BR112020016306A2

BR112020016306A2 - Gene (saur) suprarregulado pequeno de auxina para o melhoramento da arquitetura do sistema radicular da planta, tolerância ao encharcamento, resistência à seca, e rendimento

Info

Publication number: BR112020016306A2
Application number: BR112020016306-6A
Authority: BR
Inventors: Henry Nguyen; Heng Ye; Babu Valliyodan
Original assignee: Curators Of The University Of Missouri
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2019-02-12
Publication date: 2020-12-15
Also published as: US20240150784A1; WO2019157522A1; US20210002661A1; US11905518B2

Abstract

a presente invenção refere-se a plantas modificadas e métodos para produção de plantas modificadas tendo uma região não traduzida 5? de gene de tolerância ao alagamento de proteína suprarregulada pequena de auxina (saur_ft). as plantas modificadas divulgadas no presente documento têm pelo menos um dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, uma tolerância ao encharcamento aumentada, uma tolerância à seca aumentada e combinações das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENE (SAUR) SUPRARREGULADO PEQUENO DE AUXINA PARA O

MELHORAMENTO DA ARQUITETURA DO SISTEMA RADICULAR DA PLANTA, TOLERÂNCIA AO ENCHARCAMENTO, RESISTÊNCIA À SECA, E RENDIMENTO". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente provisório Norte-americano No. serial 62/629,264, depositado em 12 de fevereiro de 2018, cuja divulgação é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

HISTÓRICO DA DIVULGAÇÃO

[002] A presente divulgação refere-se em geral ao desenvolvimento de plantas cultivadas que tenham arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento. Mais particularmente, a presente divulgação se refere a plantas modificadas que tenham arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento. A presente divulgação também se refere aos métodos para selecionar plantas que tenham arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento. A presente divulgação ainda se refere aos métodos para produzir plantas cultivadas que tenham arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento.

[003] Os danos do encharcamento limitam o desenvolvimento e a produtividade das plantas cultivadas, especialmente em solos com baixa capacidade de drenagem. A arquitetura do sistema radicular é um traço agronômico e de desenvolvimento importante, e tem papéis principais na adaptação da planta e na produtividade sob ambientes com água normal, excessiva e limitada. Um sistema radicular mais profundo e mais proliferativo ajuda as plantas a extraírem água e nutrientes suficientes sob essas condições ambientais. Os mecanismos de tolerância ao encharcamento e arquitetura do sistema radicular ainda não são claros.

[004] Consequentemente, existe uma necessidade contínua de se desenvolverem plantas cultivadas que identificam os mecanismos subjacentes para a tolerância ao encharcamento e a regulação da arquitetura do sistema radicular. Esses traços podem levar ao desenvolvimento de plantas cultivadas que tenham rendimento aumentado, tolerância à seca e ao encharcamento, melhor arquitetura do sistema radicular e melhor qualidade agronômica.

BREVE DESCRIÇÃO DA DIVULGAÇÃO

[005] A presente divulgação refere-se em geral ao desenvolvimento de plantas cultivadas que tenham arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento. Mais particularmente, a presente divulgação se refere a plantas modificadas que tenham arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento. A presente divulgação também se refere aos métodos para selecionar as plantas que tenham arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento. A presente divulgação ainda se refere aos métodos para produzir plantas cultivadas que tenham arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento.

[006] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a uma planta modificada compreendendo pelo menos uma de uma região não traduzida 5' modificada do gene de tolerância ao alagamento da proteína suprarregulada pequena de auxina (SAUR_FT), uma região não traduzida 5' modificada do homólogo do gene SAUR_FT e um ortólogo do gene SAUR_FT. Em uma modalidade, a planta modificada é uma planta transgênica. Em uma modalidade, a planta modificada é produzida por edição genética.

[007] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de seleção de uma planta tendo pelo menos uma dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, tolerância ao encharcamento aumentada, tolerância à seca aumentada, rendimento aumentado, e combinações dos mesmos, o método compreendendo a obtenção de uma amostra da planta e análise do gene de tolerância ao alagamento da proteína suprarregulada pequena de auxina (SAUR_FT).

[008] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de produção de uma planta modificada compreendendo pelo menos uma dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, uma tolerância ao encharcamento aumentada, uma tolerância à seca aumentada, e combinações das mesmas, o método compreendendo: reduzir a expressão do gene de tolerância ao alagamento da proteína suprarregulada pequena de auxina (SAUR_FT).

[009] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a uma planta modificada tendo tolerância ao encharcamento aumentada compreendendo a superexpressão de GmARF20.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A divulgação será mais bem compreendida, e as características, aspectos e vantagens diferentes daquelas apresentadas acima ficarão aparentes quando se considera a seguinte descrição detalhada da mesma. A referida descrição detalhada faz referência aos desenhos a seguir, em que:

[0011] As FIGS. 1A e 1B apresentam fenotipagem para tolerância ao alagamento e distribuições fenotípicas das classificações de dano relativo ao alagamento (FIS) da população de mapeamento RIL. FIG.

1A. Fenotipagem de campo para tolerância ao alagamento usando FIS. FIS foi usada para representar os níveis de tolerância ao encharcamento, os quais são classificados de 1 a 5; 1 = sem danos aparentes, 5 = a maioria das plantas gravemente danificadas ou mortas. FIG. 1B. distribuições fenotípicas de FIS ao longo de três anos. A FIS foi coletada por 3 anos conforme indicado. “M” se refere à média da FIS da população; enquanto “S” se refere ao desvio padrão da FIS da população. As setas apontam os desempenhos médios nas classificações de danos em relação ao alagamento das duas matrizes. S99-2281 é uma matriz principal e sensível; enquanto PI 561271 é uma matriz exótica e tolerante. A hereditariedade de amplo sentido (H2) foi calculada para FIS ao longo dos três anos usando o modelo: yijk = μ + gi + tj + (gt)ij + bk(j) + eijk,.

[0012] A FIG. 2 apresenta localizações cromossômicas dos dois QTL associados com as classificações dos danos relativos ao alagamento (FIS) e as distribuições de LOD da análise QTL. qWL_Gm03 é mostrado na parte esquerda e qWL_Gm10 é mostrado na parte direita. Os mapas de ligação foram construídos com base nos resultados de genotipagem a partir de Illumina 6K SNP arrays usando JoinMap 4.0 (Tabela suplementar 1). O valor de probabilidade (LOD) foi gerado usando MapQTL 5.0 e o limite foi calculado por 1,000 permutações. As barras flanqueiam a região candidata do QTL para cada ano e as setas apontam para os picos do QTL correspondente para cada ano.

[0013] As FIGS. 3A-3D apresentam efeitos genéticos de qWL_Gm03 na tolerância ao encharcamento nas origens quase isogênicas. A distribuição fenotípica e efeitos genéticos de qWL_Gm03 nas populações de progênie derivadas de NIL147_Aa (a) e NIL221_Aa (b), respectivamente. As populações de progênie para NIL147_Aa e NIL221_Aa foram desenvolvidas através da autopolinização (FIG. 11)

contendo 82 e 100 plantas para cada população, respectivamente. As classificações de dano relativo ao alagamento (FIS) foram tomadas no estágio vegetativo precoce (R1 a R2) no campo. As plantas individuais foram genotipadas através do marcador mais próximo (Gm03_3087237_A/G) de qWL_Gm03. Os efeitos aditivos (a), efeitos de dominação (d) e a proporção da variação explicada pelo QTL (R2) foram estimados com base no modelo 1, com um valor significativo (* for P < 0,0001 e ns para P = 0,05 ou maior) indicando que o alelo derivado de PI 561271 na região heterozigótica derivada reduziu FIS. Um valor positivo ou negativo indica que o alelo parental “A” ou “a” contribuiu para uma FIS crescente de efeito. (c) O teste de tolerância ao encharcamento das NILS no estágio vegetativo precoce na estufa. Então, as plantas de cada NIL foram desenvolvidas em cones de 40 cm e submetidas ao estresse do encharcamento no estágio de desenvolvimento V2 por 10 dias. As classificações de dano relativo ao alagamento (FIS) foram avaliadas em 10 dias depois da remoção do estresse do encharcamento. (d) o teste da tolerância ao encharcamento das NILS no estágio reprodutivo precoce no campo. Cinco plantas de cada NIL foram desenvolvidas no campo em múltiplos estados nos Estados Unidos da América (MO: Missouri, AR: Arkansas, MS: Mississippi e LA: Louisiana) e submetidos ao estresse do encharcamento no estágio de desenvolvimento R1 a R2 por 5 dias. As classificações de dano relativo ao alagamento foram avaliadas em 10 dias depois da remoção do estresse do encharcamento. As colunas e barras representam meios e desvios padrão de FIS de três réplicas biológicas para cada NIL em cada localização. As diferenças significativas em FIS entre “aa” e “AA” foram observadas em cada localização (P<0,001, teste t de Student).

[0014] A FIG. 4 apresenta o mapeamento preciso da região qWL_Gm03. Os marcadores no mapa parcial do cromossomo 3 foram alinhados em oposição à sequência do genoma Williams 82 e usados para selecionar recombinantes (NIL147_06, 34 e 87) para dissecar o segmento de introgressão inicial a partir de PI 567271 (barra escura no painel superior) na origem de EM93-1 (barras vazias). N, o número de plantas em uma população de progênie derivada de recombinantes; r, coeficientes de correlação do traço marcador para as classificações de dano relativo ao alagamento (FIS), com um valor significativo (* para P < 0,0001 e ns para P = 0,05 ou maior) indicando que o alelo derivado de PI 561271 na região heterozigótica marcada reduziu FIS. As linhas pontilhadas verticais delimitam qWL_Gm03, com base nos testes de progênie. Os marcadores de SNP foram designados no ensaio de PCR de alelo específico competitivo. As posições do marcador são baseadas no conjunto do genoma da soja Wm82.a2.v1.

[0015] As FIGS. 5A-5D apresentam diferenças genotípicas no desenvolvimento da raiz entre NILs. (a) Imagens representativas de raízes de NILs no estágio de desenvolvimento V1. “aa” se refere às NILS com o alelo sensível a partir de S99-2281 e “AA” se refere aas NILS com o alelo tolerante a partir de PI 561271. Os efeitos de qFT_Gm03 no comprimento total da raiz (b) e números de pontas da raiz (c) durante o tratamento de encharcamento. Os dois conjuntos de NILs (NIL147: esquerda e NIL221: direita) foram plantados em turfa e areia (razão de 2:1) e desenvolvidos na estufa. O estresse do encharcamento foi adicionado às plantas no estágio de desenvolvimento V1. “C” se refere às condições de controle sem o estresse de encharcamento e “WL” se refere ao tratamento de encharcamento. As imagens escaneadas das raízes foram analisadas usando software WinRhizo Pro. Os pontos e barras representam os meios e erros padronizados de cada dado calculado com base em 10 réplicas biológicas. (d) Os efeitos de qWL_Gm03 na indução de raízes adventícias através do encharcamento. Dois conjuntos de NILs foram plantados nos vasos na estufa. O estresse de encharcamento foi aplicado às plantas no estágio de desenvolvimento V1 e as raízes adventícias induzidas foram contadas em 7 dias depois do tratamento. Os dados mostrados são desvios padrão ± médios de 20 plantas para cada linhagem. O teste t de Student foi usado para comparar as médias entre NIL147/221 aa e NIL147/221_AA, respectivamente.

[0016] As FIGS. 6A-6D apresentam a confirmação transgênica do efeito de SAUR-FT no desenvolvimento da raiz e a tolerância ao encharcamento. FIG. 6A. Diferenças genotípicas entre os alelos sensíveis e tolerantes de SAUR-FT nas raízes pilosas transgênicas em placas médias. Duas raízes transgênicas independentes de cada um dos 3 tipis foram desenvolvidas em uma placa. Os dados mostrados são SE ± médios de 15 placas. A comparação múltipla Duncan foi realizada para categorizar os dados em “a” e “b” ou “c” e “d” no valor p de <0,0001. FIG. 6B. Efeito do SAUR-FT superexpressado no desenvolvimento da raiz em placas médias. Duas a quatro raízes transgênicas independentes de cada um dos 2 tipos foram desenvolvidas em uma placa. Os dados mostrados são SE ± médios de 16 placas. O teste T foi realizado para comparar as médias entre a superexpressão do cDNA e controle. A origem genética usada neste experimento é a matriz tolerante PI 561271. FIG. 6C. Efeito do SAUR-FT superexpressado no desenvolvimento da raiz no solo. Vinte plantas transgênicas de compostos transgênicos independentes de cada um dos 2 tipos foram construídas e desenvolvidas nos vasos. O teste T foi realizado para comparar as médias entre a superexpressão do cDNA e controle. FIG. 6D. Efeito do SAUR-FT superexpressado na tolerância ao encharcamento no solo. Doze plantas transgênicas de compostos transgênicos independentes de cada um dos 2 tipos foram construídas e desenvolvidas nos vasos. As plantas foram submetidas ao estresse de encharcamento por 10 dias e deixadas recuperar por 7 dias. A origem genética usada neste experimento é a matriz tolerante PI 561271.

[0017] As FIGS. 7A-7C apresentam o envolvimento de auxina na regulação da tolerância ao encharcamento. A complementação de qWL_Gm03 pelo inibidor da biossíntese da auxina na tolerância ao encharcamento (FIG. 7A) e a indução de raízes adventícias (FIG. 7B). As duas linhagens foram o encharcamento tratado por 10 dias usando água (controle) e ácido p-clorofen-oxisobutírico (PCIB: um inibidor na biossíntese da auxina). Então, as plantas foram deixadas recuperar por 7 dias (esquerda) antes da avaliação para as classificações de dano relativo ao alagamento e classificação da raiz adventícia. Os dados mostrados são desvios padrão ± médios de 9 réplicas biológicas (vasos) e cada réplica contém 2 a 3 plantas. O teste t de Student foi usado para comparar as médias entre NIL147_aa e NIL147_AA. FIG. 7C. A expressão de GmARF20 nas raízes durante o tratamento de encharcamento. GmARF20 em soja é o homólogo mais próximo de AtARF19 em Arabidopsis (Ha et al. 2013). Os dados mostrados são desvios padrão ± médios de duas réplicas biológicas e cada réplica contém 10 plantas.

