles negativos (TPT95) com base no sinal de hibridização das sondas de controle negativo incluindo:
sondas de controle descombinadas e misturadas e 87 sondas C. elegans não conservadas. Para definir a sensibilidade, foi adicionado miRNA sintético NCode com razão de massa de 1/500.000 nas reações de marcação, sendo detectada a intensidade do sinal. Para especificidade, foram utilizadas sondas de combinação perfeita para miR-93, miR-27a e miR-152 e não combinadas. As sondas
Figure BRPI0807318B1_D0064
descombinadas de par base demonstraram um sinal abaixo ou no TPT95 em todos os arranjos.
Para avaliar a estabilidade do perfilamento exossomal com armazenagem e manipulações, foi coletado o soro de pacientes com câncer de ovário e divididos em quatro amostras de 4 ml. Os exossomos do tumor foram isolados imediatamente da primeira 25 alíquota por procedimento MACS e o RNA total foi isolado e armazenado a -70°C até a isolação de todas as amostras. As amostras séricas restantes foram armazenadas a 4°C para subsequente isolação de exossomos. Os exossomos do tumor foram isolados da segunda alíquota após 24 horas, da terceira alíquota após 48 horas e da quarta alíquota após 96 horas a 4°C.
RNA foi isolado de cada preparação de exossomo e armazenado. Em um estudo similar, outras alíquotas séricas foram armazenadas a
-70°C por a 28 dias, antes das isolações dos exossomos e RNA para imitar o uso dos espécimes em banco.
Considerações Estatísticas Gerais
Os dados foram analisados utilizando o pacote de software estatístico, SAS9.1 (SAS Institute,
Cary, NC) . Os níveis de exossomos circulantes de cada grupo de pacientes foram definidos como média ± desvios padrões de pelo menos dois experimentos separados feitos em triplicata.
As comparações entre esses grupos foram feitas por ANOVA de uma via, seguidas pelo pósteste de comparações múltiplas de Tukey comparando cada população.
A quantificação relativa da expressão miRNA foi calculada pelo método 2-AACt (Applied Biosystems User
Bulletin No. 2) sendo os dados analisados como loglO da quantidade relativa (RQ) do miRNA alvo, normalizado com relação ao miRNA de controle adicionado a cada amostra, permitindo comparações entre arranjos. Foram calculadas as distribuições e correlações miRNA juntamente com os intervalos de confiança de cada subarranjo.
A significância estatística foi estabelecida em p < 0,05.
EXEMPLO 1
PRESENÇA DE EXOSSOMOS CIRCULANTES EPCAM POSITIVOS
EM MULHERES
COM
DOENÇA OVARIANA BENIGNA E MALIGNA
Os exossomos EpCAM-positivos foram isolados exossomos circulantes foram ensaiados com relação à proteína total especificamente utilizando contas magnéticas anti-EpCAM, e esses e plotados com relação ao estágio da doença (Figura 3A). Os níveis de exossomos EpCAM-positivos em voluntárias normais de mesma idade (controle) foram 0,039±0,030mg/ml de proteína exossomal, que representaram o background do ensaio. As pacientes diagnosticadas com doença ovariana benigna possuíam 0,149±0,065mg/ml de proteína exossomal, que foi significativamente elevado com relação aos controles.
Todas as pacientes diagnosticadas com câncer de ovário exibiram níveis significativamente elevados de exossomos EpCAMpositivos (comparadas com a doença benigna ou com os controles) .
Mulheres com câncer de ovário de
Estágio I exibiram
0,320±0,056mg/ml de proteína exossomal circulante, que foi significativamente maior tanto aos controles quanto à doença
Os níveis de exossomos circulantes aumentaram com o progresso do estágio, com o câncer de Estágio II tendo
0,640±0,05 3mg/ml, do
Estágio
III possuindo 0,995±0,084mg/ml e do
Estágio IV apresentando 1,42±0,228mg/ml. Os níveis de exossomos associados a esses três estágios foram significativamente maiores que nas mulheres com a doença benigna ou os controles (p<0,001).
As frações resultantes ainda foram analisadas por microscopia eletrônica, que demonstrou estruturas vesiculares características de deste material foi ainda confirmada pela presença de tetraspaninas, antígenos de classe I, fosfatase alcalina do tipo placentário por Western Blot.
EXEMPLO 2
ASSOCIAÇÃO DE PEQUENOS RNAs COM EXOSSOMOS
DERIVADOS DE TUMOR
Para identificar se esses exossomos isolados contêm pequenos RNAs, são examinados utilizando um Bio-Analyzer
2100 (Figura 4). Esta análise identificou a presença de uma população significativa de pequenos RNAs na ausência de RNA 18S e
28S, geralmente observados em RNA derivado de células. Este material foi depois utilizado para perfilamento miRNA.
EXEMPLO 3
PERFILAMENTO
DE MIRNA DERIVADO
DE
EXOSSOMOS
VERSUS DERIVADO DE CÉLULAS
Foram determinados a presença e os níveis de miRNAs específicos de miRNAs derivados de células como derivados de exossomos utilizando análise de microarranjos (Figura 1) com sondas para
467 miRNAs. Os resultados exemplares estão mostrados na Tabela
1. Os perfis miRNA de nossos tumores de ovário confirmaram
2007). Além disso, demonstramos que entre os 467 miRNAs, 218 estiveram acima do limite normalizado, calculados com base no 952 percentil do sinal da sonda de controle negativo tanto nas células como nos exossomos (Tabela 2). Dos 218 miRNAs positivos, os níveis de 175 não foram significativamente diferentes entre as células do tumor de ovário e seus exossomos correspondentes. Por comparação, estiveram presentes em maior proporção nas células, enquanto 31 estiveram presentes em níveis elevados dentro dos exossomos.
Anteriormente, demonstrou-se que miRNAs específicos eram expressos excessivamente nas células do câncer de ovário humano (miR-21, miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-200b, miRcélulas do tumor original e dos exossomos circulantes do tumor das
203, miR-205 e miR-214). Para correlacionar esses achados com o material derivado dos exossomos, foram isoladas frações de RNA das mesmas pacientes (Figura 5) . Utilizando análise de microarranjo, as comparações entre os perfis miRNA derivados do tumor e dos miRNAs exossomais derivados do sangue periférico indicaram que não eram significativamente diferentes. Além disso, os níveis dos 5 perfis miRNA derivados do tumor demonstraram uma forte correlação com os níveis dos miRNAs exossomais derivados do sangue periférico (para míR-21, r=0,77; miR-141, r=0,88; miR-200a, r=0,76; míR-200b, r=0,85; miR-200c, r=0,83; miR-203, r=0,85; miR-205, r=0,91; e miR214, r=0,71).
Figure BRPI0807318B1_D0065
TABELA 1
COMPARAÇÃO QUANTITATIVA DE miRNA NOS EXOSSOMOS
CIRCULANTES E NAS CÉLULAS DE TUMOR DE INDIVÍDUOS COM CÂNCER *
Figure BRPI0807318B1_D0066
Patl Ex Células Patl Pat2 Ex Células Pat2
Nome ID 866A 866B 866C 866D
hsa-míR-296 1098 5,05 4,33 4,24 4,79
hsa-miR-330 1002 2,98 3,09 4,1 1,08
hsa-miR-20a 1007 11,46 11,35 12 11,93
hsa-miR-28 1024 9,4 10,05 9, 19 9,23
hsa-miR-302c 1032 -0,58 3,08 3, 5 1,08
hsa-miR-302a 1036 2,17 3, 66 3,47 4,33
hsa-miR-214 1057 6,58 3, 93 6, 17 2,99
hsa-miR-99b 1063 9,59 10,08 9,86 9, 16
hsa-miR-99a 1068 3,81 4,53 7,34 6,46
hsa-miR-lOa 1072 10,1 10,76 9, 63 9,55
hsa-let-7d 1085 12,53 13, 32 12,65 12,5
hsa-miR-138 1089 5,37 5,26 4,18 3, 61
hsa-miR-140 1106 3,23 4,3 2,01 0,58
hsa-miR-23a 1114 14,51 15, 08 14,99 14,78
hsa-miR-215 1122 0,71 1,79 0,51 1,38
hsa-miR-183 1127 9,08 9, 63 8,99 8,9
hsa-míR-32 1135 2 2, 49 2,42 0,58
hsa-miR-25 1139 11,34 11,3 12,23 12,01
hsa-miR-218 1143 2,71 3,37 4,61 5, 33
hsa-miR-107 1163 11,68 12,18 11,29 11,31
hsa-miR-145 1168 1,74 2,38 3,47 1,38
hsa-miR-181a 1172 11,9 12,62 11,35 11,15
hsa-miR-125a 1193 12,34 13, 07 11,67 11,84
hsa-miR-222 1198 12,37 12,53 11,77 10,99
hsa-miR-372 1105 -0,58 3,08 2,51 1,08
hsa-miR-142-3p 1253 2,72 3,06 4,59 3, 91
hsa-miR-198 1258 4,2 3, 92 3,32 3, 67
Figure BRPI0807318B1_D0067
hsa-miR-196a 1263 4,78 5,07 3,42 4,04
hsa-miR-16 1272 12,28 12,05 12,98 12,6
hsa-miR-200a 1287 8,29 8,72 7,17 7,44
hsa-miR-18a 1292 6,41 6, 66 7,98 8,5
hsa-miR-101 1297 4,62 4,87 5, 55 6, 01
hsa-miR-195 1311 6, 09 6, 58 6, 03 6, 43
hsa-miR-136 1203 3, 69 3,77 3,52 3, 65
hsa-miR-153 1225 1,71 2,08 0,51 0,58
hsa-miR-31 1227 8,97 9,49 9,6 9,32
u4 n_ o o 11 O Cl 11L.L xD 1 Ο Ί A _L / “3 2,01 3, 66 Q c;q f Q 7 R f !
hsa-miR-147 1278 4,65 2,95 3,47 3, 17
hsa-miR-106b 1282 9, 47 9, 19 10,59 10,38
hsa-miR-212 1288 2,67 1,81 2,89 3,75
hsa-miR-15a 1312 9, 92 10, 12 10,79 11,06
hsa-miR-135b 1331 4,51 4,03 4,42 4,07
hsa-miR-92 1335 12,29 12,63 12,62 12,26
hsa-miR-342 1349 9, 14 9, 62 8,36 8,39
hsa-miR-205 1368 6, 15 5,74 15,25 14,33
hsa-miR-150 1385 4,02 2,87 3,33 1,38
hsa-miR-149 1392 6,23 5, 65 5, 92 4,79
hsa-let-7b 1431 12,73 12,43 13,73 14,06
hsa-miR-370 1445 4,14 3,7 4,37 2,58
hsa-miR-20 6 1449 5,22 4,34 5,58 4,91
hsa-miR-128a 1350 7,54 7,9 8,06 8,01
hsa-miR-197 1487 11,05 9, 76 10,03 9,28
hsa-miR-182 1506 10,11 10,89 10,09 10,41
hsa-miR-553 1750 2,77 2,95 4,05 3, 17
hsa-miR-519d 1766 2,17 3,28 0,51 3,04
hsa-miR-520g 1770 -0,58 1,9 3,51 2,49
hsa-miR-520e 1774 -0,58 1,79 0,51 3,75
hsa-miR-329 1778 2,67 2,08 3,32 2,91
hsa-miR-634 1782 6, 69 2,64 3,32 1,08
hsa-miR-614 1786 1,21 -0,01 1,31 2,91
hsa-miR-223 1467 2,71 2,49 4,17 3,17
hsa-miR-485-5p 1863 4,27 2,49 2,6 0, 58
hsa-miR-369-5p 1867 2 1,49 0,51 0, 58
hsa-miR-575 1871 2,75 2,69 4,36 3,75
hsa-miR-663 1891 5, 41 5 6, 17 5,76
hsa-miR-520f hsamiR-520c 1802 1,61 1,79 2,97 3, 15
hsa-miR-382 1806 4,48 4,14 4,04 3,25
hsa-miR-655 1920 1,21 2,3 2,1 3,17
hsa-miR-545 1932 2,5 2,66 2,92 3,58
hsa-miR-502 1940 3,46 4,16 4,99 3,75
hsa-miR-200a* 1952 5,35 5,86 3,42 2,25
hsa-miR-640 1956 2,24 -0,51 2,51 0, 58
hsa-miR-514 1972 2 2,95 1,01 1,38
hsa-miR-548b 1988 1,92 -0,01 2,51 0,58
hsa-miR-609 1899 2,55 2,58 3, 6 3,54
hsa-miR-377 1929 1,74 -0,01 2,6 0,58
hsa-miR-433 1937 2,71 2,19 3,74 1,08
hsa-miR-500 1957 4,67 4,88 6,34 5, 8
Figure BRPI0807318B1_D0068
hsa-miR-652 1961 6,26 6, 6 5, 52 5,05
hsa-miR-518c 1981 0, 92 1,81 3, 68 1,38
hsa-miR-561 1985 -0,58 2,49 0,51 1,38
hsa-miR-551a 2018 3,77 3,27 4,06 3,91
hsa-miR-525 2034 -0,58 2,06 3,1 0,58
hsa-miR-570 2054 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-617 2062 2 2,49 0,51 2,91
