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PROCEDE DE DETECTION ET/OU DE QUANTIFICATION DE LIGANDS
SPECIFIOUES D'UNE PATHOLOGIE LIEE A UNE REPONSE
ALLERGIQUE.
ObJet de l'invention.
La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie liée à une réponse allergique, un complexe immunoréactif, un ou plusieurs épitopes d'un allergène, l'anticorps dirigé contre ledit complexe immunoréactif ou contre lesdits épitopes, un dispositif de détection et/ou une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire contenant ledit complexe immunoréactif, lesdits épitopes et/ou ledit anticorps.
La présente invention concerne également l'utilisation dudit complexe, desdits épitopes et dudit anticorps pour la prévention et/ou la thérapie de pathologies liées à une réponse allergique.
Arrière-plan technologique et état de la technique à la base de l'invention.
L'allergie est une réaction d'hypersensibilité provoquée par le contact avec un allergène.
L'allergie chez les êtres humains est dépendante de prédispositions génétiques, mais différents facteurs environnementaux peuvent influencer le développement des manifestations allergiques.
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Les manifestations allergiques respiratoires (asthme, rhume des foins,...) ou cutanées (urticaire, eczéma,...) ou des manifestations allergiques digestives, nerveuse, réno-vésicales, cardiaques, articulaires, oculaires peuvent être dues à l'absorption ou au contact par manipulation de produits d'origine animale (poils), végétale (poussière de bois, fibres textiles, pollen,...) ou de produits chimiques (antibiotiques, neuroleptiques,...).
En outre, de nombreuses études cliniques ont suggéré une relation entre la réaction d'hypersensibilité et le cancer, en particulier entre l'atopie respiratoire et le cancer des surfaces mucosales (Meers P. D., Allergy and Cancer, Lancet 1983,1, pp. 884-885).
La réaction immunitaire vis-à-vis de certaines allergies telles que l'anaphylaxie ou l'atopie, est une des formes d'allergie incluant une hypersensibilité immédiate.
La réaction immunitaire allergique implique les immunoglobulines de classe E (IgE).
Le complexe formé entre les allergènes spécifiques et les IgE se fixe à des cellules basophiles qui induisent la libération de molécules telles que les histamines, la sérotonine, l'héparine,..., qui peuvent notamment provoquer la constriction prolongée des cellules musculaires des bronches (Hood et al., Immunology, deuxième édition, de Benjamin/Cumming Publishing Corporation, Inc. (1984)).
Différentes techniques ont été proposées pour diagnostiquer la présence d'anticorps de type IgE à l'encontre de certains allergènes spécifiques (allergènes impliquée dans la réaction allergique vis-à-vis des pollens, des poils de chat et de chien,...) (Pharmacia-Cap System S, Phadebas RAST (ID, Phadezym RAST @,...).
Cependant, il apparaît que d'autres classes d'anticorps réagissent également spécifiquement vis-à-vis de certains allergènes (classe d'immunoglobulines de type IgM, IgA et IgG).
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En outre, il est à noter que les immunoglobulines de classe G sont, contrairement aux immunoglobulines de classe E, présentes en plus grande quantité chez un patient, en particulier chez les enfants en bas âge.
Les pools d'immunoglobulines de classe G (caractérisés par une demi-vie de longue durée) peuvent donc être plus facilement détectés.
De nombreux travaux ont été également effectués sur les allergènes et sur des épitopes particuliers de ceux-ci.
Ainsi, des travaux ont été réalisés sur les allergènes présents dans le lait de vache.
En particulier, il a été reconnu qu'il était possible d'obtenir une tolérance des enfants en bas âge vis- à-vis du lait en utilisant à titre de produit diététique des extraits d'un hydrolysat de protéines du lait de vache.
Dans la demande de brevet EP-0 629 350, on décrit l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de lait pour la préparation d'une composition diététique permettant l'induction d'une tolérance au lait de vache pour des enfants susceptibles de développer une allergie au lait de vache.
Cet hydrolysat de lait dépourvu de protéines allergéniques est obtenu en soumettant les allergènes à un traitement par trypsine et chymiotrypsine en présence d'une élastase.
Selon ce document, on démontre que les enfants traités seraient devenus tolérants vis-à-vis du lait de vache par le fait qu'ils présenteraient une réaction immunitaire cellulaire atténuée.
Buts de l'invention.
La présente invention vise à mettre au point un nouveau procédé et un nouveau dispositif de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie liée à une réponse allergique.
Un but particulier de la présente invention vise à mettre au point ledit procédé et ledit dispositif qui pourraient être utilisés dans le diagnostic de patients qui
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présenteraient éventuellement de faibles productions en immunoglobulines de classe E.