[0018] As FIGS. 8A-8F apresentam os papéis de qWL_Gm03 no rendimento. FIG. 8A Imagens das NILS no campo no estágio reprodutivo, R5. Os rendimentos (FIG. 8B) os pesos de 100 sementes (FIG. 8C) das NILS no campo. Os dados mostrados são desvios padrão ± médios do rendimento estimado de fileiras de 2,44 m com três replicações. Oitenta sementes foram plantadas para cada fileira com um espaçamento entre as fileiras de 0,76 m. As porcentagens nas colunas indicam a porção que aumentou em “AA” comparada com “aa”. (FIG. 8D) Imagens representativas das raízes de NILs no estágio de desenvolvimento R5 a partir do campo. (FIG. 8E) Diferença genotípica na área radicular no estágio R5 entre as NILS. Os dois conjuntos de NILs foram plantados sob condições sem estresse. As imagens das raízes foram analisadas usando o processamento de imagens digitais das raízes. Os dados mostrados são desvios padrão ± médios de 10 plantas para cada linhagem. (FIG. 8F) Rendimento das NILS em estufa. Os dados mostrados são desvios padrão ± médios do rendimento estimado para uma planta única com base em 22 plantas para cada linhagem. O teste t de Student foi realizado para comparar as médias de traços entre NILs com o alelo sensível “aa” e o alelo tolerante “AA”.

[0019] As FIGS. 9A-9D apresentam os papéis de qWL_Gm03 na tolerância à seca. (a) Imagens das NILS na estufa. Vinte plantas para cada linhagem foram plantadas em cones (com 1,2 m de profundidade e 20 cm em diâmetro). O estresse da seca através da retenção de água foi aplicado às plantas no estágio de desenvolvimento R1 por 14 dias. (b) os potenciais hidrofílicos das NILS durante o estresse da seca. Os dados mostrados são desvios padrão ± médios de 10 plantas para cada linhagem em cada momento. (c) teor de água das NILS depois do tratamento da seca. Os dados mostrados são desvios padrão ± médios de 10 plantas para cada linhagem. (d) densidades do comprimento da raiz das NILS. As raízes foram colhidas depois do experimento. As imagens escaneadas das raízes foram analisadas usando software WinRhizo Pro. Os dados mostrados são erros padrão médios ± de 20 plantas para cada linhagem. Os testes t de Student foram realizados para comparar as médias de traços entre NILs com o alelo sensível “aa” e o alelo tolerante “AA”.

[0020] A FIG. 10 apresenta um modelo hipotético de tolerância ao encharcamento regulado por qWL_Gm03. As setas indicam o melhoramento ou promoção e as barras indicam a inibição ou supressão. As setas ou barras sugerem os efeitos de melhoramento ou danificação, respectivamente. “WL” e “DT” se referem ao encharcamento e seca, respectivamente.

[0021] A FIG. 11 apresenta o esquema de reprodução para desenvolver população de linhagem natural recombinante e linhagens quase isogênicas (NILs) para qWL_Gm03. “a” e “A” se referem aos alelos de qWL_Gm03 a partir de S99-2281 e PI 561271, respectivamente.

[0022] As FIGS. 12A e 12B apresentam diferenças genotípicas na recuperação da planta depois do transplante. FIG. 12A. Imagens das NILs na estufa depois de 14 dias do transplante. FIG. 12B. Imagens das raízes das NILs na estufa depois de 14 dias do transplante. As plantas foram transplantadas em vasos maiores no estágio de desenvolvimento V1. Todas as plantas têm raízes em quantidade similar deixadas durante o transplante.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0023] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um versado na técnica à qual a divulgação pertence. Embora qualquer método e material similar a ou equivalente àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo.

[0024] Embora a presente divulgação seja suscetível a várias modificações e formas alternativas, as modalidades exemplificadoras das mesmas são mostradas a título de exemplo nos desenhos e são descritas no presente documento em detalhes. Deve se compreender, no entanto, que a descrição de modalidades exemplificadoras não pretende limitar a divulgação às formas específicas divulgadas, mas pelo contrário, a intenção é cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas que caem dentro do escopo da divulgação conforme definido pelas modalidades acima e as reivindicações abaixo. A referência deve ser portanto feita às modalidades acima e reivindicações abaixo para interpretação do escopo da presente divulgação.

[0025] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um versado na técnica à qual a divulgação pertence. Embora qualquer método e material similar a ou equivalente àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os métodos e materiais preferidos são descritos no presente documento. Além do mais, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto claramente necessite que seja um e apenas um elemento. O artigo indefinido "um" ou "uma" assim geralmente inclui "pelo menos um".

[0026] São divulgados no presente documento plantas modificadas e métodos de produção de plantas modificadas usando as regiões genômicas (4 pares de kilo base incluindo promotor, região não traduzida 5’, região codificadora, região não traduzida 3’) subjacentes ao gene SAUR_FT (Glyma.03g029600) no cromossomo 3 na soja. As plantas e métodos descritos no presente documento resultam em arquitetura do sistema radicular melhorada, tolerância ao encharcamento, resistência à seca e rendimento.

[0027] Conforme usado no presente documento, uma sequência de "ácido nucleico" significa uma sequência de DNA ou RNA. O termo abrange sequências que incluem qualquer um dos análogos de base de DNA e RNA tais como, porém sem se limitar a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi- N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracila, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5- carboximetilaminometil-2-tiouracila, 5-carboximetilaminometiluracila, diidrouracila, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1- metilpseudouracila, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina,

2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5- metoxiaminometil-2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarbonilmetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, metil éster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil- 5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5- metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metil éster de ácido -uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina e 2,6-diaminopurina.

[0028] Conforme usado no presente documento, "recombinante" quando usado em conexão com a molécula de ácido nucleico, significa uma molécula que foi criada ou modificada através de intervenção humana deliberada tal como através da engenharia genética. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante é uma que tem a sequência nucleotídica que foi modificada para incluir uma sequência nucleotídica artificial ou para incluir alguma outra sequência nucleotídica que não está presente dentro de sua forma nativa (não recombinante).

[0029] Além disso, uma molécula de ácido nucleico recombinante tem uma estrutura que não é idêntica àquela de qualquer molécula de ácido nucleico de ocorrência natural ou àquela de qualquer fragmento de uma molécula de ácido nucleico genômica de ocorrência natural abrangendo mais de um gene. Uma molécula de ácido nucleico recombinante também inclui, sem limitação, (a) a molécula de ácido nucleico que tem uma sequência de uma molécula de ácido nucleico genômica ou extracromossômica de ocorrência natural, mas que não é flanqueada pelas sequências codificadoras que flanqueiam a sequência em sua posição natural; (b) a molécula de ácido nucleico incorporada em um construto, cassete ou vetor de expressão, ou em um genoma da célula hospedeira de forma que o polinucleotídeo resultante não seja idêntico a qualquer vetor ou DNA genômico de ocorrência natural; (c)

uma molécula de ácido nucleico separada tal como um cDNA, um fragmento genômico, um fragmento produzido pela reação em cadeia polimerase (PCR) ou um fragmento de restrição; e (d) uma molécula de ácido nucleico recombinante tendo uma sequência nucleotídica que é parte de um gene híbrido (isto é, um gene que codifica uma proteína de fusão). Como tal, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode ser modificada (quimicamente ou enzimaticamente) ou DNA ou RNA não modificado, seja totalmente ou parcialmente de filamento único ou filamento duplo ou ainda filamento triplo.

[0030] Os métodos para sintetizar moléculas de ácido nucleico são bem conhecidos na técnica, tais como clonagem e digestão das sequências apropriadas, assim como síntese da química direta (por exemplo, deposição em jato de tinta e síntese eletroquímica). Os métodos de clonagem das moléculas de ácido nucleico são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (1995), supra; Copeland et al. (2001) Nat. Rev. Genet. 2:769-779; PCR Cloning Protocols, 2nd ed. (Chen & Janes eds., Humana Press 2002); e Sambrook & Russell (2001), supra. Os métodos de síntese química direta das moléculas de ácido nucleico incluem, porém não se limitam aos métodos de fosfotriéster de Reese (1978) Tetrahedron 34:3143-3179 e Narang et al. (1979) Methods Enzymol. 68:90-98; o método de fosfodiéster de Brown et al. (1979) Methods Enzymol. 68:109-151; o método de dietilfosforamidato de Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; e os métodos de suporte sólido de Fodor et al. (1991) Science 251:767-773; Pease et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026; e Singh-Gasson et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:974-978; assim como Patente Norte- americana No. 4,485,066. Vide também, Peattie (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1760-1764; assim como Patente EP No. 1 721 908; Publicação do pedido de patente Internacional Nos. WO 2004/022770 e WO 2005/082923; Publicação do pedido de Patente Norte-americana

No. 2009/0062521; e Patentes Norte-americanas Nos. 6,521,427; 6,818,395 e 7,521,178.

[0031] Para as sequências nucleotídicas, "variante" se refere a uma sequência nucleotídica substancialmente similar a uma sequência nucleotídica de uma molécula de ácido nucleico recombinante conforme descrito no presente documento, por exemplo, uma sequência nucleotídica substancialmente similar que codifica uma proteína de SAUR_FT. Para as sequências nucleotídicas, uma variante compreende uma sequência nucleotídica tendo deleções (isto é, truncações) na extremidade 5' e/ou 3', deleções e/ou adições de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos comparado com a sequência nucleotídica das moléculas recombinantes de ácidos nucleicos conforme descritas no presente documento; e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios comparado com a sequência nucleotídica das moléculas recombinantes de ácidos nucleicos descritas no presente documento. Um versado na técnica compreende que as variantes são construídas de uma maneira a manter a fase de leitura aberta.

[0032] As variantes conservadoras incluem aquelas sequências nucleotídicas que, devido à degeneração do código genético, resultam em uma proteína de SAUR_FT modificada funcionalmente ativa conforme descrita no presente documento. As variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas por técnicas de biologia molecular bem conhecidas tais como, por exemplo, técnicas de reação em cadeia polimerase (PCR) e técnicas de hibridização. As sequências nucleotídicas variantes também podem incluir sequências sinteticamente derivadas, tais como aquelas geradas, por exemplo, através da mutagênese sítio-direcionada porém as quais ainda proveem uma proteína de SAUR_FT modificada funcionalmente ativa. Em geral, as variantes da sequência nucleotídica das moléculas recombinantes de ácidos nucleicos conforme descritas no presente documento terão pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade sequencial com as sequências nucleotídicas das moléculas recombinantes de ácidos nucleicos conforme determinado pelos programas e parâmetros de alinhamento sequencial conforme descritos em algum outro lugar no presente documento.

[0033] Os métodos de mutação e alteração das sequências nucleotídicas, assim como embaralhamento do DNA, são bem conhecidos na técnica. Vide, Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; e Techniques in Molecular Biology (Walker & Gaastra eds., MacMillan Publishing Co. 1983) e as referências citadas no presente documento; assim como as Patentes Norte-americanas Nos. 4,873,192; 5,605,793 e 5,837,458. Como tais, as moléculas de ácidos nucleicos conforme descritas no presente documento podem ter muitas modificações.

[0034] As variantes das moléculas recombinantes de ácidos nucleicos descritas no presente documento também podem ser avaliadas através da comparação da identidade sequencial percentual entre o polipeptídeo codificado por uma variante e o polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucleico de referência. Sendo assim, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser uma que codifica um polipeptídeo com uma dada identidade sequencial percentual com o polipeptídeo de interesse. A identidade sequencial percentual entre quaisquer dois polipeptídeos pode ser calculada usando os programas e parâmetros de alinhamento sequencial descritos em algum lugar no presente documento. Quando qualquer dado par de polinucleotídeos da presente divulgação é avaliado através de comparação da identidade sequencial percentual compartilhada pelos dois polipeptídeos que eles codificam, a identidade sequencial percentual entre os dois polipeptídeos codificados pode ser de pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade sequencial.

[0035] A determinação da identidade sequencial percentual entre qualquer de duas sequências pode ser alcançada usando um algoritmo matemático. Os exemplos não limitantes dos referidos algoritmos matemáticos incluem, porém não se limitam ao algoritmo de Myers & Miller (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489; o algoritmo de alinhamento global de Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443- 453; o método de alinhamento de busca local de Pearson & Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin & Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-

5877.

[0036] A presente divulgação portanto inclui moléculas recombinantes de ácidos nucleicos tendo uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de substrato modificado de uma protease patógeno-específica, onde a proteína de substrato modificado tem uma sequência de reconhecimento de protease heteróloga e pode ser incorporada em construtos de ácido nucleico tais como cassetes e vetores de expressão.

[0037] As composições da presente divulgação também incluem construtos de ácido nucleico, tais como cassetes ou vetores de expressão, tendo promotores de plantas ligados operacionalmente com a molécula de ácido nucleico que codifica proteínas SAUR_FT para uso na transformação de células de planta, partes de planta e plantas. Além disso, os construtos podem incluir uma molécula de ácido nucleico que codifica proteínas SAUR_FT, particularmente quando as referidas proteínas SAUR_FT são não nativas/não endógenas à célula da planta, parte da planta ou planta a ser transformada.