hsa-miR-556 2070 -0, 58 1,81 1,31 1,08
hsa-miR-551b 2074 1,37 1,79 3,97 3,38
hsa-miR-424 1993 5, 87 C. 0/1 A G. A T , 3 a na
hsa-miR-612 1997 2,87 0,29 2,83 0,58
hsa-miR-130a 2005 8,07 8,66 9, 08 9,2
hsa-miR-429 2134 5, 68 5,39 3,89 4,83
hsa-miR-365 2138 8,7 8,73 7,51 7,31
hsa-miR-29a 2154 13,45 13,83 12,21 12,27
hsa-miR-503 2162 5, 44 6,25 1,31 4,39
hsa-miR-624 2166 -0,58 1,99 0,51 3,39
hsa-miR-550 2097 4,34 4,26 3,89 2,58
hsa-miR-581 2227 2,32 1,65 2,31 0,58
hsa-miR-422a 2263 8,33 8,48 9,59 9,25
hsa-miR-449 2267 2,91 2,48 1,31 0,58
hsa-miR-585 2271 3, 58 3,74 4,51 4,12
hsa-miR-92b 2182 7,86 8,04 7,75 7,13
hsa-miR-629 2316 6,12 5, 93 6, 82 7,03
hsa-miR-580 2320 -0,58 1,49 0,51 2,58
hsa-miR-448 2324 1,74 -0,51 2,83 0,58
hsa-miR-592 2332 0,21 2,95 2,83 0,58
hsa-miR-671 2839 4,15 3,98 4,21 0,58
hsa-miR-767-3p 2863 1,42 2,3 2,51 0,58
hsa-miR-608 2279 3,74 1,29 2,47 0,58
hsa-miR-210 2291 9, 13 8,6 8,39 7, 96
hsa-miR-26a 2299 12,6 12,61 12,27 12,73
hsa-miR-4 93-5p 2329 2 2,65 2,17 1,08
hsa-miR-202* 2337 2,55 2,08 3,32 1,88
hsa-miR-454-5p 2840 11,51 11,6 12,87 13,07
hsa-miR-770-5p 2844 2,24 -0,01 1,01 0,58
hsa-miR-769-3p 2865 3,8 3,74 3,01 2,88
hsa-miR-758 2869 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-765 2864 5,35 5, 13 6, 08 5,77
hsa-miR-301 1103 3, 96 4,08 4,04 4,68
hsa-miR-191 1017 9,84 10,87 11,01 10,9
hsa-miR-93 1029 9, 68 9, 58 10, 93 9,75
hsa-let-7f 1033 11,59 12,43 11,79 11,94
hsa-miR-373 1037 3,54 2,4 4,51 3,08
hsa-miR-200b 1042 10,9 11,07 10, 17 9,02
hsa-miR-100 1064 7,25 6, 69 7,81 5,54
hsa-miR-324-3p 1082 5, 67 4,71 5, 64 3, 99
hsa-miR-34b 1096 3,27 3,49 3,83 4,54
hsa-miR-324-5p 1115 3,84 2,29 4,16 4,49
hsa-miR-199a* 1124 1,82 2,24 1,01 4,17
hsa-miR-103 1164 11,27 10, 65 11,3 9, 18
hsa-miR-220 1173 3,67 3,04 4,26 3, 99
Figure BRPI0807318B1_D0069
hsa-miR-151 1199 9,73 9, 47 10,22 10,45
hsa-miR-18 6 1141 4,72 4,93 3,86 4,49
hsa-miR-128b 1153 6,29 6,26 6,7 6,1
hsa-miR-130b 1165 7,72 6, 96 7,99 6, 49
hsa-miR-338 1174 2,42 2,66 2,67 2,91
hsa-miR-199b 1178 1,98 -0,01 3, 67 3,46
hsa-miR-125b 1182 9,34 8,81 9,86 8,11
hsa-miR-122a 1243 5,11 3,49 4,97 4,71
hsa-miR-30d 1251 11,72 11,93 11,32 11,69
hsa-miR-203 12 60 Ί /IO o o <—1 σ 9,56
hsa-let-7c 1268 11,91 12,72 13,09 12,47
hsa-miR-216 1294 2 2,45 2,71 3,38
hsa-miR-15b 1313 11,75 12,27 12, 66 12,77
hsa-miR-192 1205 7,05 8,48 6 6,14
hsa-miR-133a 1215 3,27 3,07 3,82 4,11
hsa-miR-126 1380 6, 42 6, 42 5, 94 7,51
hsa-miR-326 1393 3,32 0,29 0,51 3, 17
hsa-miR-98 1423 6, 58 7,21 6,9 7,33
hsa-let-7g 1432 10,8 11,21 10,01 10,06
hsa-miR-190 1437 3,16 3, 57 4,02 4,29
hsa-miR-18 9 1442 2,59 2,79 2,92 3,38
hsa-miR-137 1339 2,66 3,06 4,36 3,88
hsa-miR-105 1345 2,37 2,48 4,32 3,17
hsa-miR-96 1507 4,66 4,17 4,58 4,58
hsa-miR-519e 1767 -0,08 2,3 2,83 1,08
hsa-miR-520a 1771 1,42 1,99 3,1 0,58
hsa-miR-451 1783 1 -0,51 3,32 2,58
hsa-miR-523 1787 -0, 58 -0, 51 0,51 0, 58
hsa-miR-299-5p 1458 1,74 2,06 2,51 0,58
hsa-miR-95 1482 3,94 3,78 2,71 3,08
hsa-miR-593 1832 4,92 1,08 4,1 2,91
hsa-miR-574 1840 11,34 9, 36 11,12 9, 45
hsa-miR-202 1864 2,59 1,9 2,97 3, 67
hsa-miR-519b 1799 -0,08 3,49 3, 97 3,83
hsa-miR-520d 1803 2,58 3,56 3,89 4,36
hsa-miR-622 1829 1,42 2,66 0,51 1,38
hsa-miR-483 1845 8,06 3,91 7,36 4,34
hsa-miR-383 1865 2,17 1, 95 0,51 1,88
hsa-miR-29b 1869 6, 67 6, 05 5,9 6, 65
hsa-miR-613 1881 2,42 -0,01 1,31 0,58
hsa-miR-453 1904 3,93 3,59 4,76 4,17
hsa-miR-23b 1930 13,2 13,81 12,99 13,61
hsa-miR-501 1942 2,87 2,72 1,31 3,25
hsa-miR-517c 1946 3,01 3,02 4,36 4,39
hsa-miR-625 1897 6, 54 7,16 5, 67 5, 65
hsa-miR-630 1905 2,74 1,49 2, 92 3,49
hsa-miR-644 1913 0,21 2,29 2,51 2,91
hsa-miR-527 2039 3,42 1,87 2,51 1,08
hsa-miR-589 2055 -0,08 -0,51 1,31 0,58
hsa-miR-508 2071 2,81 2,79 3,21 4,04
hsa-miR-449b 2083 2,41 2, 48 3,97 2,58
hsa-miR-603 1990 4,74 2,84 3,76 0,58
Figure BRPI0807318B1_D0070
hsa-miR-200c 2131 4,25 3, 75 13,3 13,7
hsa-miR-29c 2155 2,75 3,24 3, 6 4,2
hsa-miR-411 2167 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-455 2179 2,87 2,52 2,6 0,58
hsa-miR-378 2208 2,24 2,3 3, 6 2,58
hsa-miR-638 2212 7,37 6,34 8,56 7,57
hsa-miR-518 f* 2220 -0,58 -0,51 3, 17 3, 67
hsa-let-7i 2244 12,8 13,03 10,86 10,79
hsa-miR-422b 2264 9, 17 8,72 10,51 10,23
hsa-miR-193b 2268 9, 68 8,44 8,63 7,54
hsa-miR-491 2272 1,74 0,79 2,81 0,58
hsa-miR-484 2191 8,32 7,81 8,29 7,72
hsa-miR-623 2203 1,74 2,45 0,51 0,58
hsa-miR-486 2209 3,86 3, 3 4,2 4,6
hsa-miR-639 2213 1,87 1,49 2,31 1,38
hsa-miR-517a hsamiR-517b 2217 2,11 2,56 3, 87 3,28
hsa-miR-645 2221 3,12 1,29 0,51 2,58
hsa-miR-146b 2237 5,56 5,29 4,21 5, 59
hsa-miR-571 2249 3,33 2,99 4,1 2,91
hsa-miR-191* 2257 2,42 2,95 1,31 0,58
hsa-miR-7 2261 2,44 3,02 2,51 3,54
hsa-miR-647 2269 4,95 4,27 5,5 6, 01
hsa-miR-637 2273 4,65 2,84 4,9 4,17
hsa-miR-30b 2280 9, 94 9, 87 9,86 9, 66
hsa-miR-431 2288 1,74 -0,01 0,51 2,58
hsa-miR-452 2292 4,68 5,15 5, 14 5,85
hsa-miR-361 2296 10,36 11,32 10,53 10,83
hsa-miR-57 6 2314 1,87 -0,51 2,83 0,58
hsa-miR-432 2326 3,74 3, 47 3, 51 2,58
hsa-miR-375 2342 3,42 2,15 0,51 3,75
hsa-miR-766 2841 9, 66 6, 37 8,18 7,59
hsa-miR-7 68-3p 2845 9,89 9, 61 9,2 9, 48
hsa-miR-7 69-5p 2861 4,03 4,07 4,47 3,46
hsa-miR-513 2301 3,8 2,56 3,97 4,38
hsa-miR-362 2017 2,93 4,53 4,88 4,38
hsa-miR-565 2045 7,04 4,89 5,13 6, 45
hsa-miR-30e-3p 2053 8,97 9,4 7,84 7,61
hsa-miR-320 1005 12,75 13,28 13, 11 13, 09
hsa-miR-132 1014 4,94 6, 57 6,22 7,04
hsa-miR-193a 1018 4,56 4,32 3,66 4,58
hsa-miR-22 1022 8,71 8,95 8,69 8,79
hsa-miR-224 1026 6, 69 7,1 6,4 6, 96
hsa-let-7a 1030 13,37 14,07 14,63 14,91
hsa-miR-302d 1034 2,32 2,74 3,76 3,28
hsa-miR-369-3p 1038 2,72 2,38 4,68 3,83
hsa-miR-106a 1006 12,01 12,48 12,09 12,36
hsa-miR-181c 1015 5, 67 6, 09 4,64 4,27
hsa-miR-17-5p 1031 11,57 11,85 11,34 11,83
hsa-miR-302b 1035 -0,08 2,66 3,26 4,04
hsa-miR-19b 1039 10,14 10,07 11,3 11,47
hsa-miR-24 1044 12,91 13,2 13,13 13, 4
hsa-miR-17-3p 1079 4,95 5, 02 4,83 5, 34
hsa-miR-221 1088 13, 67 13,73 12,88 12,76
hsa-miR-335 1146 -0,58 -0, 51 6, 66 7, 68
hsa-miR-199a 1167 2,31 -0,51 0,51 3,17
hsa-miR-126* 1171 3, 12 1, 95 3, 68 3,15
hsa-miR-337 1175 2,22 -0,51 3, 97 2,91
hsa-miR-181a* 1179 5, 67 5, 34 5, 91 5,76
hsa-miR-331 1183 6,46 5,25 5,55 4,95
hsa-miR-340 1187 2,96 2,99 3,86 4,17
hsa-miR-188 1116 3,94 3,31 3,8 6 4,39
hsa-miR-9 1231 2,96 3,25 4 4,53
hsa-miR-34a 1235 6, 95 6,56 7,17 7,33
hsa-miR-30c 1252 13,78 13, 97 12,46 12,24
hsa-miR-19a 1271 5, 93 5,76 8,01 8,36
hsa-miR-371 1276 3, 67 2,19 3,36 3,38
hsa-miR-lOb 1301 6, 91 7,36 7,73 8,03
hsa-miR-21 1315 13, 13 13,2 12,28 12,88
hsa-miR-217 1206 2,53 2,49 0,51 3, 57
hsa-miR-302b* 1210 1,87 2,49 2,51 2,99
hsa-miR-135a 1216 2,41 3, 62 3,47 3,89
hsa-miR-148a 1361 3 1,45 6, 87 7,35
hsa-miR-339 1366 4,85 4,26 5,12 5,2
hsa-miR-187 1381 3, 69 2,4 4,21 3,75
hsa-miR-346 1390 5,77 3,2 4,09 4,87
hsa-miR-146a 1409 9,7 9,88 7,17 7,56
hsa-miR-143 1415 -0,58 -0,51 2,51 3,75
hsa-miR-219 1426 2 1,81 3,32 4,04
hsa-miR-185 1451 8,4 8,73 9,33 9,46
hsa-miR-328 1455 7,15 4,5 4,92 4,33
hsa-miR-196b 1321 4,65 4,44 5,08 5, 68
hsa-miR-204 1489 0, 71 2,49 0, 51 1,38
hsa-miR-133b 1498 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-129 1512 6, 33 6,08 7,2 8,02
hsa-miR-649 1756 3,32 2,93 3, 17 2,17
hsa-miR-522 1776 2,87 3,4 5,74 5,87
hsa-miR-618 1788 2,22 1,65 0, 51 1,08
hsa-miR-30a-5p 1460 12,45 12,55 11,09 11,04
hsa-miR-27a 1485 11,64 11,67 11,97 12,27
hsa-miR-30a-3p 1505 12,22 12,57 10 10,48
hsa-miR-494 1753 4,47 3,87 6, 12 5, 48
hsa-miR-20b 1769 10,41 10,8 10,92 11,2
hsa-miR-521 1785 3, 42 0,49 3,31 3,75
hsa-miR-363 1822 -0,58 -0,51 3,32 1,08
hsa-miR-181b 1830 11,53 11,96 10,84 11,02
hsa-miR-18a* 1850 4,52 2,99 4,97 3,83
hsa-miR-423 1874 8,9 8,85 9, 09 8,46
hsa-miR-595 1805 9, 11 6,55 8,47 6,49
hsa-miR-487b 1817 4,65 4,3 5,22 5,53
hsa-miR-425-3p 1943 4,14 4,02 3,39 3, 96
hsa-miR-594 1951 10,94 10,48 11,55 11,22
hsa-miR-532 1959 5, 87 5,79 6, 62 6,14
hsa-miR-544 1971 1,08 2,49 1,01 2,91
hsa-miR-512-3p 1910 2,56 2,74 4,41 3,83
hsa-miR-526a 2036 -0,58 -0,51 5,78 5, 87
hsa-miR-619 2044 2,01 1,49 1,01 4,08
hsa-miR-578 2048 3,54 2,79 3,17 2,38
hsa-miR-492 2060 -0,08 1,49 2,71 2,67
hsa-miR-590 2064 3,27 3,4 5,51 5,08
hsa-miR-515-3p 2068 1,74 2,88 3,51 1,08
hsa-miR-539 2080 2,74 1,81 2,51 4,28
hsa-miR-497 1995 3,05 3,11 3,26 0,58
hsa-miR-152 2007 7,72 8,44 6, 59 7,2
hsa-miR-181d 2011 8,56 8,9 7,83 7,49
hsa-miR-660 2144 5, 3 5,36 6, 62 CO
hsa-miR-584 2176 10,1 10, 43 7,6 7,99
hsa-miR-511 2109 2,59 -0, 01 2,83 2, 91
hsa-miR-141 2117 -0,58 -0,51 7,91 8,21
hsa-miR-18b 2125 5,18 5, 41 6, 65 6, 98
hsa-miR-582 2141 -0,58 -0,51 4,9 4,87
hsa-miR-58 6 2173 2,11 1,49 2,47 1,08
hsa-miR-505 2184 5,06 5,45 4,16 4,58
hsa-miR-642 2200 4,22 1,15 2,42 0,58
hsa-miR-628 2222 3,59 2,19 2,17 3,83
hsa-miR-425-5p 2234 8,86 9,29 9,01 8,92
hsa-miR-661 2274 2,42 1,81 0,51 0,58
hsa-miR-421 2185 4,06 5, 49 6, 41 6, 43
hsa-miR-27b 2303 10,82 11,2 11,39 11,55
hsa-miR-651 2335 1,71 1,69 3,39 2,91
hsa-miR-557 2339 3,37 2,49 3,51 0,58
hsa-miR-801 2846 5, 97 3,08 4,59 1,88
hsa-miR-7 68-5p 2854 8,68 8,01 8,5 8,38
hsa-miR-454-3p 2858 3 3,37 4,32 3,78
hsa-miR-498 2298 2,87 -0,51 0,51 2,67
hsa-miR-148b 1362 6, 83 6,76 6, 82 6, 69
hsa-miR-194 1416 8,57 8,28 4,64 5,81
hsa-let-7e 1421 7,42 9, 18 8,74 9, 52
hsa-miR-345 1444 4,63 4,62 3, 68 3,17
hsa-miR-155 1476 8,21 9,31 4,32 6,17
hsa-miR-374 1480 1,42 1,79 0,51 1,38
hsa-miR-26b 1484 9,52 10 9, 72 10,43
* Os dados não processados foram subtraídos do background, Log2 transformados e normalizados. A intensidade de cada oligo sonda se baseia na média dos spots duplicados. 0 limite normalizado é calculado baseado em log2(5* desvio padrão do 5 background não spot + sinal de sonda de controle negativo com método trim mean)
TABELA 2
ASSOCIAÇÃO DE miRNA COM EXOSSOMOS PERIFÉRICOS
Figure BRPI0807318B1_D0071
Figure BRPI0807318B1_D0072
TUMOR DERIVADO DE SANGUE COMPARADA COM miRNA ISOLADO DE SEUS
TUMORES CORRESPONDENTES
Associação de microRNA com exossomos periféricos tumor derivado de sangue comparada com microRNA isolado de seus tumores correspondentes.
