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BR112014014730B1 - estrutura de droga polímero terapêutica, métodos para preparar uma estrutura de oligo rna de dupla hélice, nanoparticula e composição farmacêutica - Google Patents

estrutura de droga polímero terapêutica, métodos para preparar uma estrutura de oligo rna de dupla hélice, nanoparticula e composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

ESTRUTURA DE DROGA POLÍMERO TERAPÊUTICA, NANOPARTICULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, CONJUGADO DE OLIGONUCLEOTÍDEO E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DOS MESMOS. Provendo estrutura de RNA fita dupla em que um composto polímero covalentemente ligado a um oligo RNA de dupla hélice para tratamento de doenças, particularmente câncer, melhorando a liberação do oligo RNA dupla hélice; um ligante específico ao alvo e respectivo método de, técnica de liberação de oligo RNA dupla hélice em modo específico ao alvo. Nanopartícula composta de estruturas de oligo RNA ligadas ao ligante dupla hélice efetivamente liberando o oligo RNA dupla hélice a um alvo provendo a atividade do oligo RNA dupla hélice mesmo quando o oligo RNA dupla hélice é administrado em baixa concentrações. Ainda, prevene a liberação não específica do oligo RNA dupla hélice em outros órgãos e células. Além disso, refere-se à um conjugado híbrido, que compreende materiais hidrofílico e hidrofóbicos ligados covalentemente às extremidades de um oligonucleotídeo antissenso (ASO), melhorando a estabilidade in vivo do ASO; método para preparar conjugado híbrido e nanopartícula composta pelos conjugados.

Description

Campo de Aplicação
[001] A presente invenção refere-se à uma nova estrutura de oligonucleotídeo tendo ligado a este, materiais hidrofílicos e hidrofóbicos que melhoram a liberação de oligonucleotídeos de fita simples ou fita dupla úteis para o tratamento de câncer e doenças infecciosas, e para o uso dos mesmos.
[002] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se à uma estrutura de oligo RNA de hélice dupla compreendendo um ligante específico para o alvo ligado a um material hidrofílico contido na estrutura, uma nanopartícula composta de estruturas oligo RNA ligadas ao ligante de hélice dupla, uma composição farmacêutica compreendendo a estrutura de RNA, uma composição farmacêutica compreendendo uma nanopartícula composta de estruturas de oligo RNA ligadas ao ligante de dupla hélice, um método para preparar a estrutura, um método para preparar uma nanopartícula composta de estruturas de RNA, e uma técnica para liberação da estrutura de oligo RNA ligada ao ligante de dupla hélice.
[003] Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo antissenso (doravante referenciado como “ASO”) conjugado que compreende um material hidrofílico e hidrofóbico ligado a ambas as extremidades do ASO por uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante a fim de melhorar a eficiência de liberação intracelular de ASO, um método para preparar o conjugado, e uma técnica para liberação de uma nanopartícula composto de conjugados ASO.
Estado da Técnica
[004] Uma vez que o papel de interferência de RNA (doravante referenciado como ‘RNAi’) foi encontrado, foi demonstrado que RNAi atua em um mRNA específico de sequência em uma variedade de células mamíferas (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764-773). Quando um RNA de fita dupla longo é liberado nas células, o RNA liberado é processado pelo endonuclease dicer em RNA de interferência pequeno de 21-23 pares de base (bp) (doravante referenciado como ‘siRNA’). siRNA se liga a RISC (complexo de silenciamento induzido por RNA) e inibe a expressão do gene alvo em um modo específico de sequência pelo processo em que a fita antissenso reconhece e degrada o mRNA alvo (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).
[005] Bertrand et al. relataram que siRNA tem um excelente efeito inibitório na expressão do mRNA in vitro e in vivo comparado a um oligonucleotídeo antissenso (ASO) para o mesmo gene alvo e que o efeito é de longa duração (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun.2002. 296: 1000-1004). Ainda, devido ao fato de que siRNA complementarmente se liga a mRNA alvo para regular a expressão do gene alvo em um modo específico de sequência, este pode ser vantajosamente usado em uma ampla gama de aplicações comparadas às drogas ou produtos químicos baseados em anticorpo convencionais (drogas moléculas pequenas drugs) (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. Molecular Therapy. 2006 13(4):664-670).
[006] siRNA tem excelentes efeitos e pode ser usado em uma ampla gama de aplicações, mas para que o siRNA seja liberado nos agentes terapêuticos celulares, é requerido que melhora a estabilidade e eficiência de liberação intracelular de siRNA de modo a efetivamente liberar siRNA em suas células alvo (Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov. Today. 2006 Jan; 11(1- 2):67-73).
[007] Em uma tentativa de satisfazer estes requisitos, análogos resistentes a nuclease ou carreadores como vetores virais, lipossomas ou nanopartículas foram usados.
[008] Carreadores virais como adenovírus ou retrovírus têm alga eficácia de transfecção, mas contêm os riscos de imunogenicidade e oncogenicidade. No entanto, carreadores não virais incluindo nanopartículas são avaliados por terem baixa eficiência de liberação intracelular em comparação com carreadores virais, mas têm vantagens, incluindo alta segurança in vivo, liberação específica para alvo, absorção eficiente e internalização de oligonucleotídeos RNAi nas células ou tecidos, e baixa citotoxicidade e estimulação imune. Assim, estes carreadores não virais são considerados sendo o método de liberação mais promissor que efetivamente faz inibir a expressão do gene alvo (Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J. Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632).
[009] Sist emas de liberação com várias nanopartículas foram desenvolvidos para liberação específica para câncer. Ditos sistemas de nanopartículas são geralmente projetados de modo que a superfície seja revestida com um material hidrofílico para aumentar o tempo de circulação no sangue e é positivamente carregado para aumentar endocitose (Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2008) 1615-1626). Entretanto, tecido tumoral é muito rígido e tem limitação de difusão, diferente do tecido normal, e supera a limitação de difusão ao formar novos vasos sanguíneos na região circundante por angiogênese, porque esta limitação de difusão tem efeitos adversos na migração de nutrientes requerida para tumor, e materiais residuais como oxigênio e dióxido de carbono. Os vasos sanguíneos formados em um tecido tumoral por angiogênese têm um vaso sanguíneo vazante e defeituoso incluindo uma lacuna tendo um tamanho de cerca de 100 nm a 2 m dependendo do tipo de tumor.
[010] Assim, nanopartículas facilmente passam através do endotélio capilar de tecido cancerígeno tendo um vaso sanguíneo vazante e defeituoso, em comparação aos vasos capilares estruturados de tecido normal, de modo que são facilmente liberados durante suas circulações no sangue. Além disso, o tecido de tumor não tem drenagem linfática, e assim, uma droga é acumulada neste. Este mecanismo é conhecido como o efeito aumentado de permeação e retenção (EPR). Nanopartículas são facilmente liberadas especificamente em tecido tumoral por este efeito, e este mecanismo é conhecido como direcionamento passivo (Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol Oncol. 2008 Jan-Feb; 26(1):57-64).
[011] Para superar esta distribuição não específica in vivo, direcionamento e ausência de solubilidade em água de drogas terapêuticas incluindo drogas anticâncer, estudos foram conduzidos para otimizar o tamanho de nanopartículas carregadas com drogas terapêuticas ou modificar a superfície para aumentar o tempo de suas circulações no sangue. Particularmente, com relação às nanopartículas poliméricas compreendendo os conjugados de polímero-droga, foram conduzidos estudos para aumentar a liberação específica de tumor de drogas anticâncer pela ligação de drogas anticâncer aos materiais solúveis em água biodegradáveis como albumina, poli-L-glutamato (PGA) ou um copolímero N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida (Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer. Clin Cancer Res 2008; 14: 1310-1316). Além disso, estudos foram conduzidos para ligar um material anfifílico a uma droga anticâncer de modo a formar micelas poliméricas que consistem em um núcleo hidrofóbico de droga anticâncer e uma concha hidrofílica (Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. J Control Release 2001; 74: 295-302).
[012] Assim, quando um material hidrofóbico é adicionalmente ligado à uma droga terapêutica de modo que uma droga anticâncer para aumentar a força de coesão do núcleo, micelas podem ser formadas mesmo em baixa concentração e micelas poliméricas tendo estabilidade aumentada devido ao material hidrofílico da concha ser formado. Uma droga terapêutica tendo materiais hidrofóbicos e hidrofílicos ligados à ambas as extremidades por ligação biodegradável pode formar micelas poliméricas que podem estavelmente liberar a droga terapêutica no tecido de câncer alvo.
[013] Recentemente, como a tecnologia para liberação de oligo RNA fita dupla, a tecnologia de nanopartícula auto-montada de SAMiRNA formada se baseia nas características de materiais ligados às extremidades de ácido nucleico foi desenvolvida (Korean Patent Laid-Open Publicação No. 2009-0042297). SAMiRNA é uma nanopartícula auto-montada composta de estruturas oligo RNA de fita dupla tendo ligadas a esta materiais hidrofóbicos e hidrofílicos que aumentam a liberação de oligo RNA de fita dupla, e tecnologia para formar SAMiRNA pode ser a tecnologia para melhorar a liberação intracelular de oligo RNA de fita dupla.
[014] Foi demonstrado que, quando SAMiRNA marcado com marcador fluorescente foi administrado à veia da cauda de um modelo de camundongo de xenoenxerto tumoral, a nanopartícula foi liberada especificamente pelo direcionamento passivo mencionado acima (ver A FIG. 2).
[015] Entretanto, direcionamento ativo usa nanopartículas tendo uma fração de direcionamento ligada a estas. Foi reportado que a fração de direcionamento causa o acúmulo preferencial de nano partículas no tecido algo ou aumenta a internalização de nano partículas nas células alvo (Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26(10):552-8. Epub 2008 Aug 21).
[016] Direcionamento ativo significa melhorar a liberação de nanopartículas para as células alvo usando uma fração de direcionamento como um anticorpo ou um ligante, ligado às nanopartículas. Nos anos recentes, os estudos foram conduzidos para localizar siRNAs ao tecido desejado usando várias frações de direcionamento ligadas aos siRNAs.
[017] Po r exemplo, foi demonstrado que um siRNA tendo α- tocoferol ligado a este foi efetivamente e estavelmente liberado in vivo e inibiu a expressão do gene alvo por interferência de RNA (Kazutaka Nishina et al., The American Society of Gene therapy, 2008, 16(4):734-740). Ainda, foi demonstrado que um siRNA tendo colesterol ligado a este foi mais efetivamente liberado em tecido hepático comparado à um peptídeo de penetração celular (CCP) que é principalmente usado para a liberação de siRNA (US-20060014289; Moschos S.A. et al., Bioconjug. Chem. 18:1450-1459). Foi reportado que o efeito de liberação é causado não somente pela especificidade do tecido tumoral, mas ainda pela especificidade de uma célula direcionada pela fração de direcionamento ligada.
[018] Di recionamento ativo usa materiais tendo a capacidade de ligar aos carboidratos, receptores ou antígenos, que são específicos para ou super expressos na superfície da célula alvo (Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8): 1909-1917). Assim, nanopartículas tendo uma fração de direcionamento ativo ligada a estas em tecido tumoral durante suas circulações no sangue pelo direcionamento passivo, e a liberação de nanopartículas nas células alvo é aumentada pela fração de direcionamento, assim, aumentando o efeito terapêutico da droga liberada nas células. Como a fração de direcionamento, um ligante ou um anticorpo é principalmente usado. Este liga ao seu receptor na superfície celular com alta avidez e especificidade e promove a internalização das nanopartículas pela endocitose mediada pelo receptor (RME) (Kinetic analysis of receptor-mediated endocytosis (RME) of proteins and peptides: use of RME as a drug delivery system. J Control Release 1996; 39: 191-200).
[019] O receptor de superfície celular ou antígeno que é direcionado por este ligante ou anticorpo tem uma característica em que este é específico para ou super expresso nas células alvo para facilitar o acesso do ligante de direcionamento a este, assim, aumentando a taxa de endocitose. Além disso, o receptor ou antígeno libera as nanopartículas tendo o ligante ligado a estas nas células, e é reciclado de volta para a superfície celular (Receptor-mediated endocytosis: An overview of a dynamic process. J. Biosci., Oct. 1984, 6(4), pp. 535-542.). As frações de direcionamento de tumor são materiais que se ligam especificamente aos receptores como fator de crescimento epidérmico ou receptor de lipoproteína de baixa densidade, que são especificamente expressos nas linhagens celulares alvo como receptor de folato, que são conhecidos por serem super expressos na superfície de várias células cancerígenas (Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006, 5(8): 1909-1917).
[020] Se uma fração de direcionamento, particularmente um ligante específico para o receptor que aumenta a internalização por endocitose mediada por receptor (RME), é ligado a SAMiRNA, este pode de modo eficiente promover a liberação de SAMiRNA nas células alvo, particularmente células cancerígenas, e, assim o SAMiRNA pode ser liberado nas células alvo mesmo em uma concentração e dose relativamente baixas de modo que o oligo RNA de fita dupla pode apresentar alta atividade e a liberação não específica do oligo RNA de fita dupla em outros órgãos e células pode ser inibida.
[021] Além disso, a tecnologia de formação de SAMiRNA pode ser aplicada não apenas aos oligo RNAs de fita dupla, mas também aos oligonucleotídeos de fita simples, particularmente um oligonucleotídeo antissenso de fita simples (ASO) para fins terapêuticos.
[022] A tecnologia ASO é a tecnologia de controle da transferência de informação do gene para a proteína alterando o metabolismo de mRNA usando RNA ou DNA de fita simples. Em outras palavras, é a tecnologia para realizar a inibição preferencial de expressão da proteína de interesse usando uma sequência de nucleotídeo selecionada que complementarmente e especificamente hibridiza para a proteína. Devido ao fato de que ASO se liga ao gene alvo em um modo específico de sequência, este não influencia a expressão dos genes além do gene alvo. Assim, a tecnologia ASO pode servir como uma ferramenta alvo na análise da função in vivo de uma proteína específica e pode ainda ser usada como terapia gênica contra uma doença específica (FASEBJ.9,1288-1296,1995).
[023] Nos anos recentes, um antagomir que é um novo tipo de oligonucleotídeo antissenso de fita simples foi desenvolvido e foi usado para inibir a função de microRNAs em células. Sabe-se que um antagomir ou inibidor de microRNA (inibidor de miRNA) que é um RNA curto sintetizado quimicamente complementarmente ao microRNA alvo para inibir a função do microRNA. Um antagomir preferencialmente tem uma estrutura química modificada como 2' metoxi ou fosfotioato para impedir a degradação do antagomir. Atualmente, antagomirs que inibem as funções de miRNAs relacionados às várias doenças, incluindo câncer e fibrose cardíaca e pulmonar, são conhecidos ("Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'" Nature, Dec. 2005, 438(7068): 685-689; "MicroRNAs as Therapeutic Targets" New England J. Medicine, 2006, 354 (11): 1194-1195; Meister G. et al., "Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing" RNA, Mar. 2004, 10 (3): 544-550).
[024] DNA antissenso se liga ao mRNA alvo para formar um duplex de RNA/DNA, que é degradado por RNase H (um tipo de ribonuclease que especificamente degrada um mRNA contendo um duplex híbrido RNA/DNA formado neste) in vivo. RNA atissenso forma um duplex RNA/RNA, e a degradação do mRNA alvo é induzido por RNase L. RNase L é uma ribonuclease que preferencialmente degrada RNA de fita simples ao redor de RNA de fita dupla (Pharmacol.Toxicol.32,329-376,1992).
[025] No entanto, um ASO compreendendo o inibidor de miRNA antagomir deve ser efetivamente liberado nas células alvo para obter um efeito desejado, e o ASO pode ser degradado por ribonuclease no sangue. Assim, a fim de usar uma ASO para fins terapêuticos, um conjugado ASO deve ser efetivamente liberado através da membrana celular, e a estabilidade do ASO in vivo deve ser garantida (Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).
[026] Assim, para a estabilidade in vivo, a maioria dos ASOs estão na forma de oligodeoxinucleotídeos (ODNs) obtidos por várias modificações que provêm resistência à nuclease. A modificação pode ser a substituição de um grupo -OH na posição de carbono 2’ da fração de açúcar de um ou mais nucleotídeos com -CH3 (metil), -OCH3,-NH2,-F (flúor), -O-2-metoxietil, -O-propil, -O-2-metiltioetil, -O-3-aminopropil, -O-3-dimetilaminopropil, - O-N-metilacetamido ou -O-dimetilamidoxietil; a substituição de oxigênio da fração de açúcar do nucleotídeo com enxofre; modificação da ligação entre os nucleotídeos em uma ligação fosforotioato, boranofosfofato ou metil fosfonato; ou uma combinação de uma ou mais das mesmas; ou modificação na forma de PNA (ácido nucleico peptídico) ou LNA (ácido nucleico bloqueado) (ver Crooke et al., Ann. Rev. Med. Vol.55: pp 61-65 2004, US5.660.985, US5.958.691, US6.531.584, US5.808.023, US6.326.358, US6.175.001 Braasch D. A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y. L. et al., RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M. et al., Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003).
