BR112019027617A2

BR112019027617A2 - microscopia de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida com matrizes padronizadas de nano poços

Info

Publication number: BR112019027617A2
Application number: BR112019027617-3A
Authority: BR
Inventors: Gary Mark Skinner; Geraint Wyn EVANS; Stanley S. Hong
Original assignee: Illumina, Inc.; Illumina Cambridge Limited
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2020-09-01
Also published as: KR102321151B1; TW201940411A; EP3628090A1; KR102478948B1; KR20200026202A; AU2021245157B2; US11933728B2; CA3066734A1; NZ759785A; CA3066734C; EP3628090A4; EP3628090B1; CN111052147B; MX2019014522A; AU2021245157A1; CN111052147A; IL271120B2; US11650156B2; US20210364772A1; WO2019147581A1

Abstract

  São descritas técnicas para a redução do número de ângulos necessários na geração de imagens de iluminação estruturada de amostras biológicas através do uso de fluxos de células padronizados, em que os nano poços dos fluxos de células padronizados são dispostos em, por exemplo, uma matriz quadrada ou uma matriz assimétrica. Assim, o número de imagens necessárias para resolver detalhes das amostras biológicas é reduzido. São também descritas técnicas para geração de imagens de iluminação estruturada combinado com varredura em linha usando o fluxo de células padronizado.

Description

MICROSCOPIA DE ILUMINAÇÃO ESTRUTURADA DE DIMENSIONALIDADE

REDUZIDA COM MATRIZES PADRONIZADAS DE NANO POÇOS Referência cruzada com os pedidos relacionados

[0001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido de patente provisório norte americano nº 62/621,564 depositado em 24 de janeiro de 2018 e intitulado “Microscopia de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida com matrizes padronizadas de nano poços” e o pedido de patente alemão nº N2020622 depositado em 20 de março de 2018 e intitulado “Microscopia de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida com matrizes padronizadas de nano poços”. O conteúdo completo de cada um dos pedidos acima mencionados é aqui incorporado por referência. Antecedentes

[0002] Numerosos avanços recentes no estudo da biologia se beneficiaram de métodos melhorados para a análise e sequenciamento de ácidos nucléicos. Por exemplo, o Projeto Genoma Humano determinou a sequência completa do genoma humano que, espera-se, levará a novas descobertas em campos que variam desde o tratamento de doenças até avanços na ciência básica. Um número de novas tecnologias de sequenciamento de DNA foi relatado recentemente o qual está baseado na análise massivamente paralela de moléculas únicas não amplificadas ou amplificadas, quer na forma de matrizes planares ou em grânulos.

[0003] A metodologia usada para analisar a sequência dos ácidos nucleicos em tais novas técnicas de sequenciamento é, com frequência, com base na detecção de nucleotídeos ou oligonucleotídeos fluorescentes. A microscopia de iluminação estruturada (SIM) descreve uma das referidas técnicas de sequenciamento através da qual a luz espacialmente estruturada (isto é, padronizada) pode ser usada para o imageamento de uma amostra a fim de aumentar a resolução lateral do microscópio por um fator de dois ou mais. Durante o imageamento da amostra, imagens da amostra podem ser adquiridas em diversas fases do padrão (por exemplo, a 0°, 120° e 240°), com o procedimento sendo repetido pela rotação da orientação do padrão em torno do eixo óptico (por exemplo, por 60° e 120°). As imagens capturadas (por exemplo, nove imagens, uma imagem para cada ângulo de orientação em cada fase do padrão) podem ser montadas em uma única imagem apresentando uma largura de banda de frequência espacial alargada. A única imagem pode ser novamente transformada em espaço real para gerar uma imagem apresentando uma maior resolução do que normalmente seria resolvível pelo microscópio.

[0004] Em implementações típicas de sistemas SIM, um feixe de luz linearmente polarizado está direcionado através de uma grade de difração óptica que difrata o feixe em duas ou mais ordens separadas que podem ser projetadas na amostra imageada como um padrão de efeito de interferência sinusoidal. Nestas implementações, a orientação do padrão de grade de difração óptica projetado é controlada pela rotação da grade de difração óptica em torno do eixo óptico, enquanto a fase do padrão é ajustada pelo movimento da grade de difração óptica lateralmente em torno do eixo. Em tais sistemas, a grade de difração óptica é montada em um estágio de translação, o qual, por sua vez, é montado em um estágio de rotação. Adicionalmente, tais sistemas utilizam um polarizador linear para polarizar a luz emitida pela fonte de luz antes desta ser recebida na grade.

[0005] A FIG. 1A ilustra um exemplo de uma amostra 100 e um padrão de grade de difração óptica 102 projetado na amostra 100. Embora a amostra 100 possa compreender frequências espaciais mais altas, não resolvidas, a sobreposição do padrão de grade de difração óptica 102 que apresenta uma frequência espacial mais baixa, conhecida, na amostra 100 resulta em efeito Moiré. Isto movimenta, de forma eficaz, as frequências espaciais mais altas, não resolvidas, para frequências espaciais mais baixas que são resolvíveis por um microscópio. Tal como descrito acima, a captura de imagens da amostra 100 com diferentes orientações / ângulos e fases do padrão de grade de difração óptica 102 em relação à amostra 100, resulta em imagens que podem ser combinadas em uma única imagem que é novamente transformada em espaço real para gerar uma imagem apresentando uma resolução mais alta. Sumário

[0006] Exemplos de sistemas e métodos aqui descritos estão direcionados para técnicas para a redução do número de imagens e dimensões necessárias para resolver amostras fluorescentes usando SIM através de fluxo de células particularmente padronizados e o aproveitamento do movimento do feixe de luz em relação às amostras fluorescentes para alcançar uma implementação do SIM que possa ser usada com técnicas de varredura em linha.

[0007] De acordo com uma implementação, um método de imageamento de uma amostra biológica compreende a projeção de um padrão óptico em uma amostra biológica e a captura de uma primeira imagem do padrão óptico sobreposto na amostra biológica. Adicionalmente, o método pode compreender o deslocamento de fase do padrão óptico projetado em relação à amostra biológica e a captura de pelo menos uma segunda imagem do padrão óptico da fase deslocada sobreposta na amostra biológica. Além disso, o método pode compreender a reconstrução de uma imagem com alta resolução representativa da amostra biológica com base na primeira imagem capturada e pelo menos na segunda imagem capturada.

[0008] Em alguns exemplos, a amostra biológica está contida em um fluxo de células assimetricamente padronizado compreendendo uma pluralidade de nano poços alongados. Em alguns exemplos, cada uma da pluralidade de nano poços alongados são de formato elíptico ou retangular. Em alguns exemplos, cada uma da pluralidade de nano poços alongados estão orientados de modo que, ao longo de um primeiro eixo do fluxo de células assimetricamente padronizado, a resolução é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica. Em alguns exemplos, cada uma da pluralidade de nano poços alongados estão orientados de modo que, ao longo de um segundo eixo do fluxo de células assimetricamente padronizado, a resolução não é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica.

[0009] Em algumas implementações, a captura da primeira e pelo menos da segunda imagem compreende a realização do imageamento de varredura em linha. O método pode ainda incluir: o direcionamento da luz através de uma grade de difração óptica em uma primeira fase e orientação angular, em que o padrão óptico projetado na amostra biológica é um padrão de grade de difração óptica gerado pela luz que está sendo direcionada através da grade de difração óptica, em que o deslocamento de fase do padrão óptico projetado em relação à amostra biológica inclui o deslocamento de fase da grade de difração óptica. O deslocamento de fase da grade de difração óptica pode compreender o deslocamento de fase da grade de difração óptica ao longo da primeira orientação angular. O deslocamento de fase da grade de difração óptica pode ocorrer de forma perpendicular a uma direção do imageamento de varredura em linha.

[0010] Em alguns exemplos, o método pode ainda compreender a realização de um terceiro deslocamento de fase da grade de difração óptica, projeção do padrão de grade de difração óptica na amostra biológica e captura de pelo menos uma terceira imagem do padrão de grade de difração óptica da fase deslocada sobreposto na amostra biológica antes da reconstrução da imagem em alta resolução.

[0011] Em alguns exemplos, um método de imageamento de uma amostra biológica compreende o direcionamento da luz através de uma grade de difração óptica em uma primeira fase e orientação angular, e a projeção de um padrão de grade de difração óptica gerado pela luz sendo direcionado através da grade de difração óptica na amostra biológica e captura de uma primeira imagem do padrão de grade de difração óptica sobreposto na amostra biológica. O método pode ainda compreender o deslocamento de fase da grade de difração óptica, a projeção do padrão de grade de difração óptica na amostra biológica e captura de pelo menos uma segunda imagem do padrão de grade de difração óptica da fase deslocada sobreposto na amostra biológica. Adicionalmente, o método pode compreender a reorientação da grade de difração óptica para uma segunda orientação angular, a projeção do padrão de grade de difração óptica na amostra biológica, e a captura de uma terceira imagem do padrão de grade de difração óptica sobreposto na amostra biológica. Além disso, o método pode compreender o deslocamento de fase da grade de difração óptica, a projeção do padrão de grade de difração óptica na amostra biológica e a captura de pelo menos uma quarta imagem do padrão de grade de difração óptica da fase deslocada sobreposto na amostra biológica. Além disso, o método pode compreender a reconstrução de uma imagem com alta resolução representativa da amostra biológica com base na primeira, pelo menos na segunda, a terceira e pelo menos na quarta imagem capturada.

[0012] Em alguns exemplos, a amostra biológica está contida em um fluxo de células padronizado de matriz quadrada compreendendo uma pluralidade de nano poços.

[0013] Em alguns exemplos, um sistema pode compreender uma fonte de laser que emite um feixe de luz,

uma grade de difração óptica adaptada para gerar um padrão de grade de difração óptica pela passagem do feixe de luz emitido através da grade de difração óptica, e um conjunto de câmera. O conjunto de câmera pode estar adaptado para capturar uma pluralidade de imagens de padrão de grade de difração óptica sobrepostas em uma amostra biológica, a pluralidade de imagens refletindo três fases da grade de difração óptica em relação à amostra biológica. O sistema pode ainda incluir um processador adaptado para a reconstrução de uma imagem com alta resolução representativa da amostra biológica com base em uma combinação da pluralidade de imagens.

[0014] Em alguns exemplos, a amostra biológica está localizada em um fluxo de células compreendendo uma pluralidade de nano poços orientados em uma matriz assimétrica. Em alguns exemplos, cada um da pluralidade de nano poços é de formato elíptico ou de formato retangular. Em alguns exemplos, cada um da pluralidade de nano poços está orientado de modo que, ao longo de um primeiro eixo do fluxo de células, a resolução é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica. Em alguns exemplos, cada um da pluralidade de nano poços está orientado de modo que, ao longo de um segundo eixo do fluxo de células, a resolução não é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica.

[0015] Em alguns exemplos, o conjunto de câmera compreende um conjunto de câmera com varredura em linha de integração com atraso de tempo. Em alguns exemplos, a amostra biológica está contida em um fluxo de células,

diferentes porções das quais são sobrepostas com representações das três fases da grade de difração óptica simultaneamente.

[0016] Em alguns exemplos, a grade de difração óptica do sistema inclui três elementos escalonados de fase, em que cada um dos três elementos escalonados de fase está adaptado para gerar um padrão de grade de difração óptica pela passagem do feixe de luz emitido através do elemento escalonado de fase, em que o conjunto de câmera está adaptado para capturar uma imagem de um padrão de grade de difração óptica gerado por cada um dos três elementos escalonados de fase sobrepostos na amostra biológica. Em alguns exemplos, o conjunto de câmera inclui três sensores de imagens, cada um dos três sensores de imagens adaptados para capturar a imagem do padrão de grade de difração óptica gerado por um respectivo dos elementos escalonados de fase.

[0017] De acordo com outra implementação, um sistema pode compreender: uma fonte de laser que emite um feixe de luz; uma grade de difração óptica adaptada para gerar um padrão de grade de difração óptica pela passagem do feixe de luz emitido através da grade de difração óptica; e um conjunto de câmera adaptado para capturar uma pluralidade de imagens do padrão de grade de difração óptica sobrepostas em uma amostra biológica, a pluralidade de imagens refletindo três fases da grade de difração óptica em relação à amostra biológica e duas orientações angulares da grade de difração óptica em relação à amostra biológica. O sistema pode ainda compreender um processador adaptado para reconstruir uma imagem com alta resolução representativa da amostra biológica com base em uma combinação da pluralidade de imagens.

[0018] Em alguns exemplos, a amostra biológica está localizada em um fluxo de células compreendendo uma pluralidade de nano poços orientada em uma matriz quadrada.

[0019] Em alguns exemplos, cada um da pluralidade de nano poços está orientado de modo que a resolução é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica ao longo do primeiro e segundo eixos do fluxo de células.

[0020] Deve ser apreciado que todas as combinações dos conceitos acima e dos conceitos adicionais discutidos em maiores detalhes abaixo (desde que tais conceitos não sejam mutualmente inconsistentes) estão contemplados como sendo parte da matéria objeto inventiva aqui descrita. Em particular, todas as combinações da matéria objeto reivindicada que aparecem no final desta divulgação são contempladas como sendo parte da matéria objeto inventiva aqui descrita.

[0021] Outras características e aspectos da tecnologia descrita se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir, tomada em conjunto com as figuras que a acompanham, as quais ilustram, para fins de exemplo, as características de acordo com implementações da tecnologia descrita. O sumário não tem a intenção de limitar o escopo de qualquer invenção aqui descrita, as quais são definidas pelas reivindicações e equivalentes. Breve descrição das figuras

[0022] A presente divulgação, de acordo com uma ou mais diversas implementações, é descrita em detalhes com referência às figuras a seguir. As figuras são fornecidas para fins de ilustração apenas e descrevem somente implementações típicas ou exemplos.

[0023] A FIG. 1A ilustra um exemplo de iluminação estruturada que está sendo usada para diminuir o padrão de frequência de uma amostra, permitindo resolução aumentada.

[0024] A FIG. 1B ilustra, em um exemplo, o número de ângulos necessários para resolver uma amostra para imageamento.

[0025] A FIG. 2 ilustra um exemplo de um sistema de imageamento de iluminação estruturada.

[0026] A FIG. 3A ilustra um exemplo de um padrão de fluxo de células hexagonal.

[0027] A FIG. 3B ilustra um exemplo de um padrão de fluxo de células de matriz quadrada, o uso do qual resulta no imageamento de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida.

[0028] A FIG. 3C ilustra um exemplo de um padrão de fluxo de células de matriz assimétrica, o uso da qual resulta no imageamento de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida.

[0029] A FIG. 4 é um diagrama de fluxo que ilustra exemplos de operações que podem ser implementadas para o imageamento de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida.

[0030] A FIG. 5 ilustra um exemplo de um sistema de imageamento de varredura em linha.

[0031] As FIGS. 6A - 6C ilustram, em um exemplo, o deslocamento de fase de um padrão de iluminação estruturado em uma dimensão.

[0032] A FIG. 6D ilustra um exemplo de um fluxo de células assimetricamente padronizado apresentando diferentes porções simultaneamente sobrepostas com padrões de iluminação estruturados de fase deslocada.

[0033] A FIG. 7 ilustra um exemplo de uma operação de varredura em linha usando um fluxo de células convencionalmente padronizado.

[0034] A FIG. 8 ilustra um exemplo de um sistema de imageamento de varredura em linha usando um padrão de iluminação estruturado estacionário.

[0035] A FIG. 9 ilustra um exemplo de uma operação de varredura em linha usando um padrão de iluminação estruturado estacionário que modula um feixe de luz de iluminação.

[0036] A FIG. 10 é um diagrama de fluxo que ilustra exemplos de operações que podem ser implementadas para o imageamento de iluminação estruturada de dimensionalidade reduzida usada em conjunto com o imageamento de varredura em linha.

[0037] A FIG. 11 ilustra um exemplo de componente de computação que pode ser usado para implementar diversas características de implementações descritas na presente divulgação.

[0038] A FIG. 12 ilustra um exemplo de implementação em que um padrão de grade e poço está configurado em um leve desvio angular, com três finas regiões de iluminação projetadas na amostra, relativamente distante.

[0039] As figuras não são exaustivas e não limitam a presente divulgação à forma precisamente descrita. Descrição detalhada

[0040] Como aqui utilizado para se referir a luz difratada emitida por uma grade de difração, o termo “ordem” ou “número de ordem” tem a intenção de significar o número de comprimentos de onda inteiros que representam a diferença de comprimento do caminho da luz a partir de fendas adjacentes da grade de difração para interferência construtiva. O termo “ordem zero” ou “ordem máxima zero” tem a intenção de se referir ao efeito brilhante central emitido por uma grade de difração na qual não há difração. O termo “primeira ordem” tem a intenção de se referir aos dois efeitos brilhantes emitidos em ambos os lados do efeito de ordem zero, em que a diferença de comprimento do caminho é de ± 1 comprimento de onda.

[0041] Como aqui utilizado, para se referir a uma amostra, o termo “ponto” ou “característica” tem a intenção de significar um ponto ou área em um padrão que pode ser distinguido a partir de outros pontos ou áreas de acordo com a localização relativa. Um ponto individual pode incluir uma ou mais moléculas de um tipo particular. Por exemplo, um ponto pode incluir uma única molécula de ácido nucleico alvo apresentando uma sequência particular ou um ponto pode incluir diversas moléculas de ácido nucleico apresentando a mesma sequência (e / ou sequências complementares da mesma).

[0042] Como aqui utilizado, o termo “título” se refere, em geral, a uma ou mais imagens da mesma região da amostra, em que cada uma das uma ou mais imagens representa um canal de cor respectivo. Um título pode formar um subconjunto de dados de imageamento de um conjunto de dados de imageamento de um ciclo de imageamento.

[0043] Como aqui utilizado, o termo “plano x – y” tem a intenção de significar uma área de duas dimensões definidas pelos eixos de linhas retas x e y em um sistema de coordenadas cartesiano. Quando utilizado em referência a um detector e um objeto observado pelo detector, a área pode ser ainda especificada como sendo ortogonal à direção de observação entre o detector e o objeto a ser detectado. Quando aqui utilizado para se referir a um leitor de varredura em linha, o termo “direção y” se refere à direção da varredura.

[0044] Como aqui utilizado, o termo “coordenada z” tem a intenção de significar informações que especificam a localização de um ponto, linha ou área ao longo de um eixo que é ortogonal a um plano x - y. Em implementações particulares, o eixo z é ortogonal a uma área de um objeto que é observado por um detector. Por exemplo, a direção do foco para um sistema óptico pode ser especificada ao longo do eixo z.

[0045] Como aqui utilizado, o termo “varredura de uma linha” tem a intenção de significar a detecção de seção transversal de duas dimensões em um plano x - y de um objeto, a seção transversal sendo retangular ou oblonga, e causando movimento relativo entre a seção transversal e o objeto. Por exemplo, no caso do imageamento fluorescente, uma área de um objeto com formato retangular ou oblongo pode ser especificamente excitada (com exclusão de outras áreas) e / ou a emissão a partir da área pode ser especificamente adquirida (com exclusão de outras áreas) em um determinado ponto de tempo na varredura.

[0046] Implementações aqui descritas estão direcionadas ao fluxo de células configurado para apresentar padrões quadrados ou assimétricos. Deve-se recordar que SIM depende de luz espacialmente estruturada (isto é, padronizada) para formar uma imagem de uma amostra a fim de aumentar a resolução lateral do microscópio por um fator de dois ou mais. Também se deve recordar que, tradicionalmente, imagens da amostra em múltiplas fases de padrão e múltiplas orientações / ângulos são usadas para alcançar o aumento desejado na resolução lateral.

[0047] A FIG. 1B ilustra, em geral, em um exemplo, a região observável de espaço recíproco produzida pela objetiva de um microscópio (a qual é análoga ao seu padrão de difração) e como esta está limitada nas extremidades pelas frequências espaciais mais altas do que a objetiva pode transmitir (2 NA / λ (gráfico 120). Tal como ilustrado, um ponto central representa o componente de ordem zero. Os componentes de difração de ordem zero e primeira ordem que representam um padrão de linhas paralelas estão ilustrados no gráfico 122. Se os espaçamentos do padrão estiverem nos limites de resolução, os pontos de primeira ordem ocorrem na extremidade do campo observável (no limite k0). Devido à mistura de frequências,

as regiões observáveis também contêm, em adição à imagem normal de frequências espaciais (círculo central), duas novas imagens de frequência de desvio (gráfico 124) que são centralizadas na extremidade do campo original. Estas imagens de desvio contêm frequências espaciais mais altas as quais não são observáveis usando microscópios convencionais. Tal como ilustrado pelo gráfico 126, um conjunto de imagens preparadas a partir de três fases nas orientações de 120°, finalmente, após o processamento, produzir uma imagem real que contenha o dobro da resolução espacial que pode ser observada em microscopia de fluorescência de amplo campo.

[0048] No entanto, pela configuração do fluxo de células para apresentar padrões quadrados ou assimétricos (em vez de padrões hexagonais, por exemplo), menos imagens são necessárias, uma vez que a melhora da resolução requerida para resolver o substrato se torna anisotrópica, assim, a construção de uma função de transferência óptica anisotrópica (OTF) através da utilização de um conjunto de ângulos SIM mais restrito se torna suficiente para resolver o substrato em grau adequado. Isto é, o fluxo de células apresentando padrões quadrados ou assimétricos de nano poços permite que o eixo / eixos de um fluxo de células apresentando um campo mais apertado (isto é, a distância entre os nano poços imediatamente adjacentes) e envolvendo resolução aumentada, sejam alinhados com o eixo / eixos cuja resolução deve ser aumentada. Em um exemplo de um fluxo de células padronizado quadrado, a resolução aumentada é apenas necessária em relação aos dois eixos.

Logo, apenas seis imagens são necessárias (uma imagem de cada um dos dois ângulos em torno das três fases). No caso de um fluxo de células assimetricamente padronizado, apenas três imagens de uma amostra são necessárias para alcançar a resolução aumentada (uma imagem em um ângulo em torno de três fases).

[0049] Pela redução do número de ângulos necessários para resolver uma amostra para o grau desejado, o número de imagens necessárias para completar o imageamento da amostra é reduzido. Por exemplo, no contexto da química 4-dye, um sistema pode necessitar adquirir 36 imagens a fim de gerar 4 imagens para a chamada de base (explicado abaixo). A quantidade de espaço de armazenamento (por exemplo, disco) necessária para armazenar ou prover as imagens capturadas pode também ser reduzida. Adicionalmente, o processamento e / ou a potência computacional necessária para montar as imagens em uma única imagem e, então, transformar novamente / reconstruir a única imagem em uma apresentando a resolução desejada pode também ser reduzida.

[0050] Além disso, implementações convencionais de SIM são incompatíveis com sistemas de sequenciamento que utilizam técnicas de varredura em linha para formar uma imagem de uma amostra. Varredura em linha pode se referir a usar uma linha de pixels que forma uma imagem de um fluxo de células linha a linha para construir uma imagem contínua (diferente de uma câmera ou sensor com uma matriz bidimensional de pixels que captura uma imagem fixa de um objeto inteiro, por exemplo, um fluxo de células). Um tipo particular de varredura em linha que se presta a sistemas de sequenciamento é a varredura em linha de integração com atraso de tempo (TDI).

[0051] Com implementações em SIM de múltiplos ângulos, um campo de visão fixo é necessário para adquirir cada uma das combinações de imagem de ângulo / fase. No entanto, quando as imagens são tomadas em relação a apenas um único ângulo, como no caso das implementações aqui descritas em que um fluxo de células assimetricamente padronizado é usado como um substrato da amostra, a varredura em linha TDI pode ser usada para capturar imagens da amostra que cobrem as três fases do padrão SIM. Isto é, um padrão SIM pode ser movido em relação ao fluxo de células assimetricamente padronizado para gerar as três fases necessárias para resolver a amostra no fluxo de células com resolução aumentada ao longo de apenas um eixo.

[0052] Em algumas implementações, a varredura em linha TDI pode ser usada em conjunto com técnicas SIM para formar uma imagem de uma amostra pelo uso de uma câmera ou sensor de varredura em linha TDI para capturar uma imagem ao longo de um fluxo de células (referido como “faixa”). Isto é, a varredura em linha TDI pode ser realizada em um fluxo de células padronizado com um padrão SIM em uma primeira fase. O padrão SIM pode ser deslocado para uma segunda fase, e a varredura em linha TDI pode ser repetida. O padrão SIM pode ser deslocado para uma terceira fase e a varredura em linha TDI pode ser repetida novamente. Desta forma, as imagens da amostra em cada fase padrão são capturadas.

[0053] Alternativamente, diferentes porções do fluxo de células podem ser padronizadas com diferentes fases do padrão SIM. Por exemplo, em uma primeira porção do fluxo de células, o padrão SIM pode estar localizado em uma primeira posição, em uma segunda porção do fluxo de células, o padrão SIM pode ser deslocado para uma segunda posição e em uma terceira porção do fluxo de células, o padrão SIM pode ser deslocado para uma terceira posição. Logo, como a câmera ou sensor captura a faixa, imagens da amostra em torno de cada uma dos três padrões de fase SIM são capturadas em uma única varredura em linha TDI.

[0054] Algumas implementações da varredura em linha TDI podem ser aplicadas com um gerador de imagens TDI de três chips em que as três fases de um padrão de efeito projetado podem ser especificadas em uma varredura. Tais implementações podem ser aplicadas usando uma grade de difração de três partes, em que cada parte da grade de difração corresponde a uma fase específica. Por exemplo, uma grade de difração de três elementos, com cada elemento escalonado de fase, pode ser formada no mesmo substrato. Em virtude desta implementação, nenhum movimento da grade ou da amostra pode ser necessário além do movimento ao longo da direção da varredura.

[0055] Ainda em outras implementações, em vez de deslocar o padrão SIM em relação à amostra / fluxo de células, a amostra / fluxo de células é movida enquanto o padrão SIM permanece estacionário. É entendido que a amostra está localizada / posicionada no fluxo de células resultante em uma amostra que está sendo padronizada de acordo com os nano poços que fazem o fluxo de células. Quando a varredura em linha TDI é aplicada, como notado acima, a amostra / fluxo de células já está em movimento. Assim, este movimento da amostra / fluxo de células pode ser alavancado para evitar o deslocamento do padrão SIM. Isto é, o movimento da amostra / fluxo de células em relação ao padrão SIM estacionário (dada a orientação adequada) gera as fases necessárias para resolver a amostra.

[0056] Em algumas implementações, o padrão de grade e poço pode estar configurado em leve desvio angular, com três regiões de iluminação finas projetadas na amostra, relativamente distantes. Dentro de cada linha de iluminação, os poços podem permanecer predominantemente em fase com a grade, porém a distância entre as regiões de iluminação pode ser suficiente para que, na segunda área de iluminação, eles estejam fora da fase lambda / 3, para o deslocamento de fase. O espaçamento entre as linhas de iluminação em tais implementações pode se tornar mais fácil se apresentar 3 sensores de imagem (por exemplo, três chips de varredura TDI) próximos um do outro. Este exemplo de cenário é ilustrado pela FIG. 12.

[0057] Antes de descrever as diversas implementações dos sistemas e métodos aqui descritos em detalhe, é útil descrever um exemplo de ambiente no qual a tecnologia aqui descrita pode ser aplicada. Tal exemplo de ambiente é aquele de um sistema de imageamento de iluminação estruturada 200, ilustrado na FIG. 2, que ilumina uma amostra com luz espacialmente estruturada. Por exemplo, o sistema 200 pode ser um sistema de microscopia de iluminação de fluorescência estruturado que utiliza luz de excitação espacialmente estruturada para formar uma imagem de uma amostra biológica.

[0058] No exemplo da FIG. 2, um emissor de luz 250 está configurado para produzir um feixe de luz que é colimado por lentes de colimação 251. A luz colimada é estruturada (padronizada) por um conjunto óptico de estruturação de luz 255 e direcionada por um espelho dicroico 260 através das lentes objetivas 242 em uma amostra de um recipiente de amostra 210, o qual está posicionado em um estágio 270. No caso de uma amostra fluorescente, a amostra fluoresce em resposta a luz de excitação estruturada e a luz resultante é coletada por lentes objetivas 242 e direcionada para um sensor de imagem do sistema de câmera 240 para detectar a fluorescência.

[0059] O conjunto óptico de estruturação de luz 255, em diversas implementações, mais adiante descrito, inclui uma ou mais grades de difração óptica para gerar um padrão sinusoidal de luz difratada (por exemplo, efeitos) que é projetada em amostras de um recipiente de amostra

210. As grades de difração podem ser grades de fase unidimensionais ou bidimensionais, transmissivas ou refletivas. Como descrito mais adiante, com referência a implementações particulares, no sistema 200, as grades de difração não necessariamente envolvem um estágio de rotação. Em algumas implementações, as grades de difração podem estar fixas (por exemplo, não rotacionadas ou movidas linearmente) durante a operação do sistema de imageamento.

Por exemplo, em uma implementação particular, mais adiante descrita, as grades de difração podem incluir duas grades de difrações unidimensionais transmissivas fixas substancialmente orientadas ou exatamente / perfeitamente perpendiculares uma a outra (por exemplo, uma grade de difração horizontal e uma grade de difração vertical).

[0060] Durante cada ciclo de imageamento, o sistema 200 utiliza um conjunto óptico de estruturação de luz 255 para adquirir uma pluralidade de imagens em diversas fases, lateralmente deslocadas ao longo do plano da amostra (por exemplo, ao longo do plano x - y), com este procedimento repetido uma ou mais vezes pela rotação da orientação do padrão em torno do eixo óptico (isto é, em relação ao plano x - y da amostra). As imagens capturadas podem, então, ser espacialmente reconstruídas para gerar uma imagem com resolução mais alta (por exemplo, uma imagem apresentando cerca de duas vezes a resolução espacial lateral das imagens individuais).

[0061] No sistema 200, o emissor de luz 250 pode ser um emissor de luz incoerente (por exemplo, que emite feixes de luz produzidos por um ou mais diodos de excitação), ou um emissor de luz coerente tal como emissor de luz produzido por um ou mais lasers ou diodos de laser. Tal como ilustrado no exemplo do sistema 200, o emissor de luz 250 inclui uma fibra óptica 252 para guiar um feixe óptico a ser produzido. No entanto, outras configurações de um emissor de luz 250 podem ser usadas. Em implementações que utilizam iluminação estruturada em um sistema de imageamento de múltiplos canais (por exemplo, um microscópio de fluorescência de múltiplos canais que utilizam múltiplos comprimentos de onda de luz), fibra óptica 252 pode, opcionalmente, se acoplar a uma pluralidade de diferentes fontes de luz (não mostradas), cada fonte de luz emitindo luz a partir de um diferente comprimento de onda. Embora o sistema 200 seja ilustrado como apresentando um único emissor de luz 250, em algumas implementações, múltiplos emissores de luz 250 podem estar incluídos. Por exemplo, múltiplos emissores de luz podem estar incluídos no caso de um sistema de imageamento de iluminação estruturada que utiliza múltiplos braços, mais adiante discutido. Por exemplo, a luz que corresponde aos diferentes comprimentos de onda, tal como azul, verde, vermelho ou outras cores pode ser emitida. Em alguns exemplos, um emissor / fonte de luz pode ser usado. Em alguns exemplos, dois ou mais emissores / fontes de luz podem ser usados.

[0062] Em algumas implementações, o sistema 200 pode incluir uma lente tubular 256 que podem incluir um elemento de lente para estar articulado ao longo do eixo z para ajustar o formato e caminho do feixe estruturado. Por exemplo, um componente da lente tubular pode estar articulado para ter em conta uma faixa de espessuras de amostra (por exemplo, diferentes espessuras de vidro de cobertura) da amostra no recipiente 210.

[0063] No exemplo do sistema 200, módulo ou dispositivo de distribuição de fluido 290 pode direcionar o fluxo de reagentes (por exemplo, nucleotídeos marcados com fluorescência, tampões, enzimas, reagentes de clivagem,

etc.) para o (e através do) recipiente de amostra 210 e válvula de descarga 220. O recipiente de amostra 210 pode incluir um ou mais substratos sobre os quais as amostras são providas. Por exemplo, no caso de um sistema para analisar um grande número de diferentes sequências de ácidos nucleicos, o recipiente de amostra 210 pode incluir um ou mais substratos nos quais os ácidos nucleicos a serem sequenciados estão ligados, conectados ou associados. O substrato pode incluir qualquer substrato ou matriz inerte ao qual os ácidos nucleicos podem ser ligados, tal como, por exemplo, superfícies de vidro, superfícies de plástico, látex, dextrano, superfícies de poliestireno, superfícies de polipropileno, geis de poliacrilamida, superfícies de ouro e pastilhas de silício. Em algumas implementações, o substrato está dentro de um canal ou outra área em uma pluralidade de localizações formadas em uma matriz ou conjunto ao longo de um recipiente de amostra 210. O sistema 200 também pode incluir um atuador da estação de temperatura 230 e aquecedor / refrigerador 235 que pode opcionalmente regular a temperatura das condições dos fluidos dentro do recipiente de amostra 210.

[0064] Em implementações particulares, um recipiente de amostra 210 pode ser aplicado como um fluxo de células padronizado, incluindo uma placa de cobertura translúcida, um substrato e um líquido contido entre os mesmos e uma amostra biológica, podem estar localizados em uma superfície interna da placa de cobertura translúcida ou uma superfície interna do substrato. O fluxo de células pode incluir um grande número (por exemplo, centenas,

milhões ou bilhões, ou mais) de poços ou regiões que estão padronizadas em uma matriz definida (por exemplo, uma matriz hexagonal, matriz retangular, etc.) no substrato. Cada região pode formar um aglomerado (por exemplo, um aglomerado monoclonal) de uma amostra biológica tal como DNA, RNA, ou outro material genômico o qual pode ser sequenciado, por exemplo, usando o sequenciamento por síntese. O fluxo de células pode ser ainda dividido em um número de faixas espaçadas (por exemplo, oito faixas), cada faixa incluindo uma matriz hexagonal de aglomerados.

[0065] O recipiente de amostra 210 pode ser montado em um estágio de amostra 270 para fornecer movimento e alinhamento do recipiente de amostra 210 em relação às lentes objetivas 242. O estágio de amostra pode apresentar um ou mais atuadores para permitir que ele se movimente em qualquer uma das três dimensões. Por exemplo, em termos do sistema de coordenadas cartesiano, atuadores podem ser fornecidos para permitir que o estágio se movimente nas direções X, Y e Z em relação às lentes objetivas. Isto pode permitir que a localização de uma ou mais amostras no recipiente de amostra 210 seja posicionada em alinhamento óptico com lentes objetivas 242. O movimento do estágio de amostra 270 em relação às lentes objetivas 242 pode ser alcançado pelo movimento do estágio de amostra por si só, as lentes objetivas, algum outro componente do sistema de imageamento, ou qualquer combinação dos acima. Outras implementações podem também incluir o movimento de todo o sistema de imageamento sobre uma amostra estacionária. Alternativamente, o recipiente de amostra 210 pode estar fixo durante o imageamento.

[0066] Em algumas implementações, um componente de foco (eixo z) 275 pode estar incluído para controlar o posicionamento dos componentes ópticos em relação ao recipiente de amostra 210 na direção do foco (tipicamente referido como o eixo z ou a direção z). O componente de foco 275 pode incluir um ou mais atuadores fisicamente acoplados ao estágio óptico ou um estágio de amostra, ou ambos, para movimentar o recipiente de amostra 210 no estágio de amostra 270 em relação aos componentes ópticos (por exemplo, as lentes objetivas 242) para fornecer o foco adequado para a operação de imageamento. Por exemplo, o atuador pode estar fisicamente acoplado ao estágio respectivo tal como, por exemplo, por fixação mecânica, magnética, fluídica ou outra ou contato direto ou indireto com ou para o estágio. O um ou mais atuadores pode estar configurado para movimentar o estágio na direção z enquanto mantém o estágio de amostra no mesmo plano (por exemplo, mantendo um nível ou atitude horizontal, substancialmente ou perfeitamente perpendicular ao eixo óptico). Pode ser apreciado que a perfeita perpendicularidade, paralelismo ou outra orientação pode não ser alcançada de acordo com alguns exemplos ou implementações devidas, por exemplo, a tolerâncias de fabricação, limitações operacionais, etc. No entanto, para os efeitos das tecnologias aqui divulgadas, substancialmente perpendicular, paralelo ou outra orientação é entendido por significar uma orientação suficiente para alcançar uma resolução desejada ou outro efeito relevante tal como aqui descrito e / ou contemplado.

O um ou mais atuadores pode também estar configurado para inclinar o estágio. Isto pode ser feito, por exemplo, de modo que o recipiente de amostra 210 pode ser nivelado dinamicamente para representar qualquer declive nas suas superfícies.

[0067] A luz estruturada que emana de uma amostra teste em uma localização de amostra a ser imageada pode ser direcionada através do espelho dicroico 260 para um ou mais detectores do sistema de câmera 240. Em algumas implementações, um conjunto de comutação do filtro 265 com um ou mais filtros de emissão pode estar incluído, em que o um ou mais filtros de emissão podem ser usados para passar através de comprimentos de onda de emissão particulares e bloquear (ou refletir) outros comprimentos de onda. Por exemplo, o um ou mais filtros de emissão podem ser usados para comutar entre os diferentes canais do sistema de imageamento. Em uma implementação particular, os filtros de emissão podem ser aplicados como espelhos dicroicos que direcionam a luz de emissão de diferentes comprimentos de onda para diferentes sensores de imagem do sistema de câmera 240.

[0068] O sistema de câmera 240 pode incluir um ou mais sensores de imagem para monitorar e rastrear o imageamento (por exemplo, sequenciamento) do recipiente de amostra 210. O sistema de câmera 240 pode ser aplicado, por exemplo, como uma câmera de sensor de imagem de dispositivo de carga acoplada (CCD), porém outras tecnologias de sensor de imagem (por exemplo, sensor de pixel ativo) podem ser usadas. Dados de saída (por exemplo, imagens) do sistema de câmera 240 podem ser comunicados a um módulo de análise em tempo real (não mostrado) que pode ser aplicado como uma implementação de software que, como mais adiante descrito, pode reconstruir as imagens capturadas durante cada ciclo de imageamento para criar uma imagem apresentando uma resolução espacial mais alta. Como será descrito abaixo, o sistema de câmera 240 pode também ser aplicado como uma câmera TDI CCD para efetuar técnicas de varredura em linha.

[0069] Embora não ilustrado, um controlador pode ser fornecido para controlar a operação do sistema de imageamento de iluminação estruturada 200, incluindo a sincronização dos diversos componentes ópticos do sistema

200. O controlador pode ser aplicado para controlar aspectos da operação do sistema tal como, por exemplo, a configuração do conjunto óptico de estruturação de luz 255 (por exemplo, seleção e / ou translação linear das grades de difração), movimento das lentes tubulares 256, foco, movimento do estágio e as operações de imageamento. Em diversas implementações, o controlador pode ser aplicado usando hardware, algoritmos (por exemplo, instruções executáveis por máquina), ou uma combinação dos acima. Por exemplo, em algumas implementações, o controlador pode incluir uma ou mais CPUs ou processadores com memória associada. Como outro exemplo, o controlador pode compreender hardware ou outro circuito para controlar a operação, tal como um processador de computador e um meio legível por computador não transitório com instruções legíveis por máquina armazenadas no mesmo. Por exemplo, este circuito pode incluir um ou mais do seguinte: matriz de portões de campo programável (FPGA), circuito integrado específico de implementação (ASIC), dispositivo lógico programável (PLD), dispositivo lógico programável complexo (CPLD), uma matriz lógica programável (PLA), lógica de matriz programável (PAL) ou outros dispositivos de processamento ou circuitos similares. Como ainda em outro exemplo, o controlador pode compreender uma combinação deste circuito com um ou mais processadores.

[0070] A FIG. 3A ilustra um exemplo de configuração de um fluxo de células padronizado 300 que pode ser imageada de acordo com implementações aqui descritas. Neste exemplo, o fluxo de células 300 é padronizado com uma matriz hexagonal (vide 304) de pontos ou características ordenadas 302 que podem formar imagens simultaneamente durante a corrida de imageamento. Para facilitar a ilustração, o fluxo de células 300 é ilustrado como apresentando dezenas a centenas de pontos 302. No entanto, como pode ser apreciado por um técnico no assunto, o fluxo de células 300 pode apresentar centenas, milhões ou bilhões de pontos 302 que forma imagens. Além disso, em alguns casos, o fluxo de células 300 pode ser uma amostra com múltiplos planos compreendendo múltiplos planos (substancialmente ou perfeitamente perpendicular à direção do foco) de pontos 302 que são amostrados durante uma corrida de imageamento. Em uma implementação particular, o fluxo de células 300 pode estar padronizado com milhões ou bilhões de poços que estão divididos em faixas. Nesta implementação particular, cada poço do fluxo de células pode conter material biológico que é sequenciado usando o sequenciamento por síntese.

[0071] Como aludido acima, em alguns exemplos, a fim de resolver uma amostra usando o fluxo de células padronizado 300, pelo menos nove imagens são necessárias para alcançar a resolução requerida. Isto acontece porque a matriz hexagonal dos nano poços no fluxo de células padronizado 300 é um padrão de alta frequência, em que o campo entre os nano poços é apertado e não resolvível. Em particular, neste exemplo, existem dois fatores que podem determinar quantas imagens são necessárias para resolver a amostra suficientemente.

[0072] O primeiro fator é o número de cópias da banda óptica que são desejadas. Com referência a FIG. 1B, o gráfico 122 mostra a banda normal sem o uso de SIM. O gráfico 124 ilustra um exemplo no qual uma cópia da banda óptica é criada. Isto pode melhorar a resolução em uma dimensão, enquanto o gráfico 126 / gráfico 306 (FIG. 3A) ilustra um exemplo em que três cópias da banda óptica são criadas, as quais resultam em uma melhora bastante uniforme da resolução em duas dimensões.

[0073] O segundo fator é o número de imagens usadas para desmodular fases para cada banda óptica. Embora, teoricamente, apenas duas imagens são necessárias (para obter as partes real e imaginária), três imagens são tipicamente usadas para obter melhor cálculos da média de ruído.

[0074] Deve ser entendido que, quando a translação de uma imagem a partir da frequência espacial para o espaço de Fourier (análise de dados brutos gerados por um microscópio no plano focal traseiro da objetiva é baseado na análise de Fourier), a transformada de Fourier contém 3 componentes ou eixos. Isto é, a difração da luz no plano focal traseiro da objetiva cria uma barreira de difração que dita uma resolução máxima de aproximadamente 200 nm na dimensão lateral (x,y) e 500 nm na dimensão axial (z), dependendo da abertura numérica da objetiva e o comprimento de onda médio de iluminação. De acordo, quando utiliza a matriz hexagonal dos nano poços no fluxo de células padronizado 300, as imagens são tomadas em três ângulos usando SIM. Como também discutido acima, a fim de obter a resolução requerida, as imagens devem ser tomadas ao longo de três fases em cada um dos três ângulos, em que as três fases são necessárias para garantir que todas as partes da área de imageamento sejam observadas (isto é, para cobrir o comprimento de onda total do padrão SIM), assim resultando em nove imagens. Isto resulta na resolução aumentada em todos os três eixos 308.

[0075] No entanto, em um exemplo, usando outro tipo de fluxo de células padronizado, por exemplo, um fluxo de células 310, em que os nano poços 312 são padronizados em uma matriz quadrada (vide 314), apenas dois ângulos são necessários para alcançar a resolução aumentada, a resolução aumentada estando alinhada ao longo dos eixos da matriz quadrada. O gráfico 316 ilustra um exemplo desta, em que apenas duas cópias da banda óptica são criadas e necessárias para alcançar o aumento de resolução requerido. Em outras palavras, um fluxo de células padronizado quadrado, tal como o fluxo de células 310 pode ser resolvido pelo alinhamento do padrão ou efeito SIM para aquelas direções nas quais um aumento na resolução é desejado, neste caso, ao longo de dois eixos (x e y) da matriz quadrada. Pode ser apreciado que ao longo de qualquer caminho diagonal entre nano poços 312 vizinhos, haverá alguma melhora na resolução de modo que nano poços diagonalmente vizinhos serão resolvíveis um a partir do outro. No entanto, entre os nano poços 312 ao longo dos eixos x e y, o campo (Px, Py) é estreito o suficiente para que a resolução necessite ser impulsionada pelo uso de SIM, isto é, a frequência espacial nos eixos x e y é muito alta para ser resolvida.

[0076] Pelo uso de um fluxo de células padronizado quadrado, tal como o fluxo de células 310, o requisito de dimensionalidade dos sistemas convencionais de sequenciamento utilizando SIM pode ser reduzida em uma dimensão, em que a resolução é aumentada em apenas dois eixos 318. Isto é, em vez de capturar nove imagens que cobrem três ângulos ao longo de três fases cada, apenas seis imagens que cobrem dois ângulos ao longo de três fases cada uma necessita ser capturada a fim de resolver uma amostra adequadamente contida em um fluxo de células 310. Isto é vantajoso apesar de uma redução na densidade de empacotamento do fluxo de células 310. Por exemplo, a redução na densidade de empacotamento pode ser de apenas 11 % sobre a matriz hexagonal apresentando o mesmo campo. No entanto, a implementação de SIM de acordo com diversos exemplos pode resultar em uma densidade de empacotamento aumentada em, por exemplo, 356 % para uma matriz quadrada padronizada com um campo de 350 nm, em relação a uma matriz hexagonal não SIM com um campo de 700 nm.

[0077] Pelo uso de outro tipo de fluxo de células padronizado, neste exemplo, um fluxo de células assimetricamente padronizado, o requisito de dimensionalidade dos sistemas convencionais de sequenciamento utilizando SIM pode ser reduzido em mais uma dimensão. A FIG. 3C ilustra um fluxo de células padronizado 320 cujos nano poços estão padronizados assimetricamente. Nesta implementação, cada nano poço 322 apresenta um formato ou está configurado para formar uma estrutura alongada. Como aqui utilizado, o termo estrutura alongada se refere a um formato em que a dimensão ao longo de um primeiro eixo é maior do que as dimensões ao longo de um segundo eixo. Neste exemplo, o eixo x, é mais estreito do que o comprimento ou altura do nano poço 322 ao longo de outro eixo (neste exemplo, o eixo y). Deve ser entendido que, embora a implementação ilustrada na FIG. 3C utilize nano poços elípticos, outros tipos de nano poços alongados, por exemplo, retângulos, podem ser usados. Qualquer formato de nano poço pode ser usado para que resulte em um padrão em que a amostra, ao longo de apenas um eixo, está associada a um aumento de resolução usando SIM. Em algumas implementações, a dimensão das características é padronizada, de modo que uma largura do efeito w é pelo menos substancialmente a mesma ou levemente maior do que pode ser um diâmetro de uma característica circular, um comprimento de um lado de uma característica quadrada, um comprimento do lado maior ou do lado menor de uma característica retangular, um diâmetro de uma característica elíptica ao longo do seu eixo maior ou eixo menor, ou a dimensão mais longa de uma característica de formato irregular ao longo de um eixo da característica (por exemplo, eixo x ou y). Em algumas implementações, os nano poços podem, alternativamente, apresentar o formato como quadrados ou círculos, porém, com espaçamento assimétrico entre eles. Em diversas implementações, um fluxo de células assimetricamente padronizado pode ser referir a uma matriz na qual os componentes de frequência primários estão em distâncias diferentes a partir do componente de frequência zero, uma matriz cuja célula unitária pode ser definida por uma variedade de campos, ou uma matriz na qual os componentes de frequência da matriz podem ser resolvidos por uma função de transferência óptica a qual é mais assimétrica do que o tradicional SIM OTF de 3 ângulos.

[0078] Desta forma, a amostra pode ser resolvida ao longo de uma direção ou eixo, isto é, o eixo y, enquanto ao longo de outra direção ou eixo, isto é, o eixo x, o SIM é usado para aumentar a resolução a fim de resolver a amostra. Isto é, ao longo do eixo x, o campo, Px, do fluxo de células assimetricamente padronizado 320 é estreito ou fino, implicando em um aumento na resolução, enquanto ao longo do eixo y, o campo, Py, do fluxo assimetricamente padronizado 320 é maior. De acordo, a resolução é aumentada em apenas uma direção / ao longo de um eixo 318, e apenas três imagens são capturadas a fim de resolver adequadamente uma amostra contida nos nano poços do fluxo de células 320.

Então, tal como ilustrado pelo gráfico 352, apenas uma cópia da banda óptica é criada e necessária para o aumento da resolução.

[0079] A FIG. 4 é um diagrama de fluxo que ilustra exemplos de operações que podem ser realizadas em um sistema de sequenciamento, tal como o sistema de imageamento de iluminação estruturada 200 da FIG. 2, para sequenciar uma amostra usando um fluxo de células quadrado ou assimetricamente padronizado. Na operação 400, uma fonte de luz que corresponde a um primeiro padrão de grade de difração óptica orientado em uma primeira fase pode ser ligado. Na operação 410, o padrão de grade de difração óptica em uma primeira orientação está projetado em uma amostra e uma imagem é capturada. Isto é, se referindo à FIG. 2, o emissor de luz 250 pode produzir um feixe de luz que é colimado por lentes de colimação 251. A luz colimada é estruturada (padronizada) pelo conjunto óptico de estruturação de luz 255 e direcionada pelo espelho dicroico 260 através de lentes objetivas 242 em uma amostra de recipiente de amostra 210, a qual está posicionada em um estágio 270. Nesta implementação, o recipiente de amostra 210 compreende um fluxo de células padronizado apresentando um padrão quadrado ou assimétrico, tal como o fluxo de células 310 ou 320, respectivamente (FIGS. 3B e 3C). No caso de uma amostra fluorescente, a amostra contida no fluxo de células quadrado ou assimetricamente padronizado fluoresce em resposta à luz de excitação estruturada, e a luz resultante é coletada pelas lentes objetivas 242 e direcionada para um sensor de imagem do sistema de câmera

240 para detectar a fluorescência.

[0080] Na operação 420, uma verificação pode ser realizada para determinar se um deslocamento de fase adicional é necessário. Se sim, na operação 430, a grade de difração óptica é deslocada de fase, e a operação retorna à operação 410, em que o padrão de grade de difração óptica (fase deslocada) é projetado na amostra, e uma imagem é capturada. Tal como previamente descrito, três deslocamentos de fase são, em geral, realizados para capturar uma área de imageamento completa, nesta implementação, a área completa do fluxo de células padronizado quadrado.

[0081] Se nenhum deslocamento de fase adicional é necessário, na operação 440, uma verificação pode ser realizada para determinar se um ângulo adicional é necessário, e o ângulo da grade de difração óptica é modificado na operação 450. A operação retorna à operação 410, em que o padrão de grade de difração óptica (após a mudança de ângulos) é projetada na amostra, e uma imagem é capturada. A operação procede para a operação 420, em que, se um deslocamento de fase adicional é necessário em 420, a grade de difração óptica é deslocada de fase na operação

430. Novamente, a operação retorna para a operação 410, em que o padrão de grade de difração óptica (em um novo ângulo e nova fase) é projetado na amostra, e uma imagem é capturada. Novamente, nesta implementação, imagens sobre três fases são necessárias para capturar a área completa do fluxo de células padronizado quadrado. Deve ser entendido que o controlador acima mencionado usado para controlar os aspectos do sistema de operação do sistema de imageamento de iluminação estruturada 200 pode ser configurado com instruções para realizar as funções acima descritas, por exemplo, a verificação se deslocamentos de fase adicionais ou orientações do padrão de grade de difração óptica são necessários ou não para formar uma imagem do tipo particular de fluxo de células que está sendo usado.

[0082] No caso de um fluxo de células padronizado quadrado, por exemplo, o fluxo de células 310 (FIG. 3), imagens em dois ângulos são necessárias para o aumento de resolução ao longo dos dois eixos do fluxo de células 310. De acordo, após a captura das imagens com o padrão de grade de difração óptica projetado em duas orientações que correspondem aos dois ângulos (ao longo de três deslocamentos de fase do padrão de grade de difração óptica), uma imagem em alta resolução é reconstruída na operação 460 (pela combinação de seis imagens totais e a retransformação das mesmas em um espaço real). Esta reconstrução da imagem em alta resolução pode ser realizada no sistema, ou em alguns exemplos, a reconstrução pode ser realizada usando uma entidade de processamento separada.

[0083] Em uma implementação em que o fluxo de células padronizado é um fluxo de células assimétrico, o método acima descrito não precisa envolver a mudança de ângulos. Novamente, com um fluxo de células assimétrico, o SIM é usado para o aumento da resolução ao longo de apenas um eixo. De acordo, a grade de difração óptica necessita apenas ser deslocada de fase três vezes, permitindo que imagens sejam capturadas para os três deslocamentos de fase. De acordo, uma vez que nenhum outro deslocamento de fase é necessário na operação 420, o método procede para a operação 460, em que uma imagem em alta resolução pode ser reconstruída usando apenas as três imagens capturadas.

[0084] Como previamente indicado, ao usar fluxos de células particularmente padronizados que podem se beneficiar de implementações SIM de dimensionalidade reduzida, as técnicas de varredura em linha, tal como varredura em linha TDI, podem ser usadas para formar uma imagem das amostras contidas nestes fluxos de células padronizados. A FIG. 5 é um diagrama em bloco que ilustra um exemplo de dois canais, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 que pode ser usado para formar uma imagem de uma amostra em diversas implementações.

[0085] Como no caso do sistema de imageamento de iluminação estruturada 200 da FIG. 2, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 pode ser usado para o sequenciamento de ácidos nucleicos, em que aqueles em que os ácidos nucleicos estão ligados em localizações fixas em uma matriz (isto é, os poços de um fluxo de células, tal como o fluxo de células 320) e a matriz pode ser imageada repetidamente. Em tais implementações, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 pode obter imagens e dois diferentes canais de cores, os quais podem ser usados para distinguir um tipo de base de nucleotídeo particular a partir de outra. Mais particularmente, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 pode aplicar um processo referido como uma “chamada de base”, a qual, em geral, se refere a um processo para uma determinação de uma chamada de base (por exemplo, adenina (A), citosina (C), guanina (G) ou timina (T)) para uma dada localização de marca de uma imagem no ciclo de imageamento. Durante a chamada de base de dois canais, os dados da imagem extraídos a partir de duas imagens podem ser usados para determinar a presença de uma de quatro tipos de base pela codificação da identidade da base como uma combinação das intensidades das duas imagens. Para uma dada marca ou localização em cada uma das duas imagens, a identidade de base pode ser determinada com base em sem a combinação de identidades de sinal está [ligada, ligada], [ligada, desligada], [desligada, ligada] ou [desligada, desligada].

[0086] Com referência novamente ao sistema de imageamento de varredura em linha 500, o sistema inclui um módulo de geração em linha LGC 510 com duas fontes de luz, 511 e 512, dispostas no mesmo. As fontes de luz 511 e 512 podem ser fontes de luz coerentes tal como diodos de laser os quais produzem feixes de laser. A fonte de luz 511 pode emitir luz em um primeiro comprimento de onda (por exemplo, um comprimento de onda de cor vermelha), e a fonte de luz 512 pode emitir luz em um segundo comprimento de onda (por exemplo, um comprimento de onda de cor verde). Os feixes de luz produzidos a partir das fontes de laser 511 e 512 podem estar direcionados através de uma lente ou lentes modeladoras de feixe 513. Em algumas implementações, uma única lente modeladora de luz pode ser usada para modelar os feixes de luz produzidos a partir de ambas as fontes de luz. Em outras implementações, lentes modeladoras de feixe separadas podem ser usadas para cada feixe de luz. Em alguns exemplos, as lentes modeladoras de feixe são lentes Powell, de modo que os feixes de luz são modelados em padrões de linhas. As lentes modeladoras de feixe de LGC 510 ou outros componentes ópticos do sistema de imageamento podem ser configuradas para modelar a luz emitida por fontes de luz 511 e 512 em padrões de linhas (por exemplo, pelo uso de uma ou mais lentes Powel ou outras lentes modeladoras de feixe, componentes de difração ou espalhamento). Por exemplo, em algumas implementações, a luz emitida pelas fontes de luz 511 e 512 podem ser enviadas através de uma grade de difração óptica para gerar um padrão de grade de difração óptica (padrão SIM) que pode ser projetado em uma amostra.

[0087] O LGC 510 pode ainda incluir espelho 514 e um espelho semi refletor 515 configurado para direcionar os feixes de luz através de uma única porta de interface para um módulo óptico de emissão (EOM) 530. Os feixes de luz podem passar através de um elemento de obturador 516. O EOM 530 pode incluir a objetiva 535 e um estágio z 536 o qual movimenta a objetiva 535 longitudinalmente mais próxima ou mais distante de um alvo 550. Por exemplo, o alvo (por exemplo, um fluxo de células padronizado) 550 pode incluir uma camada de líquido 552 e uma placa de cobertura translúcida 551, e uma amostra biológica pode estar localizada em uma superfície interna da placa de cobertura translúcida bem como uma superfície interna da camada de substrato localizada abaixo da camada de líquido. O estágio z pode, então, movimentar a objetiva de modo a focalizar os feixes de luz sobre cada superfície interna do fluxo de células (por exemplo, focalizado na amostra biológica). A amostra biológica pode ser DNA, RNA, proteínas ou outros materiais biológicos responsivos ao sequenciamento óptico, tal como conhecido na técnica.

[0088] O EOM 530 pode incluir o espelho semi refletor 533 para refletir um feixe de luz emitido a partir de um módulo de rastreamento de foco (FTM) 540 no alvo 550, e, então, para refletir a luz retornada do alvo 550 de volta para o FTM 540. O FTM 540 pode incluir um sensor óptico de rastreamento de foco para detectar características do feixe de luz de rastreamento do foco retornado e gerar um sinal de resposta para otimizar o foco do objetiva 535 no alvo 550.

[0089] O EOM 530 pode também incluir um espelho semi refletor 534 para direcionar a luz através da objetiva 535, enquanto permite que a luz retornada do alvo 550 passe através. Em algumas implementações, o EOM 530 pode incluir uma lente tubular 532. A luz transmitida através das lentes tubulares 532 pode passar através do elemento de filtro 531 e dentro do conjunto de câmera 520. O conjunto de câmera 520 pode incluir um ou mais sensores ópticos 521, por exemplo, sensores de varredura em linha TDI, para detectar a luz emitida a partir da amostra biológica em resposta aos feixes de luz incidentes (por exemplo, a fluorescência em resposta às luzes vermelha e verde recebidas a partir das fontes de luz 511 e 512). Em um exemplo, um LGC (tal como aquele descrito acima) pode projetar luz através de uma grade de difração para gerar um padrão de efeito linear.

[0090] Dados produzidos a partir dos sensores do conjunto de câmera 520 podem ser comunicados para um circuito de análise em tempo real 525. O circuito de análise em tempo real 525, em diversas implementações, executa instruções legíveis por computador para analisar os dados da imagem (por exemplo, pontuação de qualidade de imagem, chamada de base, etc.), reportar ou mostrar as características do feixe (por exemplo, foco, formato, intensidade, potência, brilho, posição) para uma interface gráfica de usuário (GUI), etc. Estas operações podem ser realizadas em tempo real durante os ciclos de imageamento para minimizar o tempo de análise posterior e fornecer resposta em tempo real e a resolução de problemas durante uma corrida de imageamento. Em implementações, o circuito de análise em tempo real 525 pode ser um dispositivo de computação (por exemplo, o dispositivo de computação 1100) que está comunicativamente acoplado ao e controla o sistema de imageamento 500. Em implementações mais adiante descritas, o circuito de análise em tempo real 525 pode adicionalmente executar instruções legíveis por computador para corrigir a distorção nos dados da imagem de saída recebidos de conjunto de câmera 520.

[0091] As FIGS. 6A - 6C representam um exemplo de representação de varredura em linha TDI de um fluxo de células assimetricamente padronizado, em que o SIM é usado para o aumento da resolução ao longo de um eixo do fluxo de células. Em particular, a FIG. 6A ilustra um fluxo de células assimetricamente padronizado 620 (o qual pode ser uma implementação do fluxo de células assimetricamente padronizado 320 (FIG. 3C) no qual um padrão SIM 630 é sobreposto. A varredura em linha TDI pode ser realizada ao longo do eixo y, para capturar imagens coluna por coluna do fluxo de células assimetricamente padronizado 620. As imagens capturadas na FIG. 6A são capturadas com o padrão SIM 630 em uma primeira fase.

[0092] Para fins de exemplo, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 pode utilizar o LGC 510 em coordenação com as ópticas do sistema para varredura em linha da amostra (sobreposta com um padrão SIM, isto é, um padrão de grade de difração óptica) com luz apresentando comprimentos de onda dentro do espectro da cor vermelha e para a varredura em linha da amostra com luz apresentando comprimentos de onda dentro do espectro da luz verde. Em resposta à varredura em linha, corantes fluorescentes situados em diferentes marcas da amostra podem fluorescer e a luz resultante pode ser coletada pelas lentes objetivas 535 e direcionadas para um sensor de imagem do conjunto de câmera 520 para detectar a fluorescência. Por exemplo, a fluorescência de cada marca pode ser detectada por poucos pixels do conjunto de câmera 520. Dados da imagem produzida pelo conjunto de câmera 520 podem, então, ser comunicados ao circuito de análise em tempo real 525 para o processamento, por exemplo, para combinar as imagens para formar uma faixa.

[0093] A FIG. 6B ilustra fluxo de células assimetricamente padronizado 620 sobreposto com padrão SIM

630. No entanto, na FIG. 6B, o padrão SIM 630 teve a fase deslocada ao longo do eixo x (em alinhamento com o eixo que necessita de um aumento de resolução para resolver a amostra). Tal como descrito acima, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 pode usar o LGC 510 em coordenação com as ópticas do sistema para a varredura em linha da amostra (sobreposta com o padrão SIM de fase deslocada 630). As imagens podem ser capturadas e produzidas a partir do conjunto de câmera 520 e novamente comunicadas para o circuito de análise em tempo real 525 para o processamento.

[0094] A FIG. 6C ilustra o fluxo de células assimetricamente padronizado 620 sobreposto com o padrão SIM 630. Na FIG. 6C, o padrão SIM 630 teve a fase deslocada para uma terceira fase ao longo do eixo x (em alinhamento com o eixo que necessita de um aumento de resolução para resolver a amostra). Novamente, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 pode usar o LGC 510 em coordenação com as ópticas do sistema para a varredura em linha da amostra (sobreposta com o padrão SIM de fase deslocada 630). As imagens podem ser capturadas e produzidas a partir do conjunto de câmera 520 e novamente comunicadas para o circuito de análise em tempo real 525 para o processamento. As imagens capturadas de acordo com cada fase / deslocamento de fase pode ser combinada por circuito de análise em tempo real 525 em uma única imagem e novamente transformadas em espaço real para gerar uma imagem apresentando uma resolução mais alta, neste exemplo, ao longo do eixo x.

[0095] Em outra implementação, tal como ilustrado na FIG. 6D, diferentes porções do fluxo de células 620 podem ser sobrepostas com o padrão SIM 630 em suas diferentes fases. Isto é, um padrão SIM em uma primeira fase 630A é sobreposto ao longo de uma porção mais baixa do fluxo de células 620, o mesmo padrão SIM em uma segunda fase 630B é sobreposto ao longo de uma porção média do fluxo de células 620 e, novamente, o mesmo padrão SIM em uma terceira fase 630C é sobreposto ao longo de uma porção mais alta do fluxo de células 620. De acordo, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 faz a varredura em linha do fluxo de células 620 sobreposto com as diferentes fases de um padrão SIM, (630A - 630B), de modo que o sistema de imageamento de varredura em linha 500 possa formar uma imagem do fluxo completo, de acordo com cada requisito da fase do padrão SIM, em uma única corrida. Em algumas implementações, o sistema de imageamento de varredura em linha 500 pode ser modificado para apresentar múltiplos LGCs e múltiplas câmeras ou conjuntos de sensores / câmeras, por exemplo, três, cada um o qual gera e produz luz através de três grades de difração ópticas (a mesma porém orientadas em diferentes fases) para gerar as três fases do padrão SIM. Desta forma, cada câmera ou conjunto de sensor / câmera é capaz de capturar uma imagem do fluxo de células 620 junto com um diferente padrão de fase SIM simultaneamente.

[0096] Como aludido acima, ainda em outras implementações, uma amostra / fluxo de células pode ser movimentada enquanto o padrão SIM permanece estacionário. Ao aplicar a varredura em linha TDI, a amostra / fluxo de células já está em movimento. Assim, este movimento da amostra / fluxo de células pode ser alavancado para evitar ter que deslocar o padrão SIM. Isto é, o movimento da amostra / fluxo de células em relação ao padrão SIM estacionário gera as fases requeridas necessárias para resolver a amostra.

[0097] A FIG. 7 ilustra outro exemplo de fluxo de células padronizado 720, similar ao fluxo de células padronizado de matriz hexagonal 300 (FIG. 3A). Em um sistema de imageamento de iluminação estruturada convencional, o fluxo de células 720 pode ver varrido em linha, por exemplo, na direção do eixo y. A intensidade de um feixe de luz produzido por um LGC, por exemplo, o LGC 510 (FIG. 5) na amostra no fluxo de células 720 é mostrada como sendo ampla e homogênea ao longo do eixo x (não mostrado, porém substancialmente ou exatamente perpendicular à direção da varredura em linha). Ao longo do eixo y, no entanto, a intensidade do feixe de luz é estreita. Como o feixe de laser se movimenta em relação ao fluxo de células 720, a fluorescência das imagens é capturada por uma câmera ou sensor de varredura em linha, por exemplo, um conjunto de câmera 520 (FIG. 5) na área correspondente sendo iluminada pelo feixe de luz.

[0098] No entanto, se beneficiar do fato de que a amostra / fluxo de células 720 já esta se movimentando e, uma vez que apenas um SIM unidimensional é necessário para resolver as amostras em um fluxo de células assimetricamente padronizado, por exemplo, um fluxo de células 320 (FIG. 3C), a grade de difração óptica que produz o padrão SIM pode ser mantida parada. Isto é, as múltiplas (por exemplo, três) fases requeridas necessárias para adequadamente resolver a amostra. De acordo, estágios em movimento ou outros elementos necessários para o movimento, por exemplo, uma grade de difração óptica de rotação ou translação, em um sistema de imageamento de varredura em linha convencional não são necessárias nesta implementação.

[0099] A FIG. 8 ilustra um exemplo de sistema de imageamento de varredura em linha 800 que utiliza uma grade de difração óptica estacionária. Deve ser notado que, por questão de facilidade de explicação, a FIG. 8 é uma ilustração simplificada na qual nem todas as características / elementos são mostrados. No entanto, o sistema de varredura em linha 800 pode ser uma implementação do sistema de imageamento de varredura em linha 500 que utiliza uma grade de difração óptica estacionária para manter o padrão de grade de difração óptica / padrão SIM resultante parado.

[00100] No exemplo da FIG. 8, um emissor de luz, por exemplo, o laser 802, está configurado para produzir um feixe de luz que é colimado por lentes de colimação 804. Em uma implementação, o laser 802 emite luz no comprimento de onda verde. A luz colimada está direcionada por filtro dicroico 806 através de uma grade de difração óptica estacionária 812 para as lentes objetivas 830 por meio de outro filtro dicroico 828 em uma amostra de um recipiente de amostra 832. Nesta implementação, o recipiente de amostra 830 é um fluxo de células assimetricamente padronizado, tal como fluxo de células 320 (FIG. 3C).

[00101] Um segundo emissor de luz, por exemplo, o laser 808, emite luz (no comprimento de onda vermelho, por exemplo) através da grade de difração óptica estacionária 812 para as lentes objetivas 830, também por meio de filtro dicroico 828, e na amostra de recipiente de amostra 832. O recipiente de amostra 832 está posicionado em um estágio 840 que pode movimentar o recipiente de amostra 832 em relação aos feixes de luz a partir dos lasers 802 e 808. No caso de uma amostra fluorescente, a amostra fluoresce em resposta à luz de excitação estruturada (feixes de laser a partir de lasers 802 e 808), e a luz resultante é coletada por lentes objetivas 828 e direcionada a um sensor de imagem de câmeras 814 e 820.

[00102] O filtro dicroico 806 é usado para passar o feixe de luz verde a partir do laser 802 através da grade de difração óptica estacionária 812, enquanto reflete o feixe de luz vermelho a partir do laser 808 em direção a grade de difração óptica estacionária 812. O filtro dicroico 828 funciona de forma similar uma vez que permite que os feixes de luz verde e vermelho a partir dos lasers 802 e 808 sejam refletidos para as lentes objetivas 830, enquanto permitem que a câmera 814 e 820 capturem, respectivamente, imagens fluorescidas com as luzes verde e vermelha. O filtro dicroico 816 direciona as emissões de luz verde a partir da amostra fluorescida para a câmera 814, enquanto o filtro dicroico 822 direciona a emissão de luz vermelha a partir da amostra fluorescida para a câmera

820. As lentes 818 e 824 são lentes de colimação para as câmeras 814 e 820, respectivamente. O espelho dicroico 826 direciona a emissão das luzes verde e vermelha a partir da amostra fluorescida para as câmeras adequadas.

[00103] No sistema de varredura em linha 800, a grade de difração óptica 812 é estacionária. Isto é, como previamente discutido, pelo uso dos fluxos de células assimetricamente padronizados em conjunto com SIM, apenas uma dimensão da iluminação estruturada é necessária e múltiplas fases podem ser alcançadas pelo movimento do feixe ao longo do fluxo de células. Em outras palavras, o movimento do feixe de laser em relação à amostra / fluxo de células ou o movimento da amostra / fluxo de células em relação ao feixe de laser, resultando no movimento relativo entre a amostra e os padrões de excitação de efeito, é tudo o que é necessário para gerar as diferentes fases.

[00104] A FIG. 9 ilustra um fluxo de células padronizado 920 que pode ser varrido em linha com um sistema de imageamento de varredura em linha, tal como o sistema de varredura em linha 800. Um padrão de grade de difração óptica pode ser projetado no fluxo de células 920, enquanto o fluxo de células 920 se movimenta de acordo com as técnicas de imageamento de varredura em linha. O movimento do fluxo de células 920 em relação ao padrão de grade de difração óptica estacionário cria os deslocamentos de fase necessários e as imagens capturadas durante a varredura em linha, uma vez combinadas e novamente transformadas no espaço real de aumento da resolução, como previamente discutido.

[00105] Em particular, o feixe de luz se movimenta na direção do eixo y. Novamente, a intensidade do feixe de luz é homogênea ao longo do eixo x (não mostrado), porém a intensidade ao longo do eixo y é modulada devido à passagem através de uma grade de difração óptica estacionária, por exemplo, a grade de difração óptica estacionária 812 (FIG. 8). Como o feixe de luz se movimenta em relação ao fluxo de células 920, o padrão de grade de difração óptica se desloca. Na verdade, mais do que três, ou até mesmo dezenas de deslocamentos de fase podem ser gerados. Como um resultado, pela movimentação da amostra / fluxo de células 920, em vez da grade de difração óptica, um aumento na resolução ao longo do eixo da varredura em linha pode ser alcançado. Em algumas implementações, tal como descrito acima, a resolução nesta direção pode ser aumentada em pelo menos duas vezes nas superfícies tanto com padrões de características aleatórias ou periódicas. Deve ser entendido que, devido ao fato de a resolução poder ser aumentada, por exemplo, em pelo menos duas vezes, a densidade dos nano poços no fluxo de células 920 pode ser aumentada por um fator de dois ou mais.