Elevado em células Igual entre células e exossomos Elevado em exossomos
miR-218, miR-196a, miR-195, miR-15a, miR-519d, miR-382, miR-503, miR-34b, miR-520d, miR-29c, miR-135a, miR-155 miR-296, miR-20a, miR-28, miR-302a, miR-99a, miR99b, miR-lOa, let-7a, let7b, let-7c, let-7d, let7f, let-7g, let-7i, miR138, miR-23a, miR-183, miR-25, miR-107, miR-181a, miR-125a, miR-222, miR198, miR-16, miR-200a, miR-18a, miR-101, miR-136, miR-31, miR-106b, miR-92, miR-342, miR-128a, miR182, miR-663, miR-502, miR-500, miR-652, miR-424, miR-130a, miR-429, miR365, miR-29a, miR-550, miR-422a, miR-585, miR92b, miR-629, miR-671, miR-210, miR-26a, miR-4545p, miR-769-3p, miR-765, miR-301, miR-191, miR-93, miR-200b, miR-100, miR324-5p, miR-220, miR-151, miR-186, miR-128b, miR130b, miR-125b, miR-122a, miR-30d, miR-203, miR-15b, miR-192, miR-133a, miR126, miR-98, miR-190, miR137, miR-105, miR-96, miR95, miR-519b, miR-29b, miR-453, miR-23b, miR517c, miR-625, miR-200c, miR-193a, miR-22, miR-224, miR-369-3p, miR-106a, miR181c, miR-17-5p, miR-19b, miR-24, miR-17-3p, miR221, miR-335, miR-126, miR-181a, miR-331, miR188, miR-9, miR-34a, miR30c, miR-19a, miR-371, miR-lOb, miR-21, miR-148a, miR-339, miR-187, miR-346, miR-146a, miR-185, miR328, miR-196b, miR-129, miR-214, miR-140, miR-147, miR135b, miR-205, miR-150, miR-149, miR-370, miR-206, miR-197, miR-634, miR-485-5p, miR612, miR-608, miR-202, miR-373, miR-324-3p, miR103, miR-593, miR-574, miR-483, miR-527, miR-603, miR-649, miR-18a, miR-595, miR193b, miR-642, miR-557, miR-801, let-7e
Figure BRPI0807318B1_D0073
Elevado em células Igual entre células e exossomos Elevado em exossomos
miR-522, miR-30a-5p, miR27a, miR-30a-3p, miR-494, miR-20b, miR-521, miR181b, miR-423, miR-487b, miR-425-3p, miR-594, miR532, miR-512-3p, miR-526a, miR-578, miR-638, miR422b, miR-484, miR-486, miR-645, miR-146b, miR571, miR-647, miR-637, miR-30b, miR-452, miR-361, miR-432, miR-375, miR-766, miR-768-3p, miR-769-5p, miR-513, miR-362, miR-565, miR-30e-3p, miR-320, miR590, miR-152, miR-181d, miR-660, miR-584, miR-141, miR-18b, miR-582, miR-505, miR-628, miR-425-5p, miR421, miR-27b, miR-768-5p, miR-454-3p, miR-148b, miR194, miR-345, miR-26b
EXEMPLO 4
CORRELAÇÃO DO miRNA EXOSSOMAL COM A
PRESENÇA E O
ESTÁGIO DA DOENÇA
Nossas comparações prévias entre o tumor os exossomos circulantes foram feitas em pacientes em estágio avançado. Para comparar as associações dos miRNAs específicos com a presença da doença nos vários estágios, foram determinadas as intensidades médias dos miRNAs exossomais. A presença dos 8 miRNAs diagnósticos entre pacientes com estágios I, II e III não foi significativamente diferente da maioria desses miRNAs (Figura 6). Foram menores os miR-200c e miR-214 em pacientes no estágio I, comparados com os estágios II e III. Entretanto, em todos os casos, esses miRNAs foram significativamente elevados com relação aos níveis detectados nos exossomos derivados da doença benigna. A fração de RNA pequeno não pôde ser demonstrada nos controles normais, e as tentativas de avaliar a presença dos miRNAs foram negativas .
EXEMPLO 5
ESTABILIDADE DOS PERFIS MIRNA EXOSSOMAIS
Como a medição do miRNA exossomal circulante ficou demonstrada na presente como sendo diagnostica, foi depois verificada a questão técnica de sua estabilidade. Quando foram feitos os perfis miRNA em amostras séricas armazenadas por curtos períodos de tempo a
4°C horas) e comparadas as intensidades (Figura não foram observadas diferenças significativas nos 3 miRNAs diagnósticos analisados.
Quando as amostras séricas foram armazenadas a -70°C por maiores intervalos de tempo, as intensidades desses miRNAs nos microarranjos não foram significativamente diferentes (Figura
7B)
Esses resultados indicam que os níveis desses miRNA exossomais foram estáveis e não se alteraram significativamente com o armazenamento.
DISCUSSÃO DOS EXEMPLOS 1-5
Figure BRPI0807318B1_D0074
O perfilamento da expressão microRNA pode ser utilizado como ferramenta diagnostica de cânceres que atualmente não possuem marcadores moleculares confiáveis, como do câncer de ovário. Apesar de estudos anteriores terem indicado que as assinaturas miRNA poderíam servir como diagnóstico e marcadores prognósticos do câncer de ovário, esses dados se basearam em suas expressões nas amostras de tecidos. Os presentes Exemplos fornecem dados que demonstram pela primeira vez a associação do miRNA com 25 os exossomos circulantes derivados de tumores. Em estudos miRNA podería diferenciar o tecido normal do tecido de câncer anteriores os miRNAs foram demonstrados como sendo expressos de forma aberrante nos cânceres humanos de ovário e a expressão total (lorio et al., 2007) . O estudo de Lu et al. (2005) demonstrou o uso das assinaturas miRNA como um importante avanço no diagnóstico do câncer. Este trabalho indicou que a identificação baseada em miRNA dos cânceres era superior para o diagnóstico correto de câncer desconhecidos primários com relação à classificação mRNA.
Entretanto, antes da matéria presentemente revelada, não era possível utilizar o perfilamento miRNA na ausência de uma massa de biópsia.
Nossa caracterização microscópica eletrônica original dos exossomos indicou que eram ocos (isto é, ausência de estruturas tipo viral) (Taylor & Black, 1986) . Como resultado, nosso grupo, em conjunto com os demais, focalizou os componentes protéicos externos dos exossomos e as consequências biológicas da exposição dos exossomos. Nos presentes Exemplos, entretanto, demonstramos de forma surpreendente, pela primeira vez, a presença de pequenas espécies de
RNA associadas aos exossomos tumorais circulantes
Este pequeno RNA não tem o
18S e 28S associados ao RNA das células. Além disso, análise de microarranjo apresentada na presente demonstrou que pelo menos parte dos pequenos RNA identificados é miRNA.
Os perfis de expressão miRNA de nossas células tumorais ovarianas confirmaram as aberrações miRNA indicadas nos estudos anteriores.
As análises dos exossomos tumorais circulantes e das células tumorais das mesmas pacientes demonstraram que ambos eram positivos para 46% dos miRNAs testados (218/467). Quando as intensidades do miRNA se normalizaram, a maior parte desses miRNAs foi expressa em níveis similares entre as células e os exossomos ou se elevaram dentro dos exossomos (175 não foram significativamente diferentes e 31 foram elevados dentro dos exossomos). Assim, os miRNAs aberrantemente expressos, utilizados para estabelecerem as assinaturas específicas do câncer, aparecem tanto nos compartimentos celulares como exossomais das pacientes com câncer de ovário.
Nossa comparação de miRNAs específicos, anteriormente demonstrada como sendo diagnostica, indicou um alto grau de correlação entre o miRNA do tumor e de seus correspondentes exossomos (variando entre 0,71 e 0,90). Esta alta correlação inclui até miRNAs que apareceram como presentes em maiores proporções nos exossomos, como para o miR-214. A elevação uniforme de miRNAs específicos nos exossomos levou à sugestão que a compartimentalização de miRNAs nos exossomos, em pelo menos alguns miRNAs, é um
Este processo podería ser mediado por componentes, como nucleolin ou núcleofosmina, que são aberrantemente expressos nos exossomos de tumor.
Como esses resultados demonstraram que perfilamento exossomal miRNA pode ser utilizado como um substituto do miRNA tissular e o objetivo da varredura seria a identificação da doença nos estágios iniciais, foi examinada a capacidade de detectar os miRNA exossomais circulantes nos primeiros estágios da doença. As expressões exossomais do miRNA dos miRNAs diagnósticos entre pacientes com cânceres de ovário em estágio inicial como em 25 estágio final não foram significativamente diferentes da maioria desses miRNAs (Figura 6). O miR-200c e o miR-214 foram menores nas pacientes no estágio I, comparados aos estágios II e III;
entretanto, em todos os casos, esses miRNAs foram significativamente elevados em relação aos níveis detectados nos exossomos derivados da doença benigna. A fração de pequeno RNA não pôde ser demonstrada nos controles normais as tentativas para a avaliação da presença dos miRNAs foram negativas. Assim, a ausência de exossomos e/ou de pequenos
RNA exossomais está associada aos indivíduos normais, não portadores de câncer e o tecido normal espelhando o miRNA exossomal parecem estar associados à doença benigna. A similaridade entre os estágios do câncer de ovário é o provável resultado da padronização de quantidades de pequenos RNAs exossomais de partida normalização dos dados de arranjo resultantes.
Apesar desta padronização e normalização, os perfis obtidos com o miRNA exossomal de pacientes com a doença benigna permaneceram distintos.
Esses resultados demonstram que as análises de miRNAs específicos associadas aos exossomos circulantes podem ser aplicadas a todos os estágios do câncer de ovário e que as doenças benigna e maligna parecem distinguíveis com base nos níveis dos 8
Figure BRPI0807318B1_D0075
miRNAs específicos notados na presente.
As assinaturas miRNA de exossomos paralelas às dos perfis de expressão miRNA das células tumorais de origem, indicando que o perfilamento miRNA pode ser feito na ausência de tecido refletem com precisão o perfil do tumor. Também observamos que os exossomos derivados do tumor de pacientes com câncer de pulmão contêm miRNA similar às assinaturas miRNA tumorais correspondentes (ver Exemplo 6) . Os exossomos circulantes derivados do tumor podem ser isolados utilizando marcadores tumorais, como o EpCAM, seguido pela análise de miRNAs associados aos exossomos. Como esta abordagem não é invasiva, já que não precisa de uma massa de biópsia, o perfilamento exossomal miRNA pode ser utilizado como uma ferramenta de varredura para a detecção de muitos cânceres diferentes. Como os miRNAs específicos associados aos tecidos tumorais são identificados como previsores de prognósticos, incluindo resistência terapêutica (como let-7i,
Figure BRPI0807318B1_D0076
miR-16, miR-21 e miR-214) (Yang et al., 2008; tílower et al.,
2008), suas presenças nos exossomos tumorais podem ser avaliadas
para ainda definir a utilidade do perfilamento miRNA exossomal
como indicador prognóstico. 0 uso do perfilamento miRNA exossomal
10 pode estender esta abordagem à varredura de indivíduos
assintomáticos, assim como para o monitoramento da recorrência da doença.
EXEMPLO 6
CORRELAÇÃO DO miRNA COM EXOSSOMOS DE TUMORES DE
PULMÃO DERIVADOS DE SANGUE PERIFÉRICO COMPARADO COM miRNAs
ISOLADOS DE SEUS CORRESPONDENTES TUMORES DE PULMÃO
Nos estudos demonstrando assinaturas miRNA diagnosticas de carcinoma de pulmão de células não
Figure BRPI0807318B1_D0077
pequenas(NSCLC), foram expressos excessivamente miRNAs específicos comparados com o tecido pulmonar normal (miR-17-3p, miR-21, miR106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-203, miR-205, miR210, miR-212 e miR-214). Para correlacionar esses achados com o material derivado dos pacientes, foram isoladas frações miRNA e perfiladas a partir de exossomos tumorais circulantes e do tumor original utilizando métodos revelados acima na presente e mostrados na Figura
8.
Os miRNAs isolados foram marcados na
Labeling. O perfilamento miRNA foi feito em duplicata, utilizando extremidade 3' com
Cy3 utilizando o Kit mirVana miRNA Array microarranjos contendo sondas para 467 miRNAs humanos maduros.
Após a hibridização, os arranjos miRNA foram varridos utilizando um scanner GenePix foram normalizados
4000A array scanner e os dados não processados e analisados utilizando o GeneSpring 7.0
Software (Silicon
Genetics, Redwood
City,
CA) . Foi feita a normalização expressando cada replicata miRNA relativa ao microRNA de controle (Ambion) adicionada a cada amostra, permitindo comparações entre os chips.
As comparações entre os exossomos tumorais derivados da circulação periférica e os tumores indicaram que as assinaturas miRNA não foram significativamente diferentes (Figura abordagem confirmou que pelo menos os 12 miRNAs específicos foram elevados no NSCLC e que as associações desses 12 se espelharam nos exossomos circulantes derivados de tumores.
Assim, a avaliação desses miRNAs pode ser utilizada como um substituto de seus níveis no tumor sendo, portanto, diagnósticos para a presença de câncer, e neste caso particular, do NSCLC.
EXEMPLO 7
Figure BRPI0807318B1_D0078
PERFILAMENTO DO miRNA EXOSSOMAL DERIVADO DA
PLACENTA PARA A CORRELAÇÃO COM RESULTADOS ADVERSOS DE GESTAÇÕES
Para determinar se os exossomos circulantes compreendem miRNA que podem ser diagnósticos para resultados adversos de gestações (ex. nascimento prematuro), foram coletadas amostras séricas de indivíduos grávidas e isoladas as frações 25 exossomais derivadas dos tecidos placentários utilizando anticorpos de fosfatase alcalina antiplacentária ligados com contas magnéticas. Os miRNAs foram isolados e perfilados dos exossomos isolados circulantes derivados da placenta e diretamente do tecido placentário do mesmo indivíduo como revelado acima na presente e mostrado na Figura 8. Brevemente, os miRNAs isolados foram marcados com Cy3 na extremidade 3' utilizando o kit de marcação mirVana miRNA Array. O perfilamento miRNA foi feito em 5 duplicata, utilizando microarranjos contendo sondas para 467 miRNA humanos maduros. Após a hibridização, os arranjos miRNA foram varridos utilizando um scanner GenePix 4000A array scanner e os dados não processados foram normalizados e analisados utilizando o
Figure BRPI0807318B1_D0079
GeneSpring 7.0 Software (Silicon Genetics, Redwood City, CA). Foi feita a normalização expressando cada replicata miRNA relativa ao microRNA de controle (Ambion) adicionada a cada amostra, permitindo comparações entre os chips.
Os resultados são apresentados na Tabela 3. As amostras DT1 são miRNA isolados do tecido placentário de mulheres que levaram a gestação a termo. As amostras DT2 são miRNA isolados dos exossomos derivados da placenta de mulheres que levaram a gestação a termo. As amostras DT3 são miRNA isolados do tecido
Figure BRPI0807318B1_D0080
placentário de mulheres que tiveram parto de pré-termo (parto antes de 32 semanas de gestação). As amostras DT4 são miRNA isolados dos exossomos derivados da placenta de mulheres que tiveram parto de pré-termo. As células escurecidas indicam a presença na amostra do miRNA testado...
Esses dados demonstram que foi obtido o perfilamento miRNA dos exossomos derivados da placenta que esses dados se correlacionam com os perfis miRNA da placenta.
Assim, os perfis miRNA do miRNA isolado dos exossomos produzidos pelas células placentárias pode ser utilizado com propósitos diagnósticos de resultados adversos de gestações.