[0038] Conforme usado no presente documento, "construto de ácido nucleico" se refere a um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo composto de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou combinações dos mesmos tendo incorporado nos mesmos as sequências nucleotídicas descritas no presente documento. O construto de nucleotídeo pode ser usado para transformar organismos tais como plantas. Desta forma, os promotores de plantas operacionalmente ligados às sequências nucleotídicas para proteínas SAUR_FT e proteínas SAUR_FT modificadas conforme descritas no presente documento são providas em construtos de ácido nucleico para expressão em uma célula de planta, parte da planta ou planta.

[0039] Conforme usado no presente documento, "cassete de expressão" se refere a uma molécula de ácido nucleico tendo pelo menos uma sequência de controle operacionalmente ligada a uma sequência codificadora.

[0040] Conforme usado no presente documento, "operacionalmente ligada" significa que os elementos do cassete de expressão são configurados de forma a realizar a sua função usual. Sendo assim, as sequências de controle (isto é, promotores) operacionalmente ligados a uma sequência codificadora são capazes de efetuar a expressão da sequência codificadora. As sequências de controle não necessitam ser contíguas com a sequência codificadora, à medida que elas funcionem para direcionar a expressão das mesmas. Sendo assim, por exemplo, as sequências não traduzidas intervenientes, ainda transcritas, podem estar presentes entre um promotor e uma sequência codificadora, e a sequência promotora pode ainda ser considerada "operacionalmente ligada" a uma sequência codificadora.

[0041] Conforme usado no presente documento, a "sequência codificadora" ou "sequências codificadoras" se referem a uma sequência que codifica um polipeptídeo específico, e é uma sequência nucleotídica que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de mRNA) em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando colocado sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência codificadora são determinados por um códon de iniciação em um 5' (amino) terminal e um códon de parada de tradução em um 3' (carboxi) terminal. Uma sequência codificadora pode incluir sequências de ácido nucleico viral, cDNA do mRNA procariótico ou eucariótico, sequências de DNA genômico do DNA procariótico ou eucariótico, e ainda sequências de DNA sintético. Uma sequência de terminação de transcrição estará geralmente localizada 3' a uma sequência codificadora. Exemplos de sequências codificadoras para uso no presente documento incluem a sequência nucleotídica que codifica uma proteína SAUR_FT, uma proteína SAUR_FT modificada ou ambas.

[0042] Conforme usado no presente documento, "sequência de controle" ou "sequências de controle" se referem a promotores, sinais de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição e tradução, domínios reguladores a montante, origens de replicação, sítios internos de entrada dos ribossomos ("IRES"), intensificadores, e similares, os quais proveem coletivamente a replicação, transcrição e tradução de uma sequência codificadora em uma célula hospedeira recipiente. Nem todas essas sequências de controle necessitam estar sempre presentes à medida que a sequência codificadora selecionada seja capaz de ser replicada, transcrita e traduzida em uma célula hospedeira apropriada.

[0043] Conforme usado no presente documento, um "promotor" se refere a uma região nucleotídica compreendendo uma sequência reguladora de ácido nucleico (isto é, DNA), em que a sequência reguladora é derivada de um gene ou sinteticamente criada que é capaz de ligar RNA polimerase e iniciar a transcrição de uma sequência codificadora (direção 3’) a jusante. Vários promotores podem ser usados no cassete de expressão, incluindo o promotor nativo da proteína SAUR_FT modificada.

[0044] Alternativamente, os promotores podem ser selecionados com base em um resultado desejado. Os referidos promotores incluem "promotores constitutivos" (onde a expressão da sequência polinucleotídica operacionalmente ligada ao promotor é não regulada e deste modo contínua), "promotores induzíveis" (onde a expressão da sequência polinucleotídica operacionalmente ligada ao promotor é induzida por um analito, cofator, proteína reguladora, etc.), e "promotores repressíveis" (onde a expressão da sequência polinucleotídica operacionalmente ligada ao promotor é reprimida por um analito, cofator, proteína reguladora, etc.).

[0045] Conforme usado no presente documento, "promotor de planta" se refere a um promotor que administra a expressão em uma planta tal como um promotor constitutivo, induzível (por exemplo, induzível quimicamente, ambientalmente, através de patógeno ou lesão), repressível, preferido do tecido ou outro promotor para uso em plantas.

[0046] Exemplos de promotores constitutivos incluem, porém não se limitam ao promotor 1 de actina do arroz (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3399-3406; e Patente Norte-americana No. 5,641,876), o promotor CaMV 19S (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), o promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), o promotor nos (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5754- 5749), o promotor Adh (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

84:6624-6628), o promotor da sacarose sintase (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148), os promotores de ubiquitina e similares. Vide também, Patentes Norte-americanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 e 6,177,611.

[0047] Exemplos de promotores induzidos quimicamente incluem o promotor Tn2-2 do milho, que é ativado pelos protetores herbicidas de benzenossulfonamida; o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes; e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores de interesse induzíveis quimicamente incluem promotores esteroide-responsivos (por exemplo, os promotores induzíveis por glicocorticoide em Aoyama & Chua (1997) Plant J. 11:605-612; McNellis et al. (1998) Plant J. 14:247-257; e Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425); promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237; assim como Patentes Norte- americanas Nos. 5,814,618 e 5,789,156); promotores induzíveis por ABA e turgor, o promotor do gene de proteína de ligação à auxina (Schwob et al. (1993) Plant J. 4:423-432), o promotor do gene de UDP glicose flavonoide glicosil-transferase (Ralston et al. (1988) Genetics 119:185-187), o promotor do inibidor de MPI proteinase (Cordero et al. (1994) Plant J. 6:141-150), e o promotor do gene de gliceraldeido-3- fosfato desidrogenase (Kohler et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:1293- 1298; Martinez et al. (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565; e Quigley et al. (1989) J. Mol. Evol. 29:412-421). Também estão incluídos os sistemas induzíveis por benzenossulfonamida (Patente Norte-americana No. 5,364,780) e induzíveis por álcool (Publicações dos pedidos de Patente Internacionais Nos. WO 97/06269 e WO 97/06268) e promotores de glutationa S-transferase. Os promotores induzíveis quimicamente deste modo podem ser usados para modular a expressão da sequência nucleotídica de interesse em uma planta ao se aplicar um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível quimicamente, pelo qual a aplicação do produto químico induz a expressão genética, ou um promotor repressível quimicamente, pelo qual a aplicação do produto químico reprime a expressão genética. Vide também, Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89.

[0048] Outros promotores induzíveis incluem promotores a partir de genes induzivelmente regulados em resposta ao estresse ou estímulo ambiental tal como seca, patógenos, salinidade e lesões. Vide, Graham et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:6555-6560; Graham et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:6561-6564; e Smith et al. (1986) Planta 168:94-100. Os promotores induzíveis por lesão incluem o promotor de proteína do inibidor de metalocarboxipeptidase (Graham et al. (1981) Biochem. Biophys. Res. Comm. 101:1164-1170).

[0049] Exemplos de promotores preferidos dos tecidos incluem o promotor rbcS, os promotores ocs, nos e mas que têm maior atividade em raízes ou tecido foliar lesionado, um promotor truncado (−90 a +8) 35S que direciona expressão aumentada em raízes, um promotor do gene α-tubulina que direciona expressão em raízes, assim como promotores derivados dos genes de proteína de armazenamento de zeína que direcionam a expressão em endosperma. Os exemplos adicionais de promotores preferidos dos tecidos incluem os promotores dos genes codificando as proteínas de armazenagem de sementes (por exemplo, β-conglicinina, cruciferina, napina e faseolina), zeína ou proteínas de corpos oleosos (por exemplo, oleosina), ou promotores de genes envolvidos na biossíntese de ácido graxo (por exemplo, proteína carreadora da cila, estearoil-ACP desaturase e desaturases de ácido graxo (por exemplo, fad 2-1)) e promotores de outros genes expressados durante o desenvolvimento embrionário (por exemplo, Bce4; Kridl et al. (1991) Seed Sci.

Res. 1:209-219). Os exemplos adicionais de promotores específicos dos tecidos incluem o promotor lectina (Lindstrom et al. (1990) Dev.

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Biol. 13:347-354), o promotor da célula radicular (Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449), o promotor zeína do milho (Langridge et al. (1983) Cell 34:1015-1022; Kriz et al. (1987) Mol.

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Genet. 207:90-98; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449; e Wandelt et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2354), o gene globulina-1 (Belanger et al. (1991) Genetics 129:863-872), a α-tubulina, promotor de cab (Sullivan et al. (1989) Mol.

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PEPCase (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589), os promotores associados ao complexo do gene R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183), e os promotores de chalcona sintase (Franken et al. (1991) EMBO J. 10:2605-2612). Vide também, Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112:513-524; Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4:495-505; Hansen et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 254:337-343; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38:792-803; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23:1129-1138; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112:1331-1341; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6:157-168; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112:525-535; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35:773-778; and Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12:255-265.

[0050] Em alguns casos, o promotor preferido do tecido pode ser um promotor preferido de folha. Vide, Gan et al. (1995) Science 270:1986-1988; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-518; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-367; Matsuoka et al. (1993), supra; Orozco et al. (1993), supra; Yamamoto et al. (1994), supra; e Yamamoto et al. (1997), supra.

[0051] Em alguns casos, o promotor preferido do tecido pode ser um promotor preferido de raiz. Vide, Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25:681-691 (promotor rolB); Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207- 218 (gene de glutamina sintetase específico da raiz da soja); Keller & Baumgartner (1991) Plant Cell 3:1051-1061 (elemento de controle específico da raiz no gene GRP 1.8 da vagem francesa); Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:759-772 (promotor do gene VfENOD-GRP3) Miao et al. (1991) Plant Cell 3:11-22 (clone do cDNA de comprimento total codificando glutamina sintetase citosólica (GS), que é expressada em raízes e nódulos de raiz da soja); e Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:433-443 (promotor específico de raiz do gene manopina sintase

(MAS) de A. tumefaciens); vide também, Patentes Norte-americanas Nos. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 e 5,023,179. Da mesma forma, Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2:633- 641 descreve dois promotores específicos de raiz isolados dos genes de hemoglobina a partir da Parasponia andersonii não legume não fixadora de nitrogênio e da relacionada Trema tomentosa não legume não fixadora de nitrogênio. Leach & Aoyagi (1991) Plant Sci. 79:69-76 descreve uma análise dos promotores dos genes indutores de raiz rolC e rolD altamente expressados de Agrobacterium rhizogenes. Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343-335 descreve uma fusão genética a lacZ para mostrar que o gene do T-DNA de Agrobacterium que codifica octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2' é específico da raiz na planta intacta e estimulado pela lesão do tecido foliar.

[0052] Em alguns casos, o promotor preferido do tecido pode ser um promotor preferido de semente, o qual inclui ambos promotores "específicos de semente" (isto é, promotores ativos durante o desenvolvimento de sementes tais como promotores de proteínas de armazenagem de sementes) e promotores "germinadores de semente" (isto é, promotores ativos durante a germinação das sementes). Vide, Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108-113. Exemplos de promotores preferidos das sementes incluem o promotor Cim1 (mensagem induzida pela citoquinina); o promotor cZ19B1 (zeína 19 kDa de milho); o promotor de mio-inositol-1-fosfato sintase (milps) (Publicação do pedido de Patente Internacional No. WO 00/11177; e Patente Norte-americana No. 6,225,529); o promotor de γ-zeína; e o promotor de globulina 1 (Glb-1). Para monocotiledôneas, os promotores específicos de sementes incluem promotores a partir da zeína 15 kDa do milho, zeína 22 kDa, zeína 27 kDa, γ-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2 e Glb-1. Vide também, Publicação do Pedido de Patente

Internacional No. WO 00/12733, que divulga promotores preferidos de sementes a partir dos genes end1 e end2. Para dicotiledôneas, os promotores específicos de sementes incluem promotores a partir de β- faseolina do feijão, napina, β-conglicinina, lectina da soja, cruciferina e vicilina da ervilha (Czako et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 235:33-40). Vide também, Patente Norte-americana No. 5,625,136.

[0053] Em alguns casos, o promotor preferido do tecido pode ser um promotor preferido da haste. Exemplos de promotores preferidos da haste incluem o promotor do gene MS8-15 de milho (Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 98/00533; e Patente Norte- americana No. 5,986,174), e os promotores divulgados em Graham et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:729-735.

[0054] Em alguns casos, o promotor preferido do tecido pode ser um promotor preferido do tecido vascular. Por exemplo, um promotor preferido do tecido vascular pode ser usado para expressar a proteína SAUR_FT no tecido polipexilema e floema. Exemplos de promotores preferidos do tecido vascular incluem o promotor do gene de prunasina hidrolase da Prunus serotina (Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 03/006651), e os promotores divulgados na Patente Norte-americana No. 6,921,815.

[0055] Como uma alternativa para os promotores listados acima, em alguns casos um baixo nível de expressão é desejado e pode ser alcançado ao se usar um promotor fraco. Conforme usado no presente documento, "promotor fraco" significa um promotor que administra a dirige de uma sequência codificadora em um baixo nível. Conforme usado no presente documento, "baixo nível" significa em níveis de cerca de 1/1000 transcritos até cerca de 1/100,000 transcritos até cerca de 1/500,000 transcritos. Alternativamente, reconhece-se que promotor fraco também abrange promotores que são expressados em apenas umas poucas células e não em outras para dar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor é expressado em níveis inaceitavelmente altos, porções da sequência promotora podem ser deletadas ou modificadas para reduzir os níveis de expressão. Promotores fracos podem ser usados quando se designam cassetes de expressão para genes SAUR_FT. Exemplos de promotores constitutivos fracos incluem o promotor nuclear do promotor Rsyn7 (Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 99/43838 e Patente Norte-americana No. 6,072,050), o promotor nuclear 35S CaMV e similar. Outros promotores constitutivos fracos são descritos, por exemplo, nas Patentes Norte-americanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 e 6,177,611.

[0056] O cassete de expressão pode incluir outras sequências controle 5' a uma sequência codificadora. Por exemplo, o cassete de expressão pode incluir uma sequência líder 5', que pode agir para aumentar a tradução. Exemplos de sequências líder 5' podem incluir líderes picornavírus (por exemplo, líder do vírus da encefalomiocardite (EMCV); Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126- 6130); líderes potivírus (por exemplo, líder do vírus da gravura do tabaco (TEV); Gallie et al. (1995) Gene 165:233-238); líder de vírus do mosaico anão do milho (MDMV) (Allison et al. (1986) Virology 154:9-20); proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP; Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido a partir de mRNA de proteína revestida do vírus mosaico de alfafa (AMV RNA 94; Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al., "Eukaryotic viral 5′-leader sequences act as translational enhancers in eukaryotes and prokaryotes" 237-256 In: Molecular Biology of RNA (Cech ed., Liss 1989)); e líder do vírus mosqueado clorótico do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Vide também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol.

84:965-968; e Gallie (1996) Plant Mol. Biol. 32:145-158. Outros métodos ou sequências conhecidos para aumentar a tradução também podem usados, por exemplo, íntrons, e similares.

[0057] O cassete de expressão também pode incluir uma sequência codificadora para a proteína SAUR_FT modificada. Conforme discutido acima, a proteína SAUR_FT modificada inclui uma modificação do 5'- UTR da sequência genética de SAUR_FT.

[0058] A(s) sequência(s) de controle e/ou a sequência codificadora pode ser nativa/análoga à célula hospedeira ou uma à outra. Alternadamente, a(s) sequência(s) de controle e/ou sequência codificadora podem ser heterólogas à célula hospedeira ou uma à outra. Conforme usado no presente documento, "heteróloga" se refere a uma sequência que se origina de uma espécie estrangeira, ou se a partir da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou local genômico através da intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie a partir da qual o polinucleotídeo foi derivado, ou, se for da mesma espécie/espécie análoga, um ou ambos são substancialmente modificados a partir de sua forma original e/ou sítio genômico, ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado.

[0059] O cassete de expressão também pode incluir uma região de terminação transcricional e/ou translacional que é funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional (isto é, promotor), pode ser nativa com a sequência codificadora operacionalmente ligada, pode ser nativa com a planta de interesse, ou pode ser derivada de uma outra fonte (isto é, estrangeira ou heteróloga ao promotor, a sequência codificadora, a célula hospedeira da planta ou qualquer combinação das mesmas). As regiões de terminação estão tipicamente localizadas a jusante (direção 3') a partir da sequência codificadora. As regiões de terminação incluem o gene inibidor da proteinase da batata (PinII) ou o plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Vide por exemplo, Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141- 144; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; e Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149.

[0060] O cassete de expressão também pode incluir um ou mais ligantes. Conforme usado no presente documento, "ligante" se refere a uma sequência nucleotídica que funciona para ligar um elemento do cassete de expressão com um outro sem contribuir de outra forma para a transcrição ou tradução da sequência nucleotídica de interesse quando presente no cassete de expressão. O ligante pode incluir sequências de plasmídeo, sequências de restrição e/ou sequências de uma região não traduzida 5' (5'-UTR). O comprimento e sequência do ligante pode variar e pode ser de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 nucleotídeos ou mais em comprimento.

[0061] Como a expressão das proteínas SAUR_FT pode ser direcionada para tecidos específicos ou tipos celulares através do uso apropriado dos promotores, elas também podem ser direcionadas para diferentes locais dentro de uma célula de uma planta hospedeira através do uso apropriado das sequências peptídicas de sinal e/ou direcionamento. Diferente de um promotor, que age no nível transcricional, as sequências peptídicas de sinal e/ou direcionamento fazem parte do produto de tradução inicial. Deste modo, o cassete de expressão também pode incluir uma sequência peptídica de sinal e/ou direcionamento. Exemplos das referidas sequências incluem o peptídeo transitório para a proteína carreadora acila, a pequena subunidade de RUBISCO, EPSP sintase da planta e similar. Vide, Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22:789-810; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Daniell (1999) Nat. Biotech. 17:855-856; de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999; Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:20357- 20363; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414- 1421; Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:27447-27457; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3335-3342; Shah et al. (1986) Science 233:478-481; Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; e Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6081-6087; assim como Patente Norte-americana No. 6,338,168.

[0062] A orientação adicional no direcionamento subcelular das proteínas em plantas pode ser encontrada, por exemplo, em Bruce (2001) Biochim Biophys Acta 1541:2-21; Emanuelsson et al. (2000) J. Mol. Biol. 300:1005-1016; Emanuelsson & von Heijne (2001) Biochim Biophys Acta 1541:114-119; Hadlington & Denecke (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 3:461-468; Nicchitta (2002) Curr. Opin. Cell Biol. 14:412-416; e Silva-Filho (2003) Curr. Opin. Plant Biol. 6:589-595.

[0063] O cassete de expressão também pode incluir sequências nucleotídicas que codificam polipeptídeos agronômicos e pesticidas, e similares. As referidas sequências podem ser empilhadas com qualquer combinação de sequências nucleotídicas para criar células de plantas, partes de plantas e plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico que codifica as proteínas SAUR_FT pode ser empilhada com sequências nucleotídicas codificando um polipeptídeo pesticida tal como uma δ-endotoxina. As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquer uma das sequências nucleotídicas de interesse. Exemplos de outras sequências nucleotídicas de interesse incluem sequências que codificam óleo elevado (Patente Norte-americana No. 6,232,529); aminoácidos equilibrados (hordotioninas; Patentes Norte-americanas Nos. 5,703,409; 5,885,801; 5,885,802 e 5,990,389); lisina elevada na cevada (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 98/20122); elevadas proteínas metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279-6284; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359-370; e Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123-130); digestibilidade aumentada (proteínas de armazenagem modificadas; Patente Norte-americana No. 6,858,778); e tioredoxinas (Patente Norte-americana No. 7,009,087).

[0064] As sequências nucleotídicas que codificam as proteínas SAUR_FT também podem ser empilhadas com as sequências nucleotídicas codificando polipeptídeos para resistência a herbicidas (por exemplo, resistência ao glifosato ou HPPD; vide, por exemplo, genes EPSPS, genes GAT (Publicações do Pedido de Patente Internacional Nos. WO 02/36782 e WO 03/092360; e Publicação do Pedido de Patente Norte-americana No. 2004/0082770); lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825-830); destoxificação da fumonisina (Patente Norte-americana No. 5,792,931); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que levam à resistência ao herbicida tal como as mutações S4 e/ou Hra; inibidores de glutamina sintase tal como fosfinotricina ou basta (por exemplo, gene bar); amidos modificados (pirofosforilases ADPG (AGPase), sintases de amido (SS), enzimas de ramificação do amido (SBE) e enzimas de desramificação do amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (Patente Norte-americana No. 5,602,321); beta-cetotiolase, poliidroxibutirato sintase e acetoacetil-CoA redutase (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847).

[0065] As sequências nucleotídicas que codificam as proteínas SAUR_FT também podem ser empilhadas com sequências nucleotídicas que codificam traços agronômicos tais como esterilidade masculina (Patente Norte-americana No. 5,583,210), resistência do caule, tempo de floração ou traços de tecnologia de transformação tais como regulação do ciclo celular ou direcionamento genético (Publicação do Pedido de Patente Internacional Nos. WO 99/25821; WO 99/61619 e WO 00/17364).

[0066] Essas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo, porém sem se limitar ao cruzamento de plantas através de qualquer metodologia convencional ou TOPCROSS™ (DuPont Specialty Grains; Des Moines, IA), CRISPER/Cas, nucleases dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) ou outra transformação genética. Se os traços forem empilhados ao se transformar geneticamente as plantas, as sequências nucleotídicas de interesse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo um ou mais traços desejados pode ser usada como o alvo para introduzir mais traços através da transformação subsequente. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de co-transformação com os polinucleotídeos de interesse providos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências forem introduzidas, as duas sequências podem ser contidas em cassetes de expressão separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de expressão que suprimirá a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isto pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. Ainda se reconhece que as sequências polinucleotídicas podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada usando um sistema de recombinação sítio-específico. Vide, Publicações dos Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 99/25821; WO 99/25840; WO 99/25853; WO 99/25854 e WO 99/25855.

[0067] As sequências nucleotídicas podem ser otimizadas para expressão aumentada em plantas. Isto é, as sequências nucleotídicas podem ser sintetizadas usando códons preferidos de plantas para expressão melhorada. Os métodos para optimização das sequências nucleotídicas para expressão em plantas são bem conhecidos na técnica. Vide, Campbell & Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11; Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498; e Wada et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2367-2411; assim como as Patentes Norte-americanas Nos. 5,096,825; 5,380,831; 5,436,391; 5,625,136; 5,670,356 e 5,874,304.

[0068] Para auxiliar na introdução das sequências nucleotídicas de interesse nas células hospedeiras apropriadas, o cassete de expressão pode ser incorporado ou ligado em um vetor. Conforme usado no presente documento, "vetor" se refere a um replicon, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual um outro segmento de ácido nucleico pode ser ligado de forma a provocar a replicação do segmento ligado. Um vetor é capaz de transferir as moléculas de ácido nucleico às células hospedeiras. Os vetores bacterianos podem ser tipicamente de origem plasmídica ou de fagos.

[0069] Tipicamente, todos os termos "construto do vetor", "vetor de expressão", "vetor de expressão genética", "vetor de liberação genética", "vetor de transferência genética" e "cassete de expressão" se referem a um conjunto que é capaz de direcionar a expressão de uma sequência ou gene de interesse. Sendo assim, os termos incluem veículos de clonagem e expressão.

[0070] Os vetores tipicamente contêm um ou um número pequeno de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição onde a molécula de ácido nucleico de interesse pode ser inserida de uma forma determinável sem perda da função biológica essencial do vetor, assim como um marcador selecionável que pode ser usado para identificar e selecionar células transformadas com o vetor.

[0071] Um vetor pode então ser capaz de transferir a molécula de ácido nucleico a células alvo (por exemplo, vetores de plasmídeo bacteriano, veículos particulados e lipossomos). A seleção do vetor dependerá da técnica de transformação preferida e da espécie alvo para transformação. Os vetores de transformação de planta mais comumente usados são vetores binários devido a sua capacidade de se replicarem em células hospedeiras intermediárias tais como E. coli e A. tumefaciens. As células hospedeiras intermediárias permitem que se aumente o número de cópias do vetor de clonagem e/ou se medie a transformação de uma célula hospedeira diferente. Como um número de cópias aumentado, o vetor contendo o cassete de expressão de interesse pode ser isolado em quantidades significativas para introdução na planta desejada. As descrições gerais de vetores de planta podem ser encontradas, por exemplo, em Gruber et al., "Vectors for plant transformation" 89-119 In: Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology (Glich et al. eds., CRC Press 1993). Exemplos de vetores para uso com A. tumefaciens podem ser encontrados, por exemplo, na Patente Norte-americana No. 7,102,057.

[0072] As enzimas de restrição podem ser usadas para introduzir cortes na molécula de ácido nucleico alvo (por exemplo, sequência nucleotídica codificando uma proteína de substrato modificada e/ou proteína NB-LRR) e o plasmídeo para facilitar a inserção do alvo no vetor tal como um plasmídeo. Além do mais, os adaptadores da enzima de restrição tais como adaptadores EcoRI/NotI podem ser adicionados ao mRNA alvo quando os sítios da enzima de restrição desejados não estão presentes dentro deles. Os métodos de adição de adaptadores de enzima de restrição são bem conhecidos na técnica. Vide, Krebs et al. (2006) Anal. Biochem. 350:313-315; e Lönneborg et al. (1995), supra. Da mesma forma, kits para adição de sítios de enzima de restrição estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir da Invitrogen (Carlsbad, CA).

[0073] Alternativamente, vírus tais como bacteriófagos podem ser usados como o vetor para liberar o mRNA alvo em células hospedeiras competentes. Os vetores podem ser construídos usando técnicas de biologia molecular padronizadas, conforme descrito, por exemplo, em Sambrook & Russell (2001), supra.

[0074] Marcadores selecionáveis podem ser usados para identificar e selecionar plantas transformadas, partes de plantas ou células hospedeiras de plantas. Os marcadores selecionáveis incluem sequências nucleotídicas que codificam resistência a antibióticos, tais como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO), higromicina fosfotransferase (HPT), assim como as sequências nucleotídicas que codificam a resistência à ampicilina, canamicina, espectinomicina ou tetraciclina, e ainda sequências nucleotídicas que codificam compostos herbicidas tais como glufosinato de amônio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).

[0075] Os marcadores selecionáveis adicionais podem incluir marcadores fenotípicos tais como sequências de ácido nucleico que codificam β-galactosidase, β-glucoronidase (GUS; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); luciferase (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343-350); produção de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449-450), e proteínas fluorescentes tais como proteína fluorescente verde (GFP; Chalfie et al. (1994) Science 263:802-805; Fetter et al.

(2004) Plant Cell 16:215-228; e Su et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 85:610-619); proteína fluorescente cian (CYP; Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-954; e Kato et al. (2002) Plant Physiol. 129:913-942), e proteína fluorescente amarela (PhiYFP™, disponível da Evrogen (Moscow, Russia); Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-954). Para marcadores selecionáveis adicionais, Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Barkley & Bourgeois, "Repressor recognition of operator and effectors" 177-120 In: The Operon (Miller & Reznikoff eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press 1980); Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Gill et al. (1988) Nature 334:721-724; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Hlavka et al., Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag 1985); Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; e Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956.

[0076] O vetor, portanto, pode ser selecionado para permitir a introdução do cassete de expressão na célula hospedeira apropriada tal como uma célula hospedeira de planta. Os vetores bacterianos são tipicamente de origem plasmídica ou de fagos. As células bacterianas apropriadas são infectadas com partículas de vetor de fagos ou transfectadas com DNA do vetor de fagos puro. Se um vetor plasmídico for usado, as células são transfectadas com o DNA do vetor plasmídico.

[0077] As composições da presente divulgação também incluem células de plantas (transgênicas) transformadas, partes de plantas e plantas (isto é, as próprias células de plantas, partes da planta ou plantas) tendo pelo menos um traço de rendimento aumentado, crescimento radicular aumentado, tolerância ao encharcamento aumentada e tolerância à seca aumentada quando se compara com as células de plantas controle/nativas, partes da planta ou plantas. As composições da presente divulgação também incluem células de plantas modificadas, partes de plantas e plantas (isto é, as próprias células de plantas, partes da planta ou plantas) tendo pelo menos um traço de rendimento aumentado, crescimento radicular aumentado, tolerância ao encharcamento aumentada e tolerância à seca aumentada quando se compara com células de plantas controle/nativas, partes da planta ou plantas, em que a modificação é introduzida usando tecnologias de edição genética.

[0078] As células de plantas transformadas, partes da planta ou plantas podem ter pelo menos uma molécula de ácido nucleico, construto de ácido nucleico, cassete ou vetor de expressão tendo um gene SAUR_FT modificado conforme descrito no presente documento.

[0079] Conforme usado no presente documento, "a própria célula da planta", "própria parte da planta" ou "própria planta" se refere a uma uma na qual uma alteração genética, tal como transformação, foi efetuada em relação à molécula de ácido nucleico de interesse, ou é uma célula de planta, parte da planta ou planta que descendeu de uma célula de planta, parte da planta ou planta assim alterada e que compreende a alteração.

[0080] Conforme usado no presente documento, "célula da planta de controle", "parte da planta de controle" ou "planta de controle" se refere a um ponto de referência para medir modificações no fenótipo da própria célula da planta, parte da planta ou planta. Uma célula da planta de controle, parte da planta ou planta pode compreender, por exemplo: (a) uma célula da planta (nativa) do tipo selvagem, parte da planta ou planta (isto é, do mesmo genótipo que o material de partida para a alteração genética que resultou na própria célula da planta, parte da planta ou planta); (b) uma célula da planta, parte da planta ou planta do mesmo genótipo que o material de partida, mas que foi transformada com um construto nulo (isto é, com um construto que não teve efeito conhecido no trato de interesse, tal como um construto compreendendo um gene marcador); (c) uma célula da planta, parte da planta ou planta que é uma segregante não transformada dentre a progênie de uma própria célula da planta, parte da planta ou planta; (d) uma célula da planta, parte da planta ou planta geneticamente idêntica à própria célula da planta, parte da planta ou planta, mas que não é exposta a condições ou estímulos que induziriam a expressão do gene de interesse; ou (e) a própria célula da planta, parte da planta ou a própria planta, sob condições nas quais a molécula de ácido nucleico/construto de interesse não são expressados.

[0081] Os métodos de introdução das sequências nucleotídicas nas plantas, partes de plantas ou células hospedeiras de plantas são bem conhecidos na técnica.

[0082] Conforme usado no presente documento, "célula da planta" ou "células da planta" se referem a uma célula obtida de ou encontrada em sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. A célula da planta também inclui células modificadas, tais como protoplastos, obtidos dos tecidos mencionados anteriormente, assim como culturas do tecido da célula da planta a partir dos quais as plantas podem ser regeneradas, calos das plantas e touceiras das plantas.

[0083] Conforme usado no presente documento, "parte da planta" ou "partes da planta" se referem a órgãos tais como embriões, pólen, óvulos, sementes, flores, grãos, galhas, espigas, folhas, cascas, hastes, caules, raízes, pontas das raízes, anteras, seda e similares.

[0084] Conforme usado no presente documento, "planta" ou "plantas" se referem a plantas totais e sua progênie. A progênie, variantes e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídas, contanto que elas compreendam a molécula de ácido nucleico introduzida.

[0085] Conforme usado no presente documento, "grão" significa semente madura produzida por produtores comerciais para finalidades diferentes de desenvolver ou reproduzir a espécie. A classe de plantas que pode ser usada nos métodos descritos no presente documento é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores suscetíveis a técnicas de transformação, incluindo ambas as plantas monocotiledôneas (monocots) e dicotiledôneas (dicots).

[0086] Exemplos de espécies de plantas de interesse no presente documento incluem, porém não se limitam ao milho (Zea mays), Brassica spp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas da espécie Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, milheto pérola (Pennisetum glaucum), milheto proso (Panicum miliaceum), painço (Setaria italica), capim pé de galinha (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max),

tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), aipim (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), castanha de caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterrabas açucareiras (Beta vulgaris), cana de açúcar (Saccharum spp.), aveia (Avena sativa), cevada (Hordeum vulgare), leguminosas, plantas ornamentais e coníferas.

[0087] As leguminosas de interesse incluem, porém não se limitam a, tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagens (Phaseolus vulgaris), feijão verde (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis tais como pepino (C. sativus), melão cantalupo (C. cantalupensis), e melão (C. melo).

[0088] As plantas ornamentais de interesse incluem, porém não se limitam a, azaléa (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo.

[0089] Conifers de interesse incluem, porém não se limitam aos pinheiros tais como pinheiro loblolly (Pinus taeda), pinheiro americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro contorta (Pinus contorta) e pinheiro Monterey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); cicuta oriental (Tsuga canadensis); abeto branco (Picea glauca); sequoia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros tais como abeto de prata (Abies amabilis) e bálsamo abeto (Abies balsamea); e cedros tais como tuia gigante (Thuja plicata) e cipreste do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis).

[0090] Em alguns casos, as células das plantas, partes da planta ou plantas de interesse são plantas cultivadas (por exemplo, milho, alfafa, girassol, brássica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.).

[0091] Outras plantas de interesse incluem plantas de grãos que proveem sementes de interesse, plantas com sementes oleosas e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de grãos, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. As plantas com sementes oleosas incluem algodão, soja, cártamo, girassol, Brássicas, milho, alfafa, palma, coco, etc. As plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, alfarroba, feno- grego, soja, feijões comuns, feijão fradinho, feijão mungu, feijão verde, feijão de fava, lentilhas, grão de bico, etc.

[0092] Os métodos da presente divulgação incluem a introdução e expressão em uma célula de planta, parte da planta ou planta a molécula de ácido nucleico ou construto conforme descrito no presente documento. Conforme usado no presente documento, "introdução" se refere à apresentação na célula da planta, parte da planta ou planta, de uma molécula de ácido nucleico ou construto de uma tal forma que ela ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos não dependem do método específico para introdução da molécula de ácido nucleico ou construto de ácido nucleico na célula da planta, parte da planta ou planta, apenas que ele ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta ou parte da planta. Os métodos de introdução de sequência nucleotídicas, seleção de transformantes e regeneração de plantas completas, que podem requerer modificação rotineira em relação a uma espécie específica de planta, são bem conhecidos na técnica. Os métodos incluem métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transitórios, métodos mediados por vírus e reprodução sexual. Como tal, a molécula de ácido nucleico ou construto pode ser carregado na forma epissomal ou integrado no genoma da célula hospedeira.

[0093] Os métodos de a presente divulgação incluem introduzir modificações ao promotor, região não traduzida 5’, região codificadora, região não traduzida 3’ do gene SAUR_FT usando tecnologias de edição genética. As tecnologias de edição genética adequadas incluem, por exemplo, tecnologias CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas) incluindo CRISPR/Cas9 e CRISPR/Cpf1, tecnologias de edição genética da nuclease dedo de zinco e tecnologias de edição genética TALEN (nuclease efetora do tipo ativador de transcrição).

[0094] Conforme usado no presente documento, "transformação estável" significa que a molécula de ácido nucleico ou construto de interesse introduzido na planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pela progênie do mesmo. Conforme usado no presente documento, "transformação transitória" significa que a molécula de ácido nucleico ou construto de interesse introduzido na planta não é herdado pela progênie.

[0095] Os métodos de transformação das plantas e introdução de uma sequência nucleotídica de interesse em plantas pode e variará dependendo do tipo de planta, parte da planta ou célula hospedeira da planta (isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea) direcionada para transformação. Os métodos de introdução das sequências nucleotídicas em células hospedeiras de plantas portanto incluem transformação mediada por Agrobacterium (por exemplo, A. rhizogenes ou A. tumefaciens; Patentes Norte-americanas Nos. 5,563,055 e 5,981,840), cloreto de cálcio, transferência genética direta (Paszkowski et al. (1984)

EMBO J. 3:2717-2722), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), bombardeamento de microprojéteis/aceleração de partículas (McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926; e Tomes et al., "Direct DNA transfer into intact plant cells via microprojectile bombardment" In: Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods (Gamborg & Phillips eds., Springer-Verlag 1995); assim como as Patentes Norte-americanas Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244 e 5,932,782), polietileno glicol (PEG), infecção por fagos, infecção viral e outros métodos conhecidos na técnica. Vide também, Patentes EP Nos. 0 295 959 e 0 138 341.

[0096] A molécula de ácido nucleico ou construto conforme descrito acima no presente documento pode ser introduzido na célula da planta, parte da planta ou planta usando uma variedade de métodos de transformação transitória. Os métodos de transformação de forma transitória as células das plantas, partes da planta ou plantas incluem, porém não se limitam a, infecção por Agrobacterium, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Vide, Crossway et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185; Hepler et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2176-2180; Hush et al. (1994) J. Cell Sci. 107:775-784; e Nomura et al. (1986) Plant Sci. 44:53-58. Alternativamente, a célula da planta, parte da planta ou planta pode ser transformada por sistemas de vetor viral ou através da precipitação da molécula de ácido nucleico ou construto de uma forma que impede a liberação subsequente do DNA. Sendo assim, a transcrição a partir da sequência nucleotídica ligada à partícula pode acontecer, porém a frequência com a qual ela é liberada para se tornar integrada no genoma é amplamente reduzida. Os referidos métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma; St. Louis, MO).

[0097] Da mesma forma, as moléculas de ácido nucleico ou construtos conforme descritos no presente documento podem ser introduzidos na célula da planta, parte da planta ou planta através do contato deles com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Em geral, os referidos métodos envolvem incorporar a molécula de ácido nucleico ou construto dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral. Reconhece-se que as sequências nucleotídicas podem ser inicialmente sintetizadas como parte de uma poliproteína viral, a qual pode ser posteriormente processada através da proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Os métodos para introdução das sequências nucleotídicas em plantas e expressão da proteína codificada nas mesmas, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são bem conhecidos na técnica. Vide, Porta et al. (1996) Mol. Biotechnol. 5:209-221; assim como as Patentes Norte-americanas Nos. 5,866,785; 5,889,190; 5,889,191 e 5,589,367.

[0098] Os métodos também são conhecidos na técnica para a inserção direcionada da molécula de ácido nucleico ou construto em uma localização específica no genoma da planta. Em alguns casos, a inserção da molécula de ácido nucleico ou construto em uma localização genômica desejada pode ser alcançada ao se usar um sistema de recombinação sítio-específico. Vide, Publicações do Pedido de Patente Internacional Nos. WO 99/025821, WO 99/025854, WO 99/025840, WO 99/025855 e WO 99/025853.

[0099] As técnicas de transformação para as “monocots” portanto são bem conhecidas na técnica e incluem captação genética direta de moléculas de ácidos nucleicos exógenos ou construtos por protoplastos ou células (por exemplo, através da captação mediada por PEG ou eletroporação, e bombardeamento de partículas em tecido caloso). A transformação de monocots através de Agrobacterium também foi descrita. Vide, Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 94/00977 e Patente Norte-americana No. 5,591,616; vide também,

Christou et al. (1991) Bio/Technology 9:957-962; Datta et al. (1990) Bio/Technology 8:736-740; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833- 844; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618; Koziel et al. (1993) Bio/Technology 11:194-200; Murashige & Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15:473-497; Shimamoto et al. (1989) Nature 338:274-276; Vasil et al. (1992) Bio/Technology 10:667-674; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11:1553-1558; Weeks et al. (1993) Plant Physiol. 102:1077-1084; e Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep. 7:379-384; assim como Pedidos de Patente EP Nos. 0 292 435; 0 332 581 e 0 392 225; Publicações do Pedido de Patente Internacional Nos. WO 93/07278 e WO 93/21335; e Patente Norte-americana No. 7,102,057.

[00100] As técnicas de transformação para “dicots” também são bem conhecidas na técnica e incluem técnicas mediadas por Agrobacterium e técnicas que não necessitam de Agrobacterium. As técnicas mediadas por não Agrobacterium incluem a captação direta das moléculas de ácidos nucleicos exógenos por protoplastos ou células (por exemplo, através de captação mediada por PEG ou eletroporação, bombardeamento de partículas ou microinjeção). Vide, Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717- 2722; Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:169-177; e Reich et al. (1986) Bio/Technology 4:1001-10041; assim como a Patente Norte- americana No. 7,102,057.

[00101] As células das plantas que foram transformadas podem ser tornadas em plantas através dos métodos bem conhecidos na técnica, Vide, McCormick et al. (1986) Plant Cell Rep. 5:81-84. Essas plantas podem então ser desenvolvidas, e tanto polinizadas com a mesma cepa transformada ou diferentes cepas, e a progênie resultante tendo a característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada, e que então as sementes sejam colhidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada seja alcançada.

[00102] Composições, sistemas e métodos são providos para conferir pelo menos um traço de rendimento aumentado, crescimento radicular aumentado, tolerância ao encharcamento aumentada e tolerância à seca aumentada ao se modificar um gene que codifica a tolerância ao alagamento da proteína pequena de auxina suprarregulada (SAUR_FT). Em resumo, as composições, sistemas e métodos são baseados na modificação da região não traduzida 5' de SAUR_FT. Conforme usado no presente documento, tolerância ao alagamento da proteína pequena de auxina suprarregulada (SAUR_FT) se refere a SAUR_FT de Glycine max (soja), homólogos de SAUR_FT e ortólogos de SAUR_FT.

[00103] Conforme usado no presente documento, "encharcamento" se refere a uma condição onde o sistema radicular de uma planta está totalmente submerso (solo completamente saturado), mas os órgãos acima do solo da planta estão respirando. A tolerância aumentada ao encharcamento pode incluir estratégias de sobrevivência da planta em relação à aeração do tecido radicular e modificações na arquitetura radicular tal como desenvolvimento de aerênquima, estabelecimento de exoderme suberizada, desenvolvimento de raízes rasas e adventícias (brotos nascendo) e combinações dos mesmos.

[00104] Os métodos descritos no presente documento incluem introduzir em uma célula de planta, uma parte de planta ou uma planta em pelo menos uma molécula de ácido nucleico, construto, cassete ou vetor de expressão conforme descritos no presente documento para conferir pelo menos um traço de rendimento aumentado, crescimento radicular aumentado, tolerância ao encharcamento aumentada e tolerância à seca aumentada ao se modificar um que codifica a tolerância ao alagamento da proteína pequena de auxina suprarregulada (SAUR_FT).

[00105] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a uma planta compreendendo pelo menos uma de uma região não traduzida 5' modificada do gene de tolerância ao alagamento da proteína pequena de auxina suprarregulada (SAUR_FT), uma região não traduzida 5' modificada do homólogo do gene SAUR_FT e um ortólogo do gene SAUR_FT. Em uma modalidade, a planta é uma planta transgênica.

[00106] A região não traduzida 5' modificada do gene SAUR_FT compreende uma inserção poli-A. Adequadamente, a inserção poli-A é pelo menos uma inserção nucleotídica de 11 pares de base.

[00107] A planta inclui pelo menos um traço de rendimento aumentado, crescimento radicular aumentado, tolerância ao encharcamento aumentada e tolerância à seca aumentada conforme comparado com uma planta não tendo a região não traduzida 5' modificada do gene da tolerância ao alagamento da proteína pequena de auxina suprarregulada (SAUR_FT), a região não traduzida 5' modificada do homólogo do gene SAUR_FT e o ortólogo do gene SAUR_FT.

[00108] A planta inclui cerca de 1,5 vez a cerca de 2 vezes mais raízes adventícias/aéreas do que uma planta não compreendendo a região não traduzida 5' modificada do gene SAUR_FT.

[00109] Plantas adequadas são plantas cultivadas.

[00110] Em um outro aspecto, a presente divulgação se refere a uma semente da planta.

[00111] Em um outro aspecto, a presente divulgação se refere a uma célula da planta.

[00112] Em um outro aspecto, a presente divulgação se refere a uma progênie da planta.

[00113] Em um outro aspecto, a presente divulgação se refere a um método de seleção de uma planta tendo pelo menos um dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, tolerância ao encharcamento aumentada, tolerância à seca aumentada, rendimento aumentado, e combinações dos mesmos, o método compreendendo obter uma amostra da planta e analisar o gene de tolerância ao alagamento da proteína pequena de auxina suprarregulada (SAUR_FT).

[00114] O método pode ainda incluir determinar se a planta inclui pelo menos um dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, tolerância ao encharcamento aumentada, tolerância à seca aumentada, e combinações dos mesmos quando a região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT compreende uma inserção poli-A.

[00115] O método pode ainda incluir analisar a região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT.

[00116] O método pode ainda incluir determinar se a planta tem pelo menos um dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, tolerância ao encharcamento aumentada, tolerância à seca aumentada, e combinações dos mesmos quando a região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT compreende uma inserção poli-A.

[00117] Adequadamente, a inserção poli-A é pelo menos uma inserção nucleotídica de 11 pares de base.

[00118] O método pode ainda incluir contactar a amostra com um agente que se liga especificamente a uma sequência de ácido nucleico de SAUR_FT. As sequências de ácido nucleico de SAUR_FT adequadas incluem, por exemplo, uma sequência genética de SAUR_FT, uma sequência de DNA de SAUR_FT e uma sequência de RNA de SAUR_FT. O método pode ainda incluir contactar a amostra com um agente que se liga especificamente a uma proteína SAUR_FT. Os agentes adequados que especificamente se ligam a SAUR_FT incluem por exemplo, um ácido nucleico que é complementar a uma sequência genética de SAUR_FT, uma sequência de DNA de SAUR_FT e uma sequência de RNA de SAUR_FT. Os agentes adequados que especificamente se ligam à proteína SAUR_FT incluem anticorpos, por exemplo. A planta pode ser selecionada através da determinação de uma expressão reduzida de SAUR_FT conforme comparado com a expressão de SAUR_FT em uma planta do tipo selvagem/nativa. Uma planta pode ser selecionada por pelo menos uma arquitetura do sistema radicular aumentada, uma tolerância ao encharcamento aumentada, uma tolerância à seca aumentada, e combinações das mesmas, com base na presença de uma sequência localizada em cerca de 1 até cerca de nucleotídeos de 780 bp a partir do sítio de iniciação usando Gene ID Glyma 03G029600 como uma sequência de referência. A inserção pode ser uma inserção de ácido nucleico poli A. Adequadamente, a inserção pode ser pelo menos uma inserção de 11 bp.

[00119] Em um outro aspecto, a presente divulgação se refere a um método de produção de uma planta incluindo pelo menos uma dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, uma tolerância ao encharcamento aumentada, uma tolerância à seca aumentada, e combinações das mesmas, o método compreendendo: reduzir a expressão do gene da tolerância ao alagamento da proteína pequena de auxina suprarregulada (SAUR_FT). Em uma modalidade a planta é uma planta transgênica. Em uma outra modalidade, a planta é produzida usando uma tecnologia de edição genética.

[00120] Adequadamente, a expressão do gene SAUR_FT pode ser reduzida pela modificação da região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT. A região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT pode ser modificada ao se criar uma inserção na região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT. Adequadamente, a inserção é criada em um sítio localizado em cerca de 1 até cerca de nucleotídeos de 780 bp a partir do sítio de iniciação. O sítio de iniciação pode ser determinado usando Gene ID Glyma 03G029600 como uma sequência genética de referência.

[00121] A inserção pode incluir uma inserção poli-A. Adequadamente, a inserção pode ser pelo menos uma inserção nucleotídica de 11 pares de base.

EXEMPLOS Materiais e métodos Materiais de planta e teste de encharcamento

[00122] Uma população de mapeamento da soja foi desenvolvida a partir de um cruzamento S99-2281 × PI 561271, a partir do qual as plantas foram randomicamente selecionadas e avançadas através da descendência de semente única para produzir 182 linhagens naturais recombinantes (RILs) derivadas de F7 (FIG. 11). As RILs foram avançadas mais uma geração para aumentar as sementes no campo de Delta Research Center (DRC) da University of Missouri, Portageville, MO. As linhagens quase isogênicas (NILs) para qWL_Gm03 foram identificadas a partir de famílias naturais heterogêneas na geração F8 (FIG. 11). Duas únicas plantas F8, as quais têm genótipos heterozigóticos na região qWL_Gm03, foram selecionadas a partir das famílias RIL147 e RIL221. Dois conjuntos de NILs (NIL147_aa/AA e NIL221_aa/AA) foram selecionados nas populações de progênie dessas duas plantas F8. Três recombinantes com cruzamento na região candidata de qWL_Gm03 foram selecionados a partir da população de progênie de NIL147_Aa para mapeamento preciso de qWL_Gm03 (FIG. 11).

[00123] O teste de encharcamento foi realizado tanto no campo quanto na estufa. Os testes no campo para populações de RIL e o mapeamento preciso foram conduzidos na Lee Farm no DRC em Portageville, MO. A avaliação de NILs foi realizada em quatro locais, incluindo DRC (MO), Rhower Research Station (AR), Delta Research and Extension Center (MS) e Red River Research Station (LA). Os tipos de solo dos quatro locais eram argila Sharkey (muito fina, esmectita,

térmica crômica Epiaquerts). Cada uma das linhagens foi plantada em lotes em uma densidade de 8 sementes por lote com espaçamento de 1 metro com 2 a 3 replicações. Os tratamentos de encharcamento foram impostos por irrigação extensiva. A água foi bombeada no campo quando 80% das linhagens dentro de cada bloco de maturação estava no estágio de desenvolvimento R1 (Fehr and Caviness 1977). A água foi aumentada de 5 a 10 cm acima da superfície do solo e mantida neste nível por 4 a 6 dias dependendo em quão grave o dano começou a aparecer dentro de cada bloco de maturação depois do qual a água foi deixada escoar do campo As plantas foram deixadas recuperar por 2 semanas. Cada linhagem foi classificada de 1 a 5 para uma classificação de dano por alagamento (FIS), no qual 1 indicou nenhum dano aparente e 5 indicou que a maior parte das plantas foi gravemente danificada ou morta. Os testes da estufa foram conduzidos em cones de solo com turfa e areia (razão 2:1) (profundidade de 30 cm, 5 cm em diâmetro) para o estágio vegetativo precoce e os vasos com solo do campo e Promix (razão 1:1) (profundidade de 30 cm, 20 cm em diâmetro) para o estágio vegetativo precoce. Os tratamentos de encharcamento foram impostos ao se manter água de 5 a 10 cm acima da superfície do solo e manter neste nível por 14 d. As plantas foram deixadas recuperar por 1 semana antes da classificação para FIS. Construção do mapa de ligação e análise QTL

[00124] O DNA genômico das matrizes e os 182 F8 RILs foram extraídos usando um método CTAB padrão (Doyle & Doyle 1987). A genotipagem de polimorfismo nucleotídico único (SNP) foi realizada na Washington University em St. Louis ao se usar os SoySNP6K Illumina Infinium BeadChips (Illumina, Inc. San Diego, CA). Os alelos SNP foram chamados usando o módulo de genotipagem GenomeStudio (Akond et al. 2013; Song et al. 2013). Um mapa de ligação SNP foi construído usando o programa JoinMap 3.0 (van Ooijen & Voorrips 2001). Uma classificação LOD de 3.0 foi usada para análise de dois pontos e uma classificação LOD de 2.0 foi usada para todas as análises de três pontos e análise de múltiplos pontos. QTL putativo para os traços estudados foi inicialmente detectado pelo método de mapeamento de intervalo usando o programa MapQTL 5.0 (van Ooijen 2004). O mapeamento do intervalo composto (CIM) foi então realizado usando o método multi- QTL e os cofatores apropriados (van Ooijen & Voorrips 2001). Um valor limite de significância da classificação LOD foi estimado para cada traço em cada local pela permutação 1,000 para determinar um QTL no nível de significância amplo do genoma de P = 0,05 (Doerge & Churchill 1996). Análise da associação de marcador-traço e estimativa dos efeitos genéticos

[00125] A associação de marcador-traço e estimativa dos efeitos genéticos seguiu relatórios anteriores (Ye et al. 2015). A análise de correlação linear foi usada para determinar as associações do marcador-traço em populações de progênie. Os genótipos para um local marcador foram codificados como i (i = 1, 2 e 3 para homozigoto do tipo S99-2281, heterozigoto e homozigoto do tipo PI 561271, respectivamente) para a análise de correlação. Os efeitos aditivos e de dominação do local na germinação ou altura da planta foram estimados usando o modelo de regressão linear: yij = μ + αx + dz + εij, onde yij era o valor do traço para a planta jth do genótipo marcador ith; μ era a média do modelo; x era a variável dummy para o componente aditivo e foi codificada como -1, 0 e 1 para i = 1, 2 e 3, respectivamente; z era a variável dummy para o componente de dominação e foi codificada como 0,5; 0 ou 0,5 para i = 1, 2 ou 3; a e d eram coeficientes de regressão e estimativas dos efeitos aditivos e de dominação, respectivamente; e εij era o termo de erro do modelo. As análises de correlação e regressão foram implementadas usando programa SAS (SAS Institute 2011).

Fenotipagem para os traços da raiz

[00126] Na estufa, raízes da soja foram fenotipadas conforme descrito em Prince et al., 2015. As raízes foram amostradas e limpas dos cones ou vasos. Depois, as amostras de raízes foram transferidas em bandejas claras cheias de água para remover cuidadosamente turfa, solo ou partículas de Promix firmemente presas à raiz. As raízes foram então transferidas em uma outra bandeja cheia de água, escaneada usando um Epson Scanner 10000XL (Epson America Inc., CA, USA) e analisadas usando software WinRhizo Pro (Regent Instruments Inc., Canada). Os dados no comprimento total da raiz e os números de pontas da raiz foram derivadas a partir da análise das imagens. No campo, as raízes da soja foram amostradas no estágio de desenvolvimento R5 usando o método “shovelomics” (Trachsel et al. 2011). Três imagens para cada raiz foram tomadas em um intervalo de 120°. As imagens foram analisadas por “DIRT” e foi calculada a média dos dados para as três imagens (Bucksch et al. 2014; Das et al. 2015). Os testes de potencial hídrico e teor hídrico das plantas de soja

[00127] Os brotos de plantas (tecidos acima do solo) foram pesados imediatamente depois da colheita e então secos em 105°C por 3 dias para medir o peso seco para calcular o teor hídrico. O potencial hídrico das folhas foi medido com uma câmara de pressão (Modelo 610 Pressure Chamber Instrument, PMS Instrument Co., Albany, OR, USA) em folhas totalmente maturadas a partir da cobertura superior conforme descrito por Boyer & Ghorashy 1971. Herança e QTL para tolerância ao encharcamento no cruzamento exótico de cultivar

[00128] Uma população de RIL (182 linhagens F7) foi desenvolvida pelo cruzamento de S99-2281 (principal, sensível ao encharcamento) com PI 561271 (exótica, tolerante ao encharcamento) (FIG. 11). As classificações de dano relativo ao alagamento (FIS) foram usadas para representar níveis de tolerância ao encharcamento e FIS foram classificadas a partir de 1 a 5 com 1 = sem dano aparente e 5 = a maior parte das plantas gravemente danificadas ou mortas (FIG. 1A). A avaliação do campo da população de RIL observou segregação transgressiva em FIS por todos os três anos (FIG. 1B), indicando que ambas as matrizes êm local ou locais doadores para tolerância ao encharcamento. FIS a partir de 2013 e 2014 mostraram distribuições normais; enquanto FIS a partir de 2015 foram acumuladas na direção do lado sensível. O padrão de distribuição diferente de FIS a partir de 2015 foi causado pelo período prolongado de alagamento devido a uma chuva forte inesperada durante o tempo de recuperação do alagamento. No entanto, a hereditariedade no sentido amplo (H2 = 0.50) em FIS foi detectada durante três anos (FIG. 1B), sugerindo que os fatores genéticos segregantes na população de RIL são estáveis e podem ser detectados.

[00129] Os mapas de ligação para a população de RIL foram construídos usando 1,797 marcadores SNP adquiridos da genotipagem SoySNP6K Illumina Infinium BeadChips com um intervalo genético médio de 1,47 cM (Tabela 2). Tabela 2. Informação dos mapas de ligação construída para a população de RIL. Chr Número de Comprimento (cM) Intervalo médio marcadores (cM) 1 90 114,9 1,29 2 125 133,3 1,08 3 84 114,9 1,38 4 89 136,4 1,55 5 81 109,2 1,37 6 112 171,8 1,55 7 112 133,6 1,20 8 112 173,9 1,57 9 89 130,4 1,48

10 84 138,7 1,67 11 73 139,1 1,93 12 78 127,4 1,65 13 67 89,8 1,36 14 104 120,0 1,17 15 81 113,0 1,41 16 102 103,5 1,02 17 89 126,0 1,43 18 108 147,4 1,38 19 67 82,2 1,25 20 50 130,4 2,66 Sumário 1797 2535,9 1,47

[00130] A análise QTL subsequente identificou dois novos locais associados com FIS em Chr. 3 e 10 e denominados como qWL_Gm03 e qWL_Gm10, respectivamente (FIG. 2). qWL_Gm03 foi detectado em todos os três anos de avaliação no campo e qFT_Gm10 foi apenas detectado em 2013 e 2014, possivelmente devido ao padrão de distribuição fenotípica em 2015 (FIG. 1B). O alelo doador de qWL_Gm03 era da matriz exótica (PI 561271) e o alelo doador de qWL_Gm10 era da matriz principal (S99-2281) (Tabela 1), a qual explicou as distribuições transgressivas observadas de FIS (FIG. 1B). qWL_Gm03 teve um efeito relativamente maior na tolerância ao encharcamento, conforme ele foi consistentemente marcado na mesma região cromossômica em todos os três anos independentes, explicando 16,9% a 33,1% das variações fenotípicas (Tabela 1). qWL_Gm10 explicou efeitos relativamente menores com contribuições fenotípicas variadas de até 15,4% e 8,5% em 2013 e 2014, respectivamente. Tabela 1. Sumário de QTL associado à classificação de danos em relação ao alagamento (FIS) mapeado na população de mapeamento de RIL.

Marcador mais próximo QTL ano Chro. ab R2 (%)c Doadord a 2013 3 Gm03_3087237_A/G -0,27 18,1 PI 561271 qWL_Gm03 2014 3 Gm03_3087237_A/G -0,39 33,1 PI 561271 2015 3 Gm03_3225968_G/A -0,28 16,8 PI 561271 2013 10 Gm10_43840376_T/C 0,26 15,4 S99-2281 qWL_Gm10 2014 10 Gm10_43107961_A/G 0,20 8,5 S99-2281 a O marcador mais próximo à posição de pico da distribuição LOD na FIG. 2. As posições do marcador foram baseadas no conjunto do genoma de soja de Wm82.a1.v1.1. b O efeito aditivo do QTL nos respectivos anos. c A porcentagem de contribuições do QTL para as variações fenotípicas totais dentro de cada ano. d A matriz, a partir da qual os alelos favoráveis para tolerância ao encharcamento do QTL surgem.

Efeitos do componente genético do principal QTL qWL_Gm03 isolado

[00131] Dois conjuntos de NILs (NIL147 e NIL221) foram identificados a partir de famílias naturais heterogêneas (F8:9) através do rastreio os marcadores SNP associados a QTL (FIG. 11). Duas únicas plantas (RIL147_02 e RIL221_07) com genótipos heterozigóticos na região qWL_Gm03 foram selecionadas a partir de duas famílias para avançar para F9 (FIG. 11). As duas populações F9 segregando qWL_Gm03 foram usadas para avaliar os efeitos do componente genético do QTL. As distribuições normais foram observadas nas duas populações F9 com padrões de distribuição diferentes claros para plantas com três diferentes genótipos (aa, Aa e AA) em qWL_Gm03 (FIGS. 3A & 3B). Os efeitos aditivos significantes de qWL_Gm03 foram identificados nas origens de NIL com contribuições fenotípicas de 47,4% e 37,8% em NIL147 e NIL221, respectivamente (FIGS. 3A & 3B). No entanto, os efeitos de dominação não eram significativos para qWL_Gm03 (FIGS. 3A & 3B), indicando que este QTL tem efeitos de dosagem na tolerância ao encharcamento.

[00132] Os dois conjuntos de NILs foram selecionados como NIL147 aa/AA e NIL221 aa/AA a partir das duas populações F9 (FIG. 11). As NILs com alelo tolerante “A” mostraram óbvia tolerância ao encharcamento mais forte do que as NILs com o alelo sensível “a” no estágio vegetativo precoce na estufa (FIG. 3C). Os dois conjuntos de NILs ainda foram avaliados quanto à tolerância ao encharcamento no estágio vegetativo precoce em quatro locais de campo ao longo do Centro-Sul dos Estados Unidos da América. Conforme esperado, o alelo tolerante “A” pode melhorar amplamente a tolerância ao encharcamento das plantas de soja comparado com o alelo sensível “a” em torno de todos os quatro locais (FIG. 3D). Esses resultados não apenas confirmaram os efeitos genéticos de qWL_Gm03 na tolerância ao encharcamento, mas também exibiram que qWL_Gm03 tinha potencial para ser adaptado em diferentes ambientes para melhorar a tolerância ao encharcamento das cultivares de soja. O mapeamento preciso limitou a região candidata para qWL_Gm03

[00133] Três recombinantes com cruzamentos entre os marcadores flanqueadores de qWL_Gm03, foram selecionados a partir da população F9 derivada de RIL147-02 para o teste de progênie (FIG. 11). O mapa físico parcial foi construído usando seis marcadores SNP, os quais foram desenvolvidos com base no alinhamento sequencial das regiões de intervalo QTL (Valliyodan et al. 2016). Os três recombinantes foram genotipados por esses marcadores SNP para determinar os pontos de cruzamento dos cromossomos (FIG. 4). As populações de progênie foram desenvolvidas contendo 72 a 86 plantas autopolinizadas para esses três recombinantes no campo de teste do encharcamento. Cada planta de progênie foi genotipada pelos marcadores de DNA (Gm03_3362229_C/A ou Gm03_3583259_G/T) que eram segregantes nas respectivas populações e fenotipados usando FIS no estágio reprodutivo precoce (FIG. 4). As correlações de marcador-traço eram significativas apenas nas populações de progênie NIL147-06 e -34, com r = -0,63 a -0,68 para FIS. Entretanto, a análise genética confirmou o efeito aditivo significativo de qWL_Gm03 nessas duas populações de progênie. A força similar de correlação e os efeitos aditivos nas duas populações de progênie sugerem que qWL_Gm03 se localiza nas respectivas regiões heterozigóticas dos recombinantes: NIL147-06 e - 34, as quais limitam o intervalo contendo qWL_Gm03 de <380-Kbp entre Gm03_3141146_T/C e Gm03_3517250_A/C contendo 30 genes previstos (FIG. 4). A ausência da associação de marcador-traço e o efeito aditivo significativo do QTL na população de progênie de NIL147- 87 confirmou o intervalo contendo qWL_Gm03 e excluiu a região genômica a jusante de Gm03_3517250_A/C. Anteriormente, um local (Rps1) conferindo resistência à podridão da raiz Phytophthora causada por Phytophthora sojae foi mapeado próximo à região qWL_Gm03 (Gao & Bhattacharyya 2008; Cheng et al. 2017). Com base nos resultados do mapeamento preciso, este local de resistência é excluído da região candidata de WL_Gm03 (FIG. 4). O alelo tolerante de qWL_Gm03 promove o desenvolvimento da raiz e a formação da raiz adventícia/aérea para superar o estresse de encharcamento

[00134] Inicialmente, o crescimento mais rápido dos brotos (FIG. 12A) e a regeneração da raízes (FIG. 12B) depois do transplante (danos na raiz) foram observados nas NILs tolerantes com alelo tolerante do que nas NILs sensíveis com o alelo sensível. Pareceu que as NILs tolerantes tiveram regeneração da raiz mais rápida depois do transplante. Deste modo, as arquiteturas radiculares das NILs foram adicionalmente examinadas durante o estresse de encharcamento no estágio de desenvolvimento vegetativo precoce para determinar os papéis de qWL_Gm03 nas arquiteturas radiculares e plasticidade (FIG. 5A). O estresse de encharcamento suprimiu significativamente o desenvolvimento da raiz de todas as NILs (FIGS. 5B & 5C). As diferenças no desenvolvimento da raiz foram observados entre as NILs tolerantes (NIL147/221_AA) e as NILs sensíveis (NIL147/221_aa). As NILs tolerantes tiveram comprimento de raiz significativo mais longo e mais números de ponta da raiz do que as NILs sensíveis em ambos os controle e nos mesmos momentos do tratamento de encharcamento (FIGS. 5B & 5C). O desenvolvimento da raiz foi quase completamente suprimido nas NILs sensíveis depois de 3 dias de tratamento de encharcamento; no contraste, as NILs tolerantes mantiveram um certo nível de desenvolvimento de raiz durante 10 dias de tratamento de encharcamento (FIGS. 5B & 5C). Durante o experimento, as diferenças genotípicas na formação de raízes adventícias também foram notadas entre as NILs tolerantes e sensíveis, à medida que as NILs tolerantes tenderam a formar 1,5 a 2 vezes a quantidade de raízes adventícias/aéreas do que as NILs sensíveis (FIG. 5D). Quanto mais as raízes adventícias/aéreas nas NILs tolerantes devessem ter papéis no melhoramento da absorção de O2 e transporte do sistema radicular encharcado e potencial para desenvolver em novas raízes depois do encharcamento.

Comparado ao alelo sensível de qWL_Gm03, o alelo tolerante promoveu desenvolvimento da raiz sob condições sem estresse e continuou a promover desenvolvimento da raiz ou regeneração da raiz sob estresse de encharcamento ou danos na raiz.

Deste modo, as arquiteturas radiculares e plasticidade reguladas por qWL_Gm03 devem ser o determinante chave para a tolerância ao encharcamento, devido a mudanças na eficiência da água e captação de nutrientes durante e depois dos danos da raiz causados pelo encharcamento.

Confirmação da função do gene putativo em RSA e tolerância ao encharcamento usando raízes pilosas transgênicas e plantas transgênicas compostas.

[00135] Um estudo inicial do gene candidato em desenvolvimento de raiz foi conduzido usando o sistema radicular piloso transgênico (FIGS. 6A-6D). Usando o promotor nativo através da 5'UTR, a região codificadora da proteína e 3'UTR, o alelo tolerante de SAUR-FT não mostrou nenhum efeito significativo no desenvolvimento da raiz comparado com o vetor de controle vazio, enquanto o alelo sensível diminuiu tanto o comprimento da raiz total (39%) quanto o número de pontas na raiz (40%) comparado ao controle e ao alelo tolerante (FIG. 6A). A superexpressão de SAUR-FT (região codificadora apenas) nas raízes pilosas se mostrou mais eficaz do que o alelo sensível na redução (50% e 56%) do comprimento total da raiz e número de pontas na raiz (FIG. 6B). A avaliação subsequente nas raízes e a tolerância ao encharcamento das plantas transgênicas compostas (raízes transformadas/broto do tipo selvagem) confirmou as funções de SAUR- FT no desenvolvimento da raiz e na tolerância ao encharcamento no solo, à medida que a superexpressão de SAUR-FT pode suprimir significativamente o desenvolvimento da raiz e reduzir a tolerância ao encharcamento (FIGS. 6C & 6D). Esses resultados indicaram que a variação alélica na diferenciação funcional de casos de SAUR-FT no desenvolvimento da raiz, a qual provavelmente afeta a tolerância ao encharcamento; e as funções de SAUR-FT no desenvolvimento da raiz e tolerância ao encharcamento foram confirmadas. Tolerância ao encharcamento regulada pelo envolvimento de qWLGm03 nas vias de auxina

[00136] A auxina geralmente promove a iniciação e alongamento da raiz (revisto por Overvoorde et al. 2010). Deste modo, o envolvimento de auxina na tolerância ao encharcamento foi adicionalmente avaliado pelo tratamento de um inibidor da biossíntese da auxina: ácido p- clorofen-oxisobutírico (PCIB) nas NILs (NIL147_aa e NIL147_AA) durante o encharcamento. O tratamento de PICB 10 µM mostrou prejudicar significativamente a tolerância ao encharcamento e a formação de raízes adventícias/aéreas das NILs (FIGS. 7A & 7B). Além disso, este inibidor da biossíntese de auxina mostrou complementar as diferenças genotípicas de qWL_Gm03 no desempenho da tolerância ao encharcamento e formação das raízes adventícias/aéreas (FIGS. 7A & 7B). Esses resultados juntos indicam que a variante natural de qWL_Gm03 está provavelmente envolvida nas vias de auxina para regular o desenvolvimento da raiz, formação da raiz adventícia/aérea e tolerância ao encharcamento. Isto confirmou o efeito indutor do alelo tolerante na expressão de um fator chave (GmARF20: homólogo mais próximo de AtARF19) controlando o desenvolvimento da raiz secundária através das vias de auxina (Ha et al. 2013) entre as NILs durante o encharcamento, comparado com o alelo sensível (FIG. 7C). O alelo tolerante “A” de qWL_Gm03 melhorou o rendimento no campo e a tolerância à seca na estufa através de melhor sistema radicular.

[00137] Os dois conjuntos de NILs também foram avaliados quanto aos papéis potenciais de qWL_Gm03 no sistema de produção agrícola. As NILs tolerantes e sensíveis pareceram similares no campo (FIG. 8A). No entanto, verificou-se que as NILs tolerantes têm potencial de rendimento significativamente maior do que as NILs sensíveis, com vantagens de rendimento de 16% a 40% (FIG. 8B). Não houve diferença significativa no peso de 100 sementes (FIG. 8C), o que sugeriu que o alelo tolerante “A” de qWL_Gm03 melhorou o rendimento ao aumentar os números de sementes crescentes. Os traços da raiz foram perseguidos quanto para comparação entre as NILs tolerantes e sensíveis (FIG. 8D). As NILs tolerantes tiveram melhor sistema radicular do que as NILs sensíveis com até cerca de 30% de aumento na área da raiz (FIG. 8E). O rendimento por planta foi adicionalmente avaliado na estufa. As NILs tolerantes renderam um pouco mais do que as NILs sensíveis, no entanto, as diferenças não foram significativas (FIG. 8F). Esses resultados indicaram que a vantagem do rendimento do alelo tolerante sobre o alelo sensível de qWL_Gm03 foi devido a captação mais eficiente de água e nutrientes, à medida que a diferença em rendimento entre as NILs tolerantes e sensíveis se tornou não significativa quando água e nutrientes suficientes foram fornecidos na estufa.

[00138] Acredita-se que geralmente um melhor sistema radicular ajuda a captação da água sob condições hídricas limitadas (seca). Deste modo, os papéis das melhores raízes regulados por qWL_Gm03 na tolerância à seca foram adicionalmente avaliados em cones de solo (profundidade de 1,2 m e 20 cm em diâmetro) sob as condições de estufa no estágio de desenvolvimento R1 (FIG. 9A). Sob as condições de controle (com bastante água), não houve diferença nos potenciais hídricos e teores hídricos das plantas entre as NILs tolerantes e sensíveis; no entanto, durante o tratamento de seca, as NILs tolerantes foram identificadas por manterem melhor estado hídrico do que as NILs sensíveis (FIGS. 9B & 9C). As NILs tolerantes desenvolveram maiores densidades radiculares do que as NILs sensíveis com um aumento de até 15% (FIG. 9D). Esses resultados proveram evidência direta para enfatizar a importância das raízes no melhoramento dos cultivos e indicou que a variante natural de qWL_Gm03 poderia beneficiar plantas sob condições sem estresse e outro estresse abiótico, tal como seca.

[00139] Dois novos locais de tolerância ao encharcamento foram identificados na população de RIL neste estudo e eles foram afetados amplamente pelo ambiente. Os efeitos e contribuições dos dois QTL variou ao longo dos anos e o um menor ainda estava indetectável em

2015. No entanto, o principal qWL_Gm03 é bastante estável com efeito relativamente maior (R2 até 33%) entre todos os QTL de encharcamento reportados anteriormente QTL (VanToai et al. 2001; Cornelious et al.

2005 & 2006; Nguyen et al. 2012). O isolamento do QTL principal nas origens da NIL confirmou de forma bem sucedida este QTL com contribuições fenotípicas aumentadas (até 47,4%) devido a origens genéticas mais sincronizadas. Nas origens de NIL, qWL_Gm03 continuou a mostrar características quantitativas, como os mesmos genótipos mostraram distribuições fenotípicas contínuas (FIGS. 3A & 3B) e as suas contribuições fenotípicas variaram entre populações e anos (FIGS. 3A, 2B & 4). A avaliação da tolerância ao encharcamento das NILs também confirmou a eficácia de qWL_Gm03 no melhoramento da tolerância ao encharcamento da soja em diferentes ambientes (FIG. 3D). Além disso, o alelo tolerante de qWL_Gm03 pode melhorar o rendimento sob condições de campo sem estresse (FIG. 8B) e tolerância à seca sob as condições de estufa (FIGS. 9B & 9C). Esses benefícios agronômicos do alelo tolerante de qWL_Gm03 mostraram ser contabilizados por sua capacidade de desenvolver melhor sistema radicular (FIGS. 8E & 9D). Quando água e nutriente suficiente foram fornecidos sob as condições de estufa, a vantagem de rendimento do alelo tolerante não foi significativa (FIG. 8F). No entanto, essas condições ideais eram impossíveis de serem alcançadas nos sistemas de produção agrícolas. Deste modo, é valioso introduzir o alelo tolerante de qWL_Gm03 no germoplasma principal atual a partir de fontes exóticas, o que poderia resultar não apenas na tolerância aos estresses abióticos principais, mas também no melhoramento total do rendimento no campo.

[00140] O mapeamento preciso inicial com testes de progênie limitaram qWL_Gm03 em uma região genômica de <380-Kbp contendo 30 genes previstos baseados no genoma de referência Williams 82 (FIG. 4) (Schmutz et al. 2010; Grant et al. 2010). Atualmente, os marcadores de SNP polimórficos identificados (FIG. 4) na região candidata de qWL_Gm03 podem ser usados em seleção assistida pelo marcador para o alelo tolerante em qWL_Gm03 na reprodução de soja.

[00141] As raízes foram reconhecidas como uma das partes mais importantes do melhoramento do cultivo quanto ao rendimento e tolerância à seca (Kramer 1969). O benefício de um melhor sistema radicular no melhoramento do cultivo foi reportado em várias culturas (Nguyen et al. 1997; Forster et al. 2005; Hund et al. 2011; Sadok & Sinclair 2011; Wasson et al. 2012; Uga et al. 2013). A primeira variação natural clonada para enraizamento mais profundo e mais proliferoso foi clonada como Dro1 em arroz, a qual poderia melhorar o rendimento tanto sob condições sem estresse quanto condições de seca (Uga et al. 2013; Arai-Sanoh et al. 2014). Neste exemplo, uma outra variação natural envolvida no desenvolvimento da raiz foi reportada por melhorar o rendimento e a tolerância aos estresses abióticos.

[00142] As raízes enfrentam diretamente danos durante o estresse de encharcamento devido à anoxia celular, com meristemas da raiz mostrando específica vulnerabilidade (Kozlowski 1984; Valliyodan et al. 2014). O sistema radicular danificado falha na captação de água e nutrientes, especialmente depois do encharcamento melhorado (secagem do solo). (Kramer & Jackson 1954). Além do mais, as plantas de soja geralmente mostram danos em relação ao alagamento vários dias depois da remoção do estresse de encharcamento à medida que o solo seca possivelmente devido à incapacidade de captar água suficiente para suportar tecidos acima do solo (Nguyen et al. 2012). Anteriormente, verificou-se que várias linhagens de soja tolerantes ao encharcamento têm desenvolvimento favorável da raiz sob estresse de encharcamento (Sakazono et al. 2014; Jitsuyama 2015; Kim et al. 2015); no entanto, este conhecimento não permite ter conclusões se o desenvolvimento favorável da raiz sob estresse de encharcamento é o determinante ou consequência da tolerância ao encharcamento. É possível que o desenvolvimento favorável da raiz seja apenas o resultado da tolerância ao encharcamento como o dano mais leve do encharcamento nos brotos. Neste exemplo, NILs com o alelo tolerante mostraram mais desenvolvimento favorável da raiz sob condições sem estresse e continuou a mostrar mais plasticidade favorável da raiz sob estresse e danos na raiz, para facilitar captações adequadas de água e nutrientes nas fases de estresse ou recuperação para suportar os tecidos acima do solo a superar o estresse (FIGS. 5 & 12). Deste modo, a evidência direta para suportar papéis determinantes das arquiteturas radiculares e plasticidade na regulação da tolerância ao encharcamento foi obtida sob a origem genética de NIL. Os mecanismos de tolerância ao estresse abiótico geralmente necessitam que as plantas suspendam o desenvolvimento de tecidos desnecessários para reservar energia e recursos durantes períodos de estresse, porém para promover o desenvolvimento de tecidos necessários para evitar estresses, especialmente para os estresses abióticos causados pelo alagamento, por exemplo como tolerância à submergência (Reviewed by Bailey- Serres et al. 2012; Fukao & Xiong 2013; Voesenek & Bailey-Serres 2015). Estratégia similar na tolerância ao encharcamento foi revelada para cultura em terras secas. A variante natural de qWL_Gm03 manteve (apesar de ter inibido) desenvolvimento da raiz secundária e formação de raiz adventícia/aérea para compensar danos nas raízes devido ao encharcamento, que pode evitar a insuficiente captação de água e nutrientes causada pelas raízes encharcadas (FIG. 10).

[00143] A auxina promove o desenvolvimento da planta ao estimular a divisão celular, alongamento e diferenciação (revisto por Teale et al. 2006). A auxina tem papéis na iniciação secundária das raízes e alongamento (revisto por Overvoorde et al. 2010). Neste exemplo, verificou-se o envolvimento das vias de auxina na regulação da tolerância ao encharcamento (FIGS. 7A & 7B) e a expressão de um dos genes a jusante da auxina (GmARF20) foi alterada entre as NILs tanto sob condições sem estresse quanto condições de encharcamento (FIG. 7C). Deste modo, qWL_Gm03 pode estar envolvido nas vias da auxina para induzir um dos fatores chave (GmARF20) para desenvolvimento de raiz secundária e exibição de plasticidade de raiz mais favorável (FIG. 10).

[00144] Em vista do acima, será observado que as várias vantagens da divulgação são alcançadas e outros resultados de vantagens alcançados. Como várias modificações poderiam ser feitas nos métodos acima sem partir do escopo da divulgação, se pretende que toda a matéria contida na descrição acima e mostrada nos desenhos anexos deva ser interpretada como ilustrativa e não de uma forma limitante.

[00145] Quando se introduzem elementos da presente divulgação ou as várias versões, modalidade(s) ou aspectos dos mesmos, os artigos “um”, “uma”, “a” e “referido(a)s” pretendem significar que existem um ou mais elementos. Os termos “compreendendo”, “incluindo” e “tendo” pretendem ser inclusivos e significar que existem elementos adicionais diferentes dos elementos listados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Planta modificada, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma região não traduzida 5' modificada do gene de tolerância ao alagamento de proteína suprarregulada pequena de auxina (SAUR_FT), uma região não traduzida 5' modificada do homólogo do gene SAUR_FT e um ortólogo do gene SAUR_FT.

2. Planta modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região não traduzida 5' modificada do gene SAUR_FT compreende uma inserção poli-A.

3. Planta modificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a inserção poli-A é uma inserção com 11 pares de base.

4. Planta modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um traço de rendimento aumentado, crescimento radicular aumentado, tolerância ao encharcamento aumentada e tolerância à seca aumentada quando se compara com uma planta que não tem a região não traduzida 5' modificada do gene de tolerância ao alagamento de proteína suprarregulada pequena de auxina (SAUR_FT), a região não traduzida 5' modificada do homólogo do gene SAUR_FT e o ortólogo do gene SAUR_FT.

5. Planta modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta cultivada.

6. Planta modificada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a planta cultivada é escolhida a partir de soja, milho, algodão, alfafa e canola.

7. Planta modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 1,5 vez a cerca de 2 vezes mais raízes adventícias/aéreas do que uma planta que não compreende a região não traduzida 5' modificada do gene SAUR_FT.

8. Planta modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta compreende pelo menos um dentre um comprimento de raiz total aumentado e um número de pontas de raiz aumentado quando se compara com uma planta que não tem a região não traduzida 5' modificada do gene SAUR_FT.

9. Semente da planta de acordo com a reivindicação 1.

10. Célula da planta de acordo com a reivindicação 1.

11. Progênie da planta de acordo com a reivindicação 1.

12. Método de seleção de uma planta tendo pelo menos um dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, tolerância ao encharcamento aumentada, tolerância à seca aumentada, rendimento aumentado, e combinações dos mesmos, caracterizado pelo fato de compreender a obtenção de uma amostra da planta e análise do gene de tolerância ao alagamento da proteína suprarregulada pequena de auxina (SAUR_FT).

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a análise compreende analisar a região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a planta é determinada por ter pelo menos um dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, tolerância ao encharcamento aumentada, tolerância à seca aumentada, e combinações das mesmas quando a região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT compreende uma inserção poli-A.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a inserção poli-A compreende pelo menos uma inserção com onze (11) pares de base.

16. Método de produção de uma planta modificada, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um dentre arquitetura do sistema radicular aumentada, uma tolerância ao encharcamento aumentada, uma tolerância à seca aumentada, e combinações das mesmas, o método compreendendo: redução da expressão do gene de tolerância ao alagamento da proteína suprarregulada de pequena auxima (SAUR_FT).

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a redução da expressão do gene SAUR_FT compreende modificar a região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a modificação da região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT compreende criar uma inserção na região não traduzida 5’ do gene SAUR_FT.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a inserção é criada em um sítio localizado cerca de nucleotídeo com 1 par de base até cerca de nucleotídeos com 780 pares de base a partir do sítio de iniciação.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a inserção compreende uma inserção poli-A.

21. Planta modificada tendo tolerância ao encharcamento aumentada, caracterizada pelo fato de que compreende a superexpressão de GmARF20.