La présente invention vise également à fournir une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire destinée à modifier la réponse immunitaire d'un patient vis- à-vis d'un allergène et/ou pour le traitement et/ou la prévention de syndromes liés à une pathologie immunitaire, en particulier les allergies et/ou le cancer.
Un but complémentaire de la présente invention vise à utiliser ladite composition de manière prophylactique et/ou thérapeutique pour modifier la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène, en particulier si le patient est un nouveau-né.
Eléments caractéristiques de la présente invention.
La présente invention concerne un nouveau procédé de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie liée à une réponse allergique et présent dans un fluide corporel d'un patient (tel que le sérum ou le liquide céphalo-rachidien), dans lequel :
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on prélève un échantillon du fluide corporel du patient, on fait réagir dans un test de compétition les ligands présents dans l'échantillon avec des ligands marqués, ledits ligands marqués réagissant avec au moins un allergène (de préférence fixé sur un support solide) spécifique de ladite pathologie, et on détecte et/ou quantifie l'inhibition de la réaction entre les ligands marqués et les allergènes spécifiques de la pathologie par les ligands présents dans l'échantillon.
On entend par"pathologie liée à une réponse allergique", les réactions d'hypersensibilité de type immédiat ou différé provoquées par le contact avec un allergène. Cette réaction peut être immédiate et spécifique (anaphylaxie, urticaire,...) ou différée dans le temps et moins spécifique (diarrhée, vomissements,...). Cette pathologie peut être également un syndrome
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d'hyperprolifération tel que le cancer du poumon lié à ce phénomène d'hypersensibilité immédiate, en particulier l'atopie respiratoire.
Selon l'invention, les ligands sont choisis parmi le groupe constitué par les cellules APC (Antigen Presenting Cell telles que les macrophages, les cellules dendritiques), les récepteurs des cellules APC, les anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) ainsi que leurs fragments (portions Fab des anticorps) et/ou un mélange d'entre eux.
De préférence, les ligands selon l'invention sont des immunoglobulines de classe G.
Préférentiellement, l'allergène est choisi parmi le groupe constitué par les allergènes majeurs présents dans la lait de vache, en particulier la H-lactoglobuline bovine (BLG), les antigènes majeurs intervenant dans les phénomènes allergiques vis-à-vis des plantes, (en particulier les allergènes des pollens), des animaux (en particulier les allergènes présents dans les poils d'animaux, les allergènes des venins d'animaux, l'antigène de la mite présente dans la poussière domestique, les antigènes responsables de l'allergie aux acariens, l'entérotoxine B staphylococcale (SEB), un ou plusieurs épitopes de ces allergènes et/ou un mélange d'entre eux.
(ref : ISBN 91-970475-5-4 Pharmacia AB)
La présente invention concerne également un complexe immunoréactif comprenant au moins un allergène lié à un ligand, éventuellement marqué, réagissant spécifiquement contre cet allergène.
On entend par'complexe immunoréactif", une liaison spécifique entre les allergènes et les ligands spécifiques précédemment décrits, susceptible d'être utilisée dans un dispositif de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques de la pathologie liée à une réponse allergique.
Un autre aspect de la présente invention concerne les épitopes allergéniques spécifiques d'un syndrome liés à une réponse allergique, en particulier les épitopes
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allergéniques de l'antigène de la ss-lactoglobuline bovine (BLG) tels que décrits dans les figures 14 à 16.
La présente invention concerne également l'anticorps (monoclonal ou polyclonal) dirigé contre ledit complexe immunoréactif ou lesdits épitopes allergéniques selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne le dispositif de détection et/ou de quantification d'un ligand spécifique d'une pathologie liée à une réponse allergique comprenant ledit complexe, lesdits épitopes et/ou ledit anticorps selon l'invention.
Le dispositif selon la présente invention comprend, en outre, des réactifs destiné à la détection et/ou à la quantification desdits ligands par un procédé choisi parmi le groupe constitué par la reconnaissance par des anticorps marqués, de manière isotopique ou non isotopique, sur filtre, sur support solide, sur gel, en solution, en"sandwich", par double immunodiffusion, par contre-immunoélectrophorèse, par hémagglutination et/ou un mélange d'entre eux.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire destinée à modifier la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène, comprenant ledit allergène, un ou plusieurs épitopes dudit allergène, le complexe immunoréactif selon l'invention, l'anticorps dirige contre ce complexe et/ou un mélange d'entre eux.
On entend par"modification de la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène", la modification du pool d'anticorps réagissant de manière spécifique à l'encontre de certains épitopes allergiques, c'est-à-dire la capacité pour un patient d'avoir une production d'anticorps comparable à celle d'un sujet sain telle qu'elle est diagnostiquée dans les exemples de la description.