TABELA 3
DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE miRNA DE EXOSSOMOS
PLACENTÁRIOS PERIFÉRICOS DERIVADOS DE SANGUE E TECIDO PLACENTÁRIO
RELACIONADO
Limite Normalizado : 3,11 3,14 4,26 4,85
TPT95 Normalizado /.; 4,61 5,07 5,53 5,20
DT1 DT2 DT3 DT4
Nome ID 8 66A 866B 866C 866D
hsa-miR-296 1098 oj 5,05 4,33 4,24 4,79
hsa-miR-330 1002 2,98 3,09 4,1 1,08
hsa-miR-20a 1007 11,4 6 11,35 /?.:?l/??l:120 1 11,93
hsa-miR-28 1024 9,4 10,05 9,19 9,23
hsa-miR-302c 1032 -0,58 3,08 3,5 1,08
hsa-miR-302a 1036 2,17 o; 3,66 3,47 4,33
hsa-miR-214 1057 6,58 ·;. 3, 93 6,17 - 2,99
hsa-miR-99b 1063 9,59 10,08 0 9,86 9,16
hsa-miR-99a 1068 3,81 4,53 7,34 0 1 6,46
hsa-miR-lOa 1072 10,1 10,7 6 9, 63 9,55
hsa-let-7d 1085 12,53 13,32 - 12,65 12,5
hsa-miR-138 1089 5,37 1. 5,2 6 4,18 3, 61
hsa-miR-140 1106 3,23 0 4,3 2,01 0,58
hsa-miR-23a 1114 14,51 15,08 14,99 14,78
hsa-miR-215 1122 0,71 1,79 0,51 1,38
hsa-miR-183 1127 9,08 9, 63 '/: 8,99 8,9
hsa-miR-32 1135 2 2,49 2,42 0,58
hsa-miR-25 1139 11,34 <00 11,3 12,23 '112,01
hsa-miR-218 1143 2,71 3,37 4,61 5,33
hsa-miR-107 1163 0011,68 1 12,18 .11,29 1.1 / 31
hsa-miR-145 1168 1,74 2,38 3,47 1,38
hsa-miR-181a 1172 11,9 12,62 11,35 : 11,15
hsa-miR-125a 1193 12,3 4 13,07 11,67 0..1:1,8.4
hsa-miR-222 1198 12,37 12,53 0 11,77 10,99
hsa-miR-372 1105 -0,58 3,08 2,51 1,08
hsa-miR-9* 1232 -0,58 -0,01 0,51 0,58
hsa-miR-142-3p 1253 2,72 3,06 4,59 3, 91
hsa-miR-198 1258 ó 4,2 .13,92 3,32 3, 67
hsa-miR-196a 1263 4,78 0--5:, 07 3, 42 4,04
hsa-miR-16 1272 12,28 12,05 .0 12,981 12,6
hsa-miR-200a 1287 8,29 8,72 7,17 7,44
hsa-miR-18a 1292 : 6,41 6,66. 17,98 8,5
hsa-miR-101 1297 A 4,62 4,87 5,55 6,01
hsa-miR-195 1311 <: 6,09 :.i 6,58 ?.. 6,03 0 6, 43
hsa-miR-136 1203 3,69 3,77 3, 52 3, 65
hsa-miR-153 1225 1,71 2,08 0,51 0,58
hsa-miR-31 1227 8,97 1' 9, 49 : 9,6 0 9,32
hsa-miR-184 1242 -0,08 -0,51 3,1 0,58
hsa-miR-33 1274 2,01 3, 66 3,58 3,75
hsa-miR-147 1278 0 : 4,65 2,95 3,47 3,17
hsa-miR-106b 1282 9,47 0 · 9,19 10,59 -:· 10,38
hsa-miR-212 1288 2,67 1,81 2,89 3,75
hsa-miR-15a 1312 9, 92 10,12 10,79 11,06
hsa-miR-135b 1331 . 4,51 4,03 . 4,42 4,07
hsa-miR-92 1335 12,29 12, 63 12,62 12,26
hsa-miR-342 1349 . 9,14 9, 62 8,36 8,39
hsa-miR-205 1368 6,15 5,74 15,25 14,33
hsa-miR-150 1385 4,02 2,87 3,33 1,38
hsa-miR-149 1392 6,23 5,65 5, 92 4,79
hsa-let-7b 1431 12,73 12,43 13,73 14,06
hsa-miR-370 1445 4,14 3,7 4,37 2,58
hsa-miR-206 1449 5,22 4,34 5,5.8 4,91
hsa-miR-128a 1350 7,54 7,9 8,06 8,01
hsa-miR-197 1487 11,05 9,76 10,03 9,28
hsa-miR-182 1506 10,11 10,89 10,09 10,41
hsa-miR-553 1750 2,77 2,95 4,05 3, 17
hsa-miR-606 1758 -0,58 -0,51 1,01 0,58
hsa-miR-518f 1762 1 -0,01 2,51 0,58
hsa-miR-519d 1766 2,17 3,28 0,51 3,04
hsa-miR-520g 1770 -0,58 1,9 3,51 2,49
hsa-miR-520e 1774 -0,58 1,79 0,51 3,75
hsa-miR-329 1778 2,67 2,08 3,32 2,91
hsa-miR-634 1782 6,69 2,64 3,32 1,08
hsa-miR-614 1786 1,21 -0,01 1,31 2,91
hsa-miR-596 1794 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-182* 1457 -0,08 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-223 1467 2,71 2,49 4,17 3, 17
hsa-miR-512-5p 1843 -0,58 0,79 2,51 0,58
hsa-miR-643 1855 -0,08 -0,51 0,51 2,91
hsa-miR-591 1859 0,21 1,29 0,51 0,58
hsa-miR-4 85-5p 1863 4,27 2,49 2,6 0,58
hsa-miR-369-5p 1867 2 1,49 0,51 0,58
hsa-miR-575 1871 2,75 2,69 4,36 3,75
hsa-miR-626 1879 -0,58 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-650 1883 -0,08 -0,51 3,68 0,58
hsa-miR-663 1891 5,41 6, 17 5,7 6
hsa-miR-520f hsamiR-520c 1802 1, 61 1,79 2,97 3,15
hsa-miR-382 1806 4,48 .? 4,14 4,04 3,25
hsa-miR-656 1810 -0,58 0,29 2,83 0,58
hsa-miR-605 1814 1,08 -0,51 1,31 0,58
hsa-miR-655 1920 1,21 2,3 2,1 3,17
hsa-miR-545 1932 2,5 2,66 2,92 3,58
hsa-miR-502 1940 3,4 6 : 4,16 4,99 3,75
hsa-miR-200a* 1952 5,35 5,86 3, 42 2,25
hsa-miR-640 1956 2,24 -0,51 2,51 0,58
hsa-miR-620 1960 -0,58 -0,51 0,51 1,08
hsa-miR-514 1972 2 2,95 1,01 1,38
hsa-miR-583 1980 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-548b 1988 1,92 -0,01 2,51 0,58
hsa-miR-609 1899 2,55 2,58 3, 6 3,54
hsa-miR-563 1903 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-377 1929 1,74 -0,01 2,6 0,58
hsa-miR-376a 1933 -0,58 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-433 1937 2,71 2,19 3,74 1,08
hsa-miR-500 1957 4,67 4,88 . 6,34 / 5,8
hsa-miR-652 1961 6,26 .6,6 5, 52 5, 05
hsa-miR-384 1969 -0,58 2,3 0,51 0,58
Figure BRPI0807318B1_D0081
Figure BRPI0807318B1_D0082
hsa-miR-548d 1977 -0, 58 2,3 0,51 0,58
hsa-miR-518c 1981 0, 92 1,81 3, 68 1,38
hsa-miR-561 1985 -0, 58 2,49 0,51 1,38
hsa-miR-551a 2018 3, 77 3,27 4,06 3,91
hsa-miR-554 2026 -0, 08 0,29 1,01 1,08
hsa-miR-510 2030 2, 59 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-525 2034 -0, 58 2,06 3,1 0,58
hsa-miR-570 2054 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-617 2062 2 2,49 0,51 2,91
hsa-miR-556 2070 -0, 58 1,81 1,31 1,08
hsa-miR-551b 2074 1,37 1,79 3, 97 3,38
hsa-miR-424 1993 5,87 5,84 4,54 4,79
hsa-miR-612 1997 2, 87 0,29 2,83 0,58
hsa-miR-130a 2005 8,07 / 8,66 9,08 9,2
hsa-miR-569 2110 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-302a* 2114 -0, 58 1,95 0,51 0,58
hsa-miR-4 99 2122 -0, 58 -0,01 1,01 0,58
hsa-miR-429 2134 // 5, 68 5,39 3,89 4,83
hsa-miR-365 2138 8,7 ?;; 8,7 3 7,51 7,31
hsa-miR-598 2150 -0, 58 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-29a 2154 13, 45 13,83 ··. 12,21. 12,27
hsa-miR-503 2162 : / 5,44 6,25 1,31 4,39
hsa-miR-624 2166 -0,58 1,99 0,51 3,39
hsa-miR-409-5p 2089 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-550 2097 / 4,34 4,2 6 3,89 2,58
hsa-miR-627 2101 -0,58 1,49 0,51 0,58
hsa-miR-33b 2105 -0,58 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-581 2227 2,32 1,65 2,31 0,58
hsa-miR-493-3p 2231 2,17 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-610 2239 4,57 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-516-3p 2259 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-422a 2263 8f33 Τ’, 8,48 9,59 9,25
hsa-miR-449 2267 2,91 2,48 1,31 0,58
hsa-miR-585 2271 3, 58 3,74 4,51 4,12
hsa-miR-379 2275 2,22 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-92b 2182 T 7,8 6 8,04 7,75 / 7,13
hsa-miR-629 2316 6,12 5,93 6,82 7,03
hsa-miR-580 2320 -0, 58 1,49 0,51 2,58
hsa-miR-448 2324 1,74 -0,51 2,83 0,58
hsa-miR-659 2328 -0,58 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-592 2332 0,21 2,95 2,83 0,58
hsa-miR-587 2336 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-671 2839 4,15 3,98 4,21 0,58
hsa-miR-802 2851 1,42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-767-3p 2863 1,42 2,3 2,51 0,58
hsa-miR-608 2279 >/ 3,74 1,29 2,47 0,58
hsa-miR-668 2287 1,21 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-210 2291 9, 13 / /8,6. 8,39 7,96
hsa-miR-26a 2299 12,6 12,61 12,27 / 12,73
hsa-miR-493-5p 2329 2 2,65 2,17 1,08
hsa-miR-202* 2337 2,55 2,08 3,32 1,88
hsa-miR-454-5p 2840 11,51 : H/6 12,87 13,07
hsa-miR-770-5p 2844 2,24 -0,01 1,01 0,58
hsa-miR-767-5p 2848 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-7 69-3p 2865 3,8 .<. 3,74 3,01 2,88
Figure BRPI0807318B1_D0083
hsa-miR-758 2869 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-765 2864 5,35 5,13 6,08 . 5,77
hsa-miR-301 1103 3, 96 4,08 4,04 4,68
hsa-miR-191 1017 9,84 10,87 11,01 10,9
hsa-miR-93 1029 9, 68 9,58 10,93 9,75
hsa-let-7f 1033 11,59 12,43 11,79 11,94
hsa-miR-373 1037 3,54 2,4 4,51 3,08
hsa-miR-200b 1042 / 10,9 11,07 10,17 9,02
hsa-miR-100 1064 7,25 6, 69 . 7,81 5,54
hsa-miR-324-3p 1082 5,67 4,71 5, 64 3, 99
hsa-miR-34b 1096 3,27 : . 3,4 9 3,83 4,54
hsa-miR-324-5p 1115 3,84 2,29 4,16 4,49
hsa-miR-199a* 1124 1,82 2,24 1,01 4,17
hsa-miR-103 1164 11,27 10, 65 . 11,3 9,18
hsa-miR-142-5p 1169 -0,58 -0,51 2,31 0,58
hsa-miR-220 1173 3, 67 3,04 4,26 3, 99
hsa-miR-151 1199 \ 9,73 9,47 10,22 10, 45
hsa-miR-18 6 1141 4,72 4,93 3,86 4,49
hsa-miR-128b 1153 6,29 .:·/ 6,2 6 6,1
hsa-miR-130b 1165 7,72 / 6,96 7,99 6,49
hsa-miR-338 1174 2,42 2,66 2,67 2,91
hsa-miR-199b 1178 1,98 -0,01 3, 67 3,46
hsa-miR-125b 1182 9,34 8,81 9,86 8,11
hsa-miR-124a 1213 1,74 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-122a 1243 5, ii . 3,4 9 rl 4,97. 4,71
hsa-miR-30d 1251 . 11,72 11,93 11,32 11, 69.