[027] Para liberar ASOs nas células alvo, técnicas de liberação de gene que usam vírus como adenovírus ou retrovírus, e técnicas de liberação de gene que usam carreadores não virais como lipossomas, lipídeos catiônicos ou polímeros catiônicos foram desenvolvidos. No entanto, carreadores virais têm problemas em termos de segurança, porque não é garantido que estes carreadores não causem anormalidades nas funções normais de genes hospedeiros após a incorporação no cromossomo do hospedeiro, ou não ativam oncogenes. Ainda, se o gene viral é continuamente expresso mesmo em níveis baixos para causar doenças autoimunes ou se o carreador viral causa infecção viral modificada, ASOs não podem ser efetivamente liberados.
[028] Para superar ditos problemas, métodos para fundir um gene para o lipossoma carreador não viral ou métodos para usar lipídeos catiônicos ou polímeros foram estudados para superar as deficiências do mesmo. Embora estes carreadores não virais sejam menos eficientes do que os carreadores virais, estes têm vantagens de modo que são seguros in vivo, causam menos efeitos colaterais e podem ser produzidos a custo baixo (Lehrman S. Nature. 401(6753):517-518, 1999).
[029] Para efetivamente obter a liberação estável de moléculas de ODN incluindo um ASO usando carreadores não virais, um método efetivo de prevenir a degradação enzimática e não enzimática é requerido. Assim, métodos para quimicamente modificar ASOs para preparar os ASOs estáveis contra nuclease e aumentar a absorção intracelular dos ASOs foram propostos (Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab.Parmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).
[030] Entretanto, polímeros compreendendo PEG (polietileno glicol) formam compostos tendo estruturas em micela espontaneamente formadas por interação entre estas, e estes compostos são conhecidos como micelas compostos polímero (Kataoka K. et al. Macromolecules, 29:8556-8557, 1996). Estas micelas compostos polímero têm vantagens de modo que têm um tamanho muito pequeno comparado aos outros sistemas de liberação de droga como microesferas ou nanopartículas enquanto a distribuição da mesma é muito uniforme, e são espontaneamente formadas, tornando fácil controlar a qualidade da formulação e garantir a reprodutibilidade.
[031] Nos anos recentes, a fim de aumentar a eficiência de liberação de ASOs, a tecnologia para garantir a estabilidade de ASOs e a permeação eficiente de ASOs através da membrana celular por conjugação de um material hidrofílico como o polímero biocompatível PEG aos ASOs por uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante foi desenvolvida (Registro de Patente Coreana No. 0466254). No entanto, melhorar a estabilidade in vivo de ASOs e garantir a liberação eficiente de ASOs no tecido alvo são difíceis de obter apenas por modificação química e pequilação.
[032] O pedido internacional WO2010131916 intitulado siRNA Conjugate and Preparation Method Thereof refere-se a um conjugado de siRNA-polímero e a um método para a preparação do mesmo, e mais especificamente, a um conjugado híbrido formado por ligação covalente de siRNA e um composto polimérico para melhorar a bioestabilidade do siRNA e a um método de preparação do conjugado híbrido. Todavia, não revela uma estrutura funcional conforme a presente invenção, que é direcionada à estrutura terapêutica de polímero-droga compreendendo o ligante L ligado à extremidade do bloco hidrofílico. e selecionado especificamente entre folato, N-acetilgalactosamina (NAG) e manose.
[033] O pedido de patente CN1911447 intitulado Transferrin-Polyethylene Glycol Medicine Molecular Compound and Its Use revela a composição da molécula de transferrina-polietanodiol- medicamento para a terapia alvo do tumor. No entanto, omite-se com relação ao problema sobre como entregar efetivamente RNA no organismo do paciente, uma vez que é facilmente degradado no corpo.
[034] O pedido internacional WO2011054939 intitulado Compositions and Methods for Inhibiting Expression of KIF10 Genes D4. CN102028955 Novel Targeting Compound for Tumor Gene Interference descreve apenas um dsRNA ligado ao ligante que é completamente diferente de um ligante conectado à estrutura terapêutica polímero-droga da presente invenção. O que esse documento revela é "o ligante pode ser conjugado ao dsRNA" e "é sabido que o ácido fólico na extremidade 3' do anoligonucleotídeo resulta em aumento da captação celular do oligonucleotídeo". Quando um ligante é ligado diretamente ao dsRNA e o conjugado ligante-dsRNA é transferido para uma célula, o dsRNA se torna muito vulnerável a muitas enzimas intracelulares, como as proteases. Para evitar isso, o referido documento ensina que o dsRNA requer modificações muito complicadas.
[035] O documento de patente CN102028955 intitulado Novel Targeting Compound for Tumor Gene Interference revela um novo composto de direcionamento para interferência de genes tumorais, que compreende um aptâmero, protamina e ácido ribonucleico interferente de pequenas moléculas. Nesta estrutura, a protamina funciona como uma ponte e o aptâmero é um grupo alvo. Ou seja, tal documento apenas ensina que o siRNA pode ser entregue a uma molécula alvo específica via aptâmero e não revela uma estrutura com dupla funcionalidade.
[036] O pedido de patente US2011112176 intitulado Compositions and Methods for Inhibiting Expression of KIF10 Genes revela uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla capaz de inibir a expressão do gene KIF10. Todavia, não soluciona o problema de direcionar o princípio ativo para células específicas enquanto reduz a degradação do siRNA no corpo.
[037] O pedido de patente JP2011522070 intitulado Micellic Assemblies revela uma micela e um polinucleotídeo associado à micela, compreendendo a micela uma pluralidade de copolímeros em bloco, cada um incluindo um bloco hidrofílico e um bloco hidrofóbico. No entanto, o bloco hidrofílico com uma espécie catiônica é iônico associado ao polinucleotídeo. Isto é completamente diferente da estrutura na qual o siRNA está ligado covalentemente entre um bloco hidrofílico e um bloco hidrofóbico.
[038] A publicação internacional WO2010042823 intitulada Multifunctional Self-Assembling Polymeric Nanosystems revela um bloco hidrofílico e um bloco hidrofóbico para a entrega de ácido nucleico; todavia, este é encapsulado em uma concha de hidrogel, que é diferente da estrutura na qual o siRNA é covalentemente ligado entre um bloco hidrofílico e um bloco hidrofóbico.
[039] O pedido de patente US2007287681 cujo título é siRNA- Hydrophilic Polymer Conjugates for Intracellular Delivery of siRNA and Method Thereof, bem como a publicação "Folate Receptor Targeted Delivery of Polyelectrolyte Complex Micelles Prepared from ODN-PEG-Folate Conjugate and Cationic Lipids", Sun Hwa Kim et al, Biotechnol. Prog. (20061115), vol. 23, no. 1, pages 232 - 237, revela um conjugado de polímero siRNA-hidrofílico e um conjugado ODN-PEG-FOL, respectivamente. Uma vez que as estruturas descritas nesses documentos não possuem polímero hidrofóbico, é necessário usar um composto catiônico para ser entregue na célula. Nesse caso, o composto catiônico (por exemplo, PEI) pode ser tóxico para a célula, e a micela complexa formada com o composto catiônico não é de tamanho uniforme, resultando no problema de baixa eficiência de entrega do princípio ativo na célula.
[040] O pedido de patente US2012225129 intitulado Conjugates, Particles, Compositions, and Related Methods revela um ácido nucleico covalentemente ligado a uma fração hidrofóbica ou a um polímero hidrofílico-hidrofóbico. Assim, a estrutura descrita nesse documento apresenta reduzida tendência em formar uma estrutura na qual o ácido nucleico esteja localizado entre as porções hidrofílicas e hidrofóbicas, como na presente invenção, para que o ácido nucleico seja entregue de maneira estável em uma célula.
[041] Result a, portanto, que a tecnologia SAMiRNA sobre nanopartículas obtidas por introdução de materiais hidrofóbicos e hidrofílicos ao siRNA para melhorar a liberação intracelular de siRNA foi desenvolvida. Todavia, a aplicação desta tecnologia para a liberação de ASOs não foi ainda reportada. Assim, há uma necessidade para desenvolver um sistema de liberação de ASO e um método para preparar várias modificações químicas em ASOs e conjugar vários polímeros aos ASOs para proteger os ASOs das enzimas para, assim, aumentar a estabilidade dos mesmos, e a permeação eficiente do mesmo através da membrana celular.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[042] Em um primeiro aspecto, um objetivo da presente invenção é prover uma estrutura de droga terapêutica, que compreende materiais hidrofílicos e hidrofóbicos que são compostos poliméricos biocompatíveis ligados à ambas as extremidades da droga terapêutica por uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante para aumentar a eficiência de liberação intracelular da droga terapêutica e ainda compreende um ligante ligado ao material hidrofílico, uma nanopartícula composta da estrutura da droga terapêutica, e um método de preparação da mesma.
[043] Outro objetivo da presente invenção é prover uma estrutura oligo RNA dupla hélice, que compreende materiais poliméricos biocompatíveis hidrofílicos e hidrofóbicos ligados à ambas as extremidades do oligo RNA dupla hélice por uma ligação simples ou uma ligação covalente mediada por ligante para aumentar a eficiência de liberação intracelular do oligo RNA dupla hélice, e ainda compreende, ligado ao material hidrofílico, um ligante específico para o receptor tendo a propriedade de melhorar a internalização da célula alvo (particularmente célula cancerígena) por endocitose mediada por receptor (RME); uma nanopartícula composta das estruturas oligo RNA dupla hélice ligadas ao ligante; e uma composição farmacêutica compreendendo a estrutura oligo RNA dupla hélice ligada ao ligante ou uma nanopartícula composta das estruturas oligo RNA dupla hélice ligada ao ligante.
[044] Ainda outro objetivo da presente invenção é prover métodos para preparar uma estrutura oligo RNA dupla hélice ligada ao ligante e uma nanopartícula compreendendo a mesma, e uma técnica para liberar um oligo RNA dupla hélice usando a estrutura oligo RNA dupla hélice ligada ao ligante.
[045] Quando um ligante específico ao alvo é ligado a uma estrutura oligo RNA dupla hélice, uma nanopartícula composta das estruturas oligo RNA dupla hélice ligada ao ligante pode ser efetivamente liberada na célula alvo. Assim, quando uma estrutura oligo RNA dupla hélice ligada ao ligante é administrada em uma concentração relativamente baixa, esta pode apresentar a atividade de oligo RNA dupla hélice na célula alvo. Ainda, devido ao fato de que o ligante ligado pode prevenir a liberação não específica do oligo RNA dupla hélice em outros órgãos e células, a estrutura de dupla hélice RNA ligada ao ligante pode ser usada para o tratamento de várias doenças e pode ser efetivamente usado como um novo tipo de sistema de liberação de oligo RNA dupla hélice. Particularmente, a estrutura de RNA dupla hélice ligada ao ligante pode ser efetivamente usada para o tratamento de doenças, incluindo câncer e doenças infecciosas.
[046] Em um segundo aspecto, um objetivo da presente invenção é prover um conjugado ASO-polímero, que compreende materiais poliméricos biocompatíveis hidrofílicos e hidrofóbicos ligados a ambas as extremidades do ASO por uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante para melhorar a eficiência de liberação intracelular do ASO, e um método de preparação do mesmo.
[047] Outro objetivo da presente invenção é prover uma técnica para liberar um ASO usando uma nanopartícula composta de conjugados ASO-polímero, e uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado ASO-polímero ou uma nanopartículas composta de conjugados ASO-polímero.
[048] O conjugado ASO-polímero de acordo com a presente invenção e uma nanopartícula composta dos conjugados ASO-polímero pode aumentar a estabilidade in vivo de ASO, tornando possível eficientemente liberar o ASO terapêutico nas células. Ainda, podem apresentar a atividade de ASO em concentrações relativamente baixas em comparação a um ASO cuja extremidade não foi modificada, mesmo na ausência de um agente de transfecção. Assim, o conjugado ASO-polímero e uma nanopartícula composta dos conjugados ASO-polímero podem ser usados para o tratamento de várias doenças, incluindo câncer e doenças infecciosas, e pode ainda ser muito efetivamente usado como um novo tipo de sistema de liberação de ASO em pesquisa de bioengenharia básica e indústrias médicas.
Breve Descrição das Figuras
[049] A FIG. 1 é uma vista esquemática de uma nanopartícula (SAMiRNA) composta de estruturas de oligo RNA dupla hélice tendo um ligante ligado a estas.
[050] A FIG. 2 mostra a liberação específica de tumor de SAMiRNA. A FIG. 2A é uma fotografia que mostra a biodistribuição de SAMiRNA com tempo após SAMiRNA marcado com Cy5.5 ter sido administrado uma vez à veia da cauda de um camundongo transplantado com tumor em uma dose 5 mg/kg peso corporal (a porção indicada pela linha pontilhada vermelha é uma porção transplanta do tumor). A FIG. 2(B) é uma fotografia ex vivo de cada tecido coletado em 48 horas após administração de SAMiRNA.
[051] A FIG. 3 mostra os resultados de análise de NMR de 1,3,4,6-tetraacetil-NAG (composto A). 1H NMR (300 MHz, DMSO-D6); δ7,89 ppm (1H, d, J=9,3 Hz), 5,64 ppm (1H, d, J=8,7 Hz), 5,27 ppm (1H, d, J=3,3 Hz), 5,07ppm (1H, dd, J=11,7, 3,6 Hz), 4,22 ppm (1H, t, J=6,3 Hz), 4,14-3,96 ppm (2H, m), 2,12ppm (3H, s), 2,04 ppm (3H, s), 1,99 ppm (3H, s), 1,91(3H, s), 1,78 ppm (3H, s).
[052] A FIG. 4 mostra os resultados de análise NMR de 3,4,6- triacetil-1-hexa(etilenoglicol)-N-acetilgalactosamina(NAG) (composto B). 1H NMR (300 MHz, DMSO-D6); δ7,71 ppm (1H, d, J=9,3 Hz), 5,21 ppm (1H, d, J=3,0 Hz), 4,97 ppm (1H, dd, J=11,1, 3,0 Hz), 4.56 ppm (1H, d, J=8,7 Hz), 3,88 ppm (1H, q, J=8,7 Hz), 3,83-3,74ppm (1H, m), 3,62-3,39 ppm (25H, m), 2,10 ppm (3H, s), 2,01 ppm (3H, s), 1,89 ppm (3H, s), 1,77 ppm (3H, s).
[053] A FIG. 5 mostra os resultados de análise NMR de 1- hexa(etilenoglicol)-NAG-fosforamidita) (composto C). (A) 1H NMR (300 MHz, DMSO-D6); δ 7,78 ppm (1H, d, J=9,3 Hz), 5,21 ppm (1H, d, J=3,0 Hz), 4,97 ppm (1H, dd, J=11,1, 3,6 Hz), 4,56 ppm (1H, d, J=8,1 Hz), 3,88 ppm (1H, d, J=9,0 Hz), 3,81-3,41 ppm (30H, m), 2,89 ppm (2H, t, J=5,7 Hz), 2,11 ppm (3H, s), 2,00 ppm (3H, s), 1,89 ppm (3H, s), 1,77 ppm (3H, s), 1,20-1,12 ppm (12H, m), (B) 31P dados NMR (121 MHz, DMSO-D6); δ 147,32 ppm.
[054] A FIG. 6 mostra um processo para preparar um RNA de fita simples.
[055] A FIG. 7 mostra um processo para preparar uma estrutura oligo RNA dupla hélice compreendendo PEG ligado à extremidade 5’ de um oligo RNA dupla hélice e os resultados de análise da estrutura de RNA. A FIG. 7(A) mostra um processo para ligar PEG para um oligo RNA dupla hélice usando PEG-fosforamidita, A FIG. 7(B) mostra os resultados de análise MALDI-TOF MS de um RNA de fita simples (21mer) que não foi modificado na extremidade 5‘ (SEQ ID NO: 1; MW 6662,1), e A FIG. 7(C) mostra os resultados de MALDI-TOF MS de um RNA de fita simples (21mer) tendo PEG ligado à extremidade 5’ (SEQ ID NO: 1; MW 6662,1).
[056] A FIG. 8 mostra um processo para preparar uma estrutura mono-NAG-PEG-RNA e os resultados de análise da estrutura. A FIG. 8(A) mostra um processo para ligar N-acetil galactosamina (NAG) a PEG-RNA usando N-acetil galactosamina-fosforamidita, A FIG. 8(B) mostra os resultados de análise MALDI-TOF MS de uma estrutura NAG-PEG-RNA (azul, MW 9171,2) compreendendo N-acetil galactosamina ligado a PEG-RNA (verde, MW 8624,1) e mostra que o pico central mudou pelo peso molecular de N-acetil galactosamina (MW 547).
[057] A FIG. 9 mostra um processo para preparar uma estrutura tripla-NAG-PEG-RNA e os resultados de análise da estrutura. A FIG. 9(A) mostra um processo para ligar N-acetil galactosamina a PEG-RNA usando dendrímero fosforamidita e NAG-fosforamidita, e a FIG. 9(B) mostra os resultados de análise MALDI-TOF MS de PEG- RNA (verde, M.W. 8624.1), e uma estrutura mono-NAG-PEG (azul, MW 9171,2) e uma estrutura tripla-NAG-PEG-RNA (vermelha, MW 10630), que compreende N-acetil galactosamina ligado a esta.
[058] A FIG. 10 mostra um processo para preparar uma estrutura 5‘ folato-PEG-RNA e os resultados da estrutura. A FIG. 10(A) mostra um processo para ligar folato a PEG-RNA por NHS-folato, e a FIG. 10(B) mostra os resultados de análise de MALDI-TOF MS de PEG-RNA (verde, MW 8624,1) e uma estrutura folato-PEG-RNA (azul, MW 9277,8) e mostra que o pico central mudou pela peso molecular de folato (MW 615).
[059] A FIG. 11 mostra os resultados de análise de uma estrutura 5‘ C24-RNA. A FIG. 11(A) mostra a análise de análise de MALDI- TOF MS de um RNA de fita simples complementar à SEQ ID NO: 1 (MW 7349,5), e a FIG. 11(B) mostra a análise de análise de MALDI-TOF MS de uma estrutura 5‘ C24-RNA complementar à SEQ ID NO: 1 (MW 7830,2).
[060] A FIG. 12 mostra um processo para preparar uma estrutura 3’ CPG-amina-PEG-RNA por amina-CPG.
[061] A FIG. 12 mostra um processo para preparar uma estrutura 3’ CPG-amina-PEG-RNA por amina-CPG.
[062] A FIG. 14 mostra um processo para preparar uma estrutura 3‘ folato-PEG-RNA e os resultados da análise da estrutura. A FIG. 14(A) mostra um processo para ligar folato a uma estrutura 3‘ amina-PEG-RNA por NHS-folato; e a FIG. 14(B) mostra os resultados de análise de MALDI-TOF MS de uma estrutura 3 ‘ folato-PEG-RNA (SEQ ID NO: 1; MW 9277,7).
[063] A FIG. 15 mostra os resultados de análise das propriedades físicas de uma nanopartícula (folato-SAMiRNA) composta de estruturas 5‘ folato-RNA-polímero. A FIG. 15(A) é um diagrama gráfico que mostra o tamanho e índice polidisperso (PDI) de folato-SAMiRNA, e a FIG. 15(B) é um diagrama gráfico que mostra a concentração de micela crítica de folato-SAMiRNA.
[064] A FIG. 16 mostra o efeito de folato-SAMiRNA na inibição de expressão do gene alvo em uma linhagem celular que super expressa o receptor de folato. O nível do mRNA do gene alvo na linhagem do tumor KB que super expressa receptor de folato foi medido por qPCR em 48 horas após o tratamento com folato-SAMiRNA e SAMiRNA. Na FIG. 16, sem Folato em meio de cultura: condição isenta de folato; com Folato em meio de cultura: uma condição contendo uma quantidade excessiva (1 mM) de folato; Con: um grupo teste tratado com a nanopartícula SAMiRNA-Con composta de estruturas de oligo RNA dupla hélice-polímero compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 2 (sequência de controle); SAM: um grupo teste tratado com a nanopartícula SAMiRNA-Sur composta de estruturas de oligo RNA dupla hélice-polímero compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 1 (sequência survivina); Folato-SAM: um grupo teste tratado com a nanopartícula Folato-SAMiRNA-Sur composta de estruturas de folato-oligo RNAs dupla fita compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 1 (sequência de survivina) e tendo um ligante folato ligado a esta.
[065] A FIG. 17 mostra o efeito de folato-SAMiRNA na inibição de expressão do gene alvo no tecido tumoral. O nível de mRNA do gene alvo (survivina) em tecido tumoral foi medido por qPCR em 48 horas ou 72 horas após cada um de SAMiRNA e folato-SAMiRNA foi administrado uma vez em uma dose de 5 mg/Kg peso corporal à veia caudal de um camundongo tendo um tumor composto da linhagem de célula tumoral KB que super expressa receptor de folato 48. Na FIG. 17, PBS: controle negativo; SAMiRNA: um grupo administrado com a nanopartícula SAMiRNA-Sur composta de estruturas de oligo RNA dupla hélice-polímero compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 1 (sequência de survivina) e tendo nenhum ligante ligado a estas; Folato-SAMiRNA: um grupo administrado com a nanopartícula Folato-SAMiRNA-Sur da SEQ ID NO: 1 (sequência de survivina) tendo um ligante folato ligado a esta.
[066] A FIG. 18 é uma vista esquemática de uma nanopartícula compreendendo um conjugado ASO-polímero.
[067] A FIG. 19 mostra o espectro de MALDI-TOF MS de cada um de um ASO e um conjugado ASO-polímero de acordo com a presente invenção. Quatro nucleotídeos em ambas as extremidades (extremidades 5’ e 3’) são modificados com 2-OCH3 (metoxi), e 'm' indica um grupo OCH3 (metoxi). A FIG. 19(A) mostra os dados MALDI-TOF de ASO (M.W. 5967,9 Da), e a FIG. 19(B) mostra os dados de MALDI-TOF do conjugado ASO-polímero (M.W. 8448 Da).
[068] A FIG. 20 mostra os resultados de análise das propriedades físicas de uma nanopartícula composta de conjugados ASO- polímero. A FIG. 20(A) é um diagrama gráfico que mostra o tamanho e índice de polidispersidade (PDI) de uma nanopartícula composta de conjugados ASO-polímero; e a FIG. 20(B) é um diagrama gráfico que mostra a concentração de micela crítica da nanopartícula composta dos conjugados ASO-polímero.
[069] A FIG. 21 mostra os resultados de análise do nível de expressão de mRNA em várias concentrações de tratamento (10, 50 e 100 nM) para avaliar os efeitos de um ASO e um conjugado ASO- polímero na inibição da expressão do gene alvo em células tumorais. Scramble: um ASO da SEQ ID NO: 4 (sequência de controle); Survivina: um ASO da SEQ ID NO: 3 (sequência de survivina); ASO: um ASO tendo nenhum material ligado a este; conjugado ASO-polímero: um conjugado ASO-polímero na forma de 3‘PEG-ASO-5‘lipídeo).
MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO 1. Primeiro aspecto da presente invenção
[070] No primeiro aspecto da presente invenção, o termo “fita antissenso” significa uma fita que mostra atividade de RNAi para ligar e degradar o mRNA alvo em RISC (complexo de silenciamento induzido por RNA), e o termo “fita senso” significa uma fita tendo uma sequência complementar à fita antissenso.
[071] Como usado aqui, o termo “complementar” ou “ligação complementar” significa que duas sequências para ligar a cada outra para formar uma estrutura de fita dupla. Este inclui não apenas um pareamento perfeito entre duas sequências, mas também um pareamento incorreto entre duas sequências.
[072] A presente invenção provê uma estrutura droga-polímero terapêutica tendo uma estrutura da seguinte fórmula (1) e compreendendo um ligante ligado a esta:
Figure img0001
[073] em que A é um material hidrofílico; B é um material hidrofóbico; X e Y são cada um independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; R é uma droga terapêutica; e L é um ligante específico para o receptor tendo a propriedade de melhorar a internalização da célula alvo por endocitose mediada por receptor (RME).
[074] Aqui, a droga terapêutica pode ser selecionada de entre drogas anticâncer, oligo RNA dupla hélices, drogas antivirais, drogas anti-inflamatórias esteroidais (SAIDs), drogas anti- inflamatórias não esteroidais (NSAIDs), antibióticos, agentes antifúngicos, vitaminas, hormônios, ácido retinoico, prostaglandinas, prostaciclinas, agentes anti-metabólicos, micóticos, agonistas de colina, antagonistas de adrenalina, anticonvulsivantes, drogas antiansiedade, tranquilizantes, antidepressivos, anestésicos, analgésicos, esteroides anabólicos, estrogênios, progesteronas, glicosaminoglicanos, polinucleotídeos, imunosupressores, e imunoestimulantes.
[075] Na presente invenção, a droga terapêutica é preferencialmente um oligo RNA dupla hélice ou uma droga anticâncer. Se a droga terapêutica é um oligo RNA dupla hélice, o material hidrofílico pode ser ligado à extremidade 3’ ou 5’ do oligo RNA dupla hélice.
[076] Na estrutura inventiva de droga-polímero terapêutica compreendendo um ligante ligado a esta, um ligante pode adicionalmente ser ligado à uma posição específica (particularmente extremidade) do material hidrofílico ligado ao oligo RNA dupla hélice ou a droga anticâncer. O ligante pode ser selecionado de entre um anticorpo específico de receptor alvo, um aptâmero (um ácido nucleico de fita simples (DNA, RNA ou ácido nucleico modificado) capaz de ligar à molécula alvo com alta afinidade e especificidade), um peptídeo, ou materiais químicos, incluindo folato (folato é usado de modo intercambiável com ácido fólico, e o termo “folato” como usado aqui refere-se ao folato que é ativo em natureza no corpo humano), N-Acetilgalactosamina (NAG) e manose, que tem a propriedade de ligar especificamente ao receptor que melhora a internalização da célula alvo por RME. Aqui, o ligante é um material que realiza a liberação de um modo específico ao receptor alvo, e não é limitado apenas pelo anticorpo descrito acima, aptâmero, peptídeo e materiais químicos.
[077] O oligo RNA dupla hélice é preferencialmente composto de 19-31 nucleotídeos. O oligo RNA dupla hélice que é usado na presente invenção pode ser qualquer oligo RNA dupla hélice para qualquer gene que é usado ou pode ser usado para terapia gênica ou pesquisa.
[078] O material hidrofóbico forma uma nanopartícula composta de estruturas oligo RNA dupla hélice por interação hidrofóbica. Entre os materiais hidrofóbicos, uma cadeia de carbono ou colesterol é muito apropriada para uso na preparação da estrutura da presente invenção, porque esta pode ser facilmente ligada na etapa de sintetização de oligo RNA dupla hélices.
[079] O material hidrofóbico preferencialmente tem um peso molecular de 250-1.000. Particularmente, o material hidrofóbico que é usado na presente invenção pode ser um derivado de esteroide, um derivado de glicerídeo, éter de glicerol, polipropileno glicol, um hidrocarboneto C12-C50 saturado ou insaturado, diacil fosfatidilcolina, ácido graxo, fosfolipídeo, lipopoliamina ou semelhantes, mas não é limitado a estes, e será óbvio aos especialistas na técnica que qualquer material hidrofóbico apropriado para a finalidade da presente invenção pode ser usado.
[080] Particularmente, o derivado de esteroide pode ser selecionado do grupo que consiste em colesterol, colestanol, ácido cólico, colesteril formato, colestanil formato, e colestanil amina, e o derivado de glicerídeo pode ser selecionado de entre mono-, di- e tri-glicerídeos, em que o ácido graxo de glicerídeo pode ser um ácido graxo C12-C50 saturado ou insaturado.
[081] Ainda, o material hidrofílico é preferencialmente um polímero catiônico ou não iônico tendo um peso molecular de 20010.000, e mais preferencialmente um polímero não iônico tendo um peso molecular de 1.000-2.000. Por exemplo, o material hidrofílico que é usado na presente invenção é preferencialmente um polímero hidrofílico não iônico composto como polietilenoglicol, polivinil pirrolidona ou polioxazolina, mas não é limitada a estes.
[082] O material hidrofílico pode, se necessário, ser modificado para ter um grupo funcional requerido para ligar ao ligante. Entre os materiais hidrofílicos, particularmente polietilenoglicol (PEG) pode ter vários pesos moleculares e grupos funcionais, tem boa biocompatibilidade, não induz resposta imune, aumenta a estabilidade in vivo de oligo RNA dupla hélice, e aumenta a eficiência de liberação do RNA, e, assim, este é muito apropriado para a preparação da estrutura inventiva de oligo RNA dupla hélice.
[083] O ligante que medeia a ligação covalente não é especificamente limitada, contanto que este forme uma ligação covalente entre o material hidrofílico (ou o material hidrofóbico) e a extremidade do oligo RNA dupla hélice e provê uma ligação que pode, se necessário, ser degradado em um ambiente específico. Assim, o ligante pode incluir qualquer composto que liga o material hidrofílico (ou o material hidrofóbico) ao oligo RNA dupla hélice durante o processo de preparação da estrutura.
[084] Ainda, a ligação covalente pode ser uma ligação não degradável ou uma ligação degradável. Aqui, as ligações não degradáveis incluem, entre outras, uma ligação amida ou uma ligação fosfato, e as ligações degradáveis incluem, entre outras, uma ligação dissulfeto, uma ligação degradável ao ácido, uma ligação éster, uma ligação anidreto, uma ligação biodegradável ou uma ligação enzimaticamente degradável.
[085] A presente invenção provê uma estrutura de oligo RNA dupla hélice conjugado ao ligante representada pela seguinte fórmula (2), que compreende um material hidrofílico ligado à extremidade 3’ da fita senso de um oligo RNA dupla hélice, um ligante ligado ao material hidrofílico, e um material hidrofóbico ligado à extremidade 5’ da fita senso:
Figure img0002
[086] Em que A é o material hidrofílico; B é o material hidrofóbico; X e Y são cada um independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; S é a fita senso de oligo RNA dupla hélice; AS é a fita antissenso de oligo RNA dupla hélice; e L é o ligante específico ao receptor tendo a propriedade de melhorar a internalização da célula alvo pela endocitose mediada por receptor (RME).
[087] Um método para preparar a estrutura oligo RNA dupla hélice conjugado ao ligante representada pela fórmula (2) compreende as etapas de:
[088] (1) sinteti zar um RNA de fita simples em um suporte sólido tendo um grupo funcional-material hidrofílico ligado a este;
[089] (2) covalentemente ligar um material hidrofóbico à extremidade 5’ do RNA de fita simples tendo o grupo funcional- material hidrofílico ligado a este;
[090] (4) separar a estrutura de grupo funcional-RNA-polímero e um RNA de fita simples separadamente sintetizado complementar do suporte sólido;
[091] (5) ligar um ligante à extremidade do material hidrofílico pelo grupo funcional; e
[092] (6) recozer a estrutura RNA-polímero ligada ao ligante com o RNA de fita simples complementar para formar uma estrutura de RNA de fita dupla.
[093] Em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, o método pode compreender as etapas de: (1) ligar um material hidrofílico à um suporte sólido (CPG) tendo um grupo funcional ligado a esta; (2) sintetizar um RNA de fita simples no suporte sólido (CPG) tendo o grupo funcional-material hidrofílico ligado a este; (3) covalentemente ligar um material hidrofóbico à extremidade 5’ do RNA de fita simples; (4) separar a estrutura de grupo funcional-RNA-polímero e um RNA de fita simples complementar separadamente sintetizado do suporte sólido (CPG); (5) ligar um ligante à extremidade do material hidrofílico pelo grupo funcional para preparar uma estrutura de RNA-polímero tendo o ligante ligado a esta; e (6) recozer a estrutura de RNA- polímero ligada ao ligante com o RNA de fita simples complementar para formar uma estrutura oligo RNA dupla hélice tendo o ligante ligado a esta. Após a etapa (6), a estrutura RNA-polímero e o RNA de fita simples complementar podem ser separados e purificados dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), e então o peso molecular pode ser medido por um espectrômetro de massa MALDI-TOF para determinar se a estrutura de RNA-polímero desejada e RNA foram preparadas. No método de preparação acima descrito, a etapa para sintetizar o RNA de fita simples complementar ao RNA de fita simples sintetizado na etapa (3) pode ser realizada antes da etapa (1) ou em qualquer uma das etapas (1) a (6).
[094] Em outra modalidade, a presente invenção provê uma estrutura oligo RNA dupla hélice ligada a um ligante representada pela seguinte fórmula (3), que compreende um material hidrofílico ligado à extremidade 5’ da fita senso de um oligo RNA dupla hélice, um ligante ligado ao material hidrofílico, e um material hidrofóbico ligado à extremidade 3’ da fita senso:
Figure img0003
[095] Um método para preparar uma estrutura oligo RNA dupla hélice ligada ao ligante representada pela fórmula (3) compreende as etapas de:
[096] (1) sinteti zar um RNA de fita simples em um suporte sólido tendo um grupo funcional ligado a esta;
[097] (2) covalentemente ligar um material hidrofílico ao material obtido na etapa (1);
[098] (3) covalentemente ligar um ligante ao material obtido na etapa (2);
[099] (4) separar o material obtido na etapa (3) do suporte sólido;
[0100] (5) covalentemente ligar um material hidrofóbico ao material resultante da etapa (4) pelo grupo funcional ligado à extremidade 3’; e
[0101] (6) recozer o material resultante da etapa (5) com um RNA de fita simples complementar para formar uma estrutura de RNA fita dupla.
[0102] Em uma modalidade mais preferencial, o método de preparação pode compreender as etapas de: (1) sintetizar um RNA de fita simples em um suporte sólido (CPG) tendo um grupo funcional ligado a esta; (2) covalentemente ligar um material hidrofílico à extremidade 5’ do RNA de fita simples; (3) ligar um ligante ao material hidrofílico ligado ao RNA de fita simples para sintetizar uma estrutura de grupo funcional-RNA-polímero hidrofílico; (4) separar a estrutura grupo funcional-RNA- polímero hidrofílico a partir do suporte sólido (CPG); (5) ligar um material hidrofóbico ao RNA via o grupo funcional para sintetizar uma estrutura de RNA-polímero tendo um ligante ligado a esta; e (6) recozer a estrutura RNA-polímero preparada com um RNA de fita simples complementar para preparar uma estrutura de oligo RNA dupla hélice-polímero.
[0103] Após a etapa (5), o RNA pode ser separado e purificado dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), e então o peso molecular pode ser medido por um espectrômetro de massa MALDI-TOF para determinar se a estrutura de RNA-polímero desejada e RNA foram preparados. No método de preparação acima descrito, a etapa para sintetizar o RNA de fita simples complementar ao RNA de fita simples sintetizado na etapa (1) pode ser realizada antes da etapa (1) ou em qualquer uma das etapas (1) a (6).
[0104] Em outra modalidade, a presente invenção provê uma estrutura oligo RNA dupla hélice ligada a um ligante representada pela seguinte fórmula (4), que compreende um material hidrofílico ou hidrofóbico ligado à extremidade 5’ da fita senso e fita antissenso de RNA dupla hélice:
Figure img0004
[0105] Em que A é um material hidrofílico; B é um material hidrofóbico; X e Y são cada um independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; S é a fita senso de um oligo RNA dupla hélice; AS é a fita antissenso do oligo RNA dupla hélice; e L é um ligante específico para o receptor tendo a propriedade de melhorar internalização da célula alvo por endocitose mediada por receptor (RME).
[0106] Um método para preparar a estrutura oligo RNA dupla hélice representada pela fórmula (4) compreende as etapas de:
[0107] (1) sintetizar um RNA de fita simples em um suporte sólido;
[0108] (2) covalentemente ligar um material hidrofílico à extremidade 5’ do RNA de fita simples;
[0109] (3) ligar um ligante ao material hidrofílico ligado ao RNA de fita simples;
[0110] (4) separar a estrutura RNA-polímero hidrofílico ligada a um ligante e uma estrutura RNA complementar-polímero hidrofóbico separadamente sintetizada a partir do suporte sólido; e
[0111] (5) recozer a estrutura de RNA-polímero hidrofílico ligado ao ligante com a estrutura RNA complementar-polímero hidrofóbico para formar uma estrutura de dupla fita.
[0112] O método de preparação compreende, entre etapas (1) a (4), uma etapa para sintetizar um RNA de fita simples complementar ao RNA de fita simples da etapa (1), e então covalentemente ligar um material hidrofóbico ao RNA sintetizado de fita simples para sintetizar uma estrutura de RNA de fita simples-polímero hidrofóbico.
[0113] A presente invenção ainda provê uma nanopartícula compreendendo a estrutura de oligo RNA dupla hélice tendo o ligante ligado a esta, e uma nanopartícula compreendendo a estrutura de droga terapêutica-polímero tendo o ligante ligado a esta.
[0114] Uma nanopartícula é formada por interação entre as estruturas oligo RNA dupla hélice ligadas ao ligante da presente invenção. Especificamente, uma nanopartícula é formada, que tem uma estrutura em que um material hidrofóbico está localizado no centro da nanopartícula, um oligo RNA dupla hélice é protegido por um material hidrofílico externo, e um ligante é localizado na superfície da nanopartícula (ver A FIG. 1). A nanopartícula libera o oligo RNA dupla hélice em uma célula pelo ligante, e assim libera o RNA em uma célula com eficiência aumentada. Esta nanopartícula pode ser usada para o tratamento de doenças. Síntese da estrutura e características, eficiência de liberação intracelular e efeitos de uma nanopartícula compreendendo a estrutura serão descritos em outros detalhes nos Exemplos abaixo.
[0115] A presente invenção ainda provê um método de terapia gênica que usa uma nanopartícula composta de uma estrutura oligo RNA dupla hélice ligadas ao ligante ou as estruturas droga terapêutica-polímero ligadas ao ligante.
[0116] Especificamente a presente invenção provê um método terapêutico compreendendo as etapas de: preparar uma nanopartícula composta de uma estrutura oligo RNA dupla hélice ligada aos ligantes; e introduzir a nanopartícula no corpo de um animal.
[0117] A presente invenção ainda provê uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de uma nanopartícula composta da estrutura oligo RNA dupla hélice ligada aos ligantes.
[0118] Para administração, a composição da presente invenção pode compreender, além do ingrediente ativo descrito acima, pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. O carreador farmaceuticamente aceitável que pode ser usado na presente invenção deve ser compatível com o ingrediente ativo da presente invenção e pode ser salina fisiológica, água estéril, solução de Ringer, salina tamponada, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol, ou uma mistura de dois ou mais destes. Além disso, a composição da presente invenção pode, se necessário, compreender outros aditivos convencionais, incluindo antioxidantes, tampões, e agentes bacteriostáticos. Ainda, a composição da presente invenção pode ser formulada como formas injetáveis como soluções aquosas, suspensões, ou emulsões com a ajuda de diluentes, dispersantes, surfactantes, ligantes e lubrificantes. Particularmente, a composição da presente invenção é preferencialmente fornecida como uma formulação liofilizada. Para preparação das formulações liofilizadas, qualquer método convencional conhecido na técnica pode ser usado, e um estabilizador para liofilização pode ainda ser adicionado.
[0119] Além disso, a composição da presente invenção pode ser formulada em formas de dosagens apropriadas dependendo do tipo de doença ou componente de acordo com um método conhecido na técnica ou o método revelado em Remington's pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA).
[0120] A dosagem da composição farmacêutica da presente invenção pode ser determinada pelos especialistas na técnica dependendo das condições do paciente e a gravidade da doença. Além disso, a composição da presente invenção pode ser formulada na forma de pós, comprimidos, cápsulas, líquido, soluções de injeção, pomadas, e xaropes, e pode ser fornecida em formas de dosagem unitárias ou formas de múltiplas dosagens, por exemplo, ampolas ou frascos vedados.
[0121] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada oralmente ou via parenteral. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada por várias vias, incluindo, entre outras, via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intradural, intracardíaca, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, gastrointestinal, sublingual, e local.
[0122] Para dita administração clínica, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada em formas apropriadas usando uma técnica conhecida na técnica. A dose da composição da presente invenção pode variar dependendo de vários fatores, como peso corporal do paciente, idade, sexo, condição de saúde e dieta, o tempo e método de administração, taxa de excreção, e gravidade de uma doença, e pode ser facilmente determinado por uma pessoa especialista na técnica.
2. Segundo aspecto da presente invenção
[0123] Em um segundo aspecto, a presente invenção provê um conjugado ASO-polímero representado pela seguinte fórmula 5:
Figure img0005
[0124] Em que um de A e B é um material hidrofílico, o outro é um material hidrofóbico, X e Y são cada um independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante, e R é um ASO.
[0125] Como usado aqui, o termo “ASO” significa incluir não somente oligonucleotídeos antissenso convencionais que são usados para inibir a expressão de mRNA, mas ainda antagomirs que inibem as funções de microRNA.
[0126] O material hidrofílico na fórmula (5) pode ter um ligante específico alvo ligado a este. O ligante específico alvo tem a propriedade de melhorar a internalização específico de alvo por endocitose mediada por receptor (RME) e pode ser selecionado de entre anticorpos específicos de alvo ou aptâmeros, peptídeos como ligantes específicos ao receptor, e materiais químicos como folato, N-acetilgalactosamina (NAG), e manose. Aqui, a fração de direcionamento é um material que realiza a liberação de um modo específico ao alvo, e não é limitado apenas pelo anticorpo descrito acima, aptâmero, peptídeo e materiais químicos.
[0127] No conjugado da presente invenção, o ASO preferencialmente compreende 10-50 oligonucleotídeos, mais preferencialmente 13-25 oligonucleotídeos.
[0128] Para melhorar a estabilidade in vivo, o ASO inclui oligodeoxinucleotídeos (ODNs) obtidos por várias modificações que provêm resistência a nuclease. A modificação pode ser uma ou uma combinação de duas ou mais selecionadas de entre a substituição de um grupo -OH na posição de carbono 2’ da fração de açúcar de um ou mais nucleotídeos com -CH3 (metil), -OCH3,- NH2,-F (flúor), -O-2-metoxietil, -O-propil, -O-2-metiltioetil, - O-3-aminopropil, -O-3-dimetilaminopropil, -O-N-metilacetamido ou -O-dimetilamidoxietil; a substituição de oxigênio da fração de açúcar do nucleotídeo com enxofre; modificação da ligação entre os nucleotídeos em uma ligação fosforotioato, boranofosfofato ou metil fosfonato. Alternativamente, a modificação pode ser modificação na forma de PNA (ácido nucleico peptídico) ou LNA (ácido nucleico bloqueado).
[0129] Um ASO que pode ser usado na presente invenção não é especificamente limitado e pode ser um ASO para qualquer gene que é usado ou pode ser usado para terapia gênica ou pesquisa.
[0130] Será óbvio para os especialistas na técnica que ASOs que são usados na presente invenção incluem, entre outros, um ASO tendo um pareamento perfeito com o mRNA alvo, mas ainda um ASO que pareia errado com o mRNA alvo para inibir a tradução do mRNA.
[0131] O material hidrofílico preferencialmente tem um peso molecular de 200-10.000, mais preferencialmente 1.000-2.000. Ainda, o material hidrofílico é preferencialmente um composto polímero catiônico ou não iônico.
[0132] Por exemplo, o polímero hidrofílico composto que é usado na presente invenção é preferencialmente um polímero hidrofílico não iônico composto como PEG (polietileno), polivinilpirrolidona ou polioxazolina, mas não é limitado a este.
[0133] O material hidrofílico pode, se necessário, ser modificado para ter um grupo funcional requerido para ligar aos outros materiais. Entre os materiais hidrofílicos, particularmente polietilenoglicol (PEG) pode ter vários pesos moleculares e grupos funcionais, ter boa biocompatibilidade, não induz resposta imune, aumenta a estabilidade in vivo de ASO, e aumenta a eficiência de liberação do ASO, e, assim, este é muito apropriado para a preparação do conjugado inventivo.
[0134] Além disso, o material hidrofóbico preferencialmente tem um peso molecular de 250-1.000. Particularmente, o material hidrofóbico que é usado na presente invenção pode preferencialmente ser um derivado esteroide, um derivado de glicerídeo, éter de glicerol, polipropileno glicol, um hidrocarboneto C12-C50 saturado ou insaturado, diacil fosfatidilcolina, ácido graxo, fosfolipídeo, lipopoliamina ou semelhantes, mas não é limitado a estes, e será óbvio aos especialistas na técnica que qualquer material hidrofóbico apropriado para a finalidade da presente invenção pode ser usado.
[0135] Particularmente, o derivado de esteroide pode ser selecionado do grupo que consiste em colesterol, colestanol, ácido cólico, colesteril formato, colestanil formato, e colestanil amina, e o derivado de glicerídeo pode ser selecionado de entre mono-, di- e triglicerídeos, em que o ácido graxo do glicerídeo pode ser um ácido graxo C12-C50 saturado ou insaturado.
[0136] O material hidrofóbico funciona para causar uma interação hidrofóbica para formar uma nanopartícula. Entre os materiais hidrofóbicos, particularmente uma cadeia de carbono ou colesterol é muito apropriada para a preparação do conjugado da presente invenção, porque esta pode ser facilmente ligada na etapa de preparação de um ASO.
[0137] Ainda, a ligação covalente indicada por X ou Y pode ser uma ligação não degradável ou uma ligação degradável. Aqui, as ligações não degradáveis incluem, entre outras, uma ligação amida ou uma ligação fosfato, e as ligações degradáveis incluem, entre outras, uma ligação dissulfeto, uma ligação degradável ao ácido, uma ligação éster, uma ligação anidreto, uma ligação biodegradável ou uma ligação enzimaticamente degradável.
[0138] Um conjugado ASO-polímero de acordo com a presente invenção pode ter uma estrutura em que um material hidrofílico é ligado a uma das extremidades 5’ e 3’ de um ASO e a material hidrofóbico é ligado à outra extremidade.
[0139] Um método para preparar o conjugado ASO-polímero tendo o material hidrofílico ligado à extremidade 3’ do ASO pode compreender as etapas de:
[0140] ( a) covalentemente ligar um material hidrofílico à um suporte sólido;
[0141] (b) sintetizar um ASO no suporte sólido compreendendo o material hidrofílico;
[0142] ( c) covalentemente ligar um material hidrofóbico à extremidade 5’ do ASO no suporte sólido; e
[0143] (d) separar e purificar o conjugado ASO-polímero resultante a partir do suporte sólido.
[0144] Em uma modalidade mais preferencial, o conjugado ASO- polímero é preparado por um método compreendendo as etapas de: covalentemente ligar um material hidrofílico à um suporte sólido (vidro de poro controlado (CPG)); sintetizar um ASO no suporte sólido (CPG), que tem o material hidrofílico covalentemente ligado a esta, por desbloqueio, acoplamento, capeamento e oxidação; e covalentemente ligar um material hidrofóbico à extremidade 5’ do ASO. Após conclusão da preparação do conjugado ASO-polímero, o conjugado ASO-polímero é separado a partir do suporte sólido (CPG) tratando este com 28%(v/v) amônia em banho- maria a 60°C, e o conjugado ASO-polímero pode ser separado e purificado a partir dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), após o qual o peso molecular pode ser medido por espectrômetro de massa MALDI-TOF para determinar se o conjugado ASO-polímero desejado foi preparado.
[0145] Em outro aspecto, um método para preparar um conjugado ASO-polímero compreendendo um material hidrofílico ligado à extremidade 5’ de um ASO compreende as etapas de:
[0146] ( a) sintetizar um ASO em um suporte sólido tendo um grupo funcional ligado a este;
[0147] (b) covalentemente ligar um material hidrofílico à extremidade 5’ do ASO;
[0148] ( c) separar o conjugado ASO ligado ao material hidrofílico a partir do suporte sólido; e
[0149] (d) covalentemente ligar um material hidrofóbico à extremidade 3’ do ASO separado a partir do suporte sólido.
[0150] Em uma modalidade mais preferencial, o método de preparação compreende as etapas de: sintetizar um ASO em um suporte sólido (CPG) tendo um grupo funcional ligado a este; covalentemente ligar um material hidrofílico à extremidade 5’ do ASO; tratar o sólido resultante com 28 %(v/v) amônia em banho- maria a 60°C para separar o conjugado de ASO-polímero hidrofílico ligado ao grupo funcional a partir do suporte sólido (CPG); e fixar um material hidrofóbico ao ASO via o grupo funcional para formar um conjugado ASO-polímero compreendendo o material hidrofílico e material hidrofóbico ligado a ambas as extremidades do ASO. Quando a preparação do conjugado ASO- polímero foi completada, o conjugado ASO-polímero pode ser separado e purificado a partir dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), após a qual o peso molecular pode ser medido pelo espectrômetro de massa MALDI-TOF para determinar se o conjugado ASO-polímero desejado foi preparado.
[0151] Ent retanto, o conjugado ASO-polímero pode ainda compreender um ligante ligado ao material hidrofílico.
[0152] Um método para ligar um ligante ao material hidrofílico é determinado de acordo com o tipo de grupo funcional ligado ao ligante. Por exemplo, um ligante-fosforamidita tendo fosforamidita como um grupo funcional pode ser ligado ao material hidrofílico da mesma forma que o processo de síntese de ASO, e um ligante tendo N-Hidroxisuccinimida (NHS) ligado a este pode ser ligado ao material hidrofílico por uma ligação éster de N-Hidroxisuccinimida (NHS).
[0153] Um método para preparar um conjugado ASO-polímero compreendendo um material hidrofílico ligado à extremidade 3’ de um ASO compreende as etapas de:
[0154] ( a) ligar um material hidrofílico à um suporte sólido tendo um grupo funcional ligado a este;
[0155] (b) sintetizar um ASO no suporte sólido tendo o grupo funcional-material hidrofílico ligado a esta;
[0156] ( c) covalentemente ligar um material hidrofóbico à extremidade 5’ do ASO;
[0157] (d) separar um conjugado ASO-polímero, obtido na etapa (c), a partir do suporte sólido; e
[0158] (e) ligar um ligante ao material hidrofílico do conjugado ASO-polímero separado a partir do suporte sólido.
[0159] Em uma modalidade mais preferencial, o método de preparação compreende as etapas de: ligar um polímero hidrofílico à um suporte sólido tendo um grupo funcional ligado a este; sintetizar um ASO no suporte sólido (CPG) tendo o grupo funcional-material hidrofílico ligado a esta; covalentemente ligar um material hidrofóbico ao grupo de extremidade do ASO; separar o conjugado grupo funcional-ASO-polímero resultante a partir do suporte sólido (CPG); e ligar um ligante à extremidade do polímero hidrofílico pelo grupo funcional, assim, preparando um conjugado ASO-polímero ligado ao ligante. Quando a preparação do conjugado ASO-polímero ligado ao ligante foi completada, o conjugado ASO-polímero pode ser separado e purificado a partir dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), após o qual o peso molecular pode ser medido pelo espectrômetro de massa MALDI-TOF para determinar se o conjugado ASO-polímero ligado ao ligante foi preparado.
[0160] Em outro aspecto, um método para preparar um conjugado ASO-polímero compreendendo a ligante ligado a um conjugado ASO- polímero tendo um material hidrofílico ligado à extremidade 5’ de um ASO compreende as etapas de:
[0161] ( a) sintetizar um ASO em um suporte sólido tendo um grupo funcional ligado a este;
[0162] (b) covalentemente ligar um material hidrofílico à extremidade do ASO;
[0163] ( c) covalentemente ligar um ligante ao conjugado ASO- material hidrofílico;
[0164] (d) separar um conjugado ASO-material hidrofílico-ligante, que tem o grupo funcional ligado a este, a partir do suporte sólido; e
[0165] (e) covalentemente ligar um material hidrofóbico à extremidade 3’ do ASO do conjugado separado do conjugado sólido.
[0166] Em uma modalidade mais preferencial, o método de preparação compreende as etapas de: sintetizar um ASO em um suporte sólido (CPG) tendo um grupo funcional ligado a este; covalentemente ligar um material hidrofílico ao grupo de extremidade do ASO; covalentemente ligar um ligante ao ASO- polímero hidrofílico; separar o conjugado ASO-polímero hidrofílico-ligante ligado ao grupo funcional a partir do suporte sólido (CPG); e ligar um material hidrofóbico ao conjugado separado pelo grupo funcional, para assim sintetizar um conjugado ASO-polímero ligado ao ligante tendo o material hidrofóbico ligado à extremidade oposta do polímero hidrofílico. Quando a preparação do conjugado ASO-polímero ligado ao ligante foi completada, o conjugado ASO-polímero pode ser separado e purificado a partir dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), após o qual o peso molecular pode ser medido pelo espectrômetro de massa MALDI-TOF para determinar se o conjugado ASO-polímero ligado ao ligante foi preparado.
[0167] Como resultado, o conjugado ASO-polímero sintetizado na presente invenção compreende ambos materiais hidrofóbicos e hidrofílicos, e assim, é anfifílico em natureza. A fração hidrofílica tende a sair por interação (como uma ligação hidrogênio) com moléculas de água in vivo, e o material hidrofóbico tende a entrar por interação hidrofóbica, e assim, uma nanopartícula termodinamicamente estável é formada. Em outras palavras, uma nanopartícula é formada em que o material hidrofóbico é localizado no centro da nanopartícula e o material hidrofílico está localizado fora do ASO para proteger o ASO (ver A FIG. 18). A nanopartícula formada como descrito acima melhora a liberação intracelular do ASO e pode ser usada para o tratamento de doenças. Síntese do conjugado e as características, eficiência de liberação intracelular e efeitos do conjugado serão descritos em outros detalhes nos Exemplos abaixo.
[0168] Além disso, a presente invenção provê um método de terapia gênica compreendendo as etapas de: preparar uma nanopartícula composta dos conjugados ASO-polímero; e liberar o ASO in vitro pela nanopartícula. O método de terapia gênica não é limitado à aplicação in vitro.
[0169] A presente invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva do conjugado ASO-polímero ou uma nanopartícula composta do conjugado ASO-polímero ligado ao ligante.
[0170] Para administração, a composição da presente invenção pode compreender, além do ingrediente ativo descrito acima, pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. O carreador farmaceuticamente aceitável que pode ser usado na presente invenção deve ser compatível com o ingrediente ativo da presente invenção e pode ser salina fisiológica, água estéril, solução de Ringer, salina tamponada, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol, ou uma mistura de dois ou mais destes. Além disso, a composição da presente invenção pode, se necessário, compreender outros aditivos convencionais, incluindo antioxidantes, tampões, e agentes bacteriostáticos. Ainda, a composição da presente invenção pode ser formulada como formas injetáveis como soluções aquosas, suspensões, ou emulsões com a ajuda de diluentes, dispersantes, surfactantes, ligantes e lubrificantes. Particularmente, a composição da presente invenção é preferencialmente fornecida como uma formulação liofilizada. Para preparação das formulações liofilizadas, qualquer método convencional conhecido na técnica pode ser usado, e um estabilizador para liofilização pode ainda ser adicionado.
[0171] Além disso, a composição da presente invenção pode ser formulada em formas de dosagens apropriadas dependendo do tipo de doença ou componente de acordo com um método conhecido na técnica ou o método revelado em Remington's pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA).
[0172] A dosagem da composição farmacêutica da presente invenção pode ser determinada pelos especialistas na técnica dependendo das condições do paciente e a gravidade da doença. Além disso, a composição da presente invenção pode ser formulada na forma de pós, comprimidos, cápsulas, líquido, soluções de injeção, pomadas, e xaropes, e pode ser fornecida em formas de dosagem unitárias ou formas de múltiplas dosagens, por exemplo, ampolas ou frascos vedados.
[0173] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada oralmente ou via parenteral. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada por várias vias, incluindo, entre outras, via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intradural, intracardíaca, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, gastrointestinal, sublingual, e local. A dose da composição da presente invenção pode variar dependendo de vários fatores, como peso corporal do paciente, idade, sexo, condição de saúde e dieta, o tempo e método de administração, taxa de excreção, e gravidade de uma doença, e pode ser facilmente determinado por uma pessoa especialista na técnica.
EXEMPLOS
[0174] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos exemplos. Será claro a uma pessoa com conhecimento comum na técnica que estes exemplos são para fins ilustrativos apenas e não devem ser interpretados como limitantes ao escopo da presente invenção.
Exemplo 1: Preparação de ligante material que pode ser ligado
[0175] Para preparar uma estrutura oligo RNA dupla hélice tendo um ligante ligado a esta, um material ligante que pode ser ligado à estrutura oligo RNA dupla hélice foi preparado.
[0176] Exemplo1-1:Preparaçãodereagente1-hexa(etilenoglicol)- N-acetilgalactosamina-fosforamidita(compostoA,BeC)
[0177] Para ligar N-acetil galactosamina (NAG) à uma estrutura oligo RNA dupla hélice, 1-hexa(etilenoglicol)-NAG-fosforamidita foi preparado como mostrado no seguinte esquema de reação 1. Esquema de reação 1
Figure img0006
Exemplo 1-1-1: Preparação de 1,3,4,6-tetraacetil-NAG(composto A)
[0178] O material de partida cloridrato galactosamina (Sigma Aldrich, USA) (2g, 9,27 mmol), acetonitrila (Samjeon, Coreia) (31 m£) e trietilamina (Sigma Aldrich, USA)(15,42 m£, 111,24 mmol) foram misturados com cada outro e refluxados por 1 hora. A mistura foi resfriada lentamente até temperatura ambiente e resfriada a 0°C usando água gelada, e então anidreto acético (Sigma Aldrich, USA)(8,76 m£, 92,70 mmol) foi adicionado sob gotejamento por 10 minutos. Então a água gelada foi removida e o material restante foi agitado em temperatura ambiente por 24 horas. Após conclusão da reação, uma solução aquosa de bicarbonato de sódio (Samjeon, Coreia) foi adicionado lentamente para o produto de reação até que o pH ficasse neutro. Após o pH ficar neutro, a solução de reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas, e o sólido produzido foi filtrado. O filtrado foi lavado sequencialmente com acetato de etila (Samjeon, Coreia) (100 m£ x 2), água destilada (100 m£ x 2) e acetato de etila (100 m£ x 1). O sólido foi liofilizado para gera 1,3,4,6-tetraacetil-N-acetil galactosamina (1,82g, 52,3%) (ver a FIG. 3).
Exemplo 1-1-2: Preparação de 3,4,6-triacetil-1-hexa(etilenoglicol)-NAG (composto B)
[0179] O 1,3,4,6 -tetraacetil-N-acetil galactosamina (1,81g, 4,82 mmol) preparado no Exemplo 1-1-1, cloreto de ferro III (Sigma Aldrich, USA)(1,02g, 6,27 mmol) e cloreto de metileno (Samjeon, Coreia)(48 m£) foram misturados com cada outro e agitada em temperatura ambiente por 10 minutos. Então hexa(etilenoglicol)(Sigma Aldrich, USA)(1,58 m£, 4,82 mmol) foi adicionada à mistura, seguido por refluxo por 2 horas. Após conclusão da reação, a solução de reação foi filtrada por celite (Sigma Aldrich, USA), e o filtrado foi lavado com cloreto de metileno (50 m£ x 2). O filtrado foi concentrado em pressão reduzida e adicionado ao acetato de etila (100 m£) e água destilada (100 m£), e a camada aquosa foi coletada. A camada aquosa coletada foi extraída com cloreto de metileno (100 m£ x 3), e a camada orgânica foi coletada, seca com sulfato de magnésio anidro (Samjeon, Coreia) e filtrada. O filtrado foi concentrado em pressão reduzida e seco em vácuo, assim obtendo 3,4,6-triacetil-1-hexa(etilenoglicol)-N-acetil galactosamina (2,24g, 74,9%) (ver A FIG. 4).
Exemplo 1-1-3: Preparação de 1-hexa(etilenoglicol)-NAG-fosforamidita (composto C)
[0180] O composto (2,22g, 3,71 mmol) obtido no Exemplo 1-1-2, cloreto de metileno (37 m£) e trietilamina (0,94 m£, 6,75 mmol) foram misturados com cada outro e agitado em temperatura ambiente por 10 minutos. Então, 2-cianoetil N,N- diisopropilclorofosforamidita (Sigma Aldrich, USA)(0,75 m£, 3,38 mmol) foi adicionado à mistura e agitado por 45 minutos. Após conclusão da reação, a solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e acetato de etila (100 m^) e água destilada (100 m£) foram adicionados a esta. A camada orgânica foi coletada, seca com sulfato de magnésio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado em pressão reduzida e purificado por cromatografia em coluna, assim obtendo 1-hexa(etilenoglicol)-N- acetil galactosamina-fosforamidita (1,14g, 42,2%)(ver a FIG. 5).
Exemplo 1-2: Preparação de NHS-folato
[0181] Para ligar folato à uma estrutura oligo RNA dupla hélice, NHS-folato foi preparado como mostrado no seguinte esquema de reação 2:
[0182] Esquemadereação2
Figure img0007
[0183] O material de partida ácido fólico (Sigma Aldrich, USA)(3g, 6,8 mmol), dimetil sulfóxido (Sigma Aldrich, USA)(60 m£), N-hidroxisuccinimida (Sigma Aldrich, USA)(0,86g, 7,5 mmol) e 1,3-dicyclohexylcarbodiimida (Sigma Aldrich, USA)(1,54g, 7,5 mmol) foram misturados com cada outro e agitados em temperatura ambiente por 18 horas. Após conclusão da reação, a mistura de reação foi adicionada sob gotejamento a 950ml de uma mistura 3:5 de acetato de etila: n-hexano (Samjeon, Coreia) por 10 minutos, e o sólido produzido NHS-folato (3,79g) foi filtrado (Robert J. Lee e Philip S. Low (1994) J. Biological Chemistry. 269: 31983204).
Exemplo 1-3: Preparação de peptídeo
[0184] Devido ao fato de compostos peptídicos incluírem α- aminoácido, uma relação de ligação entre um derivado de peptídeo tendo esta estrutura e o grupo funcional amina de PEG foi realizada. Nesta reação de ligação, os grupos funcionais amina presentes em PEG e o derivado de peptídeo interage com cada outro durante a reação de ligação com o ácido carboxílico do peptídeo, e por esta razão, um processo para substituir o grupo funcional amina do composto peptídico com um grupo de proteção foi requerido antes da reação de ligação. O grupo amina do composto peptídico foi substituído com um grupo de proteção 9- fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) ou tert-butiloxicarbonil (t- BOC) para remover sua reatividade com o ácido carboxílico do peptídeo, assim, preparando um composto peptídico capaz de ligar ao PEG.
Exemplo2:PreparaçãodeestruturaoligoRNAduplahélicetendo ligante ligado à extremidade 5’
[0185] O material ligante preparado no Exemplo 1 pode ser construído na forma de fosforamidita como a NAG-fosforamidita do Exemplo 1-1 de modo que este pode ser ligado à extremidade de PEG por um processo geral de síntese de oligo químico (que consiste em desbloquear, acoplar, capear e oxidar). Alternativamente, este pode ser construído na forma de NHS- ligante como o NHS-folato de Exemplo 1-2 de modo que este pode ser ligado a PEG ligado a amina por uma ligação éster, para assim sintetizar uma estrutura PEG-RNA tendo o ligante ligado à extremidade 5’ do RNA. A estrutura PEG-RNA sintetizada tendo o ligante ligado à extremidade 5’ foi recozido com uma estrutura complementar 5‘ C24-RNA tendo um grupo hidrofóbico ligado a esta, para assim sintetizar a estrutura oligo RNA dupla hélice tendo o ligante ligado à extremidade 5’.
Exemplo 2-1: Preparação de oligo RNA dupla hélice
[0186] Nos seguintes exemplos, um oligo RNA dupla hélice contra survivina foi usado para inibir survivina. Survivina é uma proteína que é expressa comumente na maioria dos tumores ou linhagens de células mutantes até o momento e é esperado que seja um importante alvo em terapia anticâncer (Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov;35(7):553-62). A survivina oligo RNA dupla hélice de acordo com a presente invenção consiste em uma fita senso estabelecida na SEQ ID NO: 1 e uma fita antissenso complementar a esta, e um nucleotídeo oligo de fita dupla que é usado como um controle de uma fita senso estabelecida na SEQ ID NO: 2 e uma fita antissenso complementar a esta. O oligo RNA dupla hélice usado neste exemplo consiste na seguinte sequência de nucleotídeo. (SEQ ID NO: 1) 5‘-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3‘ (SEQ ID NO: 2) 5‘-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3‘
[0187] Para sintetizar o oligo RNA dupla hélice, o RNA de fita simples foi sintetizado ligando nucleotídeos por ligações fosfodiéster da estrutura de RNA usando β-cianoetil fosforamidita protegido por tert-butildimetilsilil (Polymer support oligonucleotide synthesis: use of β-cyanoethyl-N,N- dialkylamine-/N-morpholine fosforamidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11): 4539-57).
[0188] No processo de síntese, um ciclo que consiste em desbloquear, acoplar, capear e oxidar foi repetido um suporte sólido tendo um nucleosídeo ligado a este, assim obtendo uma sequência de RNA desejada. O processo para sintetizar o RNA de fita simples foi realizado usando um sintetizador de RNA (384 Synthesizer, BIONEER, Coreia)(ver a FIG. 6).
Exemplo 2-2: Preparação de estrutura de 5‘ PEG-RNA
[0189] O RNA sintetizado no Exemplo 2-1 foi reagido com um reagente PEG fosforamidita de acordo com um processo de síntese de RNA geral, assim preparando uma estrutura 5‘ PEG-RNA (ver a FIG. 7). Exemplo2-3:SíntesedePEG-RNAtendoliganteligadoà extremidade 5’ Exemplo2-3-1:PreparaçãodeestruturaNAG-PEG-RNAusandoN- acetilgalactosamina(NAG)fosforamidita
[0190] A estrutura 5‘ PEG-RNA sintetizada no Exemplo 2-2 foi reagida com o reagente NAG fosforamidita (sintetizado no Exemplo 1-1) de acordo com um processo geral de síntese de RNA para ligar N-acetil galactosamina (NAG) à estrutura PEG-RNA por uma ligação fosfodiéster. O ligante N-acetil galactosamina pode prover uma ou mais moléculas de N-acetil galactosamina para PEG usando um ligante dendrímero.
Exemplo 2-3-1-1: Preparação de estrutura mono NAG-PEG-RNA
[0191] A estrutura PEG-RNA sintetizada no Exemplo 2-2 foi reagida com o reagente NAG fosforamidita (sintetizado no Exemplo 1-1) de acordo com um processo geral de síntese de RNA para ligar N- acetil galactosamina (NAG) à estrutura PEG-RNA por uma ligação fosfodiéster, assim sintetizando uma estrutura 5‘ mono-NAG-PEG RNA (ver a FIG. 8).
Exemplo 2-3-1-2: Preparação de estrutura tripla NAG-PEG-RNA
[0192] A estrutura PEG-RNA sintetizada no Exemplo 2-2 foi reagida com um reagente dendrímero fosforamidita (Trebler Fosforamidite, Glen research, USA), e então reagida com o reagente NAG fosforamidita (sintetizado no Exemplo 1-1) de acordo com um processo geral de síntese de RNA para ligar três NAGs à estrutura PEG-RNA via ligações fosfodiéster, para assim sintetizar uma estrutura 5‘ tripla-NAG-PEG-RNA (ver A FIG. 9).
Exemplo 2-3-2: Preparação de estrutura folato-PEG-RNA
[0193] A estrutura de PEG-RNA sintetizada no Exemplo 2-2 foi reagida com um reagente amina fosforamidita de acordo com um processo geral de síntese de RNA para ligar um grupo amina à estrutura PEG-RNA via uma ligação fosfodiéster, para assim sintetizar uma estrutura amina-PEG-RNA. A estrutura amina-PEG- RNA sintetizada foi ligada com o NHS-folato (sintetizado no Exemplo 1-2) via uma ligação éster para sintetizar uma estrutura 5‘ folato-PEG-RNA (ver A FIG. 10).
Exemplo2-3-3:Preparaçãodeestruturapeptídeo-PEG-RNApor modificaçãodeaminaecompostopeptídico
[0194] A reação de ligação entre o grupo carboxil do composto peptídico protegido preparado no Exemplo 1-3 e o grupo amina de PEG da estrutura amina-PEG-RNA preparada no Exemplo 2-3-2 foi realizada usando BOP (benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)- fosfônio hexafluorofosfato) (Sigma Aldrich, USA) e HOBT (1- hidroxibenzotriazol)(Sigma Aldrich, USA). Após a reação de ligação, o produto de reação foi tratado com piperidina (Sigma Aldrich, USA) para remover o grupo de proteção, assim preparando uma estrutura 5‘ peptídeo-PEG-oligo RNA dupla hélice.
Exemplo 2-4: Preparação de estrutura 5‘ C24-RNA
[0195] Uma estrutura de RNA complementar à sequência de RNA da estrutura 5’ ligante-PEG-oligo RNA de fita dupla do Exemplo 2-3 foi sintetizado pelo método de síntese de RNA do Exemplo 2-1, e então tratada com um reagente C24 tetradocosano contendo uma ligação dissulfeto de acordo com um processo geral de síntese de RNA para ligar C24 à estrutura de RNA por uma ligação fosfodiéster, assim sintetizar uma estrutura 5‘ C24-RNA (ver a FIG. 11).
Exemplo: 2-5: Recuperação e recozimento
[0196] Cada um de RNA de fita simples sintetizado nos Exemplos 21, 2-2, 2-3 e 2-4 foi tratado com 28% (v/v) amônia em banho- maria a 60°C para separar os RNAs sintetizados e estruturas de RNA a partir de CPGs, seguido por desproteção. As estruturas de 5’ ligante-PEG-RNA de fita dupla desprotegidas e estruturas 5‘ C24-oligo RNA de fita dupla foram tratadas com uma mistura de 10:3:4 (v/v/v) de N-metilpirrolidona, trietilamina e trietilamina trihidrofluoreto em um forno a 70°C para remover 2‘TBDMS (tert-butildimetilsilil).
[0197] Os RNAs foram separados a partir dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) para separar os RNAs, e os pesos moleculares de RNAs foram medidos por MALDI-TOF MS (SHIMADZU, Japão) para determinar se os RNAs foram consistentes com as sequências de nucleotídeo desejadas e estruturas de oligo RNA dupla hélice.
[0198] Em seguida, para preparar uma estrutura oligo RNA dupla hélice tendo um ligante ligado a esta, o RNA senso PEG-RNA ligado ao ligante e RNA antissenso foram misturados com cada outro na mesma quantidade, e a mistura foi adicionada para 1X tampão de recozimento (30 mM HEPES, 100 mM Acetato de potássio, 2 mM Acetato de magnésio, pH 7,0 a 7,5) e deixado reagir em um banho-maria em temperatura constante a 90°C por 3 minutos, e então deixado reagir a 37°C, assim preparando uma estrutura oligo RNA dupla hélice desejada tendo um ligante ligado à extremidade 5’ de cada uma das fitas. O oligo RNA dupla hélice preparado tendo o ligante ligado à extremidade 5’ foi submetido à eletroforese para confirmar o recozimento das fitas.
Exemplo3:PreparaçãodeestruturaoligoRNAduplahélicetendo ligante ligado à extremidade 3’
[0199] Amina-CPG foi sintetizada em 3' amina-PEG-RNA usando um reagente PEG fosforamidita, e então ligado com NHS-ligante como NHS-folato do Exemplo 1-2 via uma ligação éster, para assim sintetizar uma estrutura PEG-oligo RNA de fita dupla tendo um ligante ligado à extremidade 3’. A estrutura de PEG-oligo RNA de fita dupla sintetizada tendo um ligante ligado à extremidade 3’ foi ligada com o material hidrofóbico C24 para formar PEG-RNA-C24 tendo um ligante ligado à extremidade 3’. O PEG-RNA-C24 foi recozido com um RNA complementar para sintetizar a estrutura oligo RNA dupla hélice tendo um ligante ligado à extremidade 3’.
Exemplo 3-1: Preparação de estrutura 3‘ amina-PEG-RNA
[0200] Amina-CPG foi tratada com um reagente polietilenoglicol fosforamidita de acordo com um processo geral de síntese de RNA para sintetizar 3‘ CPG-amina-PEG. O 3‘ CPG-amina-PEG foi sintetizado em uma estrutura 3‘ CPG-amina-PEG-RNA tendo uma sequência de RNA desejada de acordo com o processo de síntese de RNA do Exemplo 2-1 (ver A FIG. 12).
Exemplo3-2:Preparaçãodeestrutura3‘amina-PEGRNA-C24
[0201] A estrutura 3‘ CPG-amina-PEG-RNA sintetizada no Exemplo 31 foi tratada com um reagente C24 tetradocosano contendo uma ligação dissulfeto de acordo com um processo geral de síntese de RNA para ligar C24 ao RNA via uma ligação fosfodiéster, para assim sintetizar uma estrutura 3‘ amina-PEG RNA-C24 (ver a FIG. 13).
Exemplo3-3:PreparaçãodeestruturaPEGRNA-C24tendoligante ligadoàextremidade3’
[0202] A estrutura 3’ amina-PEG-RNA-C24 sintetizada no Exemplo 32 foi tratada com 28% amônia em banho-maria a 60°C para separar a estrutura 3‘ amina-PEG-oligo RNA de fita dupla sintetizada e a estrutura 3‘ amina-PEG-RNA-C24 do CPG, seguido por desproteção. A estrutura 3 ‘ amina-PEG-RNA-C24 desprotegida tratada com uma mistura 10:3:4 (v/v/v) de N-metilpirrolidona, trietilamina e trietilamina trihidrofluoreto em um forno a 70°C para remover 2‘ TBDMS (tert-butildimetilsilil). A estrutura 3‘ amina-PEG-RNA-C24 separada foi ligada com um ligante material como NHS-ligante por uma ligação éster, para assim sintetizar uma estrutura PEG-RNA- C24 tendo um ligante ligado à extremidade 3’.
Exemplo 3-3-1: Preparação de estrutura 3‘ folato-PEG-RNA
[0203] A estrutura amina-PEG-RNA-C24 sintetizada no Exemplo 3-2 foi ligada com NHS-folato (sintetizada no Exemplo 1-2) por uma ligação éster para sintetizar uma estrutura 3' folato-PEG-RNA-C24 (FIG. 14).
Exemplo 3-4: Preparação de estrutura de RNA complementar
[0204] Um RNA de fita simples complementar à sequência de estrutura 3’ ligante-PEG-RNA-C24 do Exemplo 3-3 foi sintetizado ao método de síntese de RNA do Exemplo 2-1. Os RNA sintetizados de fita simples foram tratados om 28% amônia em banho-maria a 60°C para separar os RNAs sintetizados do CPG, seguido por desproteção. Os RNAs desprotegidos foram tratados com uma mistura de 10:3:4 (v/v/v) de N-metilpirrolidona, trietilamina e trietilamina trihidrofluoreto em um forno a 70°C para remover 2‘ TBDMS (2‘tert-butildimetilsilil).
Exemplo 3-5: Recozimento
[0205] Os produtos de reação de RNA e 3‘ ligante-PEG RNA-C24 foram separados a partir dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC; LC-20A Prominence, SHIMADZU, Japão), e os pesos moleculares dos materiais separados foram medidos por MALDI TOF-MS (SHIMADZU, Japão) para determinar se foram consistentes com a sequência de nucleotídeo desejada e estrutura 3’ ligante-PEG RNA-C24.
[0206] Em seguida, para preparar estrutura oligo RNA dupla hélice tendo um ligante ligado a esta, o RNA senso PEG-RNA ligado ao ligante e RNA antissenso foram misturados com cada outro na mesma quantidade, e a mistura foi adicionada a 1X tampão de recozimento (30 mM HEPES, 100 mM Acetato de potássio, 2 mM Acetato de magnésio, pH 7,0 a 7,5) e deixado reagir em um banho- maria de temperatura constante a 90°C por 3 minutos, e então deixado reagir a 37°C, assim preparado uma estrutura oligo RNA dupla hélice desejada tendo um ligante ligado à extremidade 3’ de cada uma das fitas. O oligo RNA dupla hélice preparado tendo o ligante ligado à extremidade 3’ foi submetido à eletroforese para confirmar o recozimento das fitas.
Exemplo4:Formaçãodenanopartículascompostasdeestruturasde oligoRNAduplahélicetendoliganteligadoaesta
[0207] As estruturas de oligo RNA dupla hélice tendo o ligante à extremidade 5’, e as estruturas de oligo RNA dupla hélice tendo o ligante à extremidade 3’, sintetizadas no Exemplos 2 e 3, formam uma nanopartícula (ou seja, micela) composta de estruturas de oligo RNA dupla hélice ligadas ao ligante por interações hidrofóbicas entre o material hidrofóbicos ligado às extremidades de oligo RNA dupla hélices (ver A FIG. 1). Medidas de tamanho e concentração de micela (CMC) críticas e análise de microscopia de elétron de transmissão (TEM) para uma nanopartícula composta de 5‘ folato-ligante-oligo RNA de fita dupla sintetizado no Exemplo 2 foram medidas para confirmar a formação de nanopartícula. Exemplo4-1:Mediçãodetamanhodepartículadenanopartícula compostadeestruturas5‘folato-oligoRNAdefitadupla
[0208] O tamanho da nanopartícula foi medido por medição de potencial zeta. Especificamente, as estruturas 5‘ folato-oligo RNA de fita dupla foram dissolvidas em 1,5 m£ DPBS (salina fosfato tamponada de Dulbecco) em uma concentração de 50 μg/m^, e então homogeneizadas com um sonicador (Wiseclean, DAIHAN, Coreia) (700 W; amplitude: 20%). O tamanho de nanopartículas homogeneizadas foi medido com um Zetasizer (Nano-ZS, MALVERN, GB) sob as condições seguintes: índice de refração: 1,459, índice de absorção: 0,001, temperatura de solvente PBS (salina fosfato tamponada: 25°C, viscosidade naquela temperatura: 1,0200; e índice de refração: 1,335. Cada medição consistiu em 20 leituras e foi repetida três vezes.
[0209] Foi demonstrado que nanopartículas (folato-SAMiRNA) composto de estruturas de oligo RNA dupla hélice ligadas ao folato tinham um tamanho de cerca de 100-200 nm. Um valor de índice de polidispersão inferior (PDI) indica uma distribuição mais uniforme das partículas. O valor de PDI de folato-SAMiRNA foi medido sendo menos do que 0,4, sugerindo que nanopartículas tendo um tamanho relativamente uniforme foram formadas. Foi demonstrado que o tamanho das nanopartículas compostas de ditas estruturas é apropriado para absorção em células por endocitose (Nanotoxicology: nanoparticles reconstruct lipids. Nat Nanotechnol. 2009 Feb;4(2):84-5) (ver A FIG. 15(A)).
Exemplo4-2:Mediçãodeconcentraçãodemicelacríticade nanopartículascompostasdeestruturasdeoligoRNAduplahélice
[0210] Um material anfifílico contendo ambos um grupo oleofílico e um grupo hidrofílico na molécula pode atuar como um surfactante. Quando um surfactante é dissolvido em uma solução aquosa, as frações hidrofóbicas entram para evitar contato com a água, e as frações hidrofílicas saem, assim formando uma micela. A concentração em que a micela é primeiro formada é definida como concentração de micela crítica (CMC). Um método para medir a CMC usando um corante fluorescente é baseado em uma alteração rápida na inclinação do gráfico de intensidade de fluorescência de um corante fluorescente antes e depois da formação da micela.
[0211] Para a medição de concentração de micela crítica das nanopartículas compostas das estruturas folato-ligado oligo RNA de fita dupla, 0,04 mM DPH (1,6-Diphenil-1,3,5-hexatrieno, Sigma Aldrich, USA) como um corante fluorescente foi preparado. 1 nmol/μ^' of the 5‘ folato-oligo RNA de fita duplas sintetizado no Exemplo 2 foi diluído com DPBS serialmente de 0, 0977 ^/m£ a 50 μg/m^, assim preparando 180 ^ de cada um de amostras da estrutura 5' folato-oligo RNA de fita dupla. À amostra do preparado, 20 ^ de cada um de 0,04 mM DPH em metanol e metanol isolado como um controle foi adicionado e bem agitado. Em seguida, a homogeneização usando um sonicador (Wiseclean, DAIHAN, Coreia) foi realizada do mesmo modo como descrito no Exemplo 4-1 (700 W; amplitude: 20%). Cada uma das amostras homogeneizadas foi deixada reagir em temperatura ambiente sob uma condição protegida da luz por cerca de 24 horas, e as intensidades de fluorescência (excitação: 355 nm, emissão: 428 nm, leitura superior) foram medidas. Devido ao fato de que as intensidades de fluorescência medidas foram usadas para determinar a intensidade de fluorescência relativa, a intensidade de fluorescência relativa ([intensidade de fluorescência de amostra contendo DPH]-[intensidade de fluorescência da amostra contendo metanol isolado]) na mesma concentração foi calculada e graficamente mostrada no eixo Y como uma função do valor de log de concentração de estruturas 5 ‘ folato-oligo RNA de fita dupla (eixo X) (ver a FIG. 15(B)).
[0212] As intensidades de fluorescência medidas em várias concentrações aumentam conforme a concentração aumenta, e o ponto no qual a concentração aumenta rapidamente é a concentração CMC. Assim, as regiões de baixa concentração em que a fluorescência não aumentou e a região em alta concentração em que a intensidade de fluorescência aumentou foram divididas em vários pontos para desenhar linhas de tendência, e o valor do eixo X em que as duas linhas de tendência cruzaram com cada outra foi determinado de acordo com a concentração CMC (FIG. 15(B)). A CMC medida da estrutura folato-oligo RNA de fita dupla foi muito baixa (1,33 μg/m^), sugerindo que Folato-SAMiRNA pode facilmente formar micelas em uma concentração muito baixa.
Exemplo4-3:ObservaçãodeestruturaoligoRNAduplahélicepor microscópioeletrônicodetransmissão(TEM)
[0213] A morfologia de nanopartículas formada das estruturas folato-oligo RNA de fita dupla foi observada por um microscópio eletrônico de transmissão (TEM).
[0214] Especificamente, as estruturas de folato-oligo RNA de fita dupla foram dissolvidas em DPBS (salina fosfato tamponada de Dulbecco) em uma concentração de 100 μg/m^, e então homogeneizadas com um sonicador (Wiseclean, DAIHAN, Coreia) (700 W; amplitude: 20%). As nanopartículas formadas das estruturas de folato-oligo RNA de fita dupla foram observadas por coloração negativa com um material tendo alta densidade de elétron. As nanopartículas observadas pelo microscópio eletrônico de transmissão (TEM) tiveram um tamanho semelhante ao tamanho da nanopartícula medida no Exemplo 4-1, sugerindo que as nanopartículas foram facilmente formadas.
Exemplo 5: Liberação in vitro de estruturas ligante-ligado RNAde fita dupla
[0215] Para avaliar se as nanopartículas (folato-SAMiRNA) compostas das estruturas 5‘ folato-oligo RNA de fita dupla sintetizadas no Exemplo 2 mostram efeitos melhorados de oligo RNA dupla hélice in vitro, a linhagem celular KB que super expresso o receptor de folato foi cultivada na presença ou ausência de folato sem transfecção. Como um resultado, foi demonstrado que o ligante ligado melhorou a eficiência de liberação intracelular de SAMiRNA e que SAMiRNA apresentou o efeito de inibir a expressão do gene alvo.
Exemplo 5-1: Cultura de linhagem de célula tumoral
[0216] A linhagem de célula de carcinoma epitelial oral (KB) adquirida de American type Culture Collection (ATCC) foi cultivada em meio RPMI-1640 isento de folato (Gibco, USA) suplementado com 10%(v/v) FBS, 100 unidades/m^penicilina e 100 ^g/m^ estreptomicina, sob as condições de 37°C e 5%(v/v) CO2.
Exemplo5-2:Transfecçãodelinhagemdecélulatumoralcom folato-SAMiRNA
[0217] As células tumorais (1,3 x 105 células/poço) cultivadas no Exemplo 5-1 foram cultivadas em um meio RPMI-1640 isento de folato em uma placa de 6 poços por 18 horas sob as condições descritas no Exemplo 5-1, e então o meio foi removido e a mesma quantidade de meio Opti-MEM foi adicionada a cada poço.
[0218] Nanopartículas (SAMiRNA-Sur) compostas de estruturas de oligo RNA dupla hélice compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 1 que inibe a expressão do gene alvo survivina, nanopartículas (SAMiRNA-Con) compostas de estruturas de oligo RNA dupla hélice- polímero compreendendo uma sequência de controle de SEQ ID NO: 2, e nanopartículas (Folato-SAMiRNA-Sur) compostas de estruturas de folato ligante-ligado oligo RNA de fita dupla compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 1, foram dissolvidas em DPBS em uma concentração de 50 ^/m£ de acordo com o mesmo método como descrito no Exemplo 4-1, e foram homogeneizadas por sonicação, assim obtendo nanopartículas homogeneizadas compostas de cada uma das estruturas.
[0219] Para formar uma condição em que uma quantidade excessiva de folato em meio Opti-MEM, folato foi adicionalmente adicionado ao meio para formar uma condição contendo 1 mM folato e uma condição à qual folato não foi adicionalmente adicionado. Então, as células foram tratadas com 200 nM de cada uma das amostras e cultivadas sob as condições de 37°C e 5%(v/v) CO2 por 48 horas.
Exemplo5-3:AnálisequantitativarelativademRNAdegene survivina
[0220] RNA total foi extraído de linhagem celular transfectada do Exemplo 5-2 e sintetizado em cDNA, e então o nível de expressão relativa de survivina foi quantificado em PCR de tempo real de acordo com o método descrito na Patente Coreana Laid-Open Publicação No. 2009-0042297.
[0221] SAMiRNA-Con é um grupo teste tratado com nanopartículas compostas de estruturas de oligo RNA dupla hélice compreendendo uma sequência de controle de SEQ ID NO: 2, e SAMiRNA-Sur é um grupo de teste tratado com nanopartículas compostas de estruturas oligo RNA de dupla hélice compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 1 (sequência de survivina). Folato-SAMiRNA-Sur é um grupo de teste tratado com nanopartículas compostas de estruturas folato-oligo RNA de fita dupla compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 1 (sequência de survivina).
[0222] O grau de inibição da expressão de mRNA alvo foi o nível de expressão do gene alvo no grupo teste tratado com cada um de SAMiRNA-Sur e Folato-SAMiRNA-Sur em relação ao nível de expressão do gene alvo no grupo de teste tratado com SAMiRNA-Con e foi determinado por quantificação comparativa (ver FIG. 16).
[0223] Quando uma quantidade em excesso estava presente no meio, pode ser observado que o receptor de folato na linhagem celular KB foi saturado com uma quantidade excessiva de folato, e assim, o efeito de promover a internalização intracelular pelo ligante folato ligado a SAMiRNA foi mascarado, sugerindo que o ligante folato influencia a eficiência de liberação intracelular de SAMiRNA para desempenhar um papel crítico na inibição de expressão de mRNA do gene alvo.
[0224] No caso do grupo tratado com SAMiRNA-Sur, não houve diferencia significativa na inibição da expressão do gene alvo entre a presença e a ausência de folato, mas no caso de grupo tratado com folato-SAMiRNA-Sur, a inibição da expressão do gene alvo foi cerca de duas vezes maior na ausência de folato do que na presença de folato. Em outras palavras, quando uma quantidade excessiva de folato estava presente, a alteração no efeito inibitório da expressão do gene alvo pelo ligante folato ligado não foi observada, mas quando o folato estava ausente, o aumento no efeito inibitório da expressão do gene alvo pelo ligante folato ligado foi observado.
[0225] Assim, pode ser observado que as nanopartículas compostas da estrutura oligo RNA dupla hélice ligada aos ligantes mostram eficiência de liberação intracelular melhorada e inibição aumentada do gene alvo em células em que o ligante receptor é super expresso.
Exemplo6:LiberaçãoinvivodeestruturaoligoRNAduplahélice ligada ao ligante
[0226] Para avaliar se as nanopartículas (folato-SAMiRNA) compostas de estruturas 5‘ folato-oligo RNA de fita dupla sintetizadas no Exemplo 2 melhoram o efeito de oligo RNA de fita dupla em condições in vivo, as nanopartículas foram administradas a um camundongo tendo um tumor composto de linhagem celular KB super expressando o receptor de folato, e os efeitos de folato-SAMiRNA e SAMiRNA liberados na inibição da expressão de gene alvo no tecido tumoral foram avaliados.
Exemplo 6-1: Preparação de modelo de xenoenxerto KB
[0227] A linhagem celular KB cultivada no Exemplo 5-1 foi injetada por via subcutânea em cada um dos camundongos nude de 5 semanas de idade (BALB/C nu) em uma densidade de 1 X 106 células. Após a injeção, o crescimento do tumor foi observado medindo os comprimentos do eixo longo e eixo curto do tumor em intervalos de 2 dias, e foi mostrado que o tumor cresceu em um volume de cerca de 150-200 mm3 em 2 semanas após injeção.
Exemplo6-2:EstruturasdeoligoRNAduplahéliceligadasao liganteeadministraçãodeestruturasdeoligoRNAduplahélice ligadasaoligante
[0228] Para administração no modelo de xenoenxerto KB preparado no Exemplo 6-1, as estruturas 5‘ folato-oligo RNA de fita dupla compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1, sintetizadas no Exemplo 2, e estruturas de RNA de fita dupla não tendo nenhum ligante ligado a esta, foram homogeneizadas do mesmo modo como descrito no Exemplo 4-1, assim obtendo nanopartículas homogeneizadas compostas de estruturas de oligo RNA dupla hélice. As nanopartículas homogeneizadas foram administrada uma vez na veia da cauda dos modelos de xenoenxerto KB (n=4) em uma dose de 5 mg/kg peso corporal), e o tecido tumoral foi coletado em 48 ou 72 horas após a administração. RNA total foi extraído do tecido tumoral coletado em cDNA, e então o nível de expressão relativa de survivina mRNA foi quantificado em PCR de tempo real de acordo com o método descrito na Patente Coreana Laid-Open Publicação No. 2009-0042297 (ver a FIG. 17).
[0229] Na A FIG. 17, PBS é um grupo teste administrado com um solvente isolado como um controle negativo, SAMiRNA é um grupo de teste administrado com nanopartículas compostas das estruturas de oligo RNA dupla hélice não tendo nenhum ligante ligado a esta, e Folato-SAMiRNA é um grupo de teste administrado com nanopartículas compostas das estruturas de 5‘ folato-oligo RNA de fita dupla.
[0230] O efeito inibitório da expressão de gene alvo de SAMiRNA foi maior em 72 horas após administração do que em 48 horas após administração. A inibição da expressão do gene alvo no grupo administrado com a estrutura ligada ao ligante (Folato-SAMiRNA) foi 160% em 48 horas após administração e 120% em 72 horas após administração.
[0231] Assim, pode ser observado que a estrutura de RNA de fita dupla tendo o ligante folato ligado a esta é rapidamente liberada no tecido tumoral alvo in vivo que super expressa o receptor de folato, de modo que o efeito do oligo RNA dupla hélice é melhorado, e que o efeito é mantido mesmo com a passagem do tempo.
Exemplo 7: Preparação de conjugado ASO-polímero
[0232] Nos exemplos da presente invenção, uma survivina ASO foi usada para inibir a sobrevivência (Biol. Proced. Online 2004; 6(1): 250-256). Survivina é uma proteína que é expressa comumente na maioria dos tumores ou linhagens celulares mutantes testadas até o momento e espera-se que seja um importante alvo na terapia do câncer (Abbrosini G. etal.Nat.Med,3(8):917- 921,1997).
[0233] Os ASOs usados nos seguintes exemplos são uma sequência específica para survivina estabelecida na in SEQ ID NO: 3 e uma sequência de controle estabelecida na SEQ ID NO: 4.
[0234] (SEQ ID NO: 3) survivina ASO (ISIS 23722), 5- TGTGCTATTCTGTGAATT-
[0235] (SEQ ID NO: 4) sequência misturada (ISIS 28598), 5- TAAGCTGTTCTATGTGTT-
[0236] As sequências ASO foram sintetizadas por ligação de nucleotídeos pelas ligações de fosfodiéster da estrutura do DNA usando β-cianoetilfosforamidita (Shina et al. NucleicAcidsResearch,12:4539-4557,1984).
[0237] No processo de síntese de ASO, um ciclo que consiste em desbloquear, acoplar, capear e oxidar foi repetido um suporte sólido tendo (CPG) tendo um nucleosídeo ligado a este, assim obtendo uma sequência de RNA desejada.
[0238] Especificamente, em uma etapa de desbloqueio que é a primeira etapa, um CPG tendo um nucleosídeo ligado a este é tratado com 3% ácido tricloroacético (TCA) para remover DMT (4,4'-dimetoxitritil). Em uma etapa de acoplamento que é a etapa seguinte, as cadeias de nucleotídeos são ligadas a cada outro pela reação de ligação entre o grupo 5'- hidroxil formado no CPG na etapa anterior e um monômero de nucleosídeo fosforamidita tendo uma sequência desejada. Em uma etapa de capeamento que é a terceira etapa, um grupo 5’-hidroxil que não foi reagido na etapa de acoplamento é bloqueado para eliminar a formação de uma cadeia de nucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo desejada na etapa de acoplamento do ciclo seguinte. Na etapa de capeamento, o grupo 5’-hidroxil não reagido é acetilado pelo tratamento deste com anidrido acético e N-metilimidazol. Em uma etapa de oxidação que é a etapa final, a ligação de fosfitetriéster entre um grupo 5’-hidroxil e fosforamidita, formada na etapa de acoplamento, é convertida em uma ligação fosfodiéster. Nesta etapa de oxidação, a ligação fosfitetriester é tratada com 0,02 M de solução de oxidação (0,02 M-I2 em THF/piridina/H2O) para converter fosfato em fosfato. Uma série de processos para for sintetizar o ASO foi realizada usando um sintetizador de DNA (384 Synthesizer, BIONEER, Coreia).
[0239] Em um processo para sintetizar um conjugado ASO-polímero (3'PEG-ASO-5'lipídeo), um ASO foi sintetizado por desbloqueio, acoplamento, capeamento e oxidação de um suporte 3‘ PEG-CPG tendo o material hidrofílico PEG na extremidade 3’, e o material hidrofóbico tetradocosano C24 contendo uma ligação dissulfeto foi ligado à extremidade 5’, assim preparando um conjugado ASO- polímero desejado (ver Patente Coreana Laid-Open Publicação No. 2009-0042297).
[0240] Ainda, para preparar um ligante 3'-PEG-ASO-5'lipídeo, PEG foi ligado à um CPG tendo um grupo funcional como um grupo amina ligado a este, usando um reagente PEG fosforamidita por um processo que consiste em desbloquear, acoplar, capear, e oxidar e o material hidrofóbico tetradocosano C24 contendo uma ligação dissulfeto foi ligado à extremidade 5’, assim preparando um 3‘- grupo funcional-PEG-ASO-5’-lipídeo ao qual um ligante desejado pode ser ligado. Após a conclusão da síntese, o produto de reação foi tratado com 28% (v/v) amônia em banho-maria a 60°C para separar o conjugado ASO-polímero, ao qual um ligante pode ser ligado, a partir do CPG. Então, um ligante foi ligado ao conjugado pelo grupo funcional, assim preparando um conjugado ASO-polímero (ligante 3'-PEG-ASO—5'lipídeo).
[0241] Ent retanto, para sintetizar um conjugado ASO-polímero (3'lipídeo-ASO—5'PEG), um ASO foi sintetizado em um CPG tendo um grupo funcional como um grupo amina por um processo que consiste em desbloquear, acoplar, capear e oxidar, e PEG foi ligado à extremidade 5’ usando PEG fosforamidita, assim preparando um conjugado de grupo funcional-ASO-polímero hidrofílico. Após conclusão da síntese de conjugado de grupo funcional-ASO- polímero hidrofílico, o produto de reação foi tratado com 28%(v/v) amônia em banho-maria a 60°C para separar o conjugado grupo funcional-ASO-polímero hidrofílico do CPG, e então um material hidrofóbico foi ligado ao conjugado via o grupo funcional, assim preparando um conjugado ASO-polímero tendo materiais hidrofílicos e hidrofóbicos desejados ligados a este. Então, o conjugado ASO-polímero foi separado e purificado a partir dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (LC-20A Prominence, SHIMADZU, Japão), e os pesos moleculares do ASO e o conjugado ASO-polímero foram medidos por MALDI TOF-MS (SHIMADZU, Japão) para determinar se a sequência de nucleotídeos a ser sintetizada foi obtida.
Exemplo 8: Síntese de conjugado ASO-polímero modificado comfosfotioato
[0242] o ASO usado neste Exemplo foi obtido por substituição do grupo fosfato da estrutura de DNA com um grupo fosfotioato para obter S-oligos e ligar os S-oligos por ligações de fosfotioato.
[0243] Especificamente, um ASO compreendendo S-oligos foi sintetizado por um processo que consiste em desbloquear, acoplar, capear e oxidar em que a etapa de oxidação foi realizada pelo tratamento com 0,1 M reagente de sulfurização no lugar de 0,02 M de solução de oxidação. Por este processo de síntese de ASO, ASOs modificados por fosfotioato tendo sequências de SEQ ID NOS: 3 e 4 foram sintetizadas (Shina etal.NucleicAcidsResearch,12:4539-4557,1984). Os processos de síntese restantes usados neste Exemplo foram semelhantes aos usados no Exemplo 7.
[0244] Para sintetizar um ASO em que 4 nucleotídeos em ambas as extremidades (extremidades 5’ e 3’) foram modificados com 2-OCH3 (metoxi), um nucleosídeo na região modificada na forma de 2'- OCH3-DNA foi sintetizado usando 2'-OCH3-DNA-cianoetil fosforamidita [rA(Bz),rC(Ac),rG(ibu),rU] para substituir a estrutura de DNA com fosfotiolato, e então, como descrito acima, a estrutura de DNA foi sintetizada ligando S-oligos via ligações fosfotiolato.
[0245] Para preparar um conjugado ASO-polímero modificado por fosfotiolato, um conjugado ASO modificado com fosfotiolato foi sintetizado em um suporte 3'PEG-CPG por um ciclo que consiste em desbloquear, acoplar, capear e oxidar como conhecido na técnica (ver Patente Coreana Laid-Open Publicação No. 2009-0042297), e então o material hidrofóbico tetradocosano C24 contendo uma ligação dissulfeto foi ligada à extremidade 5’, assim preparando um conjugado ASO-polímero modificado por fosfotiolato.
[0246] Ainda, para ligar um ligante à extremidade do material hidrofílico do conjugado ASO-polímero modificado por fosfotiolato, a grupo funcional ao qual um ligante pode ser ligado foi ligado ao 3' CPG, e então um material hidrofílico foi ligado ao CPG, e a reação acima mencionada foi realizada, assim preparando um conjugado ASO-polímero ao qual um ligante pode ser ligado.
[0247] Após a conclusão da síntese do conjugado ASO-polímero, o produto de reação foi tratado com 28%(v/v) amônia em banho-maria a 60°C para separar o ASO e o conjugado ASO-polímero do CPG. Então, o conjugado ASO-polímero foi separado e purificado a partir dos reagentes por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (LC-20A Prominence, SHIMADZU, Japão), e os pesos moleculares do ASO e o conjugado ASO-polímero foram medidos por MALDI TOF-MS (SHIMADZU, Japão) para determinar se a sequência de nucleotídeos a ser sintetizada foi obtida (ver FIG. 19).
Exemplo9:AvaliaçãodaestabilidadedeconjugadoASO-polímero sob condições miméticas in vivo
[0248] Para avaliar se a estabilidade dos conjugados ASO- polímero, sintetizados e separados nos Exemplos 7 e 8, foi aumentada em comparação à do original ASO tendo no polímero ligado a este, o seguinte experimento foi realizado. Especificamente, um ASO tendo no polímero ligado a este e o conjugado ASO-polímero foram incubados em 30 e 50%(v/v) meio contendo FBS (soro bovino fetal), que imita as condições in vivo, por 0, 3, 5, 7 e 10 dias, e então a degradação do conjugado ASO-polímero foi analisado comparativamente com o do ASO original por eletroforese ou reação em cadeia da polimerase (PCR).
[0249] Como um resultado, o conjugado ASO-polímero foi estável independentemente da concentração de FBS, mesmo embora PEG foi separado do ASO com a passagem do tempo, enquanto que a estabilidade do ASO não tendo nenhum polímero ligado a este começou a cair após dia 3.
Exemplo10:Análisedepropriedadesfísicasdenanopartícula compostas de conjugados ASO-polímero
[0250] Os conjugados ASO-polímero formam uma nanopartícula composta dos conjugados ASO-polímero por interação entre os materiais hidrofóbicos ligados às extremidades dos ASOs (ver FIG. 18). O tamanho e concentração de micela crítica (CMC) das nanopartículas compostas dos conjugados ASO-polímero foi medido por medição de potencial zeta.
Exemplo10-1:Mediçãodenanopartículascompostasdeconjugados ASO-polímero
[0251] O tamanho das nanopartículas compostas dos conjugados ASO- polímero, preparados no Exemplo 8 e compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 3, foi medido por medição de potencial zeta. Especificamente, 50 yg dos conjugados ASO-polímero foram dissolvidos em 1 ml de DPBS (Salina fosfato tamponada de Dulbecco), e então homogeneizados com um sonicador (Wiseclean, DAIHAN, Coreia) (700 W; amplitude: 20%). O tamanho das nanopartículas homogeneizadas foi medido com um dispositivo de medição de potencial zeta (Nano-ZS, MALVERN, GB) sob as condições seguintes: índice de refração: 1,454, índice de absorção: 0,001, temperatura da água como um solvente: 25°C. Cada medição consistiu em 20 leituras de tamanho e foi repetida três vezes.
