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BR112013016757B1 - Método para detectar a presença ou ausência de um micro-organismo alvo - Google Patents

Método para detectar a presença ou ausência de um micro-organismo alvo Download PDF

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BR112013016757B1
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Takatoshi Moriyama
Akio Kitahara
Henry J. Lubrant
Patrick A. Mach
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3M Innovative Properties Company
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Abstract

método para detectar a presença ou ausência de um micro-organismo alvo e artigos de detecção a presente invenção refere-se a um método de detecção de um micro-organismo alvo. o método compreende fornecer um dispositivo de cultura micro-organismo alvo. o método compreende fornecer um dispositivo de cultura com um meio de cultura seletivo e um artigo de detecção compreendendo um primeiro sistema indicador. o meio de cultura seletivo facilita o crescimento de um micro-organismo indicador. quando um micro-organismo indicador é detectado em uma amostra em contato com o meio de cultura, o artigo de detecção é posto em contato com o meio de cultura para detectar o micro-organismo alvo.

Description

MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM MICROORGANISMO ALVO”
Referência Remissiva a Pedidos de Depósito Correlatos [001] Este pedido reivindica o benefício sob o pedido de patente provisório U.S. n° 61/428.722, depositado em 30 de dezembro de 2010, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Antecedentes da Invenção [002] Testar amostra de todos os alimentos, bebidas e água quanto a micro-organismos patogênicos podem não ser prático em função do custo e porque micro-organismos patogênicos raramente são encontrados em, por exemplo, alimentos devidamente processados. Portanto, testes para verificar a presença de micro-organismos indicadores são rotineiramente usados para testar alimentos e água, a fim de determinar a probabilidade de contaminação com patógenos humanos. A presença de um ou mais microorganismos indicadores pode ser uma indicação de contaminação fecal, por exemplo e pode indicar a presença potencial de um microorganismo patogênico.
[003] Bactérias coliformes (ou apenas coliformes) representam um exemplo de micro-organismos indicadores. O grupo de coliformes inclui vários gêneros (por exemplo, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella e Serratia) de bactérias gram-negativas em formato de bastão que são encontradas em grandes números nas fezes de animais de sangue quente e são caracterizadas por sua capacidade de fermentar lactose para subprodutos de ácido e gás. Embora a maioria dos coliformes esteja apenas associada a infecções oportunistas em seres humanos, algumas bactérias coliformes (por exemplo, E. coli O157:H7 ou outra toxina Shiga que produz E. coli - STEC) são associadas a uma maior incidência de morbidez e mortalidade.
[004] Membros da família Enterobacteriaceae de micro
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2/60 organismos representam outro exemplo de micro-organismos indicadores. Em adição às bactérias coliformes, esta família inclui também um grande número de outras bactérias gram-negativas em formato de bastão. Como as bactérias coliformes, a presença de micro-organismos Enterobacteriaceae em uma amostra de alimento ou água pode indicar a presença de contaminação fecal e, dessa forma, a possível presença de patógenos humanos (por exemplo, Salmonella enterica Enteritiditis, Salmonella enterica Typhimurium, espécie Shigella e espécie Cronobacter).
[005] Existe uma necessidade por métodos eficientes para testar a presença de micro-organismos patogênicos em uma amostra.
Descrição Resumida da Invenção [006] De modo geral, a invenção é voltada para um método para avaliar o conteúdo microbiológico de uma amostra (por exemplo, amostra de alimento ou água, amostra ambiental). Em particular, o método da invenção pode detectar a presença ou ausência de um micro-organismo alvo em uma amostra que contenha um organismo indicador que possa indicar a presença do micro-organismo alvo. O método da invenção inclui cultivar uma amostra em um dispositivo de cultura com um primeiro sistema indicador para determinar a presença de um micro-organismo indicador e, se for detectado um micro-organismo indicador, por contato do dispositivo de cultura com um artigo de detecção compreendendo um segundo sistema indicador para determinar a presença ou ausência de um micro-organismo alvo.
[007] Em um aspecto, a presente descrição apresenta um método de detecção da presença ou ausência de um micro-organismo alvo. O método pode compreender fornecer um dispositivo de cultura incluindo um meio de cultura compreendendo ingredientes selecionados para facilitar o crescimento de um micro-organismo indicador predeterminado, um artigo de detecção compreendendo um primeiro sistema indicador e uma amostra. O primeiro
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3/60 sistema indicador pode ser selecionado para detectar um micro-organismo alvo. O método pode compreender adicionalmente inocular o dispositivo de cultura com a amostra, incubação do dispositivo de cultura inoculada por tempo suficiente para permitir o crescimento dos micro-organismos indicadores, observar o dispositivo de cultura para indicação de uma presença de ao menos um micro-organismo indicador, entrar em contato com o meio de cultura do dispositivo de cultura incubado com o artigo de detecção e observar o dispositivo de cultura em contato com o artigo para detectar uma conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado. Em algumas realizações, a conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado, se estiver presente, pode ser indicativa da presença de ao menos um microorganismo alvo. Em algumas realizações, a conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado, se estiver ausente, é indicativa da presença de ao menos um micro-organismo alvo.
[008] Em algumas realizações, o método pode compreender adicionalmente fornecer um segundo sistema indicador e colocar o segundo sistema indicador em comunicação fluida com o meio de cultura, em que observar o dispositivo de cultura quanto à presença de ao menos um microorganismo indicador compreende detectar a presença ou ausência de uma conversão do segundo sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado. Em qualquer uma das realizações acima, fornecer um dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente fornecer um dispositivo de cultura que inclui o segundo sistema indicador. Em qualquer uma das realizações do método acima, fornecer o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente fornecer um dispositivo de cultura que compreende um hidrogel ou um agente gelificante seco solúvel em água gelada.
[009] Em qualquer uma das realizações do método acima, entrar em contato com o meio de cultura com o artigo de detecção é feito apenas
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4/60 quando é observada a indicação da presença de ao menos um micro-organismo indicador.
[010] Em qualquer uma das realizações acima, fornecer um meio de cultura pode compreender fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo Enterobacteriaceae, em que fornecer um artigo de detecção pode compreender fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Salmonella. Em algumas realizações, o primeiro sistema indicador pode compreender um reagente para detectar a atividade enzimática de α-galactosidase ou caprilato esterase.
[011] Em qualquer uma das realizações acima, fornecer um meio de cultura pode compreender fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo Enterobacteriaceae, em que fornecer um artigo de detecção pode compreender fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Shigella. Em algumas realizações, o primeiro sistema indicador pode compreender um reagente para detectar β-glicosidase, β-fucosidase, N-acetil-e-galactosaminidase ou uma combinação de qualquer duas ou mais das atividades enzimáticas supracitadas.
[012] Em qualquer uma das realizações acima, fornecer um meio de cultura pode compreender fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo Enterobacteriaceae, em que fornecer um artigo de detecção pode compreender fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Cronobacter. Em algumas realizações, o primeiro sistema indicador pode compreender um reagente para detectar a atividade enzimática α-glicosidase e/ou βcelobiosidase.
[013] Em qualquer uma das realizações acima, fornecer um meio de cultura pode compreender fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo Enterobacteriaceae, em que
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5/60 fornecer um artigo de detecção pode compreender fornecer um artigo de detecção para detectar Escherichia coli. Em qualquer uma das realizações acima, fornecer um meio de cultura compreende fornecer um meio de cultura selecionados para facilitar o crescimento de um micro-organismo coliforme, em que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar Escherichia coli. Em algumas realizações, o primeiro sistema indicador pode compreender um reagente para detectar a atividade enzimática de β-glucuronidase.
[014] Em algumas realizações, fornecer um meio de cultura pode compreender fornecer um meio de cultura selecionados para facilitar o crescimento de um micro-organismos do gênero Listeria, em que fornecer um artigo de detecção pode compreender fornecer um artigo de detecção para detectar Listeria monocytogenes. Em algumas realizações, o primeiro sistema indicador pode compreender um reagente para detectar a atividade enzimática de α-manopiranosidase ou fosfolipase C específica de fosfatidil inositol.
[015] Em qualquer uma das realizações acima, observar o dispositivo de cultura ou o dispositivo de cultura em contato com o artigo pode compreender observar o dispositivo de cultura visualmente. Em qualquer uma das realizações acima, observar o dispositivo de cultura ou o dispositivo de cultura em contato com o artigo pode compreender observar o dispositivo de cultura com o uso de um leitor automatizado. Em qualquer uma das realizações acima, o método pode compreender adicionalmente enumerar uma porção de unidades formadoras de colônia do micro-organismo indicador. Em qualquer uma das realizações acima, o método pode compreender adicionalmente enumerar uma porção de unidades formadoras de colônia do micro-organismo alvo.
[016] Em qualquer uma das realizações acima, entrar em contato com o meio de cultura com o artigo de detecção pode compreender
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6/60 adicionalmente entrar em contato com o meio de cultura a uma temperatura predeterminada.
[017] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece um artigo. O artigo pode compreender um substrato com superfícies principais superior e inferior e um revestimento disposto sobre ao menos uma das superfícies principais. O revestimento pode compreender um primeiro sistema indicador. O sistema indicador pode ser convertido de um primeiro estado para um segundo estado pela atividade enzimática de α-galactopiranosídeo ou caprilato esterase. Em algumas realizações do artigo, o primeiro sistema indicador pode ser selecionado do grupo que consiste em 5-bromo-4-cloro-3indolil-a-D-galactopiranosídeo, ácido 5-bromo-6-cloro-3-indolil-caprílico e ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-caprílico.
[018] Em ainda um outro aspecto, a presente descrição apresenta um artigo. O artigo pode compreender um substrato com superfícies principais superior e inferior e um revestimento disposto sobre ao menos uma das superfícies principais. O revestimento pode compreender um primeiro sistema indicador. O primeiro sistema indicador pode ser convertido de um primeiro estado para um segundo estado pela atividade enzimática de β-glucuronidase. Em algumas realizações, o primeiro sistema indicador pode ser selecionado do grupo que consiste em ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucurônico, pnitrofenil-p-glicuronídeo, ácido p-nitrofenil-2,3,4-tri-O-acetil-p-glicurônico metil éster, ácido fenolftaleína glicurônico, ácido enolftaleína mono-P-glicurônico, naftil-AS-BI-p-D-glicuronídeo e 4-metilumbeliferil β-D-glicuronídeo, ácido 8hidróxi quinolina-beta-D-glicurônico, sal sódico, ácido 2-naftil-beta-D-glicurônico, sal sódico, ácido 4-nitrofenil-beta-D-glicurônico, sal sódico, ácido fenolftaleínabeta-D-glicurônico, mono-hidrato de sal sódico, ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxilbeta-D-glicurônico, sal de ciclohexilamônio, ácido 3-indoxil-beta-D-glicurônico, sal de ciclohexilamônio, ácido 3-indoxil-beta-D-glicurônico, sal sódico, ácido 5
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7/60 bromo-6-cloro-3-indoxil-beta-D-glicurônico, sal de ciclohexilamônio, 5-ácido bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-glicurônico, sal sódico anidro e ácido 5-bromo-4cloro-3-indoxil-beta-D-glicurônico, tri-hidrato de sal sódico.
[019] Em ainda um outro aspecto, a presente descrição apresenta um artigo. O artigo pode compreender um substrato com superfícies principais superior e inferior e um revestimento disposto sobre ao menos uma das superfícies principais. O revestimento pode compreender um primeiro sistema indicador. O primeiro sistema indicador pode ser convertido de um primeiro estado para um segundo estado pela atividade enzimática de α-manopiranosidase ou fosfolipase C especifico de fosfatidil inositol. Em algumas realizações, o primeiro sistema indicador pode ser selecionado do grupo consistindo em 5-bromo-4-cloro-
3-indoxil-mio-inositol-1-fosfato, 5-bromo-6-cloro-3-indoxil-mio-inositol-1-fosfato, sal de amônio, 4-metilumbeliferil-mio-inositol-1-fosfato, sal de N-metil-morfolina, 3indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5-bromo-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 4-cloro-3indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5-iodo-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5-bromo-4cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5- bromo-6-cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-bromo-3-indoxil-a-Dmanopiranosídeo, 6-cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-fluoro-3-indoxil-a-Dmanopiranosídeo, 4,6-dicloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6,7-dicloro-3-indoxila-D-manopiranosídeo, 4,6,7-tricloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5-bromo-4cloro-N-metil--a-D-manopiranosídeo, 3-indoxil-a-D-manopiranosídeo e N-metil-3indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-bromo-2-naftil-a-D-manopiranosídeo, 4metilumbeliferil-a-D-manopiranosídeo e 4-nitrofenil-a-D-manopiranosídeo.
[020] Em qualquer uma das realizações acima, o revestimento pode ser disposto nas superfícies principais superior e inferior. Em qualquer uma das realizações acima, o artigo pode compreender adicionalmente uma camada adesiva. Em algumas realizações, ao menos uma porção do primeiro sistema indicador pode ser disposta sobre ou na camada adesiva. Em qualquer
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8/60 uma das realizações acima, o primeiro sistema indicador pode ser disposto sobre ambas as superfícies principais. Em qualquer uma das realizações acima, o substrato pode ser selecionado do grupo consistindo em um filme polimérico, papel, um não tecido, uma membrana filtrante e derivados de qualquer um dos supracitados. Em qualquer uma das realizações acima, o revestimento pode compreender adicionalmente um aglutinante.
[021] As palavras preferencial e de preferência referem-se às realizações da invenção que possam proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias. Entretanto, outras realizações podem, também, ser preferenciais sob as mesmas ou outras circunstâncias. Além disso, a recitação de uma ou mais realizações preferenciais não implica no desuso de outras realizações e não tem a intenção de excluir outras realizações do escopo da invenção.
[022] Os termos compreende e as variações do mesmo não têm um significado limitador, sendo que esses termos aparecem na descrição e nas reivindicações.
[023] Para uso na presente invenção, um, uma, o, a, ao menos um, ao menos uma, um ou mais e uma ou mais são usados de maneira intercambiável. Dessa forma, por exemplo, um micro-organismo pode ser interpretado como um ou mais micro-organismos médios.
[024] O termo e/ou significa um ou todos os elementos mencionados ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos listados.