hsa-miR-203 1260 1,42 2,9 9,1 9,56
hsa-let-7c 1268 11, 91 12,72 13,09 12,47
hsa-miR-216 1294 2 2,45 2,71 3,38
hsa-miR-144 1300 0,71 0,49 1,01 2,91
hsa-miR-15b 1313 11,75 12,27 <12,66 12,77
hsa-miR-192 1205 7,05 8,48 : 1/6:'.:.·' . 6,14
hsa-miR-133a 1215 3,27 3,07 3,82 4,11
hsa-miR-126 1380 6, 42 6,42 5,94 7,51
hsa-miR-326 1393 3, 32 0,29 0,51 3,17
hsa-miR-98 1423 6,58 3- 7,21 6,9 •1:. 7,33
hsa-let-7g 1432 10,8 11,21 . 10,01 i 10,06
hsa-miR-190 1437 3,16 3,57 4,02 4,29
hsa-miR-189 1442 2,59 2,79 2,92 3,38
hsa-miR-137 1339 2,66 3,06 J 4,36 3,88
hsa-miR-105 1345 2,37 2,48 4,32 3,17
hsa-miR-96 1507 4,66 4,17 4,58
hsa-miR-518b 1759 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-519e 1767 -0,08 2,3 2,83 1,08
hsa-miR-520a 1771 1,42 1,99 3,1 0,58
hsa-miR-552 1779 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-451 1783 1 -0,51 3,32 2,58
hsa-miR-523 1787 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-518e 1795 -0,08 -0,51 2,83 0,58
hsa-miR-299-5p 1458 1,74 2,06 2,51 0,58
hsa-miR-95 1482 3,94 3,78 2,71 3,08
hsa-miR-520h 1824 1,74 1,08 0,51 0,58
hsa-miR-593 1832 4,92 1,08 4,1 2,91
hsa-miR-574 1840 :11.,34. 9,36 11,12 9,45
hsa-miR-641 1856 -0,58 -0,51 0,51 0,58
Figure BRPI0807318B1_D0084
Figure BRPI0807318B1_D0085
hsa-miR-504 1860 -0,58 1,81 0,51 0,58
hsa-miR-202 1864 2,59 1,9 2,97 3, 67
hsa-miR-564 1884 0, 42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-604 1892 1,71 -0,51 2,83 0,58
hsa-miR-519b 1799 -0,08 3,49 3,97 3,83
hsa-miR-520d 1803 2,58 3, 56 3,89 4,36
hsa-miR-602 1825 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-622 1829 1,42 2,66 0,51 1,38
hsa-miR-483 1845 8,06 3,91 . 7,36 4,34
hsa-miR-600 1853 0,21 -0,01 0,51 2,38
hsa-miR-631 1861 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-383 1865 2,17 1,95 0,51 1,88
hsa-miR-29b 1869 6,67 6,05 5,9 6, 65
hsa-miR-613 1881 2,42 -0,01 1,31 0,58
hsa-miR-453 1904 ui 3,93 3,59 4,76 4,17
hsa-miR-489 1908 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-23b 1930 13,2 13,81 :: 12,99 13,61
hsa-miR-376b 1934 -0, 58 -0,01 0,51 0,58
hsa-miR-501 1942 2,87 2,72 1,31 3,25
hsa-miR-517c 1946 3, 01 3,02 4,36 4,39
hsa-miR-516-5p 1950 -0, 08 -0,51 1,01 0,58
hsa-miR-548c 1978 -0,58 -0,51 1,01 1,08
hsa-miR-625 1897 6,54 7,16 5, 67 5, 65
hsa-miR-630 1905 2,74 1,49 2,92 3,49
hsa-miR-644 1913 0,21 2,29 2,51 2,91
hsa-miR-488 2015 -0, 58 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-633 2023 1, 42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-527 2039 3, 42 1,87 2,51 1,08
hsa-miR-589 2055 -0,08 -0,51 1,31 0,58
hsa-miR-508 2071 2,81 2,79 3,21 4,04
hsa-miR-566 2075 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-449b 2083 2,41 2,48 3,97 2,58
hsa-miR-603 1990 4,74 2,84 3,76 0,58
hsa-miR-607 2111 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-559 2115 -0,58 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-506 2123 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-200c 2131 4,25 : 3,75 : 13,3 13,7
hsa-miR-2 9c 2155 2,75 3,24 3, 6 4,2
hsa-miR-411 2167 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-381 2171 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-455 2179 2,87 2,52 2,6 0,58
hsa-miR-363* 2086 1,42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-380-5p 2090 0,21 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-567 2094 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-378 2208 2,24 2,3 3, 6 2,58
hsa-miR-638 2212 7,37. 6,34 8,56 .'·· 7,57
hsa-miR-542-5p 2216 1,42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-518f* 2220 -0,58 -0,51 3,17 3, 67
hsa-miR-54 9 2232 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-558 2240 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-let-7i 2244 12,8 13,03 10,86 . 10,79
hsa-miR-560 2256 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-636 2260 -0,58 -0,51 0,51 3,17
hsa-miR-422b 2264 9,1.7 i 8,72 10,51 10,23
hsa-miR-193b 2268 9,6 8 8,44 8,63 7,54
hsa-miR-4 91 2272 1,74 0,79 2,81 0,58
hsa-miR-484 2191 8,32 7,81 8,29 7,72
hsa-miR-662 2199 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-623 2203 1,74 2,45 0,51 0,58
hsa-miR-486 2209 3,86 3,3 4,2 4,6
hsa-miR-639 2213 1,87 1,49 2,31 1,38
hsa-miR-517a hsamiR-517b 2217 2,11 2,56 3,87 3,28
hsa-miR-645 2221 3, 12 1,29 0,51 2,58
hsa-miR-653 2229 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-146b 2237 5,56 5,29 4,21 5,59
hsa-miR-571 2249 3,33 2,99 4,1 2,91
hsa-miR-191* 2257 2,42 2,95 1,31 0,58
hsa-miR-7 2261 2,44 3,02 2,51 3,54
hsa-miR-647 2269 4,95 4,27 ( 5,5 6, 01
hsa-miR-637 2273 . 4,65 2,84 4,9 4,17
hsa-miR-30b 2280 9,94 9,87 9,8 6 9, 66
hsa-miR-4 31 2288 1,74 -0,01 0,51 2,58
hsa-miR-452 2292 4,68 5,15 5,14 5,85
hsa-miR-361 2296 10,36 11,32 10,53 10,8.3
hsa-miR-576 2314 1,87 -0,51 2,83 0,58
hsa-miR-432 2326 3,74 3,47 3,51 2,58
hsa-miR-375 2342 3,42 2,15 0,51 3,75
hsa-miR-7 66 2841 9, 66 6,37 8,18 7,59
hsa-miR-7 68-3p 2845 9,89 9,61 9,2 9,48
hsa-miR-769-5p 2861 4,03 4,07 4,47 3,46
hsa-miR-542-3p 2289 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-513 2301 3,8 2,56 3,97 4,38
hsa-miR-362 2017 2,93 4,53 4,88 4,38
hsa-miR-325 2025 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-520a* 2033 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-517* 2037 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-565 2045 7,04 4,89 5,13 6,45
hsa-miR-526b 2049 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-30e-3p 2053 8,97 9,4 7,8 4 7,61
hsa-miR-601 2088 2,87 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-519a 2104 -0, 58 1,49 0,51 1,08
hsa-miR-632 2108 -0, 08 2,3 0,51 0,58
hsa-miR-320 1005 12, 75 13,28 13,11 13, 09
hsa-miR-132 1014 4,94 6, 57 6,22 7,04
hsa-miR-193a 1018 4,56 4,32 3, 66 4,58
hsa-miR-22 1022 8,71 8,95 8,69 8,79
hsa-miR-224 1026 6, 69 7,1 6,4 6,96
hsa-let-7a 1030 13, 37 14,07 14,63 14,91
hsa-miR-302d 1034 2, 32 2,74 3,76 3,28
hsa-miR-369-3p 1038 2,72 2,38 4,68 3,83
hsa-miR-154* 1047 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-368 1059 1,42 0,49 0,51 0,58
hsa-miR-373* 1078 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-34c 1095 1,42 1,49 0,51 2,99
hsa-miR-154 1101 1,61 -0,51 1,31 2,75
hsa-miR-106a 1006 12,01 12,48 12,09 12,36
hsa-miR-181c 1015 '·: 5,67 6,09 4,64 4,27
hsa-miR-17-5p 1031 11,57 11,85 11,34 11,83
hsa-miR-302b 1035 -0,08 2,66 3,26 4,04
Figure BRPI0807318B1_D0086
hsa-miR-19b 1039 10,14 10,07 11,3 11,47
hsa-miR-24 1044 12,91 13,2 13,13 13,4
hsa-miR-367 1052 2,17 -0,01 1,01 0,58
hsa-miR-17-3p 1079 4,95 5,02 4,83 5,34
hsa-miR-221 1088 13, 67 13,73 12,88 12,7 6
hsa-miR-335 1146 -0,58 -0,51 6, 66 7,68
hsa-miR-323 1154 -0,58 1,81 0, 51 0,58
hsa-miR-199a 1167 2,31 -0,51 0,51 3, 17
hsa-miR-12 6* 1171 3,12 1,95 3,68 3,15
hsa-miR-337 1175 2,22 -0, 51 3, 97 2,91
hsa-miR-181a* 1179 • 5,67 5,34 5,91 5,76
hsa-miR-331 1183 6,46 5,25 5,55 4,95
hsa-miR-340 1187 2,96 2,99 3,86 4,17
hsa-miR-208 1108 1,42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-188 1116 3,94 3,31 3,86 4,39
hsa-miR-9 1231 2,96 3,25 4 4,53
hsa-miR-34a 1235 . 6,95 6,56 7,17 7,33
hsa-miR-30c 1252 13,78 13,97 12,46 12,24
hsa-miR-19a 1271 \ 5, 93 5,7 6 8,01 8,36
hsa-miR-371 1276 3,67 2,19 3,36 3,38
hsa-miR-lOb 1301 6,91 7,36 7,73 8,03
hsa-miR-21 1315 13, 13 13,2 12,28 12,88
hsa-miR-217 1206 2,53 2,49 0,51 3,57
hsa-miR-302b* 1210 1,87 2,49 2,51 2,99
hsa-miR-135a 1216 2,41 3, 62 3,47 3,89
hsa-miR-148a 1361 3 1,45 6, 87 7,35
hsa-miR-339 1366 4,85 4,26 5,12 5,2
hsa-miR-187 1381 3,69 2,4 4,21 3,75
hsa-miR-34 6 1390 5,77 3,2 4,09 4,87
hsa-miR-146a 1409 9,7 9,88 7,17 . 7,56
hsa-miR-143 1415 -0,58 -0,51 2,51 3,75
hsa-miR-219 1426 2 1,81 3,32 4,04
hsa-miR-185 1451 00 8,73 9, 33 9,46
hsa-miR-328 1455 7,15 4,5 4,92 4,33
hsa-miR-196b 1321 4,65 4,44 5, 08 5, 68
hsa-miR-204 1489 0,71 2,49 0,51 1,38
hsa-miR-133b 1498 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-129 1512 6,33 6,08 7,2 8,02
hsa-miR-649 1756 3,32 2,93 3, 17 2,17
hsa-miR-518a 1760 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-562 1764 -0,58 -0,51 0,51 1,08
hsa-miR-52 6b* 1772 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-522 1776 2,87 3,4 5,74 5, 87
hsa-miR-4 90 1784 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-618 1788 2,22 1,65 0,51 1,08
hsa-miR-525* 1796 -0,58 1,49 1,31 0,58
hsa-miR-30a-5p 1460 12,45 12,55 11,09 11,04
hsa-miR-302c* 1474 0,42 -0,01 0,51 0,58
hsa-miR-27a 1485 11,64 11,67 11,97 12,27
hsa-miR-30a-3p 1505 12,22 12,57 10 10,48
hsa-miR-4 94 1753 : 4,47 3,87 6,12 5, 48
hsa-miR-518d 1761 -0,58 2,08 0,51 0,58
hsa-miR-519c 1765 -0,08 0,29 0,51 3,75
hsa-miR-20b 1769 10,41 10,8 10,92 11,2 .
hsa-miR-520b 1773 -0,08 1,49 1,01 2,58
Figure BRPI0807318B1_D0087
hsa-miR-495 1777 -0,58 -0,51 0,51 2, 91
hsa-miR-521 1785 3,42 0,49 3,31 3,75
hsa-miR-64 6 1793 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-648 1804 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-410 1808 1,42 -0,51 0,51 1,08
hsa-miR-487a 1812 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-409-3p 1820 -0,58 -0,51 1,01 0,58
hsa-miR-363 1822 -0,58 -0,51 3,32 1,08
hsa-miR-181 b 1830 11,53 11,96 10,84 11,02
hsa-miR-616 1842 2,22 -0,51 0,51 2,49
hsa-miR-18a* 1850 4,52 2,99 4,97 3,83
hsa-miR-635 1854 -0, 58 -0, 51 1,31 0,58
hsa-miR-423 1874 8,9 8,85 9,09 8,46
hsa-miR-611 1882 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-524 1797 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-595 1805 9,11 ··: 6,55 8,47 6, 49
hsa-miR-487b 1817 4,65 4,3 5,22 5,53
hsa-miR-425-3p 1943 4,14 : 4,02 3,39 3,96
hsa-miR-594 1951 10, 94 10,48 11,55 11,22
hsa-miR-532 1959 5, 87 5,7 9 6,62 6,14
hsa-miR-568 1963 -0,58 -0,51 0,51 1,38
hsa-miR-496 1967 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-544 1971 1,08 2,49 1,01 2,91
hsa-miR-509 1975 -0,08 -0,51 0,51 3,75
hsa-miR-548a 1979 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-658 1894 -0,58 -0, 51 1,01 0, 58
hsa-miR-555 1898 1,42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-657 1902 -0,58 -0,51 0,51 1,38
hsa-miR-512-3p 1910 2,56 2,74 4,41 3,83
hsa-miR-524* 2024 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-515-5p 2032 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-526a 2036 -0,58 -0,51 5,78 5, 87
hsa-miR-619 2044 2,01 1,49 1,01 4,08
hsa-miR-578 2048 3, 54 2,79 3,17 2,38
hsa-miR-573 2056 -0,58 2,08 0,51 0,58
hsa-miR-492 2060 -0,08 1,49 2,71 2,67
hsa-miR-590 2064 3,27 3,4 5,51 5, 08
hsa-miR-515-3p 2068 1,74 2,88 3, 51 1,08
hsa-miR-621 2076 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-539 2080 2, 74 1,81 2,51 4,28
hsa-miR-497 1995 3,05 3,11 3,26 0,58
hsa-miR-152 2007 7,72 8,44 6,59 7,2
hsa-miR-181d 2011 8,56 8,9 7,83 7,49
hsa-miR-660 2144 5,3 5,36 6,62 6,8
hsa-miR-526c 2152 -0,58 -0,51 2,42 0,58
hsa-miR-584 2176 10,1 10,43 7, 6 7,99
hsa-miR-299-3p 2180 1,42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-376a* 2087 -0,58 -0,51 0, 51 0, 58
hsa-miR-597 2107 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-511 2109 2,59 -0,01 2,83 2,91
hsa-miR-599 2113 -0,58 -0,51 0, 51 0,58
hsa-miR-141 2117 -0,58 -0,51 7,91 8,21
hsa-miR-18b 2125 5,18 5,41 6,65 6,98
hsa-miR-582 2141 -0,58 -0,51 4,9. 4,87
hsa-miR-577 2153 -0, 58 -0,51 0,51 0, 58
Figure BRPI0807318B1_D0088
hsa-miR-586 2173 2,11 1,49 2,47 1,08
hsa-miR-380-3p 2177 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-505 2184 5,06 5, 45 4,16 4,58
hsa-miR-485-3p 2196 3,74 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-642 2200 4,22 1,15 2,42 0,58
hsa-miR-615 2204 3, 94 -0,01 0,51 0,58
hsa-miR-572 2206 -0,58 -0,51 0,51 0, 58
hsa-miR-520d* 2218 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-628 2222 3,59 2,19 2,17 3,83
hsa-miR-518c* 2226 0,21 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-42 5-5p 2234 : 8,86 9,29 9,01 8,92
hsa-miR-432* 2266 -0,58 -0,51 0, 51 0, 58
hsa-miR-661 2274 2,42 1,81 0,51 0,58
hsa-miR-421 2185 .·.· 4,06 ... 5,49 . 6,41 6,43
hsa-miR-452* 2193 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-27b 2303 10,82 . 11,2 . 11,39 11,55
hsa-miR-412 2307 2,59 -0,01 0,51 2,58
hsa-miR-579 2311 -0,58 -0,01 0,51 0,58
hsa-miR-519e* 2315 -0,58 -0,51 0, 51 0,58
hsa-miR-588 2327 1,42 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-651 2335 1,71 1,69 3,39 2,91
hsa-miR-557 2339 3,37. 2,49 3, 51 0, 58
hsa-miR-507 2343 -0,58 0,29 0,51 3,39
hsa-miR-801 2846 5, 97 3,08 / 4,59 1,88
hsa-miR-768-5p 2854 8,68 8,01 8,5 8,38
hsa-miR-454-3p 2858 3 3,37 4,32 3,78
hsa-miR-654 2278 2,22 -0, 51 1,31 0,58
hsa-miR-498 2298 2,87 -0,51 0,51 2,67
hsa-miR-148b 1362 6,83 6,7.6 6, 82 6, 69
hsa-miR-211 1367 3,56 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-127 1377 1,8 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-139 1384 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-194 1416 8,57 8,28 4,64 5,81
hsa-let-7e 1421 7,42 9,18 8,74 9,52
hsa-miR-345 1444 ' 4,63 4,62 3, 68 3,17
hsa-miR-1 1448 -0,58 0,29 0,51 0,58
hsa-miR-30e-5p 1461 -0, 58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-134 1470 -0,58 -0,51 0,51 0,58
hsa-miR-155 1476 8,21 9,31 4,32 6,17
hsa-miR-374 1480 1,42 1,79 0,51 1,38
hsa-miR-26b 1484 9,52 10 9,72 10,43
* Os dados não processados foram subtraídos do background, Log2 transformados e normalizados.
A intensidade de cada oligo sonda se baseia na média dos spots duplicados.
São mostrados os dados de todas as 4 67 sondas oligo humanas.
O limite normalizado é calculado baseado em log2(5* desvio padrão do background não spot + sinal de sonda de controle negativo com método trim mean).
limite normalizado é calculado baseado no 952 percentil do sinal de sonda de controle negativo.