Avantageusement, le patient est un nouveau-né et la composition est administrée à la mère avant et/ou pendant
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la grossesse.
Un dernier aspect de la présente invention concerne l'utilisation de ladite composition pharmaceutique pour la préparation d'un médicament destiné à modifier la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène et/ou pour le traitement et/ou la prévention de pathologies liées à une réponse allergique, en particulier le traitement et/ou la prévention d'allergies et/ou de cancers.
Selon une forme d'exécution préférée de cette utilisation, le patient est un nouveau-né et la composition est administrée à la mère avant ou pendant la grossesse.
Brève description des figures.
Les figures 1 à 7 représentent l'influence de l'administration orale d'un hydrolysat de lait sur la réponse immunitaire d'un individu adulte à la ss- lactoglobuline.
Les figures 8 et 9 représentent la modulation de la réponse anticorps anti-ss- lactoglobuline de nouveaux-nés en fonction de l'alimentation lactée de leur mère.
Les figures 10 à 12 représentent. la mesure de l'inhibition d'un pool d'immunoglobulines IgG marquées par le sérum de patients sains et intolérants à un allergène particulier.
La figure 13 représente la mesure de l'inhibition d'un anticorps monoclonal marqué par le sérum d'un patient sain et intolérant à un allergène.
Les figures 14 à 16 représentent la reconnaissance spécifique de certains épitopes linéaires de l'allergène BLG par des pools d'immunoglobulines de sérum de
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patients sains atteints d'allergie ou d'un cancer du poumon.
Exemples.
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1. Influence de dmjmstratrion ore d'un hvdroyC de lai sur la réponse TUG et G et I ; M de souris adutes à la ss- lactoglobuline.
Depuis l'invention des tests de détection d'anticorps par l'utilisation d'une surface recouverte d'un antigène comme les RASTS et les ELISAS (phase solide), mesurant des anticorps de plus faible affinité que les tests antérieurs (RIA ; phase liquide), on s'est aperçu d'une chose qui reste étonnante, bien que jamais soulignée : de nombreux antigènes capables d'induire une réponse allergique par anticorps de classe IgE chez les malades, sont aussi capables d'induire des anticorps de classe IgG chez tous les individus, y compris les sujets sains, atopiques ou non.
C'est le cas de la ss-lactoglobuline (BLG), la lactalbumine et la caséine, les antigènes majeurs du lait de vache (LV), ou de pollens, du DPT et diverses moisissures pour les aéroallergènes.
Pourtant, il ne suffit pas qu'une protéine soit ingérée pour induire cette réponse ; chacun ne fait pas de tels anticorps contre l'albumine de boeuf ou la gliadine du blé, par exemple. Considérant l'allergie comme un cas particulier de réponse immune généralement répandue, il est important d'analyser aussi cette réponse chez les sujets non allergiques, car elle singularise déjà certains antigènes parmi d'autres protéines alimentaires.
La réponse IgG anti-BLG (et IgA) est dirigée contre des épitopes qui diffèrent partiellement entre sujets allergiques symptomatiques et sujets guéris ou sains.
Des souris syngéniques de trois souches distinctes (l'une domestique, les autres BalbC et C57Bl) nourries sans lait depuis 5 générations au moins et âgées de 6 semaines ont été réparties en groupes égaux de 8 animaux et soumises à des régimes différents (voir fig. 1).
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Le premier consistait à recevoir de l'eau comme unique boisson pendant 72 jours, l'autre consistait à recevoir de l'eau pendant 6 semaines puis un hydrolysat commercial de lait de vache (NANHA S de Nestlé), pendant 30 jours. Ensuite, toutes les souris ont reçu du lait de vache dilué de 1/3 dans leur eau de boisson. On mesure les anticorps IgG et IgM au jour 0 (début du lait entier à 1/3) et 30 jours plus tard vis-à-vis de la ss-lactoglobuline (BLG) comme représentant de l'allergénicité du lait, par une méthode d'ELISA, en utilisant la BLG intacte (n-BLG à l'état natif) et des peptides obtenus par digestion pepsinique de la BLG (d-BLG) (voir figs. 2 à 7).
Il apparaît que : - le régime alimentaire constitué par des granules déclarés sans addition de lait n'est cependant pas entièrement dépourvu d'antigènes de lait (contamination à la production). Les mesures montrent cependant que l'apport est 30 fois inférieur à celui de l'équivalent antigénique fourni par l'hydrolysat de lait.
Ceci explique que même les souris ne recevant que de l'eau comme boisson ont développé des anticorps anti-BLG ; - la pré-nutrition des souris à l'hydrolysat de lait influence manifestement la réponse IgM et IgG vis-à-vis de la ss-lactoglobuline ; - ceci dépend de la souche sélectionnée et indique donc un déterminisme génétique ; - enfin, la spécificité des anticorps est ainsi modifiable puisque les titres mesurés sur n-BLG et d-BLG ne varient pas de façon parallèle, indiquant donc une modulation différente selon la catégorie ou le type d'épitopes (ici, conformationnels ; versus structurels) ;
- ceci est observé pour les IgM (demi-vie courte) (voir figs. 2 et 3) mais déjà observable aussi pour les IgG (voir figs. 5 et 6).
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2. Modulation la réponse antcorp anti-BLG de souriceau au moment du sevrage en fonction de l'alimentation lactée dE leur mère.
Dans ce même modèle, on administre du lait entier à la concentration de 1/1 ou 1/30 dans le lait de boisson à des souris en âge de se multiplier et appartenant à la souche domestique. On mesure les anticorps des souriceaux à l'âge de 4 semaines en tenant compte du délai entre le début du régime maternel et la date de naissance (et donc de la conception) (voir figs. 8 et 9).
Il apparaît que le régime alimentaire de la mère fait indéniablement varier les titres et la spécificité des anticorps de sa progéniture selon le délai entre l'instauration du régime maternel et celui de la conception, et d'autre part en fonction de l'apport quantitatif de lait.
L'ensemble de ces données permet de montrer que les manipulations à la fois quantitatives et qualitatives du rapport alimentaire en antigènes de lait a une influence sur la réponse immune de souris adultes, tant pour le titre des anticorps que pour la spécificité épitopique. Ceci est vrai pour leur propre réponse et pour celle qui apparaîtra chez leur progéniture. Cette influence de la réponse de la progéniture par la manipulation de la diète maternelle rend vraisemblable l'hypothèse d'une manipulation de la réponse de bébés contre les antigènes de lait en modifiant l'apport et la qualité des antigènes de lait fournis à la mère avant et durant sa grossesse.
Il est donc possible d'apporter chez un nouveau-né une tolérance immunitaire (humorale, mais probablement aussi cellulaire) vis-à-vis d'un syndrome lié à une réponse allergique en traitant la mère du nouveau-né avant et/ou pendant sa grossesse. Ce traitement prophylactique permet donc d'éviter chez un patient un traitement thérapeutique lourd de longue durée et coûteux durant l'enfance et/ou l'adolescence.
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3. Diagnostic de groupies d'individus présentant des syndromes liés à une réponse allergique. a. Réponse allergique à la ss-lactoalobuline.
La ss-lactoglobuline du lait de vache utilisée comme allergène est fixée sur un support solide.
On identifie des groupes d'individus par un test de compétition entre des immunoglobulines marquées (ces immunoglobulines sont fixées à de la biotine et révélées par la réaction d'une enzyme peroxydase liée à de la polystreptavidine) et les sérums de patients (test ELISA).
On analyse le sérum de 44 individus sains (CM tolérants) et de 44 individus présentant une intolérance au lait de vache (CM intolérants).
L'analyse de ces résultats indique qu'il est possible d'identifier les groupes d'individus sains et intolérants au lait de vache par rapport à leur réaction spécifique vis-à-vis de l'allergène (voir fig. 10).
Cette réaction s'observe également avec des allergènes constitués de l'allergène BLG natif (n-BLG) ou digérés à la pepsine (d-BLG) (voir figs. 11 et 12).
Un test de compétition a également été réalisé en utilisant une compétition entre des anticorps monoclonaux de souris M7 marqués comme précédemment et des sérums de patients.
La fig. 13 donne le résultat de ce test de compétition qui permet d'identifier les individus sains (44 CM tolérants et 65 donneurs de sang (BD) ) et les 44 individus présentant une intolérance au lait de vache (CM intolérants).
Par conséquent, certains anticorps monoclonaux permettent d'identifier de manière préférentielle dans cette compétition les individus présentant une intolérance au lait de vache. b. Caractérisation des épitopes linéaires d'un alleraène spécifique de certains syndromes.
Une relation entre l'atopie et le cancer du poumon
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a été décrite dans différentes publications (Mc Duffie H. H. et al., Chest 1988 ; 93 pp. 241-246 ; Chest 1991 ; 99 pp. 404- 407, et Michils et al., Cancer 1992 ; 69 pp. 2252-2257).
Certains allergènes (BLG, antigène pl de la mite présente dans la poussière domestique (Dermatophagoides pteronyssinus) induisent la production d'immunoglobulines chez des patients atteints de cancer.
Par conséquent, la Demanderesse a cherché à identifier les épitopes linéaires particuliers de l'allergène BLG susceptibles de réagir avec des immunoglobulines G présentes dans le sérum de patients atteints d'un cancer.
On synthétise sur une phase solide des octapeptides composant une suite successive de 8 acides aminés dans l'ordre de la structure primaire de la BLG.
On révèle ensuite des peptides ayant permis de fixer des immunoglobulines G biotinées et provenant d'un pool de 12 sujets, qui sont soit allergiques au lait, soit normaux, soit atteints d'un cancer du poumon.
La révélation de la fixation des anticorps est faite par de la streptavidine couplée à de la ss-galactosidase (voir fig. 13 à 15). Dans ces figures, on identifie certains épitopes particuliers reconnus uniquement par des pools d'immunoglobulines d'un sérum de patients atteints d'un cancer du poumon ou uniquement reconnus par les immunoglobulines présentes dans le sérum d'un patient allergique au lait.
Par conséquent, il est possible de caractériser une "signature"précise d'une pathologie (allergie, cancer, cancer et allergie).
En conclusion, sur base des exemples susmentionnés, il est possible de caractériser une pathologie liée à une réponse allergique par le fait que le système immunitaire de patients sains par rapport à des patients malades est basé sur la reconnaissance spécifique de certains épitopes d'allergènes par des anticorps spécifiques.
Il est donc possible de modifier cette réponse
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immunitaire en présentant à des patients un choix particulier d'épitopes allergiques ou non allergiques pour diagnostiquer une pathologie liée à une réponse immunitaire ou pour obtenir une prévention ou une thérapie de cette pathologie liée à une réponse allergique.
En particulier, il est possible de moduler cette réponse d'anticorps spécifiques chez des nouveaux-nés en additionnant une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire à la mère avant et/ou pendant la grossesse.
Comme le démontrent les figures 11 et 12, il est possible dans le procédé de diagnostic selon l'invention d'utiliser comme réfence marquée un pool d'immunoglobulines spécifiques d'un épitope d'unallergene caractéristique d'un profil épitopique normal (individus CM Tolérants) et de diagnostiquer les individus normaux (CM Tolérants par leur importants % d'inhibition) et les individus intolérants au lait de vache (CM Intolérants caractérisé par leur faible % inhibition).
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LIGAND DETECTION AND / OR QUANTIFICATION METHOD
SPECIFIC OF A RESPONSE-RELATED PATHOLOGY
ALLERGIC.
OBJECT OF THE INVENTION.
The present invention relates to a method for detecting and / or quantifying ligands specific for a pathology linked to an allergic response, an immunoreactive complex, one or more epitopes of an allergen, the antibody directed against said immunoreactive complex or against said epitopes, a detection device and / or a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition containing said immunoreactive complex, said epitopes and / or said antibody.
The present invention also relates to the use of said complex, said epitopes and said antibody for the prevention and / or therapy of pathologies linked to an allergic response.
Technological background and state of the art underlying the invention.
Allergy is a hypersensitivity reaction caused by contact with an allergen.
Allergy in humans is dependent on genetic predispositions, but various environmental factors can influence the development of allergic manifestations.
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Respiratory allergic manifestations (asthma, hay fever, ...) or cutaneous (hives, eczema, ...) or digestive, nervous, renovesical, cardiac, articular, ocular manifestations can be due to absorption or in contact with the handling of products of animal origin (hair), plants (wood dust, textile fibers, pollen, ...) or chemicals (antibiotics, neuroleptics, ...).
In addition, numerous clinical studies have suggested a relationship between the hypersensitivity reaction and cancer, in particular between respiratory atopy and cancer of the mucosal surfaces (Meers PD, Allergy and Cancer, Lancet 1983,1, pp. 884 -885).
The immune reaction to certain allergies such as anaphylaxis or atopy is one of the forms of allergy including immediate hypersensitivity.
The allergic immune reaction involves class E immunoglobulins (IgE).
The complex formed between specific allergens and IgE binds to basophil cells which induce the release of molecules such as histamines, serotonin, heparin, ..., which can in particular cause prolonged constriction of muscle cells in the bronchi (Hood et al., Immunology, second edition, from Benjamin / Cumming Publishing Corporation, Inc. (1984)).
Different techniques have been proposed to diagnose the presence of IgE type antibodies against certain specific allergens (allergens involved in the allergic reaction to pollens, cat and dog hair, etc.) (Pharmacia-Cap System S, Phadebas RAST (ID, Phadezym RAST @, ...).
However, it appears that other classes of antibodies also react specifically against certain allergens (class of immunoglobulins such as IgM, IgA and IgG).
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In addition, it should be noted that class G immunoglobulins are, unlike class E immunoglobulins, present in greater amounts in a patient, especially in young children.
Class G immunoglobulin pools (characterized by a long half-life) can therefore be more easily detected.
Many studies have also been carried out on allergens and on specific epitopes thereof.
Thus, work has been carried out on the allergens present in cow's milk.
In particular, it has been recognized that it is possible to obtain a tolerance of infants with regard to milk by using, as a dietary product, extracts of a protein hydrolyzate from cow's milk.
In patent application EP-0 629 350, the use of a milk protein hydrolyzate for the preparation of a dietetic composition allowing the induction of a tolerance to cow's milk for children susceptible to develop is described. an allergy to cow's milk.
This milk hydrolyzate devoid of allergenic proteins is obtained by subjecting the allergens to a treatment with trypsin and chymiotrypsin in the presence of an elastase.
According to this document, it is shown that the treated children would have become tolerant towards cow's milk by the fact that they would present an attenuated cellular immune reaction.
Aims of the invention.
The present invention aims to develop a new method and a new device for detecting and / or quantifying ligands specific for a pathology linked to an allergic response.
A particular aim of the present invention is to develop said method and said device which could be used in the diagnosis of patients who
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may have low levels of class E immunoglobulins
The present invention also aims to provide a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition intended to modify the immune response of a patient with respect to an allergen and / or for the treatment and / or prevention of syndromes linked to immune pathology, especially allergies and / or cancer.
A further aim of the present invention is to use said composition prophylactically and / or therapeutically to modify the humoral and / or cellular immune response of a patient vis-à-vis an allergen, in particular if the patient is a new born.
Characteristic elements of the present invention.
The present invention relates to a new method for detecting and / or quantifying ligands specific for a pathology linked to an allergic response and present in a patient's body fluid (such as serum or cerebrospinal fluid), in which :
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a sample of the patient's body fluid is taken, the ligands present in the sample are reacted in a competition test with labeled ligands, said labeled ligands reacting with at least one allergen (preferably fixed on a solid support) specific for said pathology, and the inhibition of the reaction between the labeled ligands and the allergens specific to the pathology by the ligands present in the sample is detected and / or quantified.
The term "pathology linked to an allergic response" means hypersensitivity reactions of immediate or delayed type caused by contact with an allergen. This reaction can be immediate and specific (anaphylaxis, hives, ...) or delayed in time and less specific (diarrhea, vomiting, ...). This pathology can also be a syndrome
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hyperproliferation such as lung cancer linked to this phenomenon of immediate hypersensitivity, in particular respiratory atopy.
According to the invention, the ligands are chosen from the group consisting of APC cells (Antigen Presenting Cell such as macrophages, dendritic cells), receptors of APC cells, antibodies (monoclonal or polyclonal) as well as their fragments (portions Fab antibodies) and / or a mixture of them.
Preferably, the ligands according to the invention are class G immunoglobulins.
Preferably, the allergen is chosen from the group consisting of major allergens present in cow's milk, in particular bovine H-lactoglobulin (BLG), the major antigens intervening in allergic phenomena with regard to plants, ( in particular pollen allergens), animals (in particular the allergens present in the hair of animals, the allergens of venoms of animals, the mite antigen present in household dust, the antigens responsible for the allergy to mites, staphylococcal enterotoxin B (SEB), one or more epitopes of these allergens and / or a mixture of them.
(ref: ISBN 91-970475-5-4 Pharmacia AB)
The present invention also relates to an immunoreactive complex comprising at least one allergen linked to a ligand, optionally labeled, reacting specifically against this allergen.
The term "immunoreactive complex" means a specific bond between the allergens and the specific ligands described above, capable of being used in a device for detecting and / or quantifying ligands specific for the pathology linked to an allergic response.
Another aspect of the present invention relates to allergenic epitopes specific for a syndrome linked to an allergic response, in particular epitopes
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allergens of the bovine ss-lactoglobulin (BLG) antigen as described in Figures 14 to 16.
The present invention also relates to the antibody (monoclonal or polyclonal) directed against said immunoreactive complex or said allergenic epitopes according to the invention.
Another aspect of the invention relates to the device for detecting and / or quantifying a ligand specific for a pathology linked to an allergic response comprising said complex, said epitopes and / or said antibody according to the invention.
The device according to the present invention further comprises reagents intended for the detection and / or quantification of said ligands by a method chosen from the group consisting of recognition by antibodies labeled, isotopically or non-isotopically, on a filter , on solid support, on gel, in solution, in "sandwich", by double immunodiffusion, by counter-immunoelectrophoresis, by hemagglutination and / or a mixture of them.
The present invention also relates to a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition intended to modify the humoral and / or cellular immune response of a patient with respect to an allergen, comprising said allergen, one or more epitopes of said allergen, the immunoreactive complex according to the invention, the antibody directs against this complex and / or a mixture of them.
The term "modification of the humoral and / or cellular immune response of a patient vis-à-vis an allergen" means the modification of the pool of antibodies reacting specifically against certain allergic epitopes, c that is, the ability for a patient to have an antibody production comparable to that of a healthy subject as diagnosed in the examples of the description.
Advantageously, the patient is a newborn and the composition is administered to the mother before and / or during
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the pregnancy.
A final aspect of the present invention relates to the use of said pharmaceutical composition for the preparation of a medicament intended to modify the humoral and / or cellular immune response of a patient towards an allergen and / or for the treatment and / or prevention of pathologies linked to an allergic response, in particular the treatment and / or prevention of allergies and / or cancers.
According to a preferred embodiment of this use, the patient is a newborn and the composition is administered to the mother before or during pregnancy.
Brief description of the figures.
Figures 1 to 7 show the influence of oral administration of a milk hydrolyzate on the immune response of an adult individual to ss-lactoglobulin.
Figures 8 and 9 show the modulation of the anti-ss-lactoglobulin antibody response of newborns according to their mother's milk supply.
Figures 10 to 12 show. measuring the inhibition of a pool of IgG immunoglobulins labeled by the serum of healthy patients and intolerant to a particular allergen.
FIG. 13 represents the measurement of the inhibition of a monoclonal antibody labeled by the serum of a healthy patient and intolerant to an allergen.
FIGS. 14 to 16 represent the specific recognition of certain linear epitopes of the allergen BLG by pools of serum immunoglobulins
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healthy patients with allergy or lung cancer.
Examples.
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1. Influence of dmjmstratrion ore of a hvdroyC de lai on the response TUG and G and I; M of mice addicted to ss-lactoglobulin.
Since the invention of antibody detection tests by the use of a surface covered with an antigen such as RASTS and ELISAS (solid phase), measuring antibodies of lower affinity than previous tests (RIA; phase liquid), we noticed one thing that remains surprising, although never emphasized: many antigens capable of inducing an allergic response by antibodies of class IgE in patients, are also capable of inducing antibodies of class IgG in all individuals, including healthy subjects, atopic or not.
This is the case of ss-lactoglobulin (BLG), lactalbumin and casein, the major antigens of cow's milk (LV), or of pollens, DPT and various molds for aeroallergens.
However, it is not enough that a protein is ingested to induce this response; not everyone makes such antibodies against beef albumin or wheat gliadin, for example. Considering allergy as a particular case of a generally widespread immune response, it is important to also analyze this response in non-allergic subjects, because it already distinguishes certain antigens among other food proteins.
The anti-BLG IgG response (and IgA) is directed against epitopes which differ partially between symptomatic allergic subjects and cured or healthy subjects.
Syngeneic mice of three distinct strains (one domestic, the other BalbC and C57Bl) fed without milk for at least 5 generations and 6 weeks old were divided into equal groups of 8 animals and subjected to different diets (see fig 1).
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The first consisted of receiving water as the sole drink for 72 days, the other consisted of receiving water for 6 weeks and then a commercial cow's milk hydrolyzate (NANHA S from Nestlé) for 30 days. Then, all the mice received cow's milk diluted 1/3 in their drinking water. The IgG and IgM antibodies are measured on day 0 (start of whole milk at 1/3) and 30 days later against ss-lactoglobulin (BLG) as a representative of the allergenicity of milk, by a method of ELISA, using intact BLG (n-BLG in its native state) and peptides obtained by pepsin digestion of BLG (d-BLG) (see figs. 2 to 7).
It appears that: - the diet consisting of granules declared without the addition of milk is not, however, entirely devoid of milk antigens (contamination during production). However, the measurements show that the intake is 30 times lower than that of the antigenic equivalent provided by the milk hydrolyzate.
This explains why even the mice receiving only water as a drink have developed anti-BLG antibodies; - the pre-nutrition of mice to the milk hydrolyzate clearly influences the IgM and IgG response vis-à-vis ss-lactoglobulin; - this depends on the selected strain and therefore indicates a genetic determinism; - finally, the specificity of the antibodies is thus modifiable since the titers measured on n-BLG and d-BLG do not vary in parallel, thus indicating a different modulation according to the category or the type of epitopes (here, conformational; versus structural );
- this is observed for IgM (short half-life) (see figs. 2 and 3) but already observable also for IgG (see figs. 5 and 6).
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2. Modulation of the mouse anti-BLG anti-corp response at the time of weaning according to their mother's milk supply.
In this same model, whole milk is administered at a concentration of 1/1 or 1/30 in drinking milk to mice of reproductive age and belonging to the domestic strain. Antibodies of mice are measured at 4 weeks of age, taking into account the time between the start of the maternal diet and the date of birth (and therefore conception) (see figs. 8 and 9).
It appears that the diet of the mother undeniably varies the titles and the specificity of the antibodies of her offspring according to the time between the establishment of the maternal diet and that of the conception, and on the other hand according to the quantitative contribution of milk.
All of these data make it possible to show that both quantitative and qualitative manipulations of the dietary ratio of milk antigens have an influence on the immune response of adult mice, both for the titer of the antibodies and for the epitopic specificity. This is true for their own answer and for the one that will appear in their offspring. This influence of the response of the offspring by the manipulation of the maternal diet makes it probable the hypothesis of a manipulation of the response of babies against the milk antigens by modifying the intake and the quality of the milk antigens supplied to the mother. before and during her pregnancy.
It is therefore possible to bring in a newborn an immune tolerance (humoral, but probably also cellular) towards a syndrome linked to an allergic response by treating the mother of the newborn before and / or during her pregnancy. This prophylactic treatment therefore makes it possible to avoid in a patient a heavy therapeutic treatment of long duration and costly during childhood and / or adolescence.
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3. Diagnosis of groups of individuals with syndromes linked to an allergic response. at. Allergic response to ss-lactoalobulin.
The ss-lactoglobulin from cow's milk used as an allergen is fixed on a solid support.
Groups of individuals are identified by a competition test between labeled immunoglobulins (these immunoglobulins are attached to biotin and revealed by the reaction of a peroxidase enzyme linked to polystreptavidin) and patient sera (ELISA test) .
The serum of 44 healthy individuals (tolerant CM) and 44 individuals with intolerance to cow's milk (intolerant CM) was analyzed.
Analysis of these results indicates that it is possible to identify groups of healthy individuals who are intolerant to cow's milk in terms of their specific reaction to the allergen (see fig. 10).
This reaction is also observed with allergens consisting of the allergen BLG native (n-BLG) or digested with pepsin (d-BLG) (see figs. 11 and 12).
A competition test was also carried out using competition between monoclonal antibodies from M7 mice labeled as above and sera from patients.
Fig. 13 gives the result of this competition test which identifies healthy individuals (44 tolerant CM and 65 blood donors (BD)) and the 44 individuals with intolerance to cow's milk (intolerant CM).
Consequently, certain monoclonal antibodies make it possible to preferentially identify in this competition individuals with intolerance to cow's milk. b. Characterization of the linear epitopes of a specific alleraene of certain syndromes.
A relationship between atopy and lung cancer
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has been described in various publications (Mc Duffie HH et al., Chest 1988; 93 pp. 241-246; Chest 1991; 99 pp. 404-407, and Michils et al., Cancer 1992; 69 pp. 2252-2257) .
Certain allergens (BLG, mite pl antigen present in household dust (Dermatophagoides pteronyssinus) induce the production of immunoglobulins in cancer patients.
Consequently, the Applicant has sought to identify the specific linear epitopes of the BLG allergen capable of reacting with immunoglobulins G present in the serum of cancer patients.
Octapeptides composing a successive sequence of 8 amino acids are synthesized on a solid phase in the order of the primary structure of BLG.
Next, peptides are revealed which have made it possible to fix biotinated immunoglobulins G and originating from a pool of 12 subjects, who are either allergic to milk, or normal, or suffering from lung cancer.
The antibody binding is revealed by streptavidin coupled to ss-galactosidase (see figs. 13 to 15). In these figures, certain particular epitopes are identified which are recognized only by pools of immunoglobulins from a serum of patients suffering from lung cancer or only recognized by the immunoglobulins present in the serum of a patient allergic to milk.
Consequently, it is possible to characterize a precise "signature" of a pathology (allergy, cancer, cancer and allergy).
In conclusion, on the basis of the above-mentioned examples, it is possible to characterize a pathology linked to an allergic response by the fact that the immune system of healthy patients compared to sick patients is based on the specific recognition of certain allergen epitopes by specific antibodies.
It is therefore possible to modify this answer
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immune system by presenting patients with a particular choice of allergic or non-allergic epitopes to diagnose a pathology related to an immune response or to obtain prevention or therapy of this pathology related to an allergic response.
In particular, it is possible to modulate this specific antibody response in newborns by adding a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition to the mother before and / or during pregnancy.
As shown in FIGS. 11 and 12, it is possible in the diagnostic method according to the invention to use as marked reference a pool of immunoglobulins specific for an allergen epitope characteristic of a normal epitopic profile (CM individuals Tolerant) and to diagnose normal individuals (CM Tolerant by their high% inhibition) and individuals intolerant to cow's milk (CM Intolerant characterized by their low% inhibition).