NL8701616A - Fructosyltransferase en bereiding van fructose-oligomeren daarmee. - Google Patents

Description

♦

JdB/JAS/WP/ag j? STAMICARBON B.V.

Uitvinders: Theodorus J.G.M. van Dooren te Roermond Johannes A.M. van Balken te Susteren -1- (11) PN 5679

FRUCTOSYLTRANSFERASE EN BEREIDING VAN FRUCTOSE-OLIGOMEREN DAARMEE

De uitvinding heeft betrekking op de bereiding van fructosyl-transferase uit een kweek van een Aspergillus-soort, op een daarvan verkregen fructosyltransferase-enzympreparaat en op de toepassing daarvan bij de bereiding van fructose-oligomeren waarvan de moleculen 5 zijn opgebouwd uit één glucose-eenheid en twee of meer fructose-eenheden.

Er is een toenemende belangstelling voor dergelijke fructose- oligomeren vanwege hun gunstige eigenschappen als calorie-arme en niet-cariogene zoetstoffen, wetke fructose-oligomeren voor het overige 10 de goede eigenschappen van sucrose bezitten, zoals is beschreven in GB-A-2.072.679 (overeenkomend met NL-A-81.Q1587) en DE-A-3.232.531.

Ook kunnen dergelijke fructose-oligomeren worden verwerkt tot hoogwaardige fructosestropen zoals is beschreven in US-A-4.276.379; US-A-4.423.150 en US-A-4.317.880 (overeenkomend met NL-A-81.02642).

15 Uit GB-A-2.072.679 en DE-A-3.232.531 is bekend dat fructosyl- transferase en fructosyltransferase-enzympreparaten op zeer uiteenlopende wijze kunnen worden verkregen, met name uit kweken van schimmels, zoals Aspergillus-, Pennicillium-, Fusarium-, Gloesporiumsoor-ten, uit kweken van gisten, zoals Saccharomyces-, Rhodotorulla-, 20 Pichia-, Hansenula-, Candida-, Aureobasidiumsoorten en ook uit sommige planten, zoals Asparagus officinalis (asperge) en Helianthus tuberosus (aardpeer). In deze octrooipublicaties wordt in de voorbeelden de bereiding beschreven van een fructosyltransferase-enzympreparaat uit een kweek van Aspergillus niger, alsmede de toepassing van dat enzym-25 preparaat voor de bereiding van een fructose-oligomeren bevattende weinig cariogene en calorie-arme zoetstof. Er wordt niet vermeld of, en zo ja in hoeverre, de met verschillende micro-organismen verkregen enzympreparaten van elkaar verschillen.

8701616 -2- (11) PN 5679

Het is bekend dat met verschillende micro-organismen bereide enzympreparaten aanmerkelijk kunnen verschillen. Echter kunnen ook met een bepaald micro-organisme onder verschillende procesomstandigheden bereide enzympreparaten duidelijke verschillen vertonen.

5 Onder fructosyltransferase of fructosyltransferase-enzym wordt elk enzym verstaan dat de transfructosylering katalyseert. Onder transfructosylering wordt de overdracht verstaan van een fructosyl-groep van een donor, bijvoorbeeld sucrose, naar een acceptor, bijvoorbeeld sucrose, kestose, nystose enz. De structuren van de enzymen zijn 10 niet bekend.

Bij de kweek uit micro-organismen wordt fructosyltransferase verkregen in de vorm van een fructosyltransferase-enzympreparaat, waaronder elk product wordt verstaan dat de gewenste enzymatische activiteit vertoont. Een enzympreparaat bevat meestal componenten die 15 inactief zijn en kan ook componenten bevatten die een andere enzymatische activiteit vertonen. Enzympreparaten kunnen bestaan uit levende gehele cellen, droge cellen, celextracten, gezuiverde en geconcentreerde preparaten en geconcentreerde preparaten afkomstig van cellen en van kweekmedia, enz.

20 Fructosyltransferase-enzympreparaten bezitten meestal ook invertase-activiteit en in sommige gevallen blijken ze eveneens isomerase-activiteit te bezitten. De invertase-activiteit is ongewenst, omdat daardoor een deel van de sucrose door de splitsing in glucose en fructose niet beschikbaar is voor de omzetting in fructose-25 oligomeren.

Gevonden werd nu dat een fructosyltransferase-enzympreparaat met gunstige eigenschappen kan worden bereid door de schimmel Aspergillus phoenicis in een voor schimmelculturen geschikt kweek-medium te kweken en het mycelium uit het kweekmedium te winnen.

30 Uit EP-A-81.200.723 (overeenkomend met NL-A-80.03723) is bekend dat uit cultures van Aspergillus phoenicis inulinase- enzympreparaten kunnen worden gewonnen. Daarbij wordt de schimmel voorgekweekt op een gebruikelijke voedingsbodem die meestal inuline bevat. De sporen worden geoogst en overgebracht in een kweekmedium, 35 dat eveneens inuline bevat. Na een geëigende incubatietijd bevat het 8701616 * -3- (11) ΡΝ 5679 kweekmedium inulinase. Het inulinase blijkt niet celgebonden te zijn en kan met de vloeistoffase van het mycelium worden gescheiden.

Volgens de onderhavige uitvinding kan op overeenkomstige wijze op een voedingsbodem, die nu meestal sucrose zal bevatten, fruc-5 tosyltransferase worden bereid. Deze fructosyttransferase is cel- gebonden en worden gewonnen door het mycelium van de vloei stoffase te scheiden. Voorzover er bij afwezigheid van sucrose fructosyltrans-ferase wordt gevormd gebeurt dat in geringe hoeveelheden. Teneinde ten minste enigszins redelijke opbrengsten aan fructosyltransferase te 10 kunnen verkrijgen is het noodzakelijk dat het kweekmedium sucrose bevat.

De volgens de uitvinding verkregen fructosyltransferases kunnen geklassificeerd worden als EC 2.4.1.99 volgens "Enzyme Nomenclature Recommendation 1984" van de International Union of Biochemistry.

15 Alhoewel het in beginsel mogelijk is om in eenzelfde kweek van Aspergillus phoenicis zowel inulinase als fructosyltransferase te bereiden en daaruit zowel een inulinase-enzympreparaat als een fructosyltransferase-enzympreparaat te winnen, verdient het de voorkeur om de kweek al naar de behoefte expliciet te richten op de 20 vorming van inulinase of op de vorming van fructosyltransferase. Inu-line resp. sucrose in het kweekmedium zijn de belangrijkste factoren om de vorming van inulinase resp. fructosyltransferase te bewerkstelligen.

Binnen het kader van de onderhavige uitvinding zijn vele 25 varianten mogelijk die de deskundige gemakkelijk zal kunnen uitwerken.

Zo kan men bijvoorbeeld de kweek beginnen onder omstandigheden die gunstig zijn voor de vorming van inulinase in een daarvoor gunstig medium. Na een geschikt tijdsverloop wordt het kweekmedium met daarin de inulinase van het mycelium gescheiden, waarna het mycelium verder 30 gekweekt wordt in een ander voor de vorming van fructosyltransferase gunstig medium onder daarvoor gunstige omstandigheden. Door in het kweekmedium zowel sucrose als inuline op te nemen kan men beide enzymen tegelijk verkrijgen, maar dat is voor geen van beide enzymen optimaal en daarom zal men in het algemeen aan afzonderlijke bereidingen 35 de voorkeur geven. Met de meeste voorkeur voert men de kweek zo uit 8701616 * -4- (11) PN 5679 dat deze vanaf het begin is gericht ofwel op de vorming van inulinase of op de vorming van fructosyltransferase. Het spreek vanzelf dat zowel de uitvinding als de mogelijke varianten binnen het kader van de uitvinding niet beperkt zijn tot de hiervoor uiteengezette uit-5 voeringsvormen.

De onderhavige werkwijze heeft de bereiding van fructosyl-transferase ten doel. Hen zal daarom in het kweekmedium sucrose opnemen en in het algemeen zal men ook de overige kweekomstandigheden zodanig kiezen dat de vorming van fructosyltransferase optimaal 10 verloopt.

Bijzonder geschikt voor de bereiding van fructosyltransferase is Aspergillus phoenicis CBS 294.80, die door aanvraagster gedeponeerd is bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn, of een mutant of variant daarvan. Voor een beschrijving van Aspergillus 15 phoenicis wordt verwezen naar "The Genus Aspergillus" door K.B. Raper en D.I. Fennel (Baltimore 1965) biz. 307-309.

Het volgens de onderhavige uitvinding te gebruiken micro-organisme, de schimmel Aspergillus phoenicis, bij voorkeur de door aanvraagster gedeponeerde Aspergillus phoenicis CBS 294.80 of mutanten 20 of varianten daarvan kan men op een gebruikelijke voedingsbodem voorkweken, bijvoorbeeld op een vaste, gedurende 30 minuten bij 11 One gesteriliseerde voedingsbodem met de samenstelling: 20 g agar, 100 g sucrose, 5 g K2HPO4, 1 g NaCl, 3 g gistextract, 0,2 g MgS04.7 H2O, 0,1 g FeS04.7 H2O, 0,1 g HnS04«4 H2O per liter water. De pH daarvan is 25 6,8. Er wordt ten minste 8 dagen bij 28«C voorgekweekt. De sporen wor den geoogst. Een vloeibare voedingsbodem met dezelfde samenstelling als de vaste voedingsbodem, maar zonder agar, wordt geënt met de sporen. De myceliumkweek geschiedt op daarvoor gebruikelijke wijze.

Het gekweekte mycelium kan dan worden afgefiltreerd. Het mycelium 30 bevat celgebonden fructosyltransferase en kan als zodanig worden gebruikt voor de transfructosylering van sucrose. Het mycelium kan ook verder worden behandeld, opgewerkt of verwerkt. Na affiltreren en meestal na uitwassen kan men het bijvoorbeeld homogeniseren in een snellopende menger.

35 Het zal duidelijk zijn dat de schimmel Aspergillus phoenicis 8701616 * -5- (11) PN 5679 op elke andere geschikte voedingsbodem volgens elke andere geschikte wijze kan worden gekweekt. Zoals hiervoor vermeld wordt de vorming van fructosyltransferase bevorderd door sucrose In de kweekmedia. Het grootste effect wordt verkregen door sucrose In de vloeibare voedings-5 bodem voor de kweek van het mycelium. Het is echter ook gewenst om de vaste voedingsbodem voor het kweken van de sporen sucrose te doen bevatten.

De onderhavige fructosyltransferases blijken de bereiding van fructoseoligomeren, die bestaan uit één glucoserest en twee of meer 10 fructoseresten, uit sucrose met goede opbrengsten te doen verlopen bij een pH tusen 5,5 en 9,5. De fructosyltransferase-activiteit bereikt een maximale waarde in het pH-gebied van 7,0 tot 9,5. Bij voorkeur ligt de pH tussen 7,0 en 9,0. De altijd optredende invertase-activiteit van fructosyltransferases blijkt bij een toenemende pH 15 vanaf een pH van 5,5 snel af te nemen en bij een pH van 7,0 een geringe waarde te bereiken, die bij verder stijgende pH weliswaar langzamer, maar gestadig blijft afnemen. In het pH-gebied van 7,0 tot 9,0 is de verhouding van de activiteiten van fructosyltransferase en invertase groot, hetgeen zeer gewenst is. Kortheidshalve zullen de 20 verschillende suikers hierna door symbolen worden aangeduid. G stelt daarbij glucose of een glucoserest voor en F fructose of een fructose-rest. GF stelt sucrose voor GF2 een uit één glucoserest en twee fruc-toseresten samengestelde suiker zoals 1-kestose, 6-kestose, neokestose, GF3 een uit één glucoserest en drie fructoserestem 25 samengestelde suiker zoals nystose enz.

Het is buitengewoon verrassend dat het gunstige activiteits-gebied van de onderhavige fructosyltransferase-enzympreparaten bij dergelijke hoge pH-waarden ligt. Tot nu toe bekende fructosyltransferases werken optimaal bij pH-waarden beneden 7,0.

30 Volgens US-A-4.317.880 dient bij de transfructosylering met een uit een kweek van de gist Putlularia pullulans gewonnen fructosyl-transferase-enzympreparaat de pH tussen 6,3 en 6,7 te liggen. Kweken van gisten kunnen meestal moei li jker worden opgewerkt dan kweken van schimmels en met name zijn de kweken van gisten slechter fiItreerbaar.

35 Uit gisten verkregen enzympreparaten zijn ook minder thermostabiel, 8701616 -6- (11) PN 5679 d.w.z. dat bij toenemende temperaturen de activiteit van een dergetijk enzympreparaat eerder gaat afnemen dan de activiteit van uit schimmels gewonnen enzympreparaten, en ook eerder geheel verloren gaat. Dit brengt met zich dat uit schimmels gewonnen enzympreparaten en met name 5 de onderhavige fructosyltransferase-enzympreparaten, die uit kweken van Aspergillus phoenicis zijn gewonnen, bij hogere temperaturen kunnen worden gebruikt dan uit gisten gewonnen enzympreparaten, hetgeen vele voordelen heeft. De onderhavige enzympreparaten onderscheiden zich in dit opzicht ook gunstig ten opzichte van uit andere schimmels 10 gewonnen fructosyltransferases, zij het minder uitgesproken dan dat ten opzichte van uit gisten verkregen preparaten het geval is.

JP-A 85-41497 beschrijft de bereiding van fructosyltrans-ferases in een kweek van een gist van het Aureobasidiumtype en de transfructosylering met een zo verkregen enzympreparaat bij een pH van 15 5,0 tot 6,0.

Volgens GB-A-2.072.679 dient de pH bij de transfructosylering tussen 4,0 en 7,0 te liggen.

In US-A-4.276.379 en US-A-4.423.150 wordt geen optimale pH genoemd, maar alle transfructosyleringen zijn uitgevoerd bij een pH 20 van 5,5*

Zoals hiervoor is opgemerkt onderscheiden de onderhavige fructosyltransferases zich van andere bekende, uit schimmelcultures verkregen fructosyltranferases bovendien door een verbeterde thermo-stabiliteit, d.w.z. dat de activiteit van de onderhavige fructosyl-25 tranferases bij toenemende temperaturen langer behouden blijft en dat de vermindering van de activiteit langzamer verloopt dan van andere fructosyltransferases. Bij een bepaalde temperatuur is de activiteit van de onderhavige fructosyltransferases stabieler dan de activiteit van bekende fructosyltransferases. De optimale temperatuur voor de 30 bereiding van fructose-oligomeren uit sucrose ligt hoger. De optimale temperaturen voor de transfructosylering met de onderhavige fruc-tosyltransferase liggen tussen 55n en 65nc. Door een geschikte keuze van de procesomstandigheden, die men gemakkelijk experimenteel kan vaststellen, kan men daardoor de transfructosylering bij zodanige tem-35 peraturen uitvoeren dat er geen of vrijwel geen infectie van het reac- 8701618 -7- (11) PN 5679 tiemengsel meer kan optreden. Dat is een bijzonder groot voordeel, want met de bekende enzympreparaten is dat niet mogelijk, of loopt de activiteit bij temperaturen waarbij infectie effectief kan worden tegengegaan, zo snel terug, dat de werkwijze economisch niet meer uit-5 voerbaar is. Doordat bekende systemen bij lagere temperaturen moeten worden gebruikt kan infectie van sucrose en enzympreparaten bevattende reactiemengsels niet of nauwelijks effectief worden voorkomen of tegengegaan. De vrijwel niet te vermijden infecties van dergelijke reaktiesystemen zijn uiteraard zeer bezwaarlijk en het is dan ook zeer 10 gewenst om die te kunnen voorkomen. Alle pogingen om een oplossing hiervoor te vinden zijn tot nu toe mislukt. De onderhavige uitvinding biedt nu tevens een oplossing voor dit probleem. Desgewenst kan men de onderhavige fructosyltransferase-enzympreparaten ook nog immobiliseren waardoor de optimale transfructosyleringstemperatuur meestal wordt 15 verhoogd. Dit kan van belang zijn om de activiteit bij temperaturen waarbij geen of vrijwel geen infectie meer optreedt verder te stabiliseren, zodat de afname van de activiteit nog langzamer verloopt.

Het imfflobiLi.seren van de onderhavige fructosyltransferases kan ook of mede gewenst zijn voor uiteenlopende andere doeleinden, 20 zoals bijvoorbeeld om het enzym in een vast of gefluldiseerd bed te kunnen gebruiken. De immobilisatie kan volgens algemeen bekende technieken worden bewerkstelligd. Hiervoor wordt verwezen naar "Immobilized Microbial Cells" door Ichiro Chibato en Lemuel B. Wingard Jr. (Academic Press 1983) en naar het overzichtsartikel van Howard H.

25 Weetall en Wayne H. Pitcher Jr. in Science 232 1396-1403 (1986).

Een zo hoog mogelijke transfructosyleringstemperatuur is ook gewenst voor een gunstige viscositeit van de meestal vrij sterk geconcentreerde suikeroplossingen. De veelal stroperigere oplossingen kunnen naarmate de temperatuur hoger is door de vermindering van de 30 viscositeit beter worden gehanteerd en gemakkelijker worden gefiltreerd. Geconcentreerde suikeroplossingen blijken verschillende voordelen op te leveren. Zo blijkt de sucroseconcentratie de fructosyltransferase-activiteit te beïnvloeden. Gunstige activiteiten treden op bij sucroseconcentraties tussen 25 en 90 gew.% sucrose per 35 liter oplossing. Zoals hiervoor vermeld is het gewenst dat de 87 0161 6 ft * -8- (11) PN 5679 verhouding van de fructosyltransferase-activiteit tot de invertase-activiteit zo groot mogelijk is. De grootste waarden van die verhouding treden op bij sucroseconcentraties van 75 tot 82,5 % Cgew/vol). Verrassenderwijze blijkt ook de thermostabiliteit van het 5 enzym door de sucroseconcentratie te worden beïnvloed en wordt de grootste thermostabiliteit verkregen bij sucroseconcentraties die eveneens tussen 75 en 82,5 gew.% liggen, zodat bij die concentraties de hoogste temperaturen kunnen worden toegepast.

Een andere gunstige eigenschap van de onderhavige fructosyl-10 transferases is dat bij de transfructosylering vrijwel uitsluitend 1-kestose (6F2) en nystose (GF3) worden gevormd. GF4 en hogere oligo-meren kunnen niet worden aangetoond. Van de mogelijke GF2 isomeren ontstaat 1-kestose en geen 6-kestose en neokestose. De hoeveelheid glucose die bij de transfructosylering in het systeem ontstaat wordt 15 tot een minimum beperkt doordat in overwegende mate kestose wordt gevormd. Door de geringe invertase-activiteit blijft de suikerinversie zeer beperkt zodat ook daardoor slechts weinig glucose ontstaat. Het eindproduct bevat relatief weinig glucose.

De bij de onderhavige werkwijze te gebruiken sucrose kan 20 zowel vrijwel zuivere sucrose in de vorm van beetwortel- of rietsuiker, als een technisch suikerhoudend product, zoals melasse e.d. zijn.

Alhoewel in beginsel elk sucrose bevattend product voor de transfructosylering kan worden gebruikt zal men bij voorkeur van pro-25 ducten met een hoog sucrosegehalte uitgaan die geen storende verontreinigingen bevatten.

De uitvinding wordt verduidelijkt door de volgende voorbeelden zonder daardoor te worden beperkt.

De reactiemengsels die bij de transfructosylering van sucrose 30 werden verkregen zijn geanalyseerd door hoge druk vloei stofchroma-tografie (HPLC).

De in de voorbeelden vermelde fructosyltransferase activiteit wordt uitgedrukt in micromolen (μπι) fructoseoligomeren (hier uitsluitend GF2 en GF3) die per minuut per g droog mycelium worden 35 gevormd. De activiteit van het in geringe hoeveelheden aanwezige 8701616 ί -9- (11) ΡΝ 5679 % invertase wordt gedefinieerd als het aantal μπιοί fructose dat per minuut per g droog mycelium ontstaat.

Voorbeeld 1

Een kweekmedium van 100 g sucrose, 5 g K2HPO4, 3 g gist-5 extract, 1 g NaCl, 0,2 g HgS04«7 H2O, 0,1 g FeS04.7 H2O, 0,1 g MnS(>4.4 H2O per liter oplossing werd geënt met sporen (eindconcentratie ongever 108 sporen per liter) van Aspergillus phoenicis CBS 294.80. De schimmel werd 2 dagen bij 30ac in een schudincubator gekweekt. Daarna werd het mycelium afgefiItreerd, met water gewassen en vervolgens werd 10 het gemalen in een Virtis-menger. Bij 100 ml van een 75 X (gew/vol) sucrose-oplossing, waarvan de pH door middel van een fosfaatbuffer op 8,0 was ingesteld, werd 1 g nat (hetgeen overeenkomt met ongeveer 0,28 g droog) mycelium gevoegd. De oplossing werd op 55ac verwarmd en geroerd. Na verschillende reaktietijden werd een monster van de 15 oplossing genomen, afgekoeld en geanalyseerd op fructose, glucose, sucrose, 1-kestose (GF2) en nystose (GF3).

De resultaten zijn samengevat in tabel I.

TABEL I

reactietijd fructose glucose omgezette 1-kestose nystose 20 sucrose (GF2) (6F3) in uren g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml 1 0,4 3,5 11,6 5,2 1,7 4 1,0 10,0 34,5 18,1 4,7 8 1,7 1 5,8 53,2 28,2 7,5 25 1 2 2,3 1 8,4 60,8 31,7 8,6 18 2,9 20,2 65,6 28,2 13,3

De gemiddelde FT activiteit over het eerste uur was 756, van uur 1 tot uur 4 603 van uur 4 tot uur 8 360 en van uur 8 tot uur 12 128. De gemiddelde FT/I verhouding was over het eerste uur 7,5 van uur 30 1 tot uur 4 7,8 van uur 4 tot uur 8 6,4.

8701616 \ \ -10- (11) PN 5679

Voorbeeld 2

Voorbeeld 1 werd herhaald met dien verstande dat de trans-fructosylering bij 60nC werd uitgevoerd.

De resultaten zijn samengevat in tabel II.

TABEL II

reactietijd fructose glucose omgezette 1-kestose nystose sucrose (6F2) (GF3) in minuten g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml 15 <0,2 2,3 8,8 6,1 0,1 30 0,25 3,8 13,7 9,3 0,3 60 0,5 6,2 22,5 15,1 0,7 120 0,8 10,0 35,0 21,7 2,8 180 1,0 12,1 42,5 25,7 3,5 240 1,2 13,7 47,5 28,2 4,5

De FT activiteit is over de eerste 30 minuten 2250, van 30-60 minuten 1440, van 60-120 minuten 950, van 120-180 minuten 550, van 180-240