Um total de 236 Sondas Humanas está Acima do
Limite em pelo menos 1 amostra.
Um total de 158 Sondas Humanas está Acima TPT95 em pelo menos 1 amostra.
Figure BRPI0807318B1_D0089
Os Exemplos apresentados demonstram a aplicação com sucesso de um ensaio diagnóstico de câncer e de resultados adversos de gestações tendo especificidade, sensibilidade e valores preditivos positivos bastante aperfeiçoados com relação aos diagnósticos atualmente disponíveis, proporcionando também outras informações sobre o estágio, classe e resposta terapêutica que não disponíveis em qualquer outro formato de ensaio.
REFERÊNCIAS
Andre F,
Schartz NE, Movassagh M, et al.
Malignant effusions and immunogenic tumour-derived exosornes.
Lancet 2002; 360: 295-305.
Bard MP,
Hegmans JP,
Hemmes A, et al.
Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions.
Am J Respir Cell Mol Biol 2004;31:114-21
Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004;116:281-97.
Berek
JS, Schultes BC Nicodemus CF.
Biologic and immunologic therapies for ovarian câncer. J
Clin Oncol
2003;21(S10):168-74.
Calin GA, Croce CM. MicroRNA-cancer connection:
the beginning of a new tale. Câncer Res 2006a;66:7390-94.
Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human câncers. Nature Rev Câncer 2006b;6:857-66.
Choi DS, Lee JM, Park GW, et al. Proteomic analysis of microvesicles derived from human colorectal câncer cells. J Proteome Res 2007;6:4646-55.
De Cecco L, Marchionni
L, Gariboldi M, Reid JF,
Lagonigro
MS, Caramuta S, et al. Gene expression profiling of
Figure BRPI0807318B1_D0090
advanced ovarian câncer: Characteristization of a molecular signature involving fibroblast growth factor
2. Oncogene
2004;23:8171-83.
Esquela-Kerscher
A, Slack
FJ.
Oncomirs microRNAs with a role in câncer. Nature Rev Câncer 2006;6:259-69.
Heijnen HFG, Schiel AE, Fijnheer R, Geuze HJ,
Sixma JJ. Activation platelets release two types of membrane vesicles: Microvesicles by surface shedding and exosomes derived from exocytosis of multivesicular bodies and alpha granules. Blood
1999;94:3791-9.
Figure BRPI0807318B1_D0091
lorio MV, Visone R, Di Leva G, Donati V, Petrocca
F, Casalini P, et al. MicroRNA signatures in human ovarian câncer.
Câncer Res 2007;67:8699-707.
J.M. Escola JM, Kleijmeer MJ, Stoorvogel W,
Griffith JM, Yoshie 0, Geuze HJ. Selective enrichment of tetraspan proteins on the internai vesicles of multivesicular endosomes and 25 on exosomes secreted by human B-lymphocytes. J Biol Chem 1998;
273: 20121-7.
Koga K, Matsumoto K, Akiyoshi T, Kubo M, et al.
Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes, Anticancer Res 2005;25: 3703-7.
Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 2005;435: 834-8.
Mears R, Craven RA, Hanrahan S, et al. Proteomic analysis of melanoma-derived exosomes by two—dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2004;4:4019-31.
Figure BRPI0807318B1_D0092
Menon U, Jacobs IJ. Recent developments in ovarian câncer screening. Curr Opin Obstet Gynecol 2000;12:39-42.
Miska EA. How microRNAs control cell division, differentiation, and death. Curr Opi. Genet Dev 2005;5:563-8.
Olver C, Vidal M, Proteomic analysis of secreted exosomes.
Subcell Biochem. 2007;43:99-131.
Paul E. Blower PE, Chung
JH, Verducci JS, Lin S,
Park JK,
Dai Z, Liu CG, Schmittgen TD,
Reinhold WC, Croce CM,
Weinstein
JN, Sadee W.
MicroRNAs modulate the chemosensitivity of tumor cells. Mol Câncer
Figure BRPI0807318B1_D0093
Therap 2008; 7: 1-9.
Raposo
G, Tenza D, Mecheri S, Peronet R, Bonnerot
C, Desaymard C. Accumulation of major histocompatibility complex class II molecules in mast cell secretory granules and their release upon degranulation. Mol Biol Cell 1997;8:2631-45.
Ratajczak J, Miekus K, Kucia M, et al. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic 25 progenitors: Evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery. Leukemia 2006;20: 847-56.
Sabapatha A, Gercel-Taylor C, Taylor DD. Specific isolation of placental-derived exosomes from the circulation of pregnant women and their immunoregulatory consequences. Am J.
Reprod Immunol 2006,56:345-55.
Sankaranarayanan R, Ferlay J. Worldwide burden of gynaecological câncer: the size of the problem. Best Pract Res 5 Clin Obstet & Gynaecol 2006;20:207-25.
Taylor DD, Doellgast GJ. Quantitation of □eroxidise-antibody binding to membrane fragments using column chromatography. Anal Biochem
1979;98:53-9.
Taylor DD,
Homesley HD,
Doellgast GJ. Binding of specific peroxidise-labeled antibody to placental-type alkaline phosphatase on tumor-derived membrane fragments. Câncer Res
1980:40:4964-69.
Taylor DD, Black PH. Shedding of plasma membrane fragments: Neoplastic and developmental importance. In:
Developmental Biology, (M. Steinberg, ed.) vol. 3, 1986:33-57.
Taylor DD, Gercel-Taylor C. Tumour-derived exosomes as mediates of T-cell signaling defects. Brit J Câncer
Figure BRPI0807318B1_D0094
2005;92:305-11.
Taylor, D.D., Bohler, H.C., Gercel-Taylor, C.
Pregnancy-linked suppression of TcR signaling pathways by a circulating factor absent in recurrent spontaneous pregnancy loss. Molecular Immunology 2006, 43: 1872-80.
Valadi, H, Ekstrom K, Bossius A, Sjostrand M, Lee
JJ, Lotvall JO. Exosome-mediated transfer of mRNA and microRNA is a novel mechanism of genetic exchange. Nature Cell. Biol. 2007;
9:652-9.
Valenti R, Huber V, Filipazzi P, Pilla L, Sovena
G, Villa A et al. Human tumor-released microvesicles promote the differentiation of myeloid cells with transforming growth factorbeta-mediated suppressive activity on T lymphocytes. Câncer Res
2006; 66: 9290-8.
Yang H, Kong W, He L, Zhao JJ, 0'Donnell JD, Wang
J, Wenham WM, Coppola D, Kruk PA, Nicosia SV, Cheng JQ. MicroRNA expression profiling in human ovarian câncer: miK-214 induces cell survival and cisplatin resistance by targeting PTEN. Câncer Res
2008; 68: 425-33.
Zhang
L, Huang J,
Yang N, et al. microRNAs exhibit high frequency genomic alterations in human câncer. Proc
Natl Acad Sei USA 2006;103:9136-41.
Figure BRPI0807318B1_D0095
1/4

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. MÉTODO, caracterizado por determinar uma quantidade de um ou mais microRNAs (miRNAs) em um ou mais exossomos isolados de uma amostra, comparando a quantidade de um ou mais miRNAs com um ou mais níveis de controle de miRNA, e determinando uma característica da amostra a partir do comparação da quantidade de uma ou mais miRNAs para um ou mais níveis de controle de miRNA.
  2. 2. MÉTODO, caracterizado por determinar uma quantidade de um ou mais miRNAs em um ou mais exossomos isolados de uma série de amostras, comparando a quantidade de um ou mais miRNAs na série de amostras, e determinando uma característica das amostras da comparação do quantidade de um ou mais miRNAs na série.
  3. 3. MÉTODO, de acordo com as reivindicações
    1 e 2, caracterizado por a amostra ou amostras compreender amostra(s) cancerígenas ou amostra(s) de distúrbios adversos da gravidez. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3,
    caracterizado por o câncer ser selecionado de um grupo consistindo câncer ovariano, câncer cervical, câncer de mama, câncer endometrial, câncer de colo, câncer de próstata, câncer de pulmão, melanoma e câncer pancreático.
    5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o distúrbio adverso da gravidez ser selecionado de um grupo consistindo ruptura prematura das membranas, pré-eclampsia, nascimento prematuro, restrição no
    crescimento intrauterino, e perda recorrente da gestação.
    Petição 870180124168, de 31/08/2018, pág. 12/29
    2/4
    6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o exossomo ser isolado em um processo compreendendo cromotografia por exclusão.
    7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o isolamento dos exossomos adicionalmente compreender a centrifugação de uma fração cromotográfica compreendendo os exossomos.
    8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracteri zado por a fração cromotográfica ser uma fração de volume vazio. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8,
    caracterizado por os exossomos serem derivados de câncer e os exossomos são separados de exossomos não-derivados de câncer através da captura imunoabsorvente utilizando um anticorpo antígeno anti-cancer.
    10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o anticorpo antígeno anti-cancer ser um anticorpo (anti-EpCAM) de molécula de adesão celular antiepitelial.
    11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a determinação da quantidade de um ou mais miRNAs compreender a marcação de um ou mais miRNAs.
    12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a quantidade de um ou mais miRNAs compreender a captura de um ou mais miRNAs com um ou mais sondas polinucleotídeas em que cada uma liga seletivamente o um ou mais miRNAs.
    Petição 870180124168, de 31/08/2018, pág. 13/29
    3/4
    13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a quantidade de um ou mais miRNAs compreender o uso de uma reação em cadeia de polimerase em tempo real para quantificar a quantidade do um ou mais miRNAs.
    14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a quantidade de um ou mais miRNAs compreender a determinação da quantidade total de miRNAs nos exossomos.
    15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o um ou mais miRNAs serem selecionados do grupo
    que consiste em, miR-218, miR-196a, miR-195, miR-15a, miR-519d, miR-382, miR-503, miR-3 4b, miR-520d, miR-29c, miR-135a, miR-155, miR-296, miR-20a, miR-28, miR-3 02a, miR-99a, miR-99b, miR-lOa, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let- 7f, let-7g, let-7i, miR-13 8, miR-23a, miR-183, miR-25, miR-107, miR-181a, miR-125a, miR-222, miR-198, miR-16, miR-200a( , miR-18a, miR-101, miR-136 ( , miR-31, miR-106b , miR-92, miR-342, miR-128a, miR-182, miR-663, miR-502, miR-50 0, miR-652, miR-424, miR-130a, miR-42 9, miR-365, miR-29a, miR-550, miR-422a , miR-585 , miR-92b, miR-629, miR-671, miR-210, miR-26a, miR-454- 5p, miR-769-3p, miR- -765, miR- 301, miR- 191, miR-
    93, miR-200b, miR-100, miR-324-5p, miR-220, miR-151, miR-186, miR-128b, miR-130b, miR-125b, miR-122a, miR-30d, miR-203, miR15b, miR-192, miR-133a, miR-126, miR-98, miR-190, miR-137, miR105, miR-96, miR-95, miR-519b, miR-29b, miR-453, miR-23b, miR517c, miR-625, miR-200c, miR-193a, miR-22, miR-224, miR-369-3p, miR-106a, miR-181c, miR-17-5p, miR-19b, miR-24, miR-17-3p, miR221, miR-335, miR-126, miR-181a, miR-331, miR-188, miR-9, miR34a, miR-30c, miR-19a, miR-371, miR-lOb, miR-21, miR-148a, miR339, miR-187, miR-346, miR-146a, miR-185, miR-328, miR-196b, miR
    Petição 870180124168, de 31/08/2018, pág. 14/29
  4. 4/4
    129, miR-522, miR-30a-5p, miR-27a, miR-30a-3p, miR-494, miR-20b, miR-521, miR-181b, miR-423, miR-487b, miR-425-3p, miR-594, miR532, miR-512-3p, miR-526a, miR-578, miR-638, miR-422b, miR-484, miR-486, miR-645, miR-146b, miR-571, miR-647, miR-637, miR-30b, miR-452, miR-361, miR-432, miR-375, miR-766, miR-768-3p, miR-7695p, miR-513, miR-362, miR-565, miR-30e-3p, miR-320, miR-590, miR152, miR-181d, miR-660, miR-584, miR-141, miR-18b, miR-582, miR505, miR-628, miR-425-5p, miR-421, miR-27b, miR-768-5p, miR-4543p, miR-148b, miR-194, miR-345, miR-26b, miR-214, miR-140, miR147, miR-135b, miR-205, miR-150, miR-149, miR-370, miR-206, miR197, miR-634, miR-485-5p, miR-612, miR-608, miR-202, miR-373, miR-324-3p, miR-103, miR-593, miR-574, miR-483, miR-527, miR-603, miR-649, miR-18a, miR-595, miR-193b, miR-642, miR-557, miR-801 e let-7e.
    16 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou
    2, caracterizado por o um ou mais miRNAs serem selecionados de um grupo consistindo miR-21, miR141, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-205, e miR-214.
    17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as amostras serem coletadas ao longo de um curso de tempo. 18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela característica do câncer ser determinada pela
    mudança na quantidade do um ou mais miRNAs na série de amostras.
    19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela característica do câncer compreender o tipo, o grau, e/ou o estágio do câncer.