[0252] Pode ser observado que as nanopartículas formadas pelos conjugados ASO-polímero tiveram um tamanho de 100-200 nm e um índice de polidispersidade (PDI) de menos do que 0,4 (ver A FIG. 20(A)). Um valor de índice de polidispersão inferior (PDI) indica uma distribuição mais uniforme das partículas. Assim, pode ser observado que as nanopartículas formadas dos conjugados ASO-polímero têm um tamanho relativamente uniforme, que é apropriado para absorção em células por endocitose (Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4:84-85, 2009).
Exemplo10-2:Mediçãodeconcentraçãodemicelacríticade conjugadosASO-polímero
[0253] Um material anfifílico contendo ambos um grupo oleofílico e um grupo hidrofílico na molécula pode atuar como um surfactante. Quando um surfactante é dissolvido em uma solução aquosa, as frações hidrofóbicas entram para evitar contato com a água, e as frações hidrofílicas saem, assim formando uma micela. A concentração em que a micela é primeiro formada é definida como concentração de micela crítica (CMC). Um método para medir a CMC usando um corante fluorescente é baseado em uma alteração rápida na inclinação do gráfico de intensidade de fluorescência de um corante fluorescente antes e depois da formação da micela.
[0254] Para a medição de concentração de micela crítica das nanopartículas compostas dos conjugados ASO-polímero, 0,04 mM DPH (1,6-Diphenil-1,3,5-hexatriene, SIGMA, USA) como um corante fluorescente foi preparado. 1 nmolM dos conjugados ASO-polímero compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 3 foram diluídos com DPBS serialmente de 0, 0977 ^/m^ a 50 μg/m^, assim preparando 180 ^ de cada uma das amostras conjugado ASO-polímero. À amostra preparada, 20 ^ de cada um de 0,04 mM DPH em metanol e metanol isolado como um controle foi adicionado e o poço agitado. Então a homogeneização usando um sonicador (Wiseclean, DAIHAN, Coreia) foi realizada do mesmo modo como descrito no Exemplo 10-1 (700 W; amplitude: 20%). Cada uma das amostras homogeneizadas foi deixada reagir a temperatura ambiente sob uma condição protegida da luz por cerca de 24 horas, e as intensidades de fluorescência (excitação: 355 nm, emissão: 428 nm, leitura superior) foram medidas. Devido ao fato de que as intensidades de fluorescência serem usados para determinar a intensidade de fluorescência relativa, a intensidade de fluorescência relativa ([intensidade de fluorescência de amostra contendo DPH]-[intensidade de fluorescência de amostra contendo metanol isolado]) na mesma concentração foi calculada e graficamente mostrado no eixo Y como uma função do valor log da concentração de conjugados ASO- polímero (eixo X) (ver FIG. 20(B)).
[0255] As intensidades de fluorescência medidas em várias concentrações aumentam conforme a concentração aumenta, e o ponto no qual a concentração aumenta rapidamente é a concentração CMC. Assim, as regiões de baixa concentração em que a fluorescência não aumentou e a região em alta concentração em que a intensidade de fluorescência aumentou foram divididas em vários pontos para desenhar linhas de tendência, e o valor do eixo X em que as duas linhas de tendência cruzaram com cada outra foi determinado de acordo com a concentração CMC. A CMC medida dos conjugados ASO-polímero foi muito baixa (1,56 μg/mβ), sugerindo que nanopartículas formadas dos conjugados ASO- polímero podem facilmente formar micelas mesmo em uma concentração muito baixa.
Exemplo11:Inibiçãodaexpressãodegenealvoemlinhagensde célulastumoraisporconjugadoASO-polímeroereagentede transfecção
[0256] Cada um de ASO tendo no polímero conjugado a este, e o conjugado ASO-polímero, preparado no Exemplo 8, foi transfectado em uma linhagem celular de câncer colorretal humano (SW480) como uma linhagem celular tumoral, e os padrões de expressão de survivina na linhagem celular tumoral transfectada foram analisados.
Exemplo 11-1: Cultura de linhagem de célula tumoral
[0257] A linhagem celular de câncer colorretal (SW480) obtida de American type Culture Collection (ATCC) foi cultivada em um meio de crescimento (meio L-15 de Leibovitz, GIBCO/Invitorgen; USA), suplementado com 10%(v/v) FBS, 100 unidades/ml penicilina e 100^/ml estreptomicina, sob as condições de 37°C e 5%(v/v) dióxido de carbono (CO2).
Exemplo11-2:Transfecçãodelinhagemcelulartumoralcom conjugadoASO-polímero
[0258] Cada um de ASO tendo no polímero conjugado a este, e o conjugado ASO-polímero, preparado no Exemplo 8, foi transfectado em uma linhagem celular de câncer colorretal humano (SW480) como uma linhagem celular tumoral, e os padrões de expressão de survivina na linhagem celular tumoral transfectada foram analisados.
[0259] A linhagem celular tumoral cultivada no Exemplo 11-1 foi cultivada em um meio de crescimento (meio L-15 de Leibovitzs, GIBCO/Invitorgen; USA) em uma placa de 6 poços em uma densidade de 1,3 x 105 células por 18 horas sob as condições descritas no
Exemplo 11-1, e então o meio foi removido, e 800^ de meio Opti- MEM (meio essencial mínimo de Eagle modificado, GIBCO/Invitorgen; USA) foi adicionado a cada poço.
[0260] Entretanto, 2 ^ de Lipofectamina™ 2000 e 198^ de meio Opti-MEM foram misturados com cada outro e deixado reagir a temperatura ambiente por 5 minutos. O produto de reação foi tratado com 25 pmole/^ de cada um dos conjugados ASO-polímero, preparado mps Exemplos 7 e 8, para concentrações finais de 10, 50 e 100 nM, e foi então deixado reagir a temperatura ambiente por 20 minutos, assim preparando as soluções de transfecção.
[0261] Em seguida, 200^ de cada uma das soluções de transfecção foi adicionada a cada poço contendo a linhagem celular tumoral e Opti-MEM, e então as células foram cultivadas por 6 horas, seguido por remoção do meio Opti-MEM. Em seguida, 2,5 m£ de meio de crescimento (meio L-15 de Leibovitz, GIBCO/Invitorgen; USA) foi adicionado a cada poço, e então as células foram cultivadas por 24 horas sob as condições de 37°C e 5%(v/v) dióxido de carbono (CO2).
Exemplo11-3:AnálisequantitativarelativademRNAdegene survivina
[0262] RNA total foi extraído de linhagem celular transfectada do Exemplo 11-2 e sintetizado em cDNA, e então o nível de mRNA do gene de survivina foi quantificado comparativamente em PCR de tempo real de acordo com o método descrito na Patente Coreana Laid-Open Publicação No. 2009-0042297 (ver A FIG. 21).
[0263] Para analisar os efeitos inibitórios de expressão de gene alvo do ASO tendo no polímero conjugado a este o conjugado ASO- polímero, as células foram transfectadas com cada um de ASO e o conjugado ASO-polímero junto com o reagente de transfecção, e então os níveis de expressão de mRNA do gene de survivina nas células foram analisados. Como resultado, foi demonstrado que a inibição de expressão do gene de survivina pelo conjugado ASO- polímero foi similar àquela pelo ASO tendo no polímero conjugado a este, sugerindo que o polímero conjugado não interfere com o mecanismo de ação do ASO.
Exemplo12:Inibiçãodaexpressãodegenealvonalinhagem celulartumoralpeloconjugadoASO-polímeroisolado
[0264] Cada um dos conjugados ASO-polímero preparado nos Exemplos 7 e 8 foi transfectado em uma linhagem celular de câncer colorretal humano (SW480) como uma linhagem celular tumoral, e os padrões de expressão de na linhagem celular tumoral transfectada foram analisados.
Exemplo 12-1: Cultura de linhagem de célula tumoral
[0265] A linhagem celular de câncer colorretal (SW480) obtida de American type Culture Collection (ATCC) foi cultivada em um meio de crescimento (meio L-15 de Leibovitz, GIBCO/Invitorgen; USA), suplementado com 10%(v/v) FBS, 100 unidades/ml penicilina e 100^/ml estreptomicina, sob as condições de 37°C e 5%(v/v) dióxido de carbono (CO2).
Exemplo12-2:Transfecçãodelinhagemcelulartumoralcom conjugadoASO-polímero
[0266] A linhagem celular tumoral cultivada no Exemplo 12-1 foi cultivada em um meio de crescimento (meio M-15 de Leibovitz, GIBCO/Invitorgen; USA) em uma placa 6 poços em uma densidade de 1,3 x 105 células por 18 horas sob as condições descritas no Exemplo 5-1, e então o meio foi removido, e 800^ de meio Opti- MEM foi adicionado a cada poço.
[0267] 100^ de meio Opti-MEM e 5, 10 ou 100^ (500 nM, 1 μM ou 10 μM) de cada um dos conjugados ASO-polímero (1 nmol/^) preparado nos Exemplos 1 e 2 foram misturados com cada outro e homogeneizados com um sonicador (Wiseclean, DAIHAN, Coreia) do mesmo modo como descrito no Exemplo 4-1 (700 W; amplitude: 20%), assim preparando soluções de transfecção contendo nanopartículas homogeneizadas formadas dos conjugados ASO-material hidrofóbico.
[0268] Em seguida, 100^ de cada uma das soluções de transfecção foi adicionado a cada poço contendo a linhagem celular tumoral e Opti-MEM, e as células foram cultivadas por 24 horas, após a qual 1 ml de 20% de meio de crescimento contendo FBS (meio M-15 de Leibovitz, GIBCO/Invitorgen; USA) foi adicionado a este. Então, as células foram adicionalmente cultivadas por 24 horas sob as condições de 37°C e 5%(v/v) dióxido de carbono (CO2). Assim, as células foram cultivadas por um total de 48 horas após o tratamento com o conjugado ASO-polímero.
Exemplo12-3:AnálisequantitativarelativademRNAdegene survivina
[0269] RNA total foi extraído de linhagem celular transfectada do Exemplo 12-2 e sintetizado em cDNA, e então os níveis de mRNA do gene de survivina foram quantificados comparativamente em PCR de tempo real de acordo com o método descrito na Patente Coreana Publicação No. 2009-0042297.
[0270] A inibição da expressão de mRNA do gene survivina foi comparada entre o ASO tendo no polímero conjugado a este e o conjugado ASO-polímero sob uma condição não contendo nenhum reagente de transfecção. Como resultado, pode ser observado que o ASO-polímero inibiu a expressão do gene alvo em uma concentração relativamente baixa em comparação ao ASO não conjugado sob uma condição não contendo nenhum reagente de transfecção.
[0271] Assim, pode ser observado que os conjugados ASO-polímero sintetizados na presente invenção ou nanopartículas compostas dos conjugados ASO-polímero são liberados em células mesmo sob uma condição não contendo nenhum reagente de transfecção de modo que ASO inibe a expressão do gene alvo.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[0272] Como descrito acima, a nova estrutura de oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção e uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo pode ser usada para o tratamento de câncer e doenças infecciosas de modo muito eficiente e útil.
[0273] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhe com referência às características específicas, será aparente aos especialistas na técnica que esta descrição é apenas para uma modalidade preferencial e não limita o escopo da presente invenção. Assim, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexadas e equivalentes das mesmas.

Claims (15)

1. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA tendo uma estrutura da seguinte fórmula (1) e compreendendo um ligante ligado a este:
Figure img0008
caracterizado pelo fato de que A é um material hidrofílico; B é um material hidrofóbico; X e Y são cada um uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante independentemente de cada outra; R é um oligo RNA de dupla hélice; e L é um ligante específico ao receptor tendo a propriedade de melhorar a internalização da célula alvo por endocitose mediada por receptor (RME), covalentemente ligado à extremidade de dito material hidrofílico onde dito ligante é selecionado de folato, N-Acetilgalactosamina (NAG) e manose.
2. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o oligo RNA dupla hélice compreende modificação compreendendo a substituição de um grupo -OH na posição de 2’ carbono da fração de açúcar de um ou mais nucleotídeos com -CH3 (metil), -OCH3,-NH2,-F (flúor), -O-2-metoxietil, -O-propil, -O-2-metiltioetil, -O-3-aminopropil, -O-3-dimetilaminopropil, -O-N-metilacetamido ou -O- dimetilamidoxietil; a substituição do oxigênio na fração açúcar do nucleotídeo por enxofre; a modificação da ligação entre os nucleotídeos em uma ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em um fosforotioato, boranofosfofato e ligação metil fosfonato, ou é modificado na forma de PNA (ácido nucleico peptídeo) ou LNA (ácido nucleico travado).
3. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o material hidrofóbico tem um peso molecular de 250-1.000.
4. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o material hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste em um derivado esteroide, um derivado de glicerídeo, éter glicerol, polipropileno glicol, um hidrocarboneto C12-C50 insaturado ou saturado, diacil fosfatidilcolina, ácido graxo, fosfolipídeo, e lipopoliamina.
5. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o derivado esteróide é selecionado do grupo que consiste em colesterol, colestanol, ácido cólico, colesteril formato, colestanil formato, e colestanil amina.
6. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o derivado de glicerídeo é selecionado de entre mono-, di- e tri-glicerídeos.
7. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o material hidrofílico tem um peso molecular de 200-10.000.
8. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o material hidrofílico é selecionado do grupo que consiste em polietileno glicol, polivinil pirrolidona, e polioxazolina.
9. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a ligação covalente é ou uma ligação não degradável ou uma ligação degradável.
10. ESTRUTURA DE DROGA-POLÍMERO TERAPÊUTICA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a ligação não degradável é ou uma ligação amida ou uma ligação fosfato em que as ligações degradáveis são selecionadas do grupo que consiste em uma ligação dissulfeto, uma ligação degradável por ácido, uma ligação éster, uma ligação anidrido, uma ligação biodegradável ou uma ligação enzimaticamente degradável.
11. MÉTODO PARA PREPARAR UMA ESTRUTURA OLIGO RNA DE DUPLA HÉLICE CONJUGADA A UM LIGANTE conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (1) sintetizar um RNA fita simples em um suporte sólido tendo um grupo funcional-material hidrofílico ligado a este; (2) covalentemente ligar um material hidrofóbico à extremidade 5’ do RNA fita simples tendo o grupo funcional-material hidrofílico ligado a este; (3) separar a estrutura de grupo funcional-RNA-polímero e um RNA fita simples complementar separadamente sintetizado a partir do suporte sólido; (4) covalentemente ligar um ligante à extremidade do material hidrofílico pelo grupo funcional; e (5) recozer a estrutura de RNA-polímero ligada ao ligante com o RNA fita simples complementar para formar uma estrutura de RNA fita dupla, onde o ligante é selecionado dentre anticorpos específicos de alvo, aptâmeros, peptídeos e materiais químicos específicos de receptor.
12. MÉTODO PARA PREPARAR UMA ESTRUTURA OLIGO RNA DE DUPLA HÉLICE conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (1) sintetizar um RNA fita simples em um suporte sólido; (2) covalentemente ligar um material hidrofílico à extremidade 5’ do RNA fita simples; (3) ligar um ligante ao material hidrofílico ligado ao RNA fita simples; (4) separar a estrutura ligada ao ligante, RNA- polímero hidrofílico e uma estrutura de RNA-polímero hidrofóbico complementar separadamente sintetizado a partir do suporte sólido; e (5) recozer a estrutura ligada ao ligante, RNA-polímero hidrofílico com a estrutura de RNA-polímero hidrofóbico complementar para formar uma estrutura de fita dupla, em que o método de preparação compreende, entre as etapas (1) a (4), uma etapa de sintetizar um RNA fita simples complementar ao RNA fita simples da etapa (1), e então covalentemente ligar um material hidrofóbico ao RNA fita simples sintetizado para sintetizar uma estrutura de RNA fita simples-polímero hidrofóbico, e onde o ligante é selecionado dentre anticorpos específicos de alvo, aptâmeros, peptídeos, materiais químicos específicos de receptor.
13. MÉTODO PARA PREPARAR UMA ESTRUTURA DE OLIGO RNA DE DUPLA HÉLICE LIGADA A UM LIGANTE conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (1) sintetizar um RNA fita simples em um suporte sólido tendo um grupo funcional ligado a este; (2) covalentemente ligar um material hidrofílico ao material obtido na etapa (1); (3) covalentemente ligar um ligante ao material obtido na etapa (2); (4) separar o material obtido na etapa (3) a partir do suporte sólido; (5) covalentemente ligar um material hidrofóbico ao material resultante da etapa (4) pelo grupo funcional ligado à extremidade 3’; e (6) recozer o material resultante da etapa (5) com um RNA fita simples complementar para formar uma estrutura de RNA fita dupla, e onde o ligante é selecionado dentre anticorpos específicos de alvo, aptâmeros, peptídeos, materiais químicos específicos de receptor.
14. NANOPARTÍCULA caracterizada por compreender estrutura de droga-polímero terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
15. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender estrutura de droga-polímero terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou a nanopartícula da reivindicação 14.
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