[025] Dispositivo de cultura, como usado aqui, refere-se a um artigo adaptado para alojar um meio nutritivo que facilita o crescimento de um micro-organismo. Opcionalmente, o dispositivo de cultura pode compreender uma tampa ou cobertura para minimizar a exposição do meio nutritivo à contaminação externa e/ou reduzir a perda de umidade do meio de cultura durante a incubação e/ou armazenamento. Alguns exemplos não-limitadores de dispositivos de cultura
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9/60 incluem frascos, béqueres, tubos, placas de Petri, placas multipoços, placas PETRIFILM, folhas de meio COMPACT DRY, folhas SANITA-KUN e similares.
[026] Sistema indicador, como aqui usado, refere-se a um ou mais de qualquer um dos seguintes e qualquer combinação de um ou mais dos seguintes: um substrato cromogênico de enzima, um substrato fluorogênico de enzima, um indicador redox (por exemplo, cloreto de trifenil tetrazólio, azul de metileno), um nutriente metabolizável, indicador de pH. Nutriente metabolizável refere-se a qualquer molécula que possa ser usada por um organismo indicador predeterminado e/ou um micro-organismo alvo predeterminado para produzir biomassa e/ou energia. O uso do nutriente metabolizável pelos micro-organismos resulta direta ou indiretamente em um pH ou outra troca iônico detectável em um meio aquoso que está em contato fluido com o micro-organismo. Um sistema indicador diferenciante é um sistema indicador que pode ser usada para distinguir dois micro-organismos não idênticos à base de suas respectivas reatividades com um componente(s) do(s) sistema(s) indicador(es).
[027] Micro-organismo indicador, como aqui usado, refere-se a um micro-organismo que pertence a um grupo de micro-organismos que é conhecido por ser encontrado em um ambiente (por exemplo, um líquido ou matriz sólida) no qual é também encontrado um micro-organismo alvo. De acordo com a presente descrição, os micro-organismos indicadores e seu microorganismos alvo correspondentes são capazes de ser cultivados no mesmo meio de cultura. Além disso, os micro-organismos alvo podem reagir com o mesmo sistema indicador que detecta os micro-organismos indicadores correspondentes. Os micro-organismos indicadores podem incluir grupos de micro-organismos relativamente grandes e diversificados (por exemplo, bactérias aeróbicas, levedura, fungos filamentosos), grupos de micro-organismos relativamente grandes e relativamente menos diversificados (por exemplo, um grupo filogeneticamente relacionado de micro-organismos como a família
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Enterobacteriaceae, por exemplo ou um grupo fisiologicamente relacionado de micro-organismos como as bactérias coliformes, por exemplo) e grupos ainda menores e/ou relativamente menos diversificados de micro-organismos (por exemplo, um gênero como Listeria, uma espécie como Escherichia coli).
[028] Micro-organismo alvo, como aqui usado, refere-se a um micro-organismo predeterminado que pode ser encontrado em um ou mais dos mesmos ambientes que os micro-organismos indicadores são encontrados. A micro-organismo alvo pode ser distinguido de um ou mais de um grupo de micro-organismos indicadores na base de sua reatividade, ou falta do mesmo, com um sistema indicador diferenciante. Em algumas realizações, o micro-organismo alvo pode pertencer ao grupo de microorganismos indicadores (por exemplo, um micro-organismo alvo exemplificador, Escherichia coli, é um membro da família Enterobacteriaceae, que é um grupo de micro-organismos indicadores conhecidos na técnica). Em certas realizações, micro-organismo alvo pode se referir a uma ou mais cepas de uma espécie específica, uma ou mais espécie de um gênero específico ou mais de uma espécie de cada dois ou mais gêneros ou uma ou mais cepas ou espécies de um grupo não taxonômico (isto é, fisiologicamente relacionado).
[029] Para uso na presente invenção, as recitações de intervalos numéricos com extremos incluem todos os números contidos nesta faixa (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).
[030] O sumário anterior da presente invenção não se destina a descrever cada uma das realizações apresentadas ou todas as implementações da presente invenção. A descrição a seguir exemplifica mais particularmente as realizações ilustrativas. Em diversos lugares, durante a aplicação, a orientação é fornecida através de listas de exemplos, nas quais os exemplos podem ser usados de várias maneiras. Em cada instância, a lista recitada serve apenas com
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11/60 um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva.
[031] Detalhes adicionais destas e outras realizações são demonstrados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens se tornarão aparentes a partir da descrição e dos desenhos e a partir das reivindicações.
Breve Descrição das Figuras [032] A figura 1 é um diagrama de blocos de uma realização de um método para detecção de um micro-organismo alvo de acordo com a presente descrição.
[033] A figura 2 é uma vista superior de uma realização de um dispositivo de cultura com colônias de micro-organismos indicadores dispostos no mesmo.
[034] A figura 3 é uma vista em perspectiva de uma realização de um artigo de detecção de acordo com a presente descrição.
[035] A figura 4 é uma vista superior do dispositivo de cultura da figura 3 após a colocação de um artigo de detecção no mesmo.
Descrição Detalhada da Invenção [036] A invenção é voltada para um método para avaliar o conteúdo microbiológico de uma amostra. Em particular, o método inclui processos de detecção sequencial que, vantajosamente, são conduzidos em um único dispositivo de cultura. Os processos de detecção são distintos, mas relacionados no sentido de que o primeiro processo de detecção identifica um grupo de micro-organismos indicadores e o segundo processo de detecção identifica um micro-organismo alvo no grupo. Vantajosamente, o resultado do primeiro processo de identificação pode ser usado para decidir se o uso do segundo processo de detecção é indicado. Consequentemente, em algumas realizações, quando um micro-organismo indicador não é detectado pelo primeiro processo de identificação, um operador pode evitar o tempo,
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12/60 materiais, mão de obra e gastos do segundo processo de identificação.
[037] A figura 1 é um diagrama de blocos mostrando uma realização de um método para detecção de um micro-organismo alvo de acordo com a presente descrição. Métodos da presente descrição são voltados para testar uma amostra quanto à presença ou ausência de um micro-organismo alvo. O método inclui a etapa 152 de fornecer uma amostra a ser testada, um artigo de detecção e um dispositivo de cultura que inclui um meio de cultura. Opcionalmente, um segundo sistema indicador pode ser fornecido. O método compreende adicionalmente a etapa 154 de colocar o segundo sistema indicador, se estiver presente, em comunicação fluida com o meio de cultura. O método compreende adicionalmente a etapa 156 de inocular o dispositivo de cultura com a amostra, a etapa 158 de incubar o dispositivo de cultura inoculado e a etapa 160 de observar o dispositivo de cultura para indicação de um micro-organismo indicador. Se for observado um micro-organismo indicador na etapa 160, o método compreende adicionalmente a etapa opcional 162 de por em contato o meio de cultura com o artigo de detecção e a etapa 164 de observar o primeiro sistema indicador. Cada uma das etapas no método é descrito em mais detalhes abaixo . Uma vantagem do método é que o artigo de detecção pode precisar ser aplicado apenas ao meio de cultura se for detectada uma indicação de um microorganismo indicador. Dessa forma, nas amostras onde não for detectada nenhuma indicação de um micro-organismo indicador, pode ser inferido que um micro-organismo alvo não está presente e o artigo de detecção não tem de ser usado.
[038] Fornecer uma amostra a ser testada pode compreender fornecer uma amostra que é suspeita de conter um micro-organismo alvo. A amostra pode ser qualquer amostra que pode incluir um micro-organismo alvo conforme definido aqui. Alguns exemplos não-limitadores de amostras
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13/60 adequadas incluem amostras ambientais (por exemplo, chumaços/esponjas de superfície, sujeira, sedimentos, fômites), alimento (por exemplo, matériasprimas, amostras em processo e amostras de produto acabado), bebidas, amostras clínicas/veterinárias (por exemplo, sangue, soro, plasma, urina, escarro, tecido, muco, fezes, exsudato de feridas, pus, líquido cefalorraquidiano) e água (por exemplo, água de superfície, água potável, água de processo).
[039] Em algumas realizações, a presença ou ausência de um micro-organismo alvo pode ser analisada em uma amostra de teste que é derivada de uma variedade de alimento, bebida ou alimento - ou fontes ambientais de processamento de bebidas. Exemplos não limitadores de fontes de alimento incluem carne crua ou processada, frutas ou vegetais crus ou processados, laticínios não fluidos (por exemplo, queijo, manteiga e sorvete), nozes, especiarias, ingredientes e xaropes. Exemplos não limitadores de fontes de bebida incluem água potável, sucos de frutas ou vegetais, leite e bebidas fermentadas. Alimento ou bebidas pasteurizadas também podem ser fontes adequadas. Exemplos não limitadores de amostras ambientais de processamento de alimentos ou bebidas incluem amostras de superfície de manuseio de alimentos (por exemplo, esteiras transportadoras, folhas, superfícies de corte, superfícies de equipamentos de mistura, filtros, recipientes de armazenamento), amostras do ambiente (por exemplo, paredes, pisos, ralos, equipamentos de ventilação) e equipamentos de limpeza (por exemplo, mangueiras, ferramentas de limpeza).
[040] Em algumas realizações, a presença ou ausência de um micro-organismo alvo pode ser analisada em uma amostra que é derivada de uma variedade de fontes humanas ou animais, como um fluido fisiológico, por exemplo, sangue, saliva, fluido de lente ocular, fluido sinovial, fluido cérebroespinhal, pus, suor, exsudato, urina, muco, leite de amamentação ou similares. Adicionalmente, a amostra de teste pode ser derivada de um local
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14/60 do corpo, por exemplo, ferimento, pele, narinas, couro cabeludo, unhas, etc.
[041] As amostras de particular interesse de fontes humanas ou animais incluem amostras que contêm muco, como amostras nasais (por exemplo, de narinas anteriores, cavidade nasofaríngea, cavidades nasais, vestíbulo nasal anterior, etc.), bem como amostras do ouvido externo, ouvido médio, boca, reto, vagina ou outro tecido similar. Os exemplos de tecidos mucosais específicos incluem membranas mucosais bucal, gengival, nasal, ocular, traqueal, bronqueal, gastrointestinal, retal, uretral, ureteral, vaginal, cervical e uterino.
[042] Além de fluidos fisiológicos, outras amostras de teste podem incluir outros líquidos bem como sólido(s) dissolvidos em meio líquido. As amostras de interesse podem incluir fluxos de processo, água, solo, plantas ou outras vegetações, ar, superfícies (por exemplo, superfícies contaminadas) e similares. Amostras podem também incluir células cultivadas. As amostras também podem incluir amostras sobre ou em um dispositivo compreendendo células, esporos ou enzimas (por exemplo, um dispositivo indicador biológico).
[043] Amostras adequadas de métodos da presente descrição podem incluir certas amostras sólidas. As amostras sólidas podem ser desintegradas (por exemplo, por mistura, sonicação, homogeneização) e podem ser suspensas em um líquido (por exemplo, água, tampão, caldo). Em algumas realizações, um dispositivo de coleta de amostra (por exemplo, um chumaço, uma esponja) que contém o material de amostra pode ser usado no método. Alternativamente, o material de amostra pode ser eluído (por exemplo, enxaguado, raspado, expressado) do dispositivo de coleta de amostra antes do uso do material de amostra no método. Em algumas realizações, as amostras líquidas ou sólidas podem ser diluídas em um líquido (por exemplo, água, tampão, caldo).
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15/60 [044] A amostra pode compreender um micro-organismo indicador, conforme descrito aqui. O micro-organismo indicador pode ser indicativo de contaminação (por exemplo, contaminação fecal), infecção (por exemplo, infecção com um microorganismo patogênico) ou um indicador de sanitização geral(por exemplo, qualquer micro-organismo aeróbico). O microorganismo indicador pode ainda ser um micro-organismo alvo.
[045] Micro-organismos de particular interesse, que podem ser de interesse como um organismo indicador ou um micro-organismo alvo, incluem organismos procariotas e eucariotas, particularmente bactérias gram-positivas, bactérias gram-negativas, fungos, micoplasma e levedura. Organismos particularmente relevantes incluem membros da família Enterobacteriaceae ou a família Micrococcaceae ou os gêneros Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Salmonella spp., Legionella spp., Shigella spp. Yersinia spp., Enterobacter spp., Escherichia spp., Bacillus spp., Listeria spp., Vibrio spp., Corynebacteria spp. assim como vírus de herpes, Aspergillus spp., Fusarium spp., e Candida spp. Organismos particularmente virulentos incluem Staphylococcus aureus (incluindo cepas resistentes como Staphylococcus aureus (MRSA)) resistente a meticilina, S. epidermidis, Streptococcus pneumoniae, S. agalactiae, S. pyogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus (VRE) resistente a vancomicina, Staphylococcus aureus (VRSA) resistente a vancomicina, -Staphylococcus aureus (VISA) resistente ao intermediário de vancomicina, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Aspergillus niger, A. fumigatus, A. clavatus, Fusarium solani, F. oxysporum, F. chlamydosporum, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Vibrio cholera, V. parahemolyticus, Salmonella cholerasuis, S. typhi, S. typhimurium, Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, Cronobacter sakazaki, E. coli O157 e múltiplos hastes gram-negativos (MDR) resistentes a medicamentos.
[046] Bactérias gram-positivas e gram-negativas são de particular
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16/60 interesse. São de particular interesse as bactérias Gram-positivas, como Listeria monocytogeness. Além disso, são de particular interesse os micróbios resistentes a antibióticos incluindo os micróbios MRSA, VRSA, VISA, VRE e MDR.
[047] Com referência novamente à etapa 152 da figura 1, além de fornecer uma amostra a ser testada, o método inclui ainda fornecer um dispositivo de cultura, um primeiro sistema indicador e um artigo com um segundo sistema indicador revestido no mesmo. O dispositivo de cultura é usado em um sentido amplo e inclui uma variedade de artigos adaptados para alojar um meio nutritivo que facilita o crescimento de um micro-organismo. A seleção de um meio nutritivo específico para facilitar o crescimento de qualquer microorganismo indicador específico de acordo com o método está dentro do escopo de conhecimento de uma pessoa que tem conhecimento básico na técnica.