    Petição 870180124168, de 31/08/2018, pág. 15/29
    1/9
    1. Aplicar um soro à coluna de filtração gel Sepharose 2B
    4. Hibridizar a sonda
    2. Coletar as frações de volume vazio que contêm exossomos marcada com microarranjo de
  5. 5. Analisar os dados e correlacionar çom dados histoclínicos
    3. Isolar os exossomos RNA circulantes obtidos do tumor, sintetizar a sonda cDNA para hibridização por microarranjo.
BRPI0807318A 2007-07-25 2008-07-25 "microrna associado a exossomos como marcador diagnóstico" BRPI0807318B8 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95181207P 2007-07-25 2007-07-25
US5043808P 2008-05-05 2008-05-05
PCT/US2008/071235 WO2009015357A1 (en) 2007-07-25 2008-07-25 Exosome-associated microrna as a diagnostic marker

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0807318A2 BRPI0807318A2 (pt) 2015-03-24
BRPI0807318B1 true BRPI0807318B1 (pt) 2018-11-13
BRPI0807318B8 BRPI0807318B8 (pt) 2021-07-27

Family

ID=40281854

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0807318A BRPI0807318B8 (pt) 2007-07-25 2008-07-25 "microrna associado a exossomos como marcador diagnóstico"

Country Status (11)

Country Link
US (5) US8216784B2 (pt)
EP (3) EP2613149B1 (pt)
JP (3) JP5156829B2 (pt)
CN (2) CN103276062A (pt)
AU (1) AU2008279016B2 (pt)
BR (1) BRPI0807318B8 (pt)
CA (1) CA2676113C (pt)
ES (1) ES2420973T3 (pt)
GB (1) GB2459228B (pt)
IL (3) IL200028A (pt)
WO (1) WO2009015357A1 (pt)

Families Citing this family (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8021847B2 (en) 2004-06-02 2011-09-20 Proxy Life Science Holdings, Inc. Microvesicle-based compositions and methods
CA2609260A1 (en) * 2004-06-02 2005-12-22 Sourcepharm, Inc. Rna-containing microvesicles and methods therefor
ES2526787T3 (es) 2006-01-05 2015-01-15 The Ohio State University Research Foundation Métodos basados en microARN para el diagnóstico de cánceres de colon, páncreas y estómago
EP3517151B1 (en) * 2006-03-09 2021-04-21 Aethlon Medical, Inc. Extracorporeal removal of microvesicular particles
EP2371971B1 (en) 2006-03-20 2013-11-27 The Ohio State University Research Foundation Microrna fingerprints during human megakaryocytopoiesis
WO2008136971A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-13 The Ohio State University Research Foundation Methods for differentiating pancreatic cancer from normal pancreatic function and/or chronic pancreatitis
EP2613149B1 (en) * 2007-07-25 2014-09-17 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microRNA as a diagnostic marker
EP2650383A1 (en) 2007-08-03 2013-10-16 The Ohio State University Research Foundation Ultraconserved regions encoding ncRNAs
EP2696203A3 (en) 2007-08-16 2014-05-28 The Royal Institution for the Advancement of Learning/McGill University Tumor cell-derived microvesicles
US20100255514A1 (en) * 2007-08-16 2010-10-07 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Tumor cell-derived microvesicles
AU2008296022B2 (en) * 2007-09-06 2014-01-23 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA signatures in human ovarian cancer
ES2419129T3 (es) * 2007-09-14 2013-08-19 The Ohio State University Research Foundation Expresión de miARN en microvesículas de sangre periférica humana y usos del mismo
CN103937876B (zh) * 2007-10-11 2016-08-17 俄亥俄州立大学研究基金会 用于诊断和治疗食管腺癌的方法和组合物
CN101424640B (zh) * 2007-11-02 2012-07-25 江苏命码生物科技有限公司 血清中微小核糖核酸的检测方法和用于检测的试剂盒、生物芯片及其制作和应用方法
EP2234483A4 (en) 2008-01-27 2011-04-27 Rosetta Genomics Ltd METHOD AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSIS OF PREGNANCY COMPLICATIONS
SG10201609507TA (en) * 2008-02-01 2017-01-27 Gen Hospital Corp Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions
AU2009219190A1 (en) * 2008-02-28 2009-09-03 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of gastric cancer
EP2294196A1 (en) * 2008-06-06 2011-03-16 Centre National de la Recherche Scientifique - CNRS Use of endo-lysosomal system and secreted vesicles (exosome-like) in treatments and diagnostics based on small rna and experimental study of small rna
US9410956B1 (en) * 2008-08-01 2016-08-09 University Of South Florida Micro-RNA profiling in ovarian cancer
US9487837B2 (en) * 2008-10-06 2016-11-08 Morehouse School Of Medicine Exosome-mediated diagnosis of hepatitis virus infections and diseases
JP2012507300A (ja) 2008-10-30 2012-03-29 カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス Ｒｎａパターンを評価する方法
CN107254538A (zh) * 2008-11-12 2017-10-17 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 使用外来体来确定表现型的方法和系统
CN101475984A (zh) * 2008-12-15 2009-07-08 江苏命码生物科技有限公司 一种非小细胞肺癌检测标记物及其检测方法、相关生物芯片和试剂盒
JP2012514994A (ja) * 2009-01-19 2012-07-05 システミック・スコットランド・リミテッド 非コードｒｎａ発現アッセイを用いた方法
CN102421916A (zh) * 2009-04-21 2012-04-18 日本电气株式会社 用于评估癌症的方法
US20120077263A1 (en) * 2009-06-05 2012-03-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for isolating exosomes
ES2547715T3 (es) * 2009-07-16 2015-10-08 The General Hospital Corporation Análisis de ácido nucleico
CN101988062A (zh) * 2009-07-30 2011-03-23 江苏命码生物科技有限公司 宫颈癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片
US8735074B2 (en) * 2009-08-28 2014-05-27 Asuragen, Inc. MiRNA biomarkers of lung disease
WO2011031892A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing kras mutations
EP3461912B1 (en) 2009-09-09 2022-07-13 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles
TW201118178A (en) * 2009-10-09 2011-06-01 Baylor Res Inst Identification of micrornas (miRNAs) in fecal samples as biomarkers for gastroenterological cancers
EP2316972A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Circulating miRNAs as non-invasive markers for diagnosis and staging in prostate cancer
CA2780222C (en) 2009-11-04 2021-11-16 Diamir, Llc Methods of using small rna from bodily fluids for diagnosis and monitoring of neurodegenerative diseases
CN101798594A (zh) * 2009-11-13 2010-08-11 北京命码生科科技有限公司 检测牛乳质量的标志物、检测方法、生物芯片和试验盒
WO2011063324A2 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 The General Hospital Corporation Microfluidic systems for isolating microvesicles
WO2011063382A1 (en) 2009-11-23 2011-05-26 The Ohio State University Materials and methods useful for affecting tumor cell growth, migration and invasion
EP2341145A1 (en) 2009-12-30 2011-07-06 febit holding GmbH miRNA fingerprint in the diagnosis of diseases
CN103237901B (zh) * 2010-03-01 2016-08-03 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 用于治疗诊断的生物标志物
KR20130043104A (ko) * 2010-04-06 2013-04-29 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 질병용 순환 생물학적 지표들
EP2559442B1 (en) * 2010-04-13 2017-12-06 Jiangsu Mingma Biotech Co., Ltd Method for regulating microrna content in organisms and uses thereof
US20130203081A1 (en) * 2010-04-13 2013-08-08 Janusz Rak Tumor cell-derived microvesicles
WO2011156734A2 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Hitachi Chemical Co., Ltd. Method of characterizing vascular diseases
JP5755326B2 (ja) 2010-06-11 2015-07-29 日立化成株式会社 腎機能の特徴を決定する方法
ES2624284T3 (es) * 2010-07-07 2017-07-13 Aethlon Medical Inc Métodos para cuantificar exosomas
WO2012031008A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
CN101921759B (zh) * 2010-09-08 2013-05-29 南京医科大学 一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用
EP2446929A1 (en) * 2010-10-27 2012-05-02 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Microvesicles derived from atheroprotective endothelial cells for the treatment and prevention of atherosclerotic diseases
US20120107825A1 (en) 2010-11-01 2012-05-03 Winger Edward E Methods and compositions for assessing patients with reproductive failure using immune cell-derived microrna
EP2638057B1 (en) 2010-11-10 2019-03-06 Exosome Diagnostics, Inc. Method for isolation of nucleic acid containing particles and extraction of nucleic acids therefrom
EP2637673B1 (en) 2010-11-12 2016-10-26 The Ohio State University Research Foundation Methods related to microrna-21 and mismatch repair in colorectal cancer
CA2817982C (en) 2010-11-15 2020-06-30 The Regents Of The University Of Michigan Controlled release mucoadhesive systems
JP2012125215A (ja) * 2010-12-17 2012-07-05 Osaka City Univ 肝線維症の存在及び／又は肝線維症の重症度の判定方法、判定マーカー、判定用キット、肝線維症の治療の効果予測方法、効果予測マーカー、並びに効果予測用キット
EP2505663A1 (en) * 2011-03-30 2012-10-03 IFOM Fondazione Istituto Firc di Oncologia Molecolare A method to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer by means of detecting miRNAs in biologic fluids
AU2012245580B2 (en) 2011-04-18 2017-07-20 Diamir, Llc miRNA-based universal screening test (UST)
ES2744589T3 (es) * 2011-05-11 2020-02-25 Exosome Diagnostics Inc Extracción de ácido nucleico de materiales biológicos heterogéneos
WO2012170037A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Hitachi Chemical Co., Ltd. Vesicle capturing devices and methods for using same
EP2723865B1 (en) * 2011-06-21 2019-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. METHODS FOR DETERMINING ACTIVITY OF RNAi IN A SUBJECT
US9771617B2 (en) * 2011-06-27 2017-09-26 Eisai R&D Management Co., Ltd. Microrna biomarkers indicative of alzheimer's disease
EP2739754A4 (en) * 2011-08-05 2015-01-21 Univ Louisville Res Found MICRO-RNA biomarkers
AU2012294458A1 (en) * 2011-08-08 2014-02-27 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Biomarker compositions and methods
AU2012323924A1 (en) * 2011-10-14 2014-05-29 The Ohio State University Methods and materials related to ovarian cancer
EP2584040A1 (en) * 2011-10-17 2013-04-24 Pharmahungary 2000 Kft. Compounds for treatment of ischemic injury
US20140243240A1 (en) * 2011-10-26 2014-08-28 Georgetown University microRNA EXPRESSION PROFILING OF THYROID CANCER
WO2013063439A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Characterizing melanoma
US20140308212A1 (en) 2011-11-07 2014-10-16 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Edible plant-derived microvesicle compositions for diagnosis and treatment of disease
EP4349343A3 (en) * 2011-11-30 2024-10-16 Jörn Bullerdiek Expression of mirnas in placental tissue
JP2015501843A (ja) 2011-12-13 2015-01-19 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ、エキソソーム阻害、およびがん転移に関する方法および組成物
US9447471B2 (en) 2011-12-29 2016-09-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Microrna profiling for diagnosis of dysplastic nevi and melanoma
AU2013209477B2 (en) 2012-01-20 2016-12-08 The Ohio State University Breast cancer biomarker signatures for invasiveness and prognosis
WO2013125691A1 (ja) 2012-02-23 2013-08-29 住友ベークライト株式会社 テスト体液サンプルの分類方法
CA2870593A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Detection of extracellular jcv micrornas
WO2013155633A1 (en) * 2012-04-19 2013-10-24 Leong Hon Sing Method for detecting or monitoring prostate cancer
AU2013302526B2 (en) 2012-08-15 2018-03-22 The University Of Chicago Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders
CA2879410C (en) * 2012-08-20 2018-06-26 National Cancer Center Agent for treating cancer
CN102864224A (zh) * 2012-09-11 2013-01-09 南京大学 一种血清microRNAs试剂盒及其应用
WO2014041087A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Muscle secretome and uses thereof
WO2014059336A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 University Of Notre Dame Du Lac Exosomes and diagnostic biomarkers
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
KR20150090072A (ko) * 2012-10-23 2015-08-05 카리스 라이프 사이언스 스위스 홀딩스 게엠베하 압타머 및 이의 용도
EP2746406B1 (en) 2012-12-18 2017-08-23 Samsung Electronics Co., Ltd. Composition and kit for diagnosing breast cancer including miRNAs within vesicle, and method of diagnosing breast cancer using the same
EP2935628B1 (en) 2012-12-19 2018-03-21 Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH Compositions and methods for aptamer screening
US9086412B2 (en) * 2012-12-31 2015-07-21 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Extracellular vesicle-associated protein markers of cancer
WO2014160032A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-02 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated rna as a diagnostic marker
DK2972193T3 (da) 2013-03-13 2020-03-23 Univ Miami Fremgangsmåde til isolation og oprensning af mikrovesikler fra cellekultursupernatanter og biologiske fluider
WO2014145612A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Ajay Goel Tissue and blood-based mirna biomarkers for the diagnosis, prognosis and metastasis-predictive potential in colorectal cancer
RU2644247C2 (ru) 2013-03-15 2018-02-08 Борд оф Риджентс, Дзе Юниверсити оф Тексас Систем Использование биогенеза микрорнк в экзосомах для диагностики и лечения
DE102013103447A1 (de) * 2013-04-05 2014-10-09 Bodo C. Melnik Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung kommerzieller Milch und Milch mit reduzierter biologischer Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren
WO2014182330A1 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Hitachi Chemical Company Ltd Devices and methods for capturing target molecules
US9213029B2 (en) 2013-06-25 2015-12-15 Samsung Electronics Co., Ltd. Method for diagnosing breast cancer by detection of polymeric immunoglobulin receptor in vesicles isolated from patients
US10301681B2 (en) * 2013-08-06 2019-05-28 Exosome Diagnostics, Inc. Methods of treating a subject with a high gleason score prostate cancer
WO2015045666A1 (ja) 2013-09-25 2015-04-02 国立大学法人東京大学 流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法
KR20150043937A (ko) 2013-10-15 2015-04-23 삼성전자주식회사 개체의 간암 진단용 조성물, 개체의 간암 진단하는 방법 및 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법
WO2015057806A1 (en) * 2013-10-15 2015-04-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Serum mirnas for the prognosis of prostate cancer
PL405648A1 (pl) 2013-10-15 2015-04-27 Warszawski Uniwersytet Medyczny Sposób diagnozowania raka watrobowokomórkowego, zastosowanie markera mikroRNA do diagnozowania zmiany chorobowej w obrębie wątroby, oceny stopnia zaawansowania choroby oraz oceny podatności pacjenta i/lub choroby na zaproponowane leczenie oraz zawierający takie markery zestaw diagnostyczny
JP6547625B2 (ja) 2013-10-25 2019-07-24 凸版印刷株式会社 膜小胞回収デバイス、膜小胞回収方法、及び膜小胞分析方法
PL406033A1 (pl) 2013-11-14 2015-05-25 Warszawski Uniwersytet Medyczny Sposób diagnozowania raka brodawkowatego tarczycy, zastosowanie markera mikroRNA do diagnozowania nowotworu tarczycy, oceny stopnia zaawansowania choroby oraz oceny podatności pacjenta i/lub choroby na zaproponowane leczenie oraz zawierający takie markery zestaw diagnostyczny
ES2813699T3 (es) 2013-11-18 2021-03-24 Diamir Llc Métodos de uso de miARN de fluidos corporales para la detección y monitoreo de la enfermedad de Parkinson (PD)
FR3014198B1 (fr) * 2013-12-03 2017-03-03 Biomerieux Sa Procede d'isolement d'exosomes
KR101535737B1 (ko) * 2014-01-09 2015-07-09 충남대학교산학협력단 miRNA를 포함하는 자간전증 진단 및 치료용 조성물
WO2015108342A1 (ko) * 2014-01-14 2015-07-23 최원철 루테리알의 형태특성을 이용한 암 예방제 또는 항암제의 스크리닝 방법
US10260105B2 (en) 2014-02-18 2019-04-16 Baylor Research Institute MiR-320e and colorectal cancer
EP3111212B1 (en) * 2014-02-27 2018-08-29 Board of Regents, The University of Texas System Methods and compositions for isolating exosomes
CN103937888B (zh) * 2014-04-14 2016-08-17 上海交通大学 鉴别胃癌的血浆microRNA标志物的筛选与应用
CN103954770B (zh) * 2014-04-25 2015-09-30 江南大学 EVs-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用