[00106] A FIG. 10 é um diagrama de fluxo que ilustra exemplos de operações que podem ser realizadas em um sistema de imageamento de varredura em linha, tal como o sistema de imageamento de varredura em linha 500 (FIG. 5) ou o sistema de imageamento de varredura em linha 800 (FIG. 8), para sequenciar uma amostra usando um fluxo de células assimetricamente padronizado. Na operação 1000, os feixes de luz a partir das fontes de laser, por exemplo, fontes de laser 802 e 808, são produzidos através de uma grade de difração óptica estacionária, por exemplo, uma grade de difração óptica estacionária 812 que corresponde a uma primeira orientação de padrão de grade de difração óptica, que pode estar ligada. Na operação 1010, o padrão de grade de difração óptica é projetado em uma amostra, e na operação 1020, a amostra é varrida em linha. A varredura em linha pode ser realizada tal como previamente descrita em relação ao sistema de imageamento de varredura em linha 800 (FIG. 8). Na operação 1030, a amostra é movimentada de acordo com as técnicas de varredura em linha acima mencionadas ou a luz direcionada pode ser movimentada como também descrito acima para alcançar movimento relativo entre a amostra e o padrão de grade de difração óptica.

[00107] As operações 1020 e 1030 podem ser repetidas quantas vezes forem necessários para capturar as imagens representativas da amostra inteira. Novamente, como um resultado da amostra sendo movimentada em relação ao padrão de grade de difração óptica estacionário, as imagens da amostra e o padrão de grade de difração óptica podem ser capturadas através dos deslocamentos de fase requeridos necessários para o aumento da resolução. Na operação 1040, uma imagem em alta resolução pode ser reconstruída.

[00108] Deve ser notado que, a fim de evitar o borrão de movimento entre o padrão de grade de difração óptica e a amostra durante a varredura em linha, as fontes de laser podem operar de forma pulsada. Isto é, as fontes de laser, por exemplo, fontes de laser 802 e 808 podem ser pulsadas de modo que, a cada excitação, uma imagem de varredura em linha pode ser capturada. Em algumas implementações, a orientação do padrão de grade de difração óptica em relação à amostra / fluxo de células pode ser deslocada por 90°. Em outras implementações, tal como ilustrado na FIGS 6A - 6C, se a orientação do padrão de grade de difração óptica é tal que a amostra não está se movimentando através de áreas de luz e escuro (como pode ser o caso se a orientação do padrão de grade de difração óptica foi deslocado em 90°), a pulsação das fontes de laser pode não ser necessária porque o movimento da amostra em relação ao padrão de grade de difração óptica se movimenta através da mesma intensidade de efeito.

[00109] Deve ser notado que, embora as implementações aqui descritas tenham sido primariamente descritas no contexto do uso das grades de difração para criar padrões de efeito que são projetados em uma amostra imageada, em implementações, os padrões de efeito projetados não precisam necessariamente ser criados por grades de difração. Qualquer método de criação de um padrão de efeito sinusoidal pode ser adequado. A criação de um padrão de efeito pode ser alcançada por meio da interferência entre duas contra propagação de feixes, mutuamente coerentes no ponto do padrão de interferência desejado; por meio do imageamento coerente ou incoerente de uma grade de difração; por meio de feixes separados por meio de um divisor de feixe e interferido; a contra propagação de feixes em um tubo de luz ou guia de onda, etc.

[00110] A FIG. 11 ilustra um exemplo do componente de computação que pode ser usado para aplicar diversas características do sistema e métodos aqui descritos, tal como as características acima mencionadas e funcionalidade de um ou mais aspectos dos métodos ilustrados na FIGS. 4 e 10 aplicados nos sistemas 200, 500 e / ou 800 e aqui descritos. Por exemplo, o componente de computação pode ser aplicado como um circuito de análise em tempo real 525.

[00111] Como aqui utilizado, o termo circuito pode descrever uma determinada unidade de funcionalidade que pode ser executada de acordo com uma ou mais implementações do presente pedido. Como aqui utilizado, um circuito pode ser aplicado utilizando qualquer forma de hardware ou uma combinação de hardware e software. Por exemplo, um ou mais processadores, controladores, ASICs, PLAs, PALs, CPLDs, FPGAs, componentes lógicos, rotinas de software ou outros mecanismos podem ser aplicados para formar um circuito. Em implementações, os diversos circuitos aqui descritos podem ser aplicados como circuitos discretos ou as funções e características descritas podem ser compartilhadas em parte ou no total dentre um ou mais circuitos. Em outras palavras, um técnico no assunto, após a leitura desta descrição, pode apreciar que diversas características e funcionalidades aqui descritas podem ser aplicadas em qualquer implementação dada e podem ser aplicadas em uma ou mais circuitos separados ou compartilhados em diversas combinações e permutações. Mesmo que diversas características ou elementos de funcionalidade possam ser descritos individualmente ou reivindicados como módulos separados, um técnico no assunto entenderá que essas características e funcionalidades podem ser compartilhadas entre um ou mais elementos de software e hardware comuns, e tal descrição não exigirá ou implicará que componentes separados de hardware ou software sejam usados para aplicar tais características ou funcionalidade.

[00112] Quando os componentes ou circuitos do pedido são aplicados em sua totalidade ou parcialmente utilizando software, em uma implementação, estes elementos de software podem ser aplicados para operar com um módulo de computação ou de processamento capaz de executar a funcionalidade descrita a seu respeito. Um exemplo do referido componente de computação é mostrado na FIG. 13. Diversas implementações são descritas nos termos dos exemplos de componentes de computação 1000. Após a leitura desta descrição, será evidente para um técnico no assunto como aplicar este pedido usando outros módulos ou arquiteturas de computação.

[00113] Com referência agora à FIG. 13, o componente de computação 1000 pode representar, por exemplo, recursos de computação ou processamento encontrados em computadores desktop, laptop, notebook e tablet; dispositivos de computação portáteis (tablets, PDA’s, smart phones, telefones celulares, palmtops, etc.); mainframes, supercomputadores, estações de trabalho ou servidores; ou qualquer outro tipo de dispositivos de computação de uso especial ou de uso geral como pode ser desejável ou apropriado para uma determinada implementação ou ambiente. O componente de computação 1000 pode também representar capacidades de computação incorporadas ou disponíveis para um determinado dispositivo. Por exemplo, um componente de computação pode ser encontrado em outros dispositivos eletrônicos tais como, por exemplo, câmeras digitais,

sistemas de navegação, telefones celulares, dispositivos de computação portáteis, modems, roteadores, WAPs, terminais e outros dispositivos eletrônicos que podem incluir algumas formas de capacidade de processamento.

[00114] O componente de computação 1000 pode incluir, por exemplo, um ou mais processadores, controladores, módulos de controle ou outros dispositivos de processamento, tal como um processador 1004. O processador 1004 pode ser aplicado usando um motor de processamento de uso geral ou de uso especial tal como, por exemplo, um microprocessador, controlador, ou outra lógica de controle. No exemplo ilustrado, o processador 1004 está conectado a um bus 1002, embora qualquer meio de comunicação possa ser utilizado para facilitar a interação com outros componentes do componente de computação 1000 ou para comunicar externamente.

[00115] O componente de computação 1000 pode também incluir um ou mais módulos de memória, aqui referido simplesmente como memória principal 1008. Por exemplo, de preferência, uma memória de acesso aleatório (RAM) ou outra memória dinâmica, podem ser usadas para armazenar informações e instruções a serem executadas pelo processador 1004. A memória principal 1008 também pode ser usada para o armazenamento de variáveis temporárias ou outras informações intermediárias durante a execução de instruções a serem executadas pelo processador 1004. O componente de computação 1000 pode, da mesma forma, incluir uma memória somente de leitura (“ROM”) ou outro dispositivo de armazenamento estático acoplado ao bus 1002 para armazenamento de informação estática e instruções para o processador 1004.

[00116] O componente de computação 1000 pode também incluir uma ou mais diversas formas de mecanismo de armazenamento de informações 1010, as quais podem incluir, por exemplo, uma unidade de meio de comunicação 1012 e uma interface de unidade de armazenamento 1020. A unidade de meio de comunicação 1012 pode incluir uma unidade ou outro mecanismo para dar suporte ao meio de comunicação de armazenamento fixo ou removível 1014. Por exemplo, uma unidade de disco rígido, uma unidade de estado sólido, uma unidade de fita magnética, uma unidade de disco óptico, uma unidade de CD ou DVD (R ou RW), ou outras unidades de meio de comunicação removíveis ou fixas podem ser fornecidas. De acordo, o meio de comunicação de armazenamento 1014 pode incluir, por exemplo, um disco rígido, uma unidade de estado sólido, fita magnética, cartucho, disco óptico, um CD, DVD ou Blu-ray, ou outro meio fixo ou removível que seja lido, escrito ou acessado pela unidade de meio de comunicação 1012. Como estes exemplos ilustram, o meio de comunicação de armazenamento 1014 pode incluir um meio de armazenamento utilizável por computador apresentando software ou dados informáticos nele armazenados.

[00117] Em exemplos alternativos, o mecanismo de armazenamento de informações 1010 pode incluir outras instrumentações similares para permitir que os programas de computador ou outras instruções ou dados sejam carregados no componente de computação 1000. Tais instrumentações devem incluir, por exemplo, uma unidade de armazenamento fixa ou removível 1022 e uma interface 1020. Exemplos de tais unidades de armazenamento 1022 e interfaces 1020 podem incluir um cartucho de programa e interface de cartucho, uma memória removível (por exemplo, uma memória flash ou outra módulo de memória removível) e um slot de memória, um slot e placa PCMCIA, e outras unidades de armazenamento fixas ou removíveis 1022 e interfaces 1020 que permitem que o software e dados sejam transferidos a partir da unidade de armazenamento 1022 para o componente de computação 1000.

[00118] O componente de computação 1000 pode também incluir uma interface de comunicação 1024. A interface de comunicação 1024 pode ser utilizada para permitir a transferência de software e dados entre o componente de computação 1000 e os dispositivos externos. Exemplos de interfaces de comunicação 1024 pode incluir um modem ou softmodem, uma interface de rede (tal como um Ethernet, placa de interface de rede, Wimedia, IEEE 802.XX ou outra interface), uma porta de comunicação (tal como por exemplo, uma porta USB, porta IR, porta RS232 de interface de Bluetooth®, ou outra porta), ou outra interface de comunicação. O software e os dados transferidos através da interface de comunicação 1024 podem normalmente ser carregados em sinais, que podem ser eletrônicos, eletromagnéticos (que incluem sinais ópticos) ou outros sinais capazes de serem trocados por uma determinada interface de comunicação 1024. Estes sinais podem ser fornecidos para a interface de comunicações 1024 por meio de um canal 1028. Este canal 1028 pode carregar sinais e deve ser aplicado usando um meio de comunicação com ou sem fios. Alguns exemplos de um canal podem incluir uma linha telefônica, um link celular, um link de RF, um link óptico, uma interface de rede, uma rede local ou de área ampla, e outros canais de comunicação com ou sem fios.

[00119] Neste documento, os termos “meio legível por computador”, “meio utilizável por computador” e “meio de programa de computador” são usados para, em geral, se referir a um meio de comunicação não transitório, volátil ou não volátil, tal como, por exemplo, memória 1008, unidade de armazenamento 1022, e meio de comunicação 1014. Estas e outras diversas formas de meio de comunicação de programa de computador ou meio de comunicação utilizável por computador podem estar envolvidas ao levar uma ou mais sequências de uma ou mais instruções a um dispositivo de processamento para execução. Tais instruções inseridas no meio, são, em geral, referidas como “código de programa de computador” ou um “produto de programa de computador” (o qual pode estar agrupado na forma de programas de computador ou outros agrupamentos). Quando executado, tais instruções podem permitir que o módulo de computação 1000 realize características ou funções do presente pedido como aqui discutido.

[00120] Embora descritos acima no que diz respeito a diversos exemplos e implementações, deve ser entendido que as diversas características, aspectos e funcionalidades descritas em uma ou mais das implementações individuais não estão limitados em sua aplicabilidade à implementação particular com a qual eles estão descritos, porém, em vez disso, podem ser aplicadas, isolada ou em diversas combinações, a uma ou mais das outras implementações do pedido, sendo tais implementações descritas ou não e sendo tais características apresentadas ou não como sendo parte de uma implementação descrita. Assim, a amplitude e o escopo do presente pedido não devem estar limitados por qualquer um dos exemplos de implementação descritos acima.

[00121] Deve ser apreciado que todas as combinações dos conceitos acima (desde que tais conceitos não sejam mutualmente inconsistentes) estão contempladas como sendo parte da matéria objeto inventiva aqui descrita. Em particular, todas as combinações da matéria objeto reivindicada que aparecem no final desta divulgação estão contempladas como sendo parte da matéria objeto inventiva aqui descrita.

[00122] Os termos “substancialmente” e “cerca de” usados ao longo desta divulgação, incluindo as reivindicações, são usados para descrever e contabilizar pequenas flutuações, tais como devidas às variações no processamento. Por exemplo, eles podem se referir a menos ou igual a ± 5 %, tal como menos ou igual a ± 2 %, tal como menos ou igual a ± 1 %, tal como menos ou igual a ± 0.5 %, tal como menos ou igual a ± 0.2 %, tal como menos ou igual a ± 0.1 %, tal como menos ou igual a ± 0.05 %.

[00123] Na medida do aplicável, os termos “primeiro”, “segundo”, “terceiro”, etc. são aqui empregados meramente para mostrar os respectivos objetos descritos por estes termos como entidades separadas e não se destinam a conotar um sentido de ordem cronológica, salvo explicitamente aqui indicado em contrário.

[00124] Termos e frases usadas neste documento, e variações dos mesmos, salvo expressamente indicado em contrário, deve ser interpretado como mais abertas ao contrário de limitativas. Como exemplos do acima: o termo “incluindo” deve ser interpretado como significando “incluindo, sem limitação” ou similares; o termo “exemplo” é usado para fornecer exemplo de casos do item em discussão, e não uma lista exaustiva ou limitativa do mesmo; os termos “um” ou “uma” devem ser interpretados como significando “pelo menos um”, “um ou mais” ou similares; e adjetivos tal como “convencional”, “tradicional”, “normal”, “padrão”, “conhecido” e termos de significado similar não devem ser interpretados como limitativos do item descrito a um determinado período de tempo ou a um item disponível a partir de um determinado tempo, porém, devem ser lidos para englobar tecnologias convencionais, tradicionais, normais ou padrão que possam estar disponíveis ou ser conhecidas agora ou em qualquer momento no futuro. Da mesma forma, quando este documento se refere a tecnologias que podem ser aparentes ou conhecidas por um técnico no assunto, tais tecnologias abrangem aquelas aparentes ou conhecidas pelo técnico no assunto agora ou em qualquer momento no futuro.

[00125] A presença de palavras e frases de ampliação tais como “uma ou mais”, “pelo menos”, “porém não limitado” ou outras frases similares, em alguns casos, não deve ser interpretada para significar que o caso mais restrito é pretendido ou necessário nos casos em que tais frases de ampliação podem estar ausentes.

[00126] Adicionalmente, as diversas implementações aqui indicadas estão descritas em termos dos exemplos dos diagramas de bloco, diagramas de fluxo e outras ilustrações. Como se tornará evidente para um técnico no assunto após a leitura deste documento, as implementações ilustradas e suas diversas alternativas podem ser aplicadas sem estarem confinadas aos exemplos ilustrados. Por exemplo, os diagramas de blocos e a descrição que os acompanha não devem ser interpretados como impondo uma arquitetura ou configuração particular.

[00127] Enquanto diversas implementações da presente divulgação foram descritas acima, deve ser entendido que elas foram apresentadas apenas para fins de exemplo, e não de limitação. Da mesma forma, os diversos diagramas podem demonstrar um exemplo de arquitetura ou outra configuração para a divulgação, a qual é feita para ajudar no entendimento das características e funcionalidade que podem estar incluídas na divulgação. A divulgação não está restrita aos exemplos de arquiteturas ou configurações ilustradas, porém, as características desejadas podem ser aplicadas utilizando uma variedade de arquiteturas e configurações alternativas. Na verdade, será evidente para um técnico no assunto como as configurações funcionais, lógicas ou físicas de particionamento alternativas podem ser aplicadas para aplicar as características desejadas da presente divulgação. Além disso, uma multiplicidade de diferentes nomes de componentes de constituintes além daqueles aqui demonstrados pode ser aplicada às diversas partições. Adicionalmente, com relação aos diagramas de fluxo, as descrições operacionais e as reivindicações de método, a ordem na qual as etapas estão aqui apresentadas não deve impor que diversas implementações sejam aplicadas para realizar a funcionalidade recitada na mesma ordem, a menos que o contexto dite o contrário.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de geração de imagens de uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender: projetar um padrão óptico em uma amostra biológica e capturar uma primeira imagem do padrão óptico sobreposto na amostra biológica; deslocar a fase do padrão óptico projetado em relação à amostra biológica e capturar pelo menos uma segunda imagem do padrão óptico com fase deslocada sobreposto na amostra biológica; e reconstruir uma imagem com alta resolução representativa da amostra biológica com base na primeira imagem capturada e a pelo menos segunda imagem capturada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a amostra biológica estar contida em uma célula de fluxo com padrão assimétrico compreendendo uma pluralidade de nano poços alongados.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de cada uma da pluralidade de nano poços alongados ser de formato elíptico ou de formato retangular.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de cada uma da pluralidade de nano poços alongados estar orientada de modo que, ao longo de um primeiro eixo da célula de fluxo com padrão assimétrico, a resolução é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de cada uma da pluralidade de nano poços alongados estar orientada de modo que, ao longo de um segundo eixo da célula de fluxo com padrão assimétrico, a resolução não é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a captura da primeira e da, pelo menos, segunda imagem compreender a realização da geração de imagens de varredura em linha.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ainda compreender: direcionar luz através da grade de difração óptica em uma primeira fase e orientação angular, em que o padrão óptico projetado na amostra biológica é um padrão de grade de difração óptica gerado pela luz que é direcionada através da grade de difração óptica, em que o deslocamento da fase do padrão óptico projetado em relação à amostra biológica compreende deslocar a fase da grade de difração óptica.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de deslocar a fase da grade de difração óptica compreender deslocar a fase da grade de difração óptica ao longo da primeira orientação angular.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de deslocar a fase da grade de difração óptica ocorrer de forma perpendicular à direção da geração de imagens de varredura em linha.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender: direcionar a luz através de uma grade de difração óptica em uma primeira fase e orientação angular, em que o padrão óptico projetado na amostra biológica é um padrão de grade de difração óptica gerado pela luz que é direcionada através da grade de difração óptica, em que deslocar a fase do padrão óptico projetado em relação à amostra biológica compreende deslocar a fase da grade de difração óptica; e realizar um terceiro deslocamento de fase da grade de difração óptica, projetando o padrão de grade de difração óptica na amostra biológica e capturando pelo menos uma terceira imagem do padrão de grade de difração óptica da fase deslocada sobreposto na amostra biológica antes da reconstrução da imagem com alta resolução.

11. Método de geração de imagens de uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender: direcionar luz através de uma grade de difração óptica em uma primeira fase e orientação angular; projetar um padrão de grade de difração óptica gerado pela luz que é direcionada através da grade de difração óptica na amostra biológica e capturar uma primeira imagem do padrão de grade de difração óptica sobreposto na amostra biológica; deslocar a fase da grade de difração óptica, projetando o padrão de grade de difração óptica na amostra biológica e capturando pelo menos uma segunda imagem do padrão de grade de difração óptica da fase deslocada sobreposto na amostra biológica; reorientar a grade de difração óptica para uma segunda orientação angular, projetando o padrão de grade de difração óptica na amostra biológica, e capturando uma terceira imagem do padrão de grade de difração óptica sobreposto na amostra biológica; deslocar a fase da grade de difração óptica, projetando o padrão de grade de difração óptica na amostra biológica e capturando pelo menos uma quarta imagem do padrão de grade de difração óptica da fase deslocada sobreposto na amostra biológica; e reconstruir uma imagem com alta resolução representativa da amostra biológica com base na primeira, a pelo menos segunda, a terceira e pelo menos a quarta imagens capturadas.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a amostra biológica estar contida em uma célula de fluxo com padrão de matriz quadrada compreendendo uma pluralidade de nano poços.

13. Sistema caracterizado pelo fato de compreender: uma fonte de laser que emite um feixe de luz; uma grade de difração óptica adaptada para gerar um padrão de grade de difração óptica com a passagem do feixe de luz emitido através da grade de difração óptica; e um conjunto de câmera adaptado para capturar uma pluralidade de imagens de padrão de grade de difração óptica sobreposto na amostra biológica, a pluralidade de imagens refletindo três fases da grade de difração óptica em relação à amostra biológica; e um processador adaptado à reconstrução de uma imagem com alta resolução representativa da amostra biológica com base em uma combinação da pluralidade de imagens.

14. Sistema, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de a amostra biológica estar localizada em um fluxo de célula compreendendo uma pluralidade de nano poços orientados em uma matriz assimétrica.

15. Sistema, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de cada uma da pluralidade de nano poços serem de formato elíptico ou de formato retangular.

16. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de cada uma da pluralidade de nano poços estar orientada de modo que, ao longo de um primeiro eixo do fluxo de célula, a resolução é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica.

17. Sistema, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de cada uma da pluralidade de nano poços estar orientada de modo que, ao longo de um segundo eixo do fluxo de célula, a resolução não ser aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica.

18. Sistema, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de o conjunto de câmera compreender um conjunto de câmera com varredura em linha de integração com atraso de tempo.

19. Sistema, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de a amostra biológica estar contida em um fluxo de célula, diferentes porções do qual sendo sobrepostos com representações das três fases da grade de difração óptica simultaneamente.

20. Sistema, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de a grade de difração óptica compreender três elementos escalonados de fase, em que cada um dos três elementos escalonados de fase está adaptado para gerar um padrão de grade de difração óptica com a passagem do feixe de luz emitido através do elemento escalonado de fase, em que o conjunto de câmera está adaptado para capturar uma imagem de um padrão de grade de difração óptica gerado por cada um dos três elementos escalonados de fase sobreposto na amostra biológica.

21. Sistema, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de o conjunto de câmera compreender três sensores de imagens, cada um dos três sensores de imagens adaptado para capturar a imagem do padrão de grade de difração óptica gerado por um dos respectivos elementos escalonados de fase.

22. Sistema caracterizado pelo fato de compreender: uma fonte de laser que emite um feixe de luz; uma grade de difração óptica adaptada para gerar um padrão de grade de difração óptica com a passagem do feixe de luz emitido através da grade de difração óptica; e um conjunto de câmera adaptado para capturar uma pluralidade de imagens do padrão de grade de difração óptica sobreposto na amostra biológica, a pluralidade de imagens refletindo três fases da grade de difração óptica em relação à amostra biológica e duas orientações angulares da grade de difração óptica em relação à amostra biológica; e um processador adaptado para reconstruir uma imagem com alta resolução representativa da amostra biológica com base em uma combinação da pluralidade de imagens.

23. Sistema, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de a amostra biológica estar localizada em um fluxo de célula compreendendo uma pluralidade de nano poços orientada em uma matriz quadrada.

24. Sistema, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de cada uma da pluralidade de nano poços estarem orientados de modo que, ao longo do primeiro e segundo eixos do fluxo de célula, a resolução é aumentada para resolver informações representativas da amostra biológica.