[048] Em algumas realizações, o meio nutritivo pode compreender um ou mais inibidores seletivos. Inibidores seletivos, como aqui usado, refere-se a compostos químicos que são adicionados ao meio nutritivo para inibir parcial ou completamente o crescimento de certos microorganismos suscetíveis ou grupos de micro-organismos, assim favorecendo seletivamente o crescimento de outros micro-organismos ou grupos de microorganismos. Os inibidores seletivos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, sais biliares, sais inorgânicos (por exemplo, NaCl, LiCl, MgCl2) e antibióticos (fluorquinolonas, β-lactama, aminoglicosídeos). Em determinadas realizações preferenciais da presente descrição, o meio nutritivo pode incluir inibidores seletivos a concentrações que são minimamente seletivos (isto é, a concentrações que estão abaixo das concentrações costumeiras usadas em meios de crescimento seletivos). Vantajosamente, o uso de meio nutritivo minimamente seletivo pode permitir a recuperação e detecção de mais microorganismos alvo com o uso do método da presente descrição. Sem se ater à teoria, isso pode ser possível porque a concentração mais baixa de inibidores
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17/60 seletivos permite o crescimento de micro-organismos alvo feridos, submetidos a estresse e/ou relativamente suscetíveis no meio seletivo, possibilitando assim sua detecção com o segundo sistema indicador.
[049] O primeiro sistema indicador é usado para indicar a presença ou ausência de um micro-organismo alvo. O segundo sistema indicador opcional é usado para indicar a presença ou ausência de um micro-organismo indicador. O primeiro e/ou segundo sistema indicador pode compreender um substrato enzimático cromogênico, um substrato enzimático fluorogênico, um indicador redox, um nutriente metabolizável, um indicador de pH ou qualquer combinação de dois ou mais dos supracitados. Em algumas realizações, uma combinação de um indicador de pH e um certo nutriente metabolizável pode ser fornecida do método fornecendo um dos componentes no meio de cultura do dispositivo de cultura e fornecendo o outro componente no artigo de detecção.
[050] A escolha do primeiro sistema indicador pode depender do micro-organismo alvo e/ou o meio de cultura usado no dispositivo de cultura e tais escolhas são guiadas pela presente revelação, conforme será reconhecido por uma pessoa com conhecimento básico na técnica. Em algumas realizações do método, um primeiro sistema indicador altamente diferencial (isto é, um sistema indicador que reage com relativamente poucos micro-organismos, incluindo o micro-organismo alvo) pode ser usado em conjunção com um meio de cultura minimamente seletivo. Nessas realizações, o meio de cultura minimamente seletivo pode permitir a recuperação e crescimento de micro-organismos alvo feridos e/ou submetidos a estresse, possibilitando assim a detecção de tais organismos alvo que podem ser inibidos por um meio de cultura bastante seletivo.
[051] Em algumas realizações do método, um primeiro sistema indicador relativamente menos diferencial (isto é, um sistema indicador que reage com relativamente muitos micro-organismos, incluindo o micro-organismo alvo) pode ser usado em conjunção com um meio de cultura bastante seletivo. Essa
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18/60 abordagem pode ser usada com amostras altamente complexas (por exemplo, amostras que exigem condições fortemente seletivas, como amostras de ralo de piso que tendem a ter conteúdo microbiano altamente diversificado ou amostras de culturas de caldo relativamente não seletivos pré-enriquecimento). Um exemplo dessa abordagem é o uso de Demi-Fraser/UVM, sistema de enriquecimento de caldo Fraser com detecção de ágar Modified Oxford de micro-organismos Listeria.
[052] Em qualquer uma das realizações, o primeiro ou segundo sistema indicador pode compreender um indicador de oxidação-redução (também chamado de indicador redox) adequado para reações biológicas de oxidação-redução. Os corantes indicadores de oxirredução podem ser dependentes de pH ou independentes de pH. Alguns exemplos não-limitadores de corante indicadores de oxirredução incluem 2,2'-bipiridina (complexo de Ru), Nitrofenantrolina (complexo de Fe), N-ácido fenilantranílico, 1,10-fenantrolina (complexo de Fe), N-etoxicrisoidina, 2,2'-bipiridina (complexo de Fe), 5,6dimetilfenantrolina (complexo de Fe), o-dianisidina, sódio sulfonato de difenilamina, difenilbenzidina, difenilamina, Viologen, 2,6-dibromofenolindofenol de sódio, Sodium 2,6-diclorofenol-indofenol, o-Cresol de sódioindofenol, tionina (sin. violeta de Lauth), azul de metileno, Indigotetraácido sulfônico, Indigotriácido sulfônico, Indigodiácido sulfônico, Indigomonoácido sulfônico, fenosafranina, safranina T e vermelho neutro.
[053] Em qualquer uma das realizações, o primeiro e/ou segundo sistema indicador pode compreender um substrato enzimático cromogênico. Substratos enzimáticos cromogênicos elegíveis incluem derivados de bromocloro-indolila, derivados de nitrofenila e derivados de fenoftaleína, por exemplo.
[054] Derivados úteis de 5-bromo-4-cloro-3-indolila incluem acetato de 5-bromo-6-cloro-3-indolila, acetato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-p-D-galactopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-
1,3-diacetato, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D- fucopiranosídeo, 5-bromo-4
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19/60 cloro-3-indolil-p-D-glicopiranosídeo, ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-Dglicurônico, fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila e sulfato de 5-bromo-4-cloro3-indolila.
[055] Derivados úteis de nitrofenila incluem derivados de pnitrofenol e o-nitrofenol. P-nitrofenois particularmente úteis incluem fosfato dietilp-nitrofenil; fosfato de di-p-nitrofenila; p-nitrofenil-2-acetamido-2-desoxi-3-O-pgalactopiranosil-p-glicopiranosídeo; p-nitrofenil-2-acetamido-2-desoxi-pglicopiranosídeo; p-nitrofenilacetato, p-nitrofenil-N-acetil-p-D-glucosaminídeo, pnitrofenil-p-D-N,N’-diacetil quitobiose; p-nitrofenil-a-glicopiranosídeo, p-nitrofenilα-maltosídeo; p-nitrofenil-p-maltosídeo; p-nitrofenil-a-manopiranosídeo; pnitrofenil-p-manopiranosídeo; miristato de p-nitrofenila; palmitato de p-nitrofenila; fosfato de p-nitrofenila; bis(p-nitrofenil)fosfato; tris(p-nitrofenil)fosfato; p-nitrofenilp-glicopiranosídeo; p-nitrofenil-p-glicuronídeo; α-p-nitrofenil glicerina; p-nitrofenilα-ramnopiranosídeo; estearato de p-nitrofenila; sulfato de p-nitrofenila; ácido pnitrofenil-2,3,4-tri-O-acetil-p-glicurônico metil éster; e valerato de p-nitrofenila.
[056] O-nitrofenois particularmente úteis incluem acetato de onitrofenil, o-nitrofenil-p-glicosídeo e o-nitrofenil-p-D-glicopiranosídeo. Outros derivados de nitrofenila particularmente úteis incluem nitrofenil-p-fucopiranosídeo, nitrofenil-a-galactopiranosídeo, butirato de nitrofenila, caprato de nitrofenila, caproato de nitrofenila, caprilato de nitrofenila, laurato de nitrofenila e proprionato de nitrofenila.
[057] Derivados de indoxila úteis incluem acetato de indoxila; indoxil-p-D-glicosídeo; sulfato de 3-indoxila; fosfato de 3-indoxila.
[058] Derivados de fenolftaleína úteis incluem: dibutirato de fenolftaleína; difosfato de fenolftaleína; dissulfato de fenolftaleína; ácido fenolftaleína glicurônico; ácido fenolftaleína mono-P-glicosidurônico; ácido fenolftaleína mono-P-glicurônico; e monofosfato de fenolftaleína.
[059] Todos os substratos cromogênicos acima descritos
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20/60 reagirão diretamente com uma enzima adequada para produzir um cromóforo.
[060] Substratos enzimáticos adicionais contendo derivados de Inaftila, 2-naftila e Naftil-AS-BI são empregadas de modo útil se o produto modificado de enzima derivada é ainda reagido com um reagente cromogênico, como tinturas diazotadas, por exemplo, 1-diazo-4-benzoilamino2,5, dietoxibenzeno, (comercialmente disponíveis como Sal Fast Blue BB da Sigma Chemical), 1-diazo-4-benzoilamino-2,5-dietoxibenzeno, p-diazo-2,5dietóxi- N-benzoilalanina, cloreto de cloro-2-metilbenzeno diazônico e sal oaminoazotolueno diazônico, para produzir um cromóforo.
[061] Derivados de 1-naftila particularmente úteis incluem 1naftil-N-acetil-P-D-glicosaminídeo.
[062] Derivados de 2-naftila particularmente úteis incluem 2naftil-fosfato; 2-naftil-butirato; 2-naftil-caprilato; 2-naftil-miristato; L-leucil-2naftilamida; L-valil-2-naftilamida; L-cistil-2-naftilamida; N-benzoil-DL-arginina2-naftilamida; N-glutarila-fenilalanina 2-naftilamina; 2-naftil-fosfato; 6-bromo-2naftil-a-D-galactopiranosídeo; 2-naftil-P D-galactopiranosídeo; 2-naftil-2-Dglicopiranosídeo; 6-bromo-2-naftol-P-D-glicopiranosídeo; 6-bromo-2-naftil-2-Dmanopiranosídeo; e 2-naftil-a-L-fucopiranosídeo.
[063] Derivados de naftil-AS-BI particularmente úteis incluem naftil-AS-BI-fosfato e naftil-AS-BI-P-D-glicuronídeo.
[064] Quando a enzima cuja atividade a ser detectada for alfa-Dglicosidase, um substrato enzimático cromogênico adequado, por exemplo, é pnitrofenil-a-glicopiranosídeo. Quando a atividade enzimática a ser detectada for alfa-L-arabinofuranosidase, um substrato enzimático cromogênico adequado, por exemplo, é p-nitrofenil-a-L-arabinofuranosídeo. Quando a atividade enzimática a ser detectada for beta-D-glicosidase, um substrato enzimático cromogênico adequado, por exemplo, é p-nitrofenil-P-D-glicopiranosídeo.
[065] Em qualquer uma das realizações, o primeiro e/ou segundo
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21/60 sistema indicador pode compreender um substrato enzimático fluorogênico. Substratos enzimáticos fluorogênicos elegíveis incluem derivados de 4-metil umbeliferona 7-amido-4-metilcoumarina, fluoresceína, rodamina e fluorescamina, por exemplo.
[066] Derivados de 4-metilumbeliferila adequados incluem, por exemplo: 4-metilumbeliferil-2-acetamido-4, 6-O-benzilideno-2-desoxi-e-Dglicopiranosídeo; acetato de 4-metilumbeliferila; 4-metilumbeliferil-N-acetil- βD-galactosaminídeo; 4-metilumbeliferil-N-acetil-a-D-glicosaminídeo; 4metilumbeliferil-N-acetil- β-D-glicosaminídeo; ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-aD-N-acetil neuramínico; 4-metilumbeliferil a-L-arabinofuranosídeo; 4metilumbeliferil α-L-arabinosídeo; butirato de 4-metilumbeliferila; 4metilumbeliferil β-D-celobiosídeo; metilumbeliferil β-D-N, N'diacetil quitobiosídeo; elaidato de 4-metilumbeliferila; 4-metilumbeliferil-β-Dfucosídeo; 4-metilumbeliferil-a-L-fucosídeo; 4-metilumbeliferil-β-L-fucosídeo;
4-metilumbeliferil-a-D-galactosídeo; 4-metilumbeliferil-β-D-galactosídeo; 4metilumbeliferil-a-D-glicosídeo; 4-metilumbeliferil-β-D-glicosídeo; 4- metilumbeliferil-β-D-glicuronídeo; p-guanidinobenzoato de 4-metilumbeliferila; heptanoato de 4-metilumbeliferila; 4-metilumbeliferila-a-D-manopiranosídeo;
4-metilumbeliferila-β-D-manopiranosídeo; oleato de 4- metilumbeliferila; palmitato de 4-metilumbeliferila; fosfato de 4-metilumbeliferila; propionato de
4-metilumbeliferila; estearato de 4-metilumbeliferila; sulfato de 4metilumbeliferila; 4-metilumbeliferil-β-D-N, N', N”-triacetilquitotriose; 4metilumbeliferil-2,3,5-tri-o-benzoil-a-L-arabinofuranosídeo; cinamato cloreto de 4- metilumbeliferil-p-trimetilamônio; e 4-metilumbeliferil-β-D-xilosídeo.
[067] Derivados adequados de 7-amido-4-metilcumarina incluem, por exemplo: L-alanina-7-amido-4-metilcumarina; L-prolina 7-amido-4metilcumarina; L-tirosina-7-amido-4-metilcumarina; L-leucina-7-amido-4metilcumarina; L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina; e 7-glutarilfenilalaninaPetição 870190068023, de 18/07/2019, pág. 28/143
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7-amido-4-metilcumarina.
[068] Derivados adequados de peptídeo de 7-amido-4metilcumarina incluem, por exemplo: N-t-BOC-Ile-Glu-Gly-Arg-7-amido-4metilcumarina; N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7-amido-4-metilcumarina; N-CBZPhe-Arg 7-amido-4-metilcumarina; Pro-Phe-Arg 7-amido-4-metilcumarina; N-tBOC-Val-Pro-Arg 7-amido-4-metilcumarina; e N-glutaril-Gly-Arg 7-amido-4metilcumarina.
[069] Derivados de diacetilfluoresceína adequados incluem, por exemplo, diacetato de fluoresceína, fluoresceína di-(P-D-galactopiranosídeo) e dilaurato de fluoresceína.
[070] Quando a atividade biológica a ser detectada for alfa-Dglicosidase, quimotripsina, substratos enzimáticos fluorogênicos adequados são 4metilumbeliferil-alfa-D-glicosídeo, 7-glutarilfenilalanina-7-amido-4-metilcumarina ou heptanoato de 4-metilumbeliferila, respectivamente. Quando a atividade biológica a ser detectada for alfa-L-arabinofuranosidase, um substrato enzimático fluorogênico adequado é 4-metilumbeliferil-alfa-L-arabinofuranosídeo. Quando a atividade biológica a ser detectada for beta-D-glicosidase, um substrato enzimático fluorogênico adequado é 4-metilumbeliferil-beta-D-glicosídeo.
[071] Em qualquer uma das realizações do método, o primeiro e/ou segundo sistema indicador pode compreender uma tintura indicadora de pH usada em conjunto com um nutriente metabolizável. A tintura indicadora de pH pode ser selecionada de acordo com critérios conhecidos na técnica, como por exemplo, faixa de pH, compatibilidade com o indicator e/ou micro-organismos alvo e solubilidade. Em algumas realizações, uma forma de sal do indicador de pH pode ser usada, por exemplo, para aumentar a solubilidade do indicador de pH em uma mistura aquosa. Alguns exemplos não limitadores de corantes de indicador de pH adequados incluem, por exemplo, azul de timol, tropeolina OO, amarelo de metila, laranja de metila, azul de bromofenol, verde de bromocresol,
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23/60 vermelho de metila, azul de bromotimol, vermelho de fenol, vermelho neutro, fenolftaleína, timolfaleína, amarelo de alizarina, tropeolina O, nitramina, ácido trinitobenzoico, azul de timol, azul de bromofenol, azul de tetrabromofenol, verde de bromocresol, púrpura de bromocresol, vermelho de metila, azul de bromotimol, vermelho de fenol, vermelho Congo e vermelho de cresol.
[072] O nutriente metabolizável pode ser qualquer nutriente metabolizável conhecido na técnica para reagir com ao menos um microorganismo (um micro-organismo indicador e/ou um micro-organismo alvo) e para resultar em uma alteração de pH (por exemplo, uma alteração localizada de pH) em um meio aquoso que está em contato fluido com o micro-organismo. O nutriente pode ser selecionado a partir de uma variedade de tipos de nutriente conhecidos na técnica. Exemplos não limitadores de tipos de nutriente incluem carboidratos (por exemplo, açúcares, polissacarídeos e derivados dessas substâncias), gorduras (por exemplo, ácidos graxos, ésteres ácidos graxos e derivados dessas substâncias), aminas (por exemplo, aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, proteínas, poliaminas e derivados dessas substâncias), polifosfatos, purinas, pirimidinas, nucleosídeos e nucleotídeos.
[073] Em algumas realizações, o segundo sistema indicador opcional pode ser fornecido em um dispositivo de cultura (por exemplo, em um meio de cultura de ágar em uma placa de petri; em um meio de cultura desidratado em um dispositivo como dispositivo de cultura Petrifilm, por exemplo). Quando fornecido como um componente de um hidrogel, como um componente de um meio de cultura de ágar, o segundo sistema indicador opcional é fornecido em comunicação fluida com o meio de cultura. Quando fornecido como um componente desidratado como parte de um dispositivo de cultura reidratável, como uma placa Petrifilm, o segundo sistema indicado r opcional é colocado em comunicação fluida com o meio de cultura, conforme indicado na etapa 154 da figura 1. Isso pode ser obtido, por exemplo,
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24/60 reidratando-se o meio de cultura desidratado no dispositivo com um líquido (por exemplo, água, um tampão, um diluente). Em algumas realizações, meios de cultura reidratáveis incluem agentes gelificantes solúveis em água fria como ágar, agarose, goma guar, goma de xantana, goma de alfarrobeira, álcool polivinílico e/ou polivinil pirrolidona, por exemplo . Opcionalmente, o líquido pode conter uma amostra material, permitindo assim o desempenho simultâneo da etapa 154 e a etapa de inoculação 156 pelo operador.
[074] Inocular o dispositivo de cultura pode ser feito por uma variedade de métodos que são conhecidos na técnica. Alguns exemplos nãolimitadores de métodos de inoculação adequados incluem técnicas de pourplate, técnicas de inoculação de superfície, técnicas de streak-plate, técnicas de swab-plate e técnicas de contato de superfície (por exemplo, métodos de Rodac). As técnicas para plaquear a membrana de filtro podem ser usadas no presente método, desde que a membrana filtrante não interfere substancialmente na reação entre os micro-organismos e os sistemas indicadores ou interferir com a observação dos sistemas indicadores.
[075] Métodos da presente descrição incluem incubar um dispositivo de cultura inoculado durante um período. Um versado na técnica relevante reconhecerá que a temperatura de incubação pode ser selecionada de acordo com o micro-organismo a ser detectado. Por exemplo, se for para detectar uma levedura ou mofo, a primeira temperatura de incubação tipicamente pode ser à temperatura ambiente (cerca de 23°C) a cerca de 32°C. Por exemplo, se for para detectar uma bactéria, a primeira temperatura de incubação tipicamente pode ser de temperatura ambiente a cerca de 45°C.
[076] De acordo com a presente descrição, o período de incubação pode ser de cerca de uma hora. Em algumas realizações, o tempo da primeira incubação é menor que cerca de 4 horas (por exemplo, menos que cerca de 2 horas, menos que cerca de 3 horas, ou menos que cerca de 4 horas. Em
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25/60 algumas realizações, o período de incubação é menor que cerca de 8 horas (por exemplo, menos que cerca de 5 horas, menos que cerca de 6 horas, menos que cerca de 7 horas ou menos que cerca de 8 horas). Em algumas realizações, a primeira incubação é menor que cerca de 12 horas (por exemplo, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, ou cerca de 12 horas. Em algumas realizações, o período de incubação é menor que ou igual a cerca de 15 horas (por exemplo, menos que cerca de 13 horas, menos que cerca de 14 horas ou menos que cerca de 15 horas. Em algumas realizações, o período de incubação é de até 48 horas (por exemplo, menos que cerca de 24 horas, menos que cerca de 36 horas ou menos que cerca de 48 horas.
[077] Após o período de incubação, o dispositivo de cultura é observado para indicação da presença de um micro-organismo indicador. Em algumas realizações, o dispositivo de cultura é observado visualmente. Em algumas realizações, observar o dispositivo de cultura pode compreender utilizar um dispositivo de formação de imagens para observar o dispositivo de cultura. Os dispositivos de formação de imagens para fazer varredura e, opcionalmente, analisar um dispositivo de cultura são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, leitor de placa PETRIFILM (PPR), disponível junto à 3M Company (St. Paul, MN, EUA), o contador de colônias PETRISCAN disponível junto à Spiral Biotech (Norwood, MA) e os leitores de placa PROTOCOL e ACOLYTE disponíveis junto à Synbiosis (Cambridge, Reino Unido).
[078] Nas realizações que utilizam o segundo sistema indicador opcional, uma indicação da presença de um micro-organismo indicador pode ser observado detectando-se uma conversão do segundo sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado. Por exemplo, em algumas realizações, o segundo sistema indicador pode incluir um reagente cromogênico (por exemplo, cloreto de trifenil tetrazólio ou 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-Dglicopiranosídeo) que existe em um primeiro estado incolor até ser convertido
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26/60 (por exemplo, por micro-organismos indicadores) para um segundo estado colorido. Em outras realizações, o segundo sistema indicador pode incluir um reagente fluorogênico (por exemplo, 4-metilumbeliferil β-D-galactosídeo ou diacetato de fluoresceína) que existe em um primeiro estado incolor até ser convertido (por exemplo, por micro-organismos indicadores) para um segundo estado fluorescente. Em outras realizações, o segundo sistema indicador pode incluir um reagente (por exemplo, um indicador de pH) que pode ser convertido de um primeiro estado colorido ou fluorescente para um segundo estado colorido ou fluorescente por um produto de atividade microbiana (por exemplo, a fermentação de um carboidrato para produtos finais de ácido).
[079] Em algumas realizações, detectar uma conversão do segundo sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado pode compreender observar uma colônia de micro-organismos para detectar a conversão. Em algumas realizações, detectar uma conversão do segundo sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado pode compreender observar o meio de cultura para detectar a conversão.
[080] A figura 2 ilustra vários aspectos de detecção de um microorganismo indicador de acordo com a presente descrição. A figura 2 mostra uma vista superior de uma realização de um dispositivo de cultura inoculado que inclui micro-organismos indicadores reagindo com um segundo sistema indicador. O dispositivo de cultura tem um meio de cultura 282 que inclui um segundo sistema indicador que inclui um carboidrato fermentável (por exemplo, glicose) e um reagente (por exemplo, vermelho de clorofenol) em um primeiro estado (o primeiro estado é ilustrado como cinza escuro na figura 2; vermelho de clorofenol existe em um primeiro estado de cor violeta em um meio de cultura que tem um pH de cerca de 6,8 ou mais). Também são mostradas na figura 2 colônias de micro-organismos indicadores 284 que fermentaram a glicose até virar produtos finais do ácido difusíveis, que
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27/60 reagem com o reagente para convertê-lo para um segundo estado (o segundo estado é ilustrado como um halo cinza claro 286 em torno das colônias 284 na figura 2; vermelho de clorofenol se converte para um segundo estado de cor amarela em um meio de cultura tendo um pH menor que cerca de 5,2). Em algumas realizações, as colônias podem ser manchadas pelo reagente e podem ter a mesma cor (ou cor similar) do meio de cultura imediatamente em torno delas. Em outras realizações (não mostradas), o segundo sistema indicador pode simplesmente compreender um substrato enzimático ou reagente redox que se altera de um primeiro estado para um segundo estado e assim alterando diretamente a cor ou propriedades fluorescentes das colônias em si, em vez do meio de cultura em torno das colônias.
[081] Nas realizações que não utilizam o segundo sistema indicador opcional (por exemplo, um dispositivo de cultura contendo um meio de cultura de ágar seletivo, não mostrado), uma indicação da presença de um micro-organismo indicador pode ser detectado observando-se a presença de uma colônia bacteriana (por exemplo, pelo seu tamanho típico, formato, cor e/ou moforlogia, conforme conhecido na técnica) sobre ou dentro do meio de cultura.
[082] A Tabela 1 mostra vários exemplos não-limitadores de meios de cultura seletivos que podem ser usados para suportar o crescimento dos microorganismos Enterobacteriaceae, um grupo exemplificador de micro-organismos indicadores que indicam a presença dos micro-organismos alvo Salmonella. Também são mostradas na Tabela 1 sistemas indicadores exemplificadores (ou seja, segundos sistemas indicadores, de acordo com a presente descrição) que podem ser usados para detectar os micro-organismos Enterobacteriaceae. Os primeiros sistemas indicadores exemplificadores que podem ser usados para indicar a presença dos micro-organismos alvo Salmonella incluem substratos enzimáticos de esterase de ácido caprílico (apresentados na Publicação de Pedido de Patente PCT n° WO2007023185, que é aqui incorporada na íntegra, a
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28/60 título de referência); 2-desoxi-D-ribose mais vermelho neutro (apresentados na patente US n° 7.150.977; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência);
5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo (apresentados na patente US n° 6.368.817; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência); propanodiol mais vermelho neutro (apresentados na patente US n° 5.194.374; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência); e uma combinação de melibiose, manitol, sorbitol e vermelho neutro (apresentados na patente US n° 5.786.167; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência).
Tabela 1
Meio de Cultura Sistema Indicador
Ágar Bile Violeta Vermelho Glicose + vermelho neutro
Placa de Contagem de Enterobacteriaceae PETRIFILM Glicose + vermelho de clorofenol
[083] Uma realização exemplificadora de um método de detecção de um micro-organismo alvo Salmonella de acordo com a presente descrição inclui utilizar um dispositivo de cultura (por exemplo, uma placa de ágar Petri ou um dispositivo de cultura PETRIFILM) com um meio de cultura que inclui os componentes mencionados na Tabela 2. Ao se preparar o meio de cultura de ágar, todos os componentes com exceção da novobiocina de sódio e da cefsulodina são misturados um ao outro em qualquer ordem e depois disso fervidas e resfriadas para formar um meio basal. A novobiocina de sódio e a cefsulodina são adicionadas ao meio basal resfriado, fervido antes da conclusão do meio de plaqueamento. Em adição ao meio de cultura, um artigo de detecção é preparado com um primeiro sistema indicador compreendendo 5-bromo-4cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo, conforme descrito no Exemplo 1. O meio de cultura é inoculado com uma amostra e incubado durante um período de tempo (por exemplo, cerca de 18 a 48 horas). Após a incubação, o dispositivo de cultura é observado para indicação da presença de ao menos um microorganismo indicador (por exemplo, uma colônia e/ou zona vermelha genericamente circular que indica a fermentação de 2-desoxi-D-ribose para um
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29/60 produto final de ácido que altera o indicador de pH vermelho neutro de incolor para vermelho). A zona pode ter uma colônia visível dentro ou próxima ao centro. Se um micro-organismo indicador for detectado, o artigo de detecção é posto em contato com o meio de cultura e o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado durante um período de tempo (por exemplo, cerca de 1 a 5 horas) e observado para indicação da presença de um micro-organismo alvo (ou seja, uma colônia de cor azul geralmente no centro de uma zona vermelha que foi formada a partir da reação dos micro-organismos com o primeiro sistema indicador. Opcionalmente, um segundo sistema indicador adicional compreendendo um substrato cromogênico β-galactopiranosídeo que produz uma cor diferente do 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo) pode ser adicionado ao meio de cultura ou ao artigo de detecção. O segundo sistema indicador adicional pode ser usado para identificar ainda micro-organismos indicadores não-alvo, como certas cepas de E. coli e Citrobacter freundii. Como alternativa ao vermelho neutro, outros indicadores de pH conhecidos na técnica podem ser usados no segundo sistema indicador para detectar produtos finais de ácido da fermentação da 2-desoxi-D-ribose. Exemplos de outros indicadores de pH adequados são apresentados na presente invenção. Em algumas realizações, outros segundos sistemas indicadores (por exemplo, cloreto de trifenil tetrazólio) podem ser usados no lugar ou em adição à 2-desoxi-Dribose/sistema indicador vermelho neutro para indicar a presença de microorganismos indicadores. Em algumas realizações, outros segundos indicadores podem ser incorporados no artigo de detecção em vez do meio de cultura. Primeiros sistemas indicadores alternativos que poderiam ser incluídos no artigo de detecção podem incluir substratos enzimáticos cromogênicos ou fluorogênicos de a-galactosidase, substratos enzimáticos cromogênicos ou fluorogênicos de caprilato esterase ou sistemas indicadores para detectar fermentação de fenilalanina deaminase ou propanediol.
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Tabela 2.
Componente Gramas/litro
Extrato de levedura 3,00
Peptona de Proteose 10,00
Pó Lab Lemco 1,00
Cloreto de sódio 5,00
L-fenilalanina 3,50
Citrato Férrico de Amônio 0,50
Sais Biliares #3 0,40
Sais Biliares 0,20
2-desoxi-D-ribose 12,0
Vermelho Neutro 0,03
Ágar* 15,97
Água desionizada* 950 ml/litro
Novobiocina de sódio 0,02
Cefsulodina 0,006
[084] Alguns exemplos não-limitadores de meios de cultura seletivos que podem ser usados para suportar o crescimento de microorganismos Enterobacteriaceae e/ou coliformes, grupos exemplificadores de micro-organismos indicadores que indicam a presença de micro-organismos alvo E. coli O157:H7 incluem meio bílis-glicose violeta vermelho, meio bílislactose violeta vermelho, de E. coli PETRIFILM, placas de contagem de coliformes PETRIFILM, placas de contagem de Enterobacteriaceae PETRIFILM e placas de contagem rápida de coliformes PETRIFILM. Primeiros sistemas indicadores exemplificadores que podem ser usados para indicar a presença de micro-organismos alvo E. coli O157:H7 incluem uma combinação de salicina, adonitol, inositol e sorbitol com vermelho de fenol (apresentados na patente US n° 6.617.149; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência).
[085] Alguns exemplos não-limitadores de meios de cultura seletivos que podem ser usados para suportar o crescimento de microorganismos Listeria, um grupo de micro-organismos indicadores exemplificadores que indicam a presença de micro-organismos alvo Listeria monocytogenes incluem meio modificado Oxfords e meio R&F. Primeiros sistemas indicadores exemplificadores que podem ser usados para indicar a
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31/60 presença de micro-organismos alvo Listeria monocytogenes incluem substratos enzimáticos fosfatidil inositol fosfolipase C (apresentados na publicação de pedido de patente US n° 20070259393, que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência) e substratos enzimáticos alfa manosidase (apresentados na patente US n° 7.351.548; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência). Exemplos não limitadores de primeiros sistemas indicadores que podem ser usados para detectar micro-organismos alvo Listeria monocytogenes incluem 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-1-fosfato, 5bromo-6-cloro-3-indoxil mio-inositol-1-fosfato, sal de amônio, 4-metilumbeliferil mio-inositol-1-fosfato, sal de N-metil-morfolina, 3-indoxil-a-D-manopiranosídeo,
5-bromo-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 4-cloro-3-indoxil-a-D- manopiranosídeo, 5-iodo-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3indoxil-a-D-manopiranosídeo, cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5-bromo-6ch1oro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-bromo-3-indoxil-a-Dmanopiranosídeo, 6-cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-fluoro-3-indoxil-aD-manopiranosídeo, 4,6-dicloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6,7-dicloro-3indoxil-a-D-manopiranosídeo, 4,6,7-tricloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5bromo-4-cloro-N-metil-a-D-manopiranosídeo, 3-indoxil-a-D-manopiranosídeo e N-metil-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-bromo-2-naftil-a-D-manopiranosídeo, 4-metilumbeliferil-a-D-manopiranosídeo e 4-nitrofenil-a-D-manopiranosídeo.
[086] Em uma realização preferencial, um dispositivo de cultura de filme fino para detectar a presença de um micro-organismo Listeria pode compreender um meio de caldo desidratado que inclui peptona proteose, triptona, ácidos de casamino, Lab Lemco Powder/extrato de carne bovina, glicose, extrato de levedura, hidrogênio fosfato dipotássico, cloreto de lítio, albumina sérica bovina, goma guar, ácido nalidíxico (sal sódico), substratos enzimáticos cromogênicos para detectar a atividade enzimática de bglicosidase (por exemplo, Salmon-p-D-glicosídeo e/ou Magenta-p-D
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32/60 glicosídeo) e pentrahidrato de ceftazidima. Uma amostra líquida é usada para inocular o meio e um micro-organismo Listeria, se estiver presente, cresce e forma colônias que têm cor vermelha em função da hidrólise dos substratos enzimáticos cromogênicos disp-glicosidase. Se um micro-organismo Listeria for detectado no dispositivo de cultura, o meio inoculado no dispositivo de cultura pode ser opcionalmente contatado com um artigo de detecção compreendendo um revestimento desidratado que inclui um indicador cromogênico para detectar a atividade enzimática de fosfatidil inositol fosfolipase C (por exemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-1-fosfato), goma guar e um tampão de fosfato. Se uma ou mais das colônias incluir micro-organismos Listeria monocytogenes, irá hidrolisar o substrato enzimático de fosfatidil inositol fosfolipase C, fazendo com que as colônias se tornem azuis. Vantajosamente, o artigo de detecção só precisa ser usado se um micro-organismo Listeria for primeiramente detectado observando-se a prova de atividade enzimática de β-glicosidase associada a uma colônia.
[087] Alguns exemplos não-limitadores de meios de cultura seletivos que podem ser usados para suportar o crescimento de microorganismos Enterobacteriaceae, um micro-organismo indicador exemplificador que indica a presença de micro-organismos alvo Cronobacter sakazaki, incluem meio de bílis-glicose violeta vermelho e placas de contagem de Enterobacteriaceae PETRIFILM. Primeiros sistemas indicadores exemplificadores que podem ser usados para indicar a presença dos microorganismos alvo Cronobacter sakazaki incluem alfa glicosidase cromogênico e substratos enzimáticos de beta celobiosidase (apresentados na publicação de pedido de patente US n° 2006/0257967 que é aqui incorporada na íntegra, a título de referência).
[088] Em algumas realizações, um grupo de micro-organismos indicadores que é conhecido por ser encontrado em ambiente similar (por
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33/60 exemplo, material fecal) pois o micro-organismo alvo não pode realmente incluir o micro-organismo alvo. Um exemplo dessa condição é ilustrado pela relação de micro-organismos indicadores coliformes e micro-organismos alvo Salmonella. Bactérias coliformes são encontradas em material fecal e são caracterizados pela capacidade de fermentar lactose para produtos finais de ácido. Certos micro-organismos alvo Salmonella (por exemplo, Salmonella enterica Typhimurium) são encontrados em material fecal e não fermentam a lactose para produtos finais de ácido. Dessa forma, um método de acordo com a presente descrição pode incluir fornecer um primeiro sistema indicador (por exemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo) para detectar micro-organismos alvo Salmonella e um segundo sistema indicador (por exemplo, lactose e vermelho neutro) para detectar micro-organismos indicadores coliformes. Nessa realização, colônias que reagem com o primeiro sistema indicador não reagiriam com o segundo sistema indicador.
[089] A observação de uma indicação da presença de um organismo indicador denota a possível presença de um micro-organismo alvo (por exemplo, um patógeno potencial) em uma amostra. Dessa forma, é uma características do método que, quando uma indicação da presença de microorganismos indicadores é observado, um artigo de detecção pode ser usado para confirmar a presença ou ausência do micro-organismo alvo em uma amostra. Do contrário, em algumas realizações onde uma indicação da presença de microorganismos indicadores não é observada no dispositivo de cultura, o uso de um artigo de detecção no método pode ser evirtado porque a ausência de um microorganismo indicador em uma amostra denota a ausência de um micro-organismo alvo em uma amostra.
[090] Métodos da presente descrição compreendem fornecer um artigo de detecção compreendendo um primeiro sistema indicador. A figura 3 mostra uma vista em perspectiva de uma realização de um artigo de detecção
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300 de acordo com a presente descrição. O artigo de detecção 300 compreende um suporte sólido 310 com superfícies principais superiores e inferiores, e um revestimento 320 disposto sobre o mesmo. O revestimento 320 compreende um primeiro sistema indicador, conforme descrito aqui. O primeiro sistema indicador pode ser selecionado para detectar um micro-organismo alvo específico. Opcionalmente, uma camada adesiva (não mostrada) pode ser disposta no suporte sólido 310 entre o suporte sólido 310 e o revestimento 320. A camada adesiva opcional deve compreender um adesivo que não interfere substancialmente com a reação do primeiro sistema indicador com o microorganismo alvo e/ou interfere com a observação do segundo sistema indicador. Um exemplo não limitador de um adesivo adequado inclui o adesivo sensível à pressão isooctil acrilato/acrilamida (94:6) descrito na patente US n° 4.565.783; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência.
[091] Em algumas realizações, o revestimento 320 é substancialmente isento de água (isto é, tem conteúdo de água não maior que maios ou menos o conteúdo de água do revestimento desidratado quando deixado equilibrando-se com o meio ambiente). Em algumas realizações, o revestimento 320 pode ser aplicado ao substrato 310 ou à camada adesiva opcional (não mostrada) na forma de um revestimento seco como um pó ou o revestimento pode ser aplicado ao substrato na forma de um líquido que é subsequentmente seco no substrato, ambos processos conforme descrito, por exemplo, na patente US n° 4.565.783. Em algumas realizações, o artigo 300 pode ser construído, revestido e seco conforme descrito para a fabricação do compósito na patente US n° 6.022.682, que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência.
[092] Em algumas realizações, o revestimento 320 compreende um aglutinante. Há muitos aglutinantes que seriam adequados para uso no artigo de detecção 300. Alguns exemplos não-limitadores de aglutinantes
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35/60 adequados incluem agarose, goma guar, goma de xantana, goma de alfarrobeira e outras gomas naturais. Um aglutinante preferencial é goma guar.
[093] O revestimento 320 pode também incluir de preferência outros constituintes como, por exemplo, um agente tampão adequado para controlar o pH em um ponto onde uma reação entre o primeiro sistema indicador e o micro-organismo alvo é facilitada. A escolha do agente tampão específico (por exemplo, um tampão de fosfato) e pH (por exemplo, 7,2) pode depender do primeiro sistema indicador e/ou do micro-organismo alvo, conforme será reconhecido por uma pessoa tendo conhecimento básico da técnica.
[094] O suporte sólido 310 deve ser selecionado a partir de materiais que podem ser revestidos e não substancialmente obscurece a observação dos reagentes ou produtos do primeiro sistema indicador e, opcionalmente, o segundo sistema indicador. O suporte sólido 310 pode ser um filme de polímero, como um filme de poliéster. O suporte sólido 310 pode ser derivado de um material laminar (por exemplo, filme polimérico, papel, não tecido), deixado para cortar ou perfurar os artigos de detecção 300 de tamanho ou formato desejado após o revestimento e secagem. Em algumas realizações, o suporte sólido 310 pode ser transparente ou translúcido, ou pode se tornar transparente ou translúcida quando colocado em contato com um hidrogel. O material usado para o suporte sólido 310 pode ser selecionado para conferir qualquer grau de rigidez ou flexibilidade ao artigo de detecção 300. Além disso, o artigo de detecção 300 pode ser preparado em qualquer formato (por exemplo, circular, ovóide, quadradas, retangular, etc.) ou espessura, dependendo do que é desejado para uma aplicação específica.
[095] O suporte sólido 310 é de preferência transparente ou ao menos translúcido, para permitir a visualização de mudanças de cor que se desenvolvem quando o artigo é colocado em contato fluido com um dispositivo de cultura. O suporte sólido 310 também fornece estabilidade ao artigo e protege
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36/60 contra danos.
[096] O suporte sólido 310 pode ser selecionado de modo que seja descolável do revestimento 320, deixando o revestimento livre para uso nos testes (por exemplo, em contato fluido com um meio de cultura) sem o suporte sólido 310. Por exemplo, onde um filme de poliéster é usado como o suporte sólido, o suporte sólido 310 pode ser descolável do revestimento 320 quando o revestimento 320 se torna hidratado após o contato com o dispositivo de cultura.
[097] Em uso, o artigo de detecção é colocado em contato fluido com o meio de cultura do dispositivo de cultura. De preferência, o artigo de detecção e o meio de cultura serão colocados em contato no dispositivo de cultura (por exemplo, colocando-se o artigo de detecção em contato com o meio de cultura no dispositivo de cultura). Em certas realizações preferenciais, o artigo de detecção é dimensionado para que tenha substancialmente o mesmo formato e área superficial para que o artigo entre em contato com uma superfície inteira do meio de cultura no dispositivo de cultura. Em algumas realizações, o artigo de detecção pode ser pré-hidratados (por exemplo, com água estéril ou tampão), embora seja contemplado que a umidade no meio de cultura é suficiente para hidratar o artigo de detecção, permitindo assim que o primeiro sistema indicador para entrar em contato fluido com micro-organismos presentes no dispositivo de cultura.
[098] Sem se ater à teoria, acredita-se que o contato fluido entre o meio de cultura e o artigo de detecção permite a difusão do primeiro sistema indicador, um metabólito produzido pelo micro-organismo e/ou o micro-organismo (ou componente do mesmo, como uma enzima, por exemplo) de modo que um componente do primeiro sistema indicador pode reagir com o metabólito, o micro-organismo alvo ou um componente do microorganismo alvo e ser convertido de um primeiro estado para um segundo estado. Dessa forma, em algumas realizações, a conversão do primeiro
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37/60 sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado, se estiver presente, é indicativa da presença de ao menos um micro-organismo alvo.
[099] Em algumas realizações, a conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado, se estiver ausente, é indicativa da presença de ao menos um micro-organismo alvo. Nessas realizações do método, quando um micro-organismo indicador altere o primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado (por exemplo, a colônia e/ou o meio de cultura imediatamente em torno da colônia se torna colorido ou fluorescente), então o micro-organismo indicador não é o micro-organismo alvo. Do contrário, nessas realizações, se o micro-organismo indicador não alterar o primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado, é uma indicação de que o micro-organismo indicador é o micro-organismo alvo. Um exemplo não limitador específico pode ilustrar este ponto. Certos micro-organismos do gênero Shigella são patogênicos para seres humanos e, assim, Shigella é um exemplo de um micro-organismo alvo. Shigella é um gênero da família Enterobacteriaceae. Como os microorganismos Enterobacteriaceae (incluindo a espécie Shigella) pode ser encontrado em material fecal, micro-organismos Enterobacteriaceae são um exemplo de micro-organismos indicadores de Shigella. Em uma realização do método da presente descrição, uma amostra de material pode ser inoculada nos meios de cultura seletivos de Enterobacteriaceae (por exemplo, bílis ágar violeta vermelho ou placas de contagem de Enterobacteriaceae PETRIFILM). Se os micro-organismos indicadores forem detectados no meio de cultura, um artigo de detecção compreendendo, por exemplo, um substrato cromogênico enzimático para detectar β-glicosidase, β-fucosidase, e/ou N-acetil-βgalactosaminidase pode ser contatado com o meio de cultura. A conversão de qualquer um desses substratos enzimáticos de um estado não-colorido para um estado colorido é uma indicação de que a colônia não é o micro-organismo
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38/60 alvo porque os micro-organismos alvo Shigella não compreendem nenhuma das atividades enzimáticas correspondentes desses substratos enzimáticos.
[0100] Após colocar o artigo de detecção em contato fluido com o meio de cultura, o meio de cultura em contato com o artigo é observado para detectar uma conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado (por exemplo, de um estado incolor para um estado colorido, de um estado não fluorescente para um estado fluorescente, de uma primeira cor para uma segunda cor). Essa conversão pode ser detectada, por exemplo, por nenhum dos meios de detecção discutido na presente invenção para detectar a conversão do segundo sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado. Opcionalmente, em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado em uma temperatura predeterminada durante um período de tempo para facilitar a conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado. A temperatura de incubação pode ser, por exemplo, a temperatura ambiente (cerca de 23°C), até cerca de 28°C, até cerca de 30°C, até cerca de 35°C, até cerca de 37°C, até cerca de 42°C ou até cerca de 45°C. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado na mesma temperatura da temperatura de incubação usada para cultivar e detectar os micro-organismos indicadores. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado em uma temperatura diferente (por exemplo, menor ou maior) da temperatura de incubação usada para cultivar e detectar os micro-organismos indicadores.
[0101] Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por pelo menos cerca de 15 minutos. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por pelo menos cerca de 30 minutos. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por pelo menos
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39/60 cerca de 60 minutos. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por pelo menos cerca de 90 minutos. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por pelo menos cerca de 2 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por pelo menos cerca de 4 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até cerca de 60 minutos. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até cerca de 90 minutos. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até cerca de 2 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até cerca de 3 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até cerca de 4 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até 5 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até 8 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até 12 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por até 24 horas. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por entre cerca de 15 minutos e cerca de 8 horas, inclusive.Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo podeser incubado por entre cerca de 30 minutos e cerca de 8 horas, inclusive.Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo podeser incubado por entre cerca de 30 minutos e cerca de 5 horas, inclusive.Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por entre cerca de 1 hora e cerca de 5 horas, inclusive. Em algumas realizações, o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por entre cerca de 2 horas e cerca de 5 horas, inclusive. Em algumas realizações,
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40/60 o meio de cultura em contato com o artigo pode ser incubado por entre cerca de 2 horas e cerca de 4 horas, inclusive.
[0102] A figura 4 mostra uma vista superior do dispositivo de cultura da figura 3 após a colocação de um artigo de detecção em contato com o meio de cultura (crescimento) no dispositivo. O dispositivo de cultura tem um meio de cultura 482 sobre e/ou dentro do qual as colônias crescem. Conforme mostrado na figura 2, colônias de micro-organismos indicadores 484 estão presentes e alteraram o primeiro sistema indicador de um primeiro estado (cinza escuro) para um segundo estado (cinza claro), formando um halo distinto 486 em torno das colônias de micro-organismos indicadores 484. Também são mostradas na figura 4 colônias de micro-organismos alvo 485, que aparentam ser maiores do que as colônias de micro-organismos indicadores 484. Isso pode ser, por exemplo, em função da conversão do segundo sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado. Em algumas realizações, o segundo sistema indicador pode ser um substrato cromogênico precipitável enzimático (por exemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo) que, quando reagido com um micro-organismo alvo, pode tornar a colônia azul e fazer a colônia aparentar ser ligeiramente maior. As colônias de micro-organismos alvo 485 também reagiram com o primeiro sistema indicador e têm halos 486 em torno delas.
[0103] Métodos da presente descrição opcionalmente podem compreender ainda uma etapa de enumerar um tipo de micro-organismo. Enumerar um tipo de micro-organismo compreende contar inúmeras colônias (ou unidades formadoras de colônia) do tipo específico de micro-organismo. O número de unidades formadoras de colônia enumeradas pode ser usado para estimar o número de micro-organismos por grama (ou por mililitro) na amostra original. O número de unidades formadoras de colônia enumeradas pode ser comparado com um relatório descritivo para determinar se a amostra original está em
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41/60 conformidade com um padrão de qualidade, por exemplo. Em algumas realizações, todos os micro-organismos de um tipo específico (por exemplo, microorganismos indicadores, micro-organismos alvo) podem ser enumerados. Em algumas realizações, uma porção (por exemplo, até um número limite predeterminado) dos micro-organismos de um tipo específico pode ser enumerada.
[0104] Em algumas realizações, enumerar um tipo de microorganismo compreende enumerar o número de micro-organismos indicadores. Em algumas realizações, enumerar um tipo de micro-organismo compreende enumerar o número de micro-organismos alvo. Em algumas realizações, enumerar um tipo de micro-organismo compreende enumerar o número de micro-organismos indicadores e o número de micro-organismos alvo. Em algumas realizações, enumerar um tipo de micro-organismo pode compreender utilizar um dispositivo de formação de imagens para enumerar os microorganismos.
Realizações [0105] A realização 1 é um método de detecção da presença ou ausência de um micro-organismo alvo, compreendendo:
fornecer:
um dispositivo de cultura incluindo um meio de cultura que compreende ingredientes selecionados para facilitar o crescimento de um micro-organismo indicador predeterminado;
um artigo de detecção compreendendo um primeiro sistema indicador, em que o primeiro sistema indicador é selecionado para detectar um micro-organismo alvo; e uma amostra;
inoculação do dispositivo de cultura com a amostra;
incubação do dispositivo de cultura inoculada por tempo
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42/60 suficiente para permitir o crescimento dos micro-organismos indicadores;
observar o dispositivo de cultura para indicação de uma presença de ao menos um micro-organismo indicador;
entrar em contato com o meio de cultura do dispositivo de cultura incubado com o artigo de detecção; e observar o dispositivo de cultura em contato com o artigo para detectar uma conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado.
[0106] A realização 2 é método de acordo com a realização 1 em que a conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado, se estiver presente, é indicativa da presença de ao menos um micro-organismo alvo.
[0107] A realização 3 é o método de acordo com a realização 1, em que a conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado, se estiver ausente, é indicativa da presença de ao menos um micro-organismo alvo.
[0108] A realização 4 é o método de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente fornecer um segundo sistema indicador e colocar o segundo sistema indicador em comunicação fluida com o meio de cultura, em que observar o dispositivo de cultura para indicação da presença de ao menos um micro-organismo indicador compreende detectar uma conversão do segundo sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado.
[0109] A realização 5 é o método de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, em que fornecer o dispositivo de cultura compreende adicionalmente fornecer um dispositivo de cultura que compreende um hidrogel ou um agente gelificante seco solúvel em água gelada.
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43/60 [0110] A realização 6 é o método de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, em que entrar em contato com o meio de cultura com o artigo de detecção é feito apenas quando a indicação da presença de ao menos um micro-organismo indicador é observada.
[0111] A realização 7 é o método de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, em que fornecer um dispositivo de cultura compreende adicionalmente fornecer um dispositivo de cultura que inclui o segundo sistema indicador.
[0112] A realização 8 é o método de qualquer uma das realizações 1 a 7, em que fornecer um meio de cultura compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo Enterobacteriaceae, em que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Salmonella.
[0113] A realização 9 é o método da realização 8, em que o primeiro sistema indicador compreende um reagente para detectar a atividade enzimática de α-galactosidase ou caprilato esterase.
[0114] A realização 10 é o método de qualquer uma das realizações 1 a 7, em que fornecer um meio de cultura compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo Enterobacteriaceae, em que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Shigella.
[0115] A realização 11 é o método da realização 10, em que o primeiro sistema indicador compreende um reagente para detectar β-glicosidase, β-fucosidase, N-acetil-p-galactosaminidase, ou uma combinação de quaisquer duas ou mais das atividades enzimáticas anteriormente mencionados.
[0116] A realização 12 é o método de qualquer uma das realizações 1 a 7, em que fornecer um meio de cultura compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo
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Enterobacteriaceae, em que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Cronobacter.
[0117] A realização 13 é o método da realização 12, em que o primeiro sistema indicador compreende um reagente para detectar atividade enzimática de α-glicosidase e/ou β-cellobiosidase.
[0118] A realização 14 é o método de qualquer uma das realizações 1 a 7, em que fornecer um meio de cultura compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um microorganismo Enterobacteriaceae, em que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar Escherichia coli.
[0119] A realização 15 é o método da realização 14, em que o primeiro sistema indicador compreende um reagente para detectar a atividade enzimática de β-glucuronidase.
[0120] A realização 16 é o método de qualquer uma das realizações 1 a 7, em que fornecer um meio de cultura compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um microorganismo coliforme, em que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar Escherichia coli.
[0121] A realização 17 é o método da realização 16, em que o primeiro sistema indicador compreende um reagente para detectar a atividade enzimática de β-glucuronidase.
[0122] A realização 18 é o método de qualquer uma das realizações 1 a 7, em que fornecer um meio de cultura compreende fornecer um meio de cultura selecionados para facilitar o crescimento de um microorganismos do gênero Listeria, em que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar Listeria monocytogenes.
[0123] A realização 19 é o método da realização 18, em que o
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45/60 primeiro sistema indicador compreende um reagente para detectar a atividade enzimática de Da-manopiranosidase e/ou fosfolipase C específico de fosfatidil inositol.
[0124] A realização 20 é o método de qualquer uma das realizações 1 a 19, em que observar o dispositivo de cultura ou o dispositivo de cultura em contato com o artigo compreende observar o dispositivo de cultura visualmente.
[0125] A realização 21 é o método de qualquer uma das realizações 1 a 19, em que observar o dispositivo de cultura ou o dispositivo de cultura em contato com o artigo compreende observar o dispositivo de cultura com o uso de um dispositivo de formação de imagens.
[0126] A realização 22 é o método de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente enumerar unidades formadoras de colônias de microorganismos indicadores no dispositivo de cultura.
[0127] A realização 23 é o método de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente enumerar unidades formadoras de colônias de microorganismos alvo no dispositivo de cultura.
[0128] A realização 24 é o método de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, em que por em contato o meio de cultura com o artigo de detecção compreende adicionalmente por em contato o meio de cultura com o artigo de detecção a uma temperatura predeterminada.
[0129] A realização 25 é um artigo de detecção compreendendo um substrato com superfícies principais superiores e inferiores e um revestimento compreendendo um primeiro sistema indicador disposta sobre ao menos uma das superfícies principais, em que o primeiro sistema indicador é convertido de um primeiro estado para um segundo estado pela atividade
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46/60 enzimática de α-galactopiranosídeo ou caprilato esterase.
[0130] A realização 26 é o artigo da realização 25, em que o primeiro sistema indicador inclui um indicador selecionado do grupo consistindo em 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo, ácido 5bromo-6-cloro-3-indolil-caprílico, ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-caprílico, e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos indicadores supracitados.
[0131] A realização 27 é um artigo de detecção compreendendo um substrato com superfícies principais superiores e inferiores e um primeiro sistema indicador revestido em ao menos uma das superfícies principais, em que o primeiro sistema indicador é convertido de um primeiro estado para um segundo estado pela atividade enzimática de β-glucuronidase.
[0132] A realização 28 é o artigo da realização 27, em que o primeiro sistema indicador inclui um indicator selecionado do grupo consistindo em ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicurônico, p-nitrofenil-βglicuronídeo, ácido p-nitrofenil-2,3,4-tri-O-acetil-e-glicurônico metil ester, ácido fenolftaleína glicurônico, ácido fenolftaleína mono-P-glicurônico, naftil-AS-BIβ-D-glicuronídeo, 4-metilumbeliferil β-D-glicuronídeo, ácido 8-hidróxi quinolina-beta-D-glicurônico, sal sódico, ácido 2-naftil-beta-D-glicurônico, sal sódico, ácido 4-nitrofenil-beta-D-glicurônico, sal sódico, ácido fenolftaleínabeta-D-glicurônico, mono-hidrato de sal sódico, ácido 5-bromo-4-cloro-3indoxil-beta-D-glicurônico, sal de ciclohexilamônio, ácido 3-indoxil-beta-Dglicurônico, sal de ciclohexilamônio, ácido 3-indoxil-beta-D-glicurônico, sal sódico, ácido 5-bromo-6-cloro-3-indoxil-beta-D-glicurônico, sal de ciclohexilamônio, ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-glicurônico, sal sódico anidro e ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-glicurônico, tri-hidrato de sal sódico e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos indicadores supracitados.
[0133] A realização 29 é um artigo de detecção compreendendo
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47/60 um substrato com superfícies principais superiores e inferiores e um primeiro sistema indicador revestido em ao menos uma das superfícies principais, em que o primeiro sistema indicador é convertido de um primeiro estado para um segundo estado pela atividade enzimática de α-manopiranosidase ou fosfolipase C específica de fosfatidil inositol s.
[0134] A realização 30 é o artigo da realização 29, em que o primeiro sistema indicador inclui um indicador selecionado do grupo consistindo em 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-1-fosfato, 5-bromo-6cloro-3-indoxil mio-inositol-1-fosfato, sal de amônio, 4-metilumbeliferil mioinositol-1-fosfato, sal de N-metil-morfolina, 3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5bromo-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 4-cloro-3-indoxil-a-Dmanopiranosídeo, 5-iodo-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3indoxil-a-D-manopiranosídeo, cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5-bromo-
6-cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-bromo-3-indoxil-a-D- manopiranosídeo, 6-cloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-fluoro-3-indoxil-aD-manopiranosídeo, 4,6-dicloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6,7-dicloro-3indoxil-a-D-manopiranosídeo, 4,6,7-tricloro-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 5bromo-4-cloro-N-metil--a-D-manopiranosídeo, 3-indoxil-a-D-manopiranosídeo e N-metil-3-indoxil-a-D-manopiranosídeo, 6-bromo-2-naftil-a-Dmanopiranosídeo, 4-metilumbeliferil-a-D-manopiranosídeo, 4-nitrofenil-a-Dmanopiranosídeo e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos indicadores anteriormente mencionados.
[0135] A realização 31 é o artigo de qualquer uma das realizações 25 a 30, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma camada adesiva, em que ao menos uma porção do primeiro sistema indicador é disposta sobre ou dentro da camada adesiva.
[0136] A realização 32 é o artigo de qualquer uma das realizações 25 a 31, em que o primeiro sistema indicador é revestido em
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48/60 ambas as superfícies principais.
[0137] A realização 33 é o artigo de qualquer uma das realizações 25 a 32, em que o substrato é selecionado do grupo consistindo em um filme polimérico, papel, um não tecido, uma membrana filtrante e derivados de qualquer um dos anteriormente mencionados.
[0138] A realização 34 é o artigo de qualquer uma das realizações 25 a 33, em que o revestimento compreende um aglutinante.
Exemplos
Materiais
Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4) - Mallinkrodt Baker, Inc.; Phillipsburg, NJ, EUA
Fosfato de Potássio Dibásico (K2HPO4) - AMRESCO; Solon, OH
Goma guar - goma M150 guar MEYPROGAT, Meyhall Chemical AG
5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo - BIOSYNTH AG, Rietlistr, Suíça
Filme de poliéster - 0,074 mm (2,91 ml) filme de poliéster transparente
BCIG - 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glicuronídeo ácido Sal Ciclohexil amônio - BIOSYNTH AG
Metil Gluicuronídeo - ácido 1-O-metil-beta-D-glicurônico, Sal de Sódio - BIOSYNTH AG
Exemplo 1. Preparação de um Artigo de Detecção para detectar um micro-organismo alvo Salmonella.
[0139] Uma composição de revestimento foi preparada pela adição de 13,6 g de fosfato de potássio monobásico em 1000 ml de água tratada com osmose reversa em um recipiente de 4 litros e mistura com um misturador a ar durante cerca de 1,5 minuto seguido de adição de 3,4 g de
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49/60 fosfato de potássio dibásico e mistura por cerca de 2 minutos. Em seguida, 11 g de goma guar foram lentamente adicionados e misturados durante cerca de 5 minutos. O recipiente foi coberto e aquecido em uma placa quente, sob misturação, até a mistura alcançar 80°C. O recipiente foi removido da placa quente e misturado à temperatura ambiente durante cerca de 15 minutos e então refrigerado até a mistura atingir 40°C. Uma suspensão indicadora foi preparada pela adição de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo a 10 ml de água de osmose reversa e vortexação da mistura para formar uma suspensão uniforme. Após resfriamento da composição de revestimento a cerca de 40°C, a suspensão indicadora foi misturada na composição de revestimento.
[0140] A mistura foi então removida do refrigerador e deixada alcançar a temperatura ambiente. A mistura foi manualmente revestida a faca a uma largura de cerca de 20,32 cm (8 polegadas) em uma lâmina de 25,4 cm (10 polegadas) por 137,2 cm (54 polegadas) de filme de poliéster para obter um peso seco de revestimento de cerca de 9,69 g/m2 (0,150 grama por 24 polegadas quadradas, Disco 1A). O procedimento de revestimento foi repetido para fornecer filmes revestidos tendo peso seco de revestimento de 11,95 g/m2 (0,185 g/24 polegadas quadradas, Disco 1B), 15,5 g/m2 (0,240 g/24 polegadas quadradas, Disco 1C) e 19,38 g/m2 (0,30 g/24 polegadas quadradas, Disco 1D). As folhas revestidas foram submetidas a secagem em um forno ajustado a 110°C (230°F) por 5 a 15 minutos até secar. As folhas revestidas foram armazenadas em sacos plásticos. As folhas foram cortadas em quadrados de 10,2 cm (4 polegadas) e os quadrados foram mantidos em sacos plásticos até serem testados.
Exemplo 2. Detectar um micro-organismo alvo Salmonella com um Artigo de Detecção.
[0141] Uma colônia de Salmonella enterica Agona ((FSD #140)
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50/60 isolada de uma placa de raia do ágar foi inoculada em 5 ml de caldo triptcaseína de soja e incubada de um dia para o outro a 35°C. A cultura feita de um dia para o outro foi diluída em diluente de fosfato de Butterfield para obter uma suspensão que tem aproximadamente 100 unidades de formação de colônia (CFU) por mililitro. Quatro dispositivos de cultura bacterianos (Placas de contagem de Enterobacteriaceae 3M™ Petrifilm™; 3M Company; St. Paul, MN, EUA) foram cada um inoculados com 1 ml da suspensão bacteriana de acordo com as instruções do fabricante e incubados a 35°C por 22 a 24 horas. Os dispositivos foram inspecionados e as colônias vermelhas (cerca de 1 mm de diâmetro) circundadas por zonas ácidas amarelas (aproximadamente 24 mm de diâmetro) O filme superior da placa de cultura foi cuidadosamente levantada do filme inferior para expor o meio de cultura na placa de cultura. Dois discos quadrados (Disco 1A) foram inseridos na placa. O primeiro disco foi colocado com sua superfície revestida contra o meio de cultura aderido ao filme inferior (isto é, voltado para baixo). O segundo disco foi colocado no topo do primeiro disco com o lado revestido do segundo disco voltado para o lado oposto do filme inferior (isto é, voltado para para cima). O filme superior foi cuidadosamente abaixado (com o uso de um movimento rolante) para colocar o meio de cultura aderido ao filme superior em contato com o lado revestido do segundo disco. Foi aplicada leve pressão dos dedos à superfície externa do filme superior da placa fechada para assegurar o contato entre as superfícies do dispositivo de cultura e as superfícies revestidas dos discos. O procedimento foi repetido com os Discos 1B, 1C e 1D. Os dispositivos com os discos foram incubados a 35°C e inspecionados a cada hora durante cinco horas. Foram tiradas imagens digitais durante cada inspeção. As imagens mostraram que, em cerca de 3 horas, todas as colônias em cada uma das placas se tornaram azul a verde azulado em função da hidrólise do 5-bromo-4cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo pelos micro-organismos nas colônias.
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Exemplo 3. Preparação de um Artigo de Detecção para Detectar um Micro-organismo Alvo E. coli.
[0142] Uma composição de revestimento foi preparada de acordo com o procedimento do Exemplo 1. Uma suspensão foi preparada dissolvendo-se 0,4 g de ácido 1-O-metil-p-D-glicurônico (sal sódico) e 2,0 gramas de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-p-D-glicurônico em 50 ml de água tratada com osmose reversa em um béquer com agitação constante a temperatura ambiente com uma barra de agitação magnética. O béquer contendo suspensão indicadora foi colocado em um refrigerador.
[0143] A composição de revestimento foi removida do refrigerador quando resfriou para aproximadamente 40°C e foi subsequentemente misturado com um misturador de motor a ar até formar um vórtice. A suspensão indicadora foi adicionada à composição de revestimento e misturada durante cerca de 20 minutos. O meio de detecção resultante foi, então, coberto e refrigerado até o uso.
[0144] Os Discos 2A, 2B, 2C e 2D foram preparados e armazenados de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1 tendo peso seco de revestimento de 9,69 g/m2 (0,150 grama por 24 polegadas quadradas, Disco 2A), 11,95 g/m2 (0,185 g/24 polegadas quadradas, Disco 2B), 15,5 g/m2 (0,240 g/24 polegadas quadradas, Disco 2C) e 19,38 g/m2 (0,30 g/24 polegadas quadradas, Disco 2D).
Exemplo 4. Detectar um Micro-organismo Alvo E. coli com um Artigo de Detecção.
[0145] Uma colônia isolada da cepa E. coli (ATCC #51813) foi inoculada em 5 ml de caldo triptcaseína de soja e incubada a 35°C por 20 horas para fornecer uma cultura de um dia para o outro tendo uma concentração bacteriana de aproximadamente 2 x 109 cfu/ml. A cultura foi submetida a vórtice e 10 microlitros da cultura foram adicionados a 99 ml de tampão de fosfato Butterfields (Diluição 1). A suspensão foi agitada vigorosamente por cerca de 20
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52/60 segundos e 5 microlitros dessa diluição foi adicionado a outros 99 ml de tampão de fosfato Butterfields (Diluição 2). Essa suspensão foi agitada vigorosametne por cerca de 20 segundos. Dezesseis dispositivos de cultura bacteriana (Placa de Contagem de Coliformes de Alta Sensibilidade 3M™ Petrifilm™; 3M Company; St. Paul, MN, EUA) foram cada um inoculados com 5 ml da Diluição 2 de acordo com as instruções do fabricante. Quatro dispositivos de cultura foram incubados a cada uma das 4 temperaturas (32°C, 35°C, 37°C e 44,5°C, respectivamente) por 22 a 24 horas. Os dispositivos de cultura foram removidos do incubadores e uma imagem digital de cada placa foi registrada com uma câmera digital. Cada colônia tinha uma aparência característica (ou seja, centro de colônia vermelha de cerca de 1 mm de diâmetro circundado por uma zona vermelha de cerca de 2 a 3 mm de diâmetro) de uma colônia de coliformes na Placa de Contagem de Coliformes de Alta Sensibilidade.
[0146] Discos de cada tipo (ou seja, Disco 2A, Disco 2B, Disco 2C e Disco 2D) foram colocados conforme descrito no Exemplo 2 em dispositivos de cultura separados que foram incubados em cada temperatura. Os dispositivos com os discos foram então incubados em suas respectivas temperaturas por 5 horas. Uma imagem digital de cada dispositivo de cultura foi registrada após cada hora do período de incubação de 5 horas.
[0147] Após os dispositivos de cultura contendo os discos serem incubados, eles foram observados. Cada uma das colônias vermelhas em todas as placas que se tornaram azuis após o dispositivo de cultura ser posto em contato com o disco e incubado por 5 horas. Placas que foram incubadas a uma temperatura mais altas com os discos foram observadas por ter colônias azuis mais cedo do que as placas que foram incubadas a temperaturas mais baixas. Placas que receberam artigos de detecção com pesos de revestimento mais altos também foram observados por ter colônias azuis mais cedo do que as placas que receberam artigos de detecção com pesos de revestimento mais baixos.
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Exemplo 5. Exemplo Profético da Preparação de um Dispositivo de Cultura para Cultivar Micro-organismos Indicadores Listeria.
[0148] Uma composição do meio de cultura é preparada com os materiais na Tabela 3. Peptona Proteose, Triptona, Ácidos de Casamino e Extrato de Levedura podem ser obtidos, por exemplo, junto à Becton Dickinson (Sparks, MD). O extrato de pó/carne bovina Lab Lemco pode ser obtido, por exemplo, junto à Oxoid (Hampshire, Reino Unido). A albumina sérica bovina pode ser obtido, por exemplo, junto à Serologicals Corporation (Norcross, GA). Os indicadores de beta-D-glicosídeo podem ser obtidos junto à BioSynth AG, por exemplo. Ceftazadima pode ser obtida junto à Glaxo Wellcome, por exemplo.
Tabela 3.
Componente Material Gramas
1 Peptona de proteose 6,0
2 Triptona 19,2
3 Ácidos casamino 12,0
4 Lab Lemco Pó/Extrato de Carne Bovina 10,0
5 Glicose 5,0
6 Extrato de levedura 14,0
7 Fosfato de potássio, dibásico 9,0
8 Cloreto de lítio 15,0
9 albumina de soro bovino 6,0
10 Goma guar 10
11 Ácido nalidíxico, sal sódico 0,02
12 Salmão-beta-D glicosídeo 0,06
13 Magenta-beta-D glicosídeo 0,066
14 Pentahidrato de ceftazidima 0,027
[0149] Uma primeira mistura é preparada pela adição dos componentes 1 a 10 (mostrados na Tabela 3) com 1000 ml de água de osmose reversa, misturar para obter uma suspensão uniforme, aquecer a mistura até atingir 80°C e então resfriar à temperatura ambiente. Enquanto a primeira mistura está resfriando, uma segunda mistura é preparada pela mistura dos componentes 11 a 14 (mostrados na Tabela 1 em 10 mililitros de água de osmose reversa. A segunda mistura é submetida a vórtice para fornecer uma mistura uniforme, que é adicionada à primeira mistura e então misturada ainda para fornecer um meio de cultura uniforme. O meio de cultura é então refrigerado
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54/60 por 18 a 24 h (2 a 8°C).
[0150] O meio de cultura refrigerado é deixado para aquecer naturalmelnte até a temperatura ambiente e então aplicada a faca como revestimento sobre uma folha de 0,074 mm (2,6 mil) de espessura de filme de poliéster transparente e secado a cerca de 93°C (200°F) por 5 a 10 minutos. O vão da faca é ajustada para fornecer um peso seco de revestimento de aproximadamente 33,27 a 34,88 g/m2 (515 a 540 mg/24 pol.2). Uma folha de 0,46 mm (18 mil) de espessura de espuma de poliestireno de célula fechada é laminada a uma fita de transferência adesiva sensível à pressão. Aberturas circulares de 5,1 cm (2 polegadas) de diâmetro são perfuradas da folha de espuma e a folha de espuma é laminada ao lado revestido do meio de cultura do filme de poliéster para formar uma estrutura similar à porção inferior do dispositivo de cultura mostrado na figura 1 da patente US n° 4.565.783. A preparação do dispositivo de cultura é completada pela remoção do filme superior de uma Placa de Contagem Expressa de Estafilococos 3M™ Petrifilm™ e afixando-a à folha de isopor com fita adesiva revestida dupla, produzindo assim um dispositivo que lembra o dispositivo de cultura completo mostrado na figura 1 da patente US n° 4.565.783.
Exemplo 6. Exemplo Profético da Preparação de um Artigo de Detecção para Detectar um Micro-organismo Alvo Listeria monocytogenes.
[0151] Uma composição de revestimento é feita pela mistura de goma guar, fosfato dissódico e hidrogênio fosfato de potássio (mostrado na Tabela 4) em 1000 mililitros de água de osmose reversa para formar uma dispersão uniforme conforme descrito no Exemplo 1.
Tabela 4
Material gramas
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-1-fosfato 0,60
Goma guar 10
Fosfato dissódico, dibásico 8,0
Fosfato de potássio, monobásico 4,0
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55/60 [0152] O recipiente com a composição de revestimento é coberto e a dispersão é misturada continuamente enquanto aquecida a uma temperatura de 80°C. Então, é removido do calor e misturado continuamente a temperatura ambiente. Uma suspensão indicadora é preparada pela adição do 5-bromo-4cloro-3-indoxil-mio-inositol-1-fosfato (que pode ser obtido junto à Biosynth AG, por exemplo) a 10 ml de água de osmose reversa e vortexação para formar uma suspensão uniforme. Após a composição de revestimento resfriar à temperatura ambiente, a suspensão indicadora é misturada na composição de revestimento. A mistura é coberta e refrigerada por 18 a 22 horas. A mistura de revestimento é removida do refrigerador e deixada para aquecer naturalmente até a temperatura ambiente. Um filme de poliéster de 0,074 mm (2,9 mil) é revestido a faca com a mistura de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1 para obter um filme com um peso seco de revestimento de cerca de 5,17 a 6,14 g/m2 (80 a 95 mg/24 pol.2). O filme de poliéster é girado e revestido a faca no outro lado, da mesma forma. O filme, revestido em ambos os lados, é então cortado por matriz em discos circulares tendo um diâmetro de cerca de 5,1 cm (2 polegadas).
Exemplo 7 - Exemplo Profético de Detecção de um Micro-organismo Alvo Listeria monocytogenes [0153] Culturas de enriquecimento são preparadas a partir de alimentos e amostras ambientais com o uso de procedimentos padrão de coleta de amostra- e caldo de enriquecimento, (por exemplo, conforme especificado pelo Departamento de Agricultura dos EUA, Serviço de Inspeção de Segurança dos Alimentos Norte-Americano ou Manual Analítico Bacteriológico). Oito diluições seriais em 10 vezes da cultura são preparadas no diluente de Butterfield. Um mililitro de cada diluição é inoculado em dispositivos individuais de cultura descritos no Exemplo 5. Os dispositivos são então incubados a 35 a 37°C por 18 a 30 horas. Os dispositivos são inspecionados quanto à moforlogia típica de colônia (por exemplo, colônias vermelhas de aproximadamente 0,5 a 1,5 mm de diâmetro)
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56/60 indicativo de Listeria (um grupo de micro-organismos indicadores que indica a presença de Listeria monocytogenes). Se forem vistas colônias tipicamente coloridas no dispositivo de cultura após a incubação, o usuário pode ainda inserir um artigo de detecção para diferenciar as colônias. O filme superior do dispositivo de cultura é gentilmente puxado e um artigo de detecção de 5,1 cm (2 polegadas) descrito no Exemplo 6 é posto em contato com o meio de cultura. O filme superior é novamente fechado, colocando-o em contato com o artigo de detecção. O filme superior pode ser pressionado com leve pressão dos dedos para por em contato com as áreas de crescimento do dispositivo com o artigo de detecção. O dispositivo é incubado por até 5 horas a 35 a 37°C e inspecionado periodicamente (por exemplo, de hora em hora) quanto à presença de cor azul ou azulesverdeado nas colônias. As colônias de cor azul ou azul-esverdeado indicam a presença de L. monocytogenes.
Exemplo 8 - Método de Detecção de um Micro-organismo Alvo Listeria MONOCYTOGENES.
Preparação de Dispositivo de Cultura de Filme Fino - Substrato Revestido de Caldo:
[0154] Todos os ingredientes mostrados na Tabela 5, com exceção da goma guar, foram misturados com 970 mililitros de água desionizada em béquer de aço inoxidável. Sob misturação, o goma guar foi adicionado e a mistura completa foi aquecida a 80°C. A mistura completa aquecida foi agitada por cerca de 15 minutos, coberta e resfriada em um refrigerador de um dia para o outro. Antes do revestimento, vinte mililitros de Suplemento A (albumina sérica bovina, 3,2 g/20 ml) e dez mililitros de Suplemento B (pentahidrato de ceftazidina, 40 mg/10 ml) foram misturados com a mistura de revestimento. A mistura de revestimento com suplementos foi aplicada a faca como revestimento sobre filme de poliéster transparente (0,07 mm (2,91 mil) de espessura) com o uso de um vão 0,38 mm (15 mil). O poliéster revestido foi seco por cerca de 8
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57/60 minutos em um forno ajustado a 210°C. O peso do revestimento final da mistura seca revestida foi de 0,308 g/154,8 cm2 (0,308 g/24 pol.2). Espaçadores de isopor (0,51 mm (20 mil) de espessura), com aberturas de diâmetro de 5,08 cm (2 polegadas), foram aderidos ao filme revestido, seco, conforme descrito no Exemplo 1 da patente US n° 5.601.998; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência. O substrato foi cortado em aproximadamente peças de 10,2 cm (4”) por 10,2 cm (4”), cada peça tendo um espaçador com a abertura de 5 cm que enquadrou uma área circular da composição de caldo seca, revestida.
Tabela 5. Composição de Mistura de Revestimento.
Componente Material Gramas
1 Proteose peptonada n° 3 3,127
2 Peptona de caseína tipo III 9,6
3 Ácidos casamino 6,0
4 Peptona de carne (suína) 5,0
5 Glicose 2,5
6 Extrato de levedura 7,0
7 Fosfato de potássio, dibásico 4,5
8 Cloreto de lítio 9,0
10 Goma guar 12
11 Ácido nalidíxico, sal sódico 0,01
Preparação de Dispositivo de Cultura de Filme Fino - Substrato
Revestido de Pó:
[0155] Papel revestido de polietileno (0,13 mm de espessura) foi obtido junto à Schoeller Paper (Pulaski, NY, EUA). 6-cloro-3-indoxil-p-Dglicopiranosídeo (X-gluc, número de peça B5020) foi obtido junto à Biosynth AG (Staad, Suíça). O X-gluc (139,1 mg foi cuidadosamente misturado em 200 gramas de adesivo (um copolímero de isooctil acrilato e acrilamida em uma razão entre o peso 96:4). A mistura adesiva foi, então, aplicada como revestimento a placa sobre o papel revestido de polietileno e aquecido em um forno a 210°C para obter um peso seco de revestimento de 0,237 g/154,8 cm2 (0,237 g/24 pol.2). O filme revestido de adesivo foi revestido com uma camada de goma guar que foi previamente desinfetada com o uso de óxido de etileno. O excesso de goma guar
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58/60 foi agitado e o substrato revestido de pó foi cortado em peças de aproximadamente 10,2 cm (4”) por 10,2 cm (4”).
Conjunto dos Dispositivos de Cultura de Filme Fino:
[0156] Uma peça de fita dupla (3M Company, St. Paul, MN, EUA) foi aplicada ao longo de uma borda do espaçador de isopor em cada substrato revestido de caldo. Um substrato revestido de pó foi alinhado (com o lado revestido de pó voltado para o espaçador) para sobrepor o substrato revestido de caldo e o lado revestido de pó foi aderido à fita dupla para formar os dispositivos de cultura montados.
Preparação de Artigos de Detecção:
[0157] Uma mistura de revestimento foi preparada misturando-se em 1000 mililitros de água desionizada os seguintes componentes: 13,0 gramas de goma guar e uma solução de 141,3 miligramas de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-p-mioinositol-1-fosfato (X-IP, número de peça B7404-P00, obtido junto à Biosynth AG) dissolvido em 2,0 ml de dimetil sulfóxido (DMSO). A mistura foi aquecida em um béquer coberto a 80°C sob misturação, misturado nessa temperatura por mais 15 minutos e então resfriada em um refrigerador. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente antes do revestimento. A mistura foi revestida a faca (vão de 0,64 mm (25-mil)) no filme de poliéster transparente descrito acima. O filme revestido foi seca em forno a 210°C para se obter um peso seco de revestimento de 0,092 g/154,8 cm2 (0,092 g/24 pol2). O substrato revestido foi cortado em peças de aproximadamente 10,2 cm (4”) por 10,2 cm (4”).
Método de Detecção.
[0158] Uma colônia pura de cada uma das bactérias mostradas na Tabela 6 foi inoculada em tubos separados de caldo triptcaseína de soja contendo extrato de levedura (TSBYE). Os tubos foram incubados a 35°C por 18 a 24 horas. Dispositivos individuais de cultura (preparados conforme descrito neste Exemplo) foram abertos e hidratados por pipetagem de 1,5 ml de tampão de Butterfield na
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59/60 área circular do caldo desidratado definido pelo espaçador de isopor. Os dispositivos de cultura foram fechados, colocando o papel revestido de pó em contato com o tampão e espalhando o tampão por toda a área de crescimento circular definida pelo espaçador. As placas hidratadas foram deixadas em descanso a temperatura ambiente por 1 hora.
[0159] Dez microlitros de cada cultura cultivada de um dia para o outro de Listeria foram inoculados por técnica de placa de raia em dispositivos hidratados individuais de cultura e os dispositivos de cultura inoculados foram incubado a 35°C em um saco plástico com vedação de zíper por 24 horas. Após a incubação, as colônias foram observadas e a aparência da colônia é descrita na Tabela 6.
[0160] As placas incubadas foram abertas, fazendo com que o gel hidratado contendo as colônias bacterianas permanecessem fixadas ao substrato de papel revestido de polipropileno. Um artigo de detecção (descrito neste Exemplo) foi colocado no dispositivo de cultura de modo que o lado revestido do artigo de detecção voltado para o gel hidratado contendo as colônias. O dispositivo de cultura foi então fechado, fazendo com que o lado revestido do artigo de detecção para por em contato o gel hidratado contendo as colônias bacterianas. Os dispositivos de cultura foram então incubados a 35°C e observados. As observações são relatadas na Tabela 6. Os resultados indicam que apenas os micro-organismos Listeria monocytogenes reagidos (ou seja, hidrolisados) com o substrato enzimático indicator (5-bromo-4-cloro-3-indoxil-p-mio-inositol-1-fosfato) do artigo de detecção.
Tabela 6. Observações de Dispositivos de Cultura Contendo Microorganismos de Listeria.
Microorganismo Aparência da colônia Em Dispositivo de Cultura1 Aparência da Colônia após Adição no Artigo de Detecção2
Listeria monocytogenes, ATCC 19111 De cor avermelhada De cor azul
Listeria grayi, De cor avermelhada De cor avermelhada
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60/60
Microorganismo Aparência da colônia Em Dispositivo de Cultura1 Aparência da Colônia após Adição no Artigo de Detecção2
ATCC 19120
Listeria ivanovi, ATCC 19119 De cor avermelhada De cor avermelhada
Listeria seeligeri, ATCC 35967 De cor avermelhada De cor avermelhada
Listeria welshimeri, ATCC 35897 De cor avermelhada De cor avermelhada
Listeria innocua De cor avermelhada De cor avermelhada
1 Aparência da colônia - incubação após 24 horas 2 - Aparência da colônia em 15 a 60 minutos após o artigo de detecção ser posto em contato com a área de crescimento do dispositivo de cultura.
[0161] Várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Essas e outras realizações estão no escopo das reivindicações a seguir.

Claims (10)

  1. Reivindicações
    1. MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM MICRO-ORGANISMO ALVO, caracterizado por compreender fornecer:
    um artigo de detecção compreendendo um primeiro sistema indicador, em que o primeiro sistema indicador é selecionado para detectar um micro-organismo alvo;
    um dispositivo de cultura incluindo um segundo sistema indicador desidratado em um meio de cultura desidratado que compreende ingredientes selecionados para facilitar o crescimento de um micro-organismo indicador predeterminado; e uma amostra;
    colocar o segundo sistema indicador em comunicação fluida com o meio de cultura;
    inocular o dispositivo de cultura com a amostra;
    incubar o dispositivo de cultura inoculada por tempo suficiente para permitir o crescimento dos micro-organismos indicadores;
    observar o dispositivo de cultura para uma indicação de uma presença de pelo menos um micro-organismo indicador;
    colocar o meio de cultura do dispositivo de cultura incubado em contato com o artigo de detecção;
    observar o dispositivo de cultura em contato com o artigo para detectar uma conversão do primeiro sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado;
    em que observar o dispositivo de cultura para uma indicação da presença de pelo menos um micro-organismo indicador compreende detectar uma conversão do segundo sistema indicador de um primeiro estado para um segundo estado.
  2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
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    2/3 pelo contato do meio de cultura com o artigo de detecção ser realizado somente quando a indicação da presença de pelo menos um dos microorganismos indicadores é observada.
  3. 3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por fornecer um meio de cultura que compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo Enterobacteriaceae, sendo que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Salmonella.
  4. 4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por fornecer um meio de cultura que compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo Enterobacteriaceae, sendo que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Shigella.
  5. 5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 2, caracterizado por fornecer um meio de cultura que compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um microorganismo Enterobacteriaceae, sendo que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar um micro-organismo do gênero Cronobacter.
  6. 6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 2, caracterizado por fornecer um meio de cultura que compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um microorganismo Enterobacteriaceae, sendo que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar Escherichia coli.
  7. 7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por fornecer um meio de cultura que
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    3/3 compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo coliforme, sendo que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar Escherichia coli.
  8. 8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por fornecer um meio de cultura que compreende fornecer um meio de cultura selecionado para facilitar o crescimento de um micro-organismo do gênero Listeria, sendo que fornecer um artigo de detecção compreende fornecer um artigo de detecção para detectar Listeria monocytogenes.
  9. 9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por observar o dispositivo de cultura ou o dispositivo de cultura em contato com o artigo compreende observar o dispositivo de cultura visualmente.
  10. 10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por observar o dispositivo de cultura ou o dispositivo de cultura em contato com o artigo compreende observar o dispositivo de cultura utilizando um dispositivo de imagem.
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