CN103993015B (zh) * 2014-05-23 2016-04-27 山西医科大学 人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物及其应用
KR102711760B1 (ko) * 2014-06-12 2024-09-30 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터 전립선암 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법
EP3173143A4 (en) 2014-07-24 2018-06-27 Toppan Printing Co., Ltd. Lipid membrane structure, lipid-membrane-structure-immobilization carrier, and method for fusing cells
KR101784714B1 (ko) 2014-08-19 2017-10-12 주식회사 엠모니터 재발 난소암 진단 또는 난소암 재발 예측용 mirna 마커 및 그 용도
US20170298352A1 (en) 2014-09-30 2017-10-19 Research Institute at Nationwide Children's Hospit al Compositions and methods for treating hepatic fibrosis
WO2016057474A1 (en) * 2014-10-06 2016-04-14 Indiana University Research & Technology Corporation Systems and methods for localized surface plasmon resonance biosensing
RU2571507C1 (ru) * 2014-10-09 2015-12-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Способ диагностики и мониторинга онкологических заболеваний с использованием экзосом крови
US10266895B2 (en) 2014-11-05 2019-04-23 Hitachi Chemical Company Ltd. Exosomes and microvesicles in intestinal luminal fluids and stool and use of same for the assessment of inflammatory bowel disease
WO2016077537A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Hitachi Chemical Co., Ltd. Method and device for diagnosing organ injury
US11079378B2 (en) 2014-12-10 2021-08-03 Xpecting Diagnostics, Inc. Detection of analytes in bodily fluid to determine the initiation of parturition
EP3250706A4 (en) * 2015-01-30 2018-09-05 The Johns Hopkins University Extracellular vesicles for agent delivery
WO2016140388A1 (ko) * 2015-03-05 2016-09-09 경북대학교 산학협력단 엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법
US10071133B2 (en) * 2015-03-12 2018-09-11 Mitsui Chemicals, Inc. Method for destroying exosomes, kit for destroying exosomes, and method for isolating exosomes derived from normal cells
GB201504772D0 (en) * 2015-03-20 2015-05-06 Univ Aston Preeclampsia
US20160320390A1 (en) * 2015-05-01 2016-11-03 Morehouse School Of Medicine Compositions and methods for capturing exosomes
WO2016186215A1 (ja) * 2015-05-20 2016-11-24 Jsr株式会社 分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、薬効評価方法、キット、液状組成物及び検体希釈液
EP3307243A4 (en) 2015-06-09 2019-01-02 The Board of Regents of The University of Texas System Diagnostic test for early stage cancer
US20180177727A1 (en) 2015-06-10 2018-06-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of exosomes for the treatment of disease
WO2016201220A1 (en) * 2015-06-10 2016-12-15 Children's National Medical Center Adipocyte-derived exosomes, and compositions, kits, and methods of using the same for detection and screening
CN106319031A (zh) * 2015-06-23 2017-01-11 上海市计划生育科学研究所 反复自然流产相关微小rna及其应用
EP3314027A4 (en) 2015-06-29 2019-07-03 Caris Science, Inc. THERAPEUTIC OLIGONUCLEOTIDES
CA2993652A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Caris Science, Inc. Targeted oligonucleotides
JP6624704B2 (ja) 2015-08-31 2019-12-25 日立化成株式会社 尿路上皮疾患の評価のための分子法
US11180810B2 (en) 2015-09-29 2021-11-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Methods for detecting hepatic fibrosis and responsiveness to therapy
KR101695347B1 (ko) * 2015-10-12 2017-01-11 이화여자대학교 산학협력단 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 조산 위험성 예측용 조성물 및 이의 이용
CN105368931A (zh) * 2015-10-15 2016-03-02 天津市泌尿外科研究所 尿液中exosome源性miRNAs生物标记物的检测方法
US10975436B2 (en) 2016-01-05 2021-04-13 Diamir, Llc Methods of using miRNA from bodily fluids for diagnosis and monitoring of neurodevelopmental disorders
WO2017124000A1 (en) 2016-01-14 2017-07-20 The Regents Of The University Of California 3d-exoquant method for the analysis of surface molecules and quantification of tissue-specific exosomes in biological fluids
EP3430137A4 (en) 2016-03-18 2019-11-06 Caris Science, Inc. OLIGONUCLEOTIDE THONES AND USES THEREOF
US11149313B2 (en) 2016-03-21 2021-10-19 Diamir, Llc Methods of using miRNAs from bodily fluids for detection and differentiation of neurodegenerative diseases
CA3025486A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probes and uses thereof
EP3472201A4 (en) * 2016-06-20 2020-05-13 Healthtell Inc. METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF AUTOIMMUNE DISEASES
WO2017223117A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Healthtell Inc. Methods for diagnosis and treatment of autoimmune diseases
JP6980219B2 (ja) * 2016-08-22 2021-12-15 いであ株式会社 がんを検出、又はがんの進行期を判定する方法
CN106282360B (zh) * 2016-08-31 2019-11-08 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合、其探针组合物及应用
CN108473973A (zh) 2016-09-30 2018-08-31 赛尔莱克斯生命科学公司 包含负载蛋白的外泌体的组合物以及制备和递送该组合物的方法
WO2018071806A1 (en) * 2016-10-13 2018-04-19 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosomal biomarkers for diagnosis and prognosis of cancer and related methods
CN106282387A (zh) * 2016-10-17 2017-01-04 上海赛安生物医药科技有限公司 胃癌检测引物探针及其试剂盒
CA3043264A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Healthtell Inc. Methods for identifying candidate biomarkers
EP3541827A4 (en) * 2016-11-11 2020-05-13 University of Tennessee Research Foundation BIOMARKER FOR EARLY EMBRYONAL VITABILITY AND METHOD FOR IT
EP3577214A4 (en) 2017-02-06 2021-03-24 Goetzl, Edward, J. ENDOTHELIAL CELL-DERIVED EXOSOMES AND USES
US11746381B2 (en) 2017-03-10 2023-09-05 Cancer Diagnostics Research Innvovations, LLC Methods for diagnosing and treating gastric cancer using miRNA expression
WO2018170624A1 (zh) * 2017-03-18 2018-09-27 深圳市博奥康生物科技有限公司 降低微小rna-185和微小rna-424表达的方法
JP7083818B2 (ja) * 2017-04-28 2022-06-13 一丸ファルコス株式会社 プラセンタ抽出物
CA3065999A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Nanosomix, Inc. Detection of biomarkers on vesicles for the diagnosis and prognosis of diseases and disorders
CN107243012B (zh) * 2017-05-25 2020-01-24 江苏大学 一种exosomes装载的miR-93-5p在治疗类风湿性关节炎中的应用
WO2019008414A1 (en) * 2017-07-05 2019-01-10 Datar Rajan GENE EXPRESSION ANALYSIS BASED ON EXOSOMES FOR THE CARE OF CANCER
US11899024B2 (en) 2017-07-12 2024-02-13 Exosome Diagnostics, Inc. Treatment and diagnosis of parkinson's disease using isolated and enriched populations of biofluid-derived extracellular vesicles
US10781487B2 (en) 2017-07-24 2020-09-22 Diamir, Llc miRNA-based methods for detecting and monitoring aging
CN107365852B (zh) * 2017-08-14 2021-08-13 江苏为真生物医药技术股份有限公司 血清外泌体中肺癌相关microRNA分子标记的应用及其检测试剂盒
KR102109921B1 (ko) * 2017-09-27 2020-05-12 ㈜로제타엑소좀 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 순도 분석 방법
WO2019094727A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for assessing and treating cancer
US12036262B2 (en) 2017-11-22 2024-07-16 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Edible plant-derived nanoparticles for regulation of gut microbiota
CN108753964A (zh) * 2018-06-04 2018-11-06 谢丽 一种用于非小细胞肺癌诊断及转移预警的试剂盒
KR102184911B1 (ko) * 2019-06-07 2020-12-01 한림대학교 산학협력단 miR-548을 함유하는 조산 예방 또는 치료제 조성물
US20220275455A1 (en) * 2019-07-08 2022-09-01 Preferred Networks, Inc. Data processing and classification for determining a likelihood score for breast disease
CN110747268B (zh) * 2019-10-23 2023-02-03 华南农业大学 一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用
CN110878341A (zh) * 2019-12-18 2020-03-13 苏州绘真医学检验有限公司 一种检测血液外泌体miRNA的引物组、试剂盒及方法
KR102242639B1 (ko) * 2020-01-28 2021-04-21 고려대학교 산학협력단 간 섬유화 진단용 바이오마커 miRNA4668-5p
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
RU2769927C2 (ru) * 2020-02-28 2022-04-08 Общество с ограниченной ответственностью "МедФлорина" Способ диагностики меланомы с помощью экзосомальных микроРНК
WO2021195154A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Avem Holdings, Llc Isolation and purification of exosomes for regenerative medicine
WO2022066617A1 (en) * 2020-09-23 2022-03-31 Ewinger, Inc. Reagents, methods and kits for identifying pregnant human beings at risk for placental bed disorder(s)
CN112575088B (zh) * 2020-12-29 2022-07-05 浙江大学医学院附属妇产科医院 一种血浆外泌体miRNA生物标记物及其应用
WO2022204378A2 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 City Of Hope Identification of rna biomarkers in colorectal cancer
WO2022216765A1 (en) * 2021-04-07 2022-10-13 Trustees Of Boston University Exosome-based cancer assays
CN113736877A (zh) * 2021-10-15 2021-12-03 青岛大学附属医院 基于微小RNA 27a的子痫前期诊断用途及组合物
WO2024050519A2 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions for detecting cancer using exosomal proteins
CN117802235A (zh) * 2022-09-30 2024-04-02 上海思路迪生物医学科技有限公司 血液胞外囊泡miRNA在卵巢癌诊断中的应用
KR20240058548A (ko) * 2022-10-26 2024-05-07 연세대학교 산학협력단 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
CN116855614A (zh) * 2023-07-17 2023-10-10 宁夏大学 用于黄牛早期妊娠诊断的miRNA标志物及其应用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5089181A (en) 1987-02-24 1992-02-18 Vestar, Inc. Method of dehydrating vesicle preparations for long term storage
US5449754A (en) 1991-08-07 1995-09-12 H & N Instruments, Inc. Generation of combinatorial libraries
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
CA2284211A1 (en) 1997-03-20 1998-09-24 University Of Washington Solvent for biopolymer synthesis, solvent microdroplets and methods of use
US6242266B1 (en) 1999-04-30 2001-06-05 Agilent Technologies Inc. Preparation of biopolymer arrays
US6180351B1 (en) 1999-07-22 2001-01-30 Agilent Technologies Inc. Chemical array fabrication with identifier
US6232072B1 (en) 1999-10-15 2001-05-15 Agilent Technologies, Inc. Biopolymer array inspection
US6171797B1 (en) 1999-10-20 2001-01-09 Agilent Technologies Inc. Methods of making polymeric arrays
US6812023B1 (en) 2000-04-27 2004-11-02 Anosys, Inc. Methods of producing membrane vesicles
JP2002330055A (ja) * 2001-04-27 2002-11-15 Tdk Corp 表面弾性波フィルタ、表面弾性波フィルタ用パッケージ及び表面弾性波フィルタモジュール
US20030036077A1 (en) 2001-05-31 2003-02-20 Chronix Biomedical Methods for generating an mRNA expression profile from an ecellular mRNA containing blood sample and using the same to identify functional state markers
AU2002314957A1 (en) 2001-06-06 2002-12-16 Proteologics, Inc. Methods and compositions related to tagging of membrane surface proteins
CN1753993A (zh) * 2002-12-18 2006-03-29 第三次浪潮技术公司 小核酸的检测
WO2005114192A1 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Centre National De La Recherche Scientifique A device for binding a target entity to a bait entity and detection methods using the same
US8021847B2 (en) 2004-06-02 2011-09-20 Proxy Life Science Holdings, Inc. Microvesicle-based compositions and methods
CA2609260A1 (en) 2004-06-02 2005-12-22 Sourcepharm, Inc. Rna-containing microvesicles and methods therefor
EP1774015A4 (en) * 2004-07-09 2009-01-21 Chronix Biomedical Inc NUCLEIC ACID DETECTION FOR ASSESSING THE RISK OF BOVINE SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY (BSE)
US9164108B2 (en) 2005-03-22 2015-10-20 Sri International Liposome-based microarray and methods of use thereof
WO2006119365A2 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Cold Spring Harbor Laboratory Composition and methods for cancer diagnosis utilizing the mir 17-92 cluster
US20090011428A1 (en) 2006-01-18 2009-01-08 The Regents Of The University Of California Fluid Membrane-Based Ligand Display System for Live Cell Assays and Disease Diagnosis Applications
AU2008207746B2 (en) 2007-01-26 2013-09-05 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods of detecting autoantibodies for diagnosing and characterizing disorders
AU2008207735B2 (en) 2007-01-26 2013-10-03 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Modification of exosomal components for use as a vaccine
EP2613149B1 (en) * 2007-07-25 2014-09-17 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microRNA as a diagnostic marker
ES2419129T3 (es) 2007-09-14 2013-08-19 The Ohio State University Research Foundation Expresión de miARN en microvesículas de sangre periférica humana y usos del mismo
CN107254538A (zh) 2008-11-12 2017-10-17 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 使用外来体来确定表现型的方法和系统
US20130288258A1 (en) * 2012-04-27 2013-10-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING COLORECTAL CANCER USING MICRO RNAs

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0807318A2 (pt) 2015-03-24
JP2013102768A (ja) 2013-05-30
GB0914442D0 (en) 2009-09-30
BRPI0807318B8 (pt) 2021-07-27
US20120238467A1 (en) 2012-09-20
IL200028A (en) 2015-11-30
CN101755208A (zh) 2010-06-23
WO2009015357A1 (en) 2009-01-29
JP5383940B2 (ja) 2014-01-08
US20100151480A1 (en) 2010-06-17
US8637254B2 (en) 2014-01-28
CA2676113A1 (en) 2009-01-29
JP5291241B2 (ja) 2013-09-18
JP2013188212A (ja) 2013-09-26
US20100298151A1 (en) 2010-11-25
AU2008279016A1 (en) 2009-01-29
CA2676113C (en) 2014-07-08
EP2181332A1 (en) 2010-05-05
US20190085410A1 (en) 2019-03-21
US20170137892A1 (en) 2017-05-18
GB2459228B (en) 2012-06-20
EP2181332B1 (en) 2013-04-10
IL252040A0 (en) 2017-06-29
IL200028A0 (en) 2010-04-15
CN103276062A (zh) 2013-09-04
EP2181332A4 (en) 2011-02-23
ES2420973T3 (es) 2013-08-28
US8216784B2 (en) 2012-07-10
JP5156829B2 (ja) 2013-03-06
EP2613149A1 (en) 2013-07-10
IL252040B (en) 2018-10-31
GB2459228A (en) 2009-10-21
EP2806273A1 (en) 2014-11-26
EP2613149B1 (en) 2014-09-17
IL242337A (en) 2017-05-29
EP2806273B1 (en) 2017-09-06
AU2008279016B2 (en) 2013-08-22
CN101755208B (zh) 2014-05-07
JP2010534480A (ja) 2010-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2420973T3 (es) Micro-ARN asociado a exosoma como marcador de diagnóstico
US7888035B2 (en) Methods for assessing RNA patterns
US8748101B2 (en) Methods, compositions, and devices utilizing MicroRNA to determine physiological conditions
ES2622589T3 (es) Huella dactilar del miARN en el diagnóstico de la EPOC
US9822416B2 (en) miRNA in the diagnosis of ovarian cancer
US20100286044A1 (en) Detection of tissue origin of cancer
US8768630B2 (en) miRNA target prediction
US20110107440A1 (en) Skin cancer associated micrornas
US20120219958A1 (en) MicroRNA Signatures Differentiating Uterine and Ovarian Papillary Serous Tumors
AU2011311881A1 (en) MicroRNAs (miRNA) as biomakers for the identification of familial and non-familial colorectal cancer
Aghanoori et al. MiRNA molecular profiles in human medical conditions: connecting lung cancer and lung development phenomena
WO2012013821A1 (en) Inhibition of dicer function for treatment of cancer
US20130184169A1 (en) Methods for assessing rna patterns
LI et al. Exosomassoziierte microRNA als Diagnosemarker MicroARN associé à l’exosome comme marqueur diagnostique
MacLellan Circulating microRNAs as biomarkers for early cancer detection

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B08E Application fees: payment of additional fee required [chapter 8.5 patent gazette]

Free format text: COMPLEMENTAR A RETRIBUICAO DA(S) 4A. E 5A. ANUIDADE(S), DE ACORDO COM TABELA VIGENTE, REFERENTE A(S) GUIA(S) DE RECOLHIMENTO 22110877908-0 E 22120443528-0, RESPECTIVAMENTE.

B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AS 4A E 5A ANUIDADES (COMPLEMENTACAO).

B08H Application fees: decision cancelled [chapter 8.8 patent gazette]
B08G Application fees: restoration [chapter 8.7 patent gazette]
B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 13/11/2018, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 25/07/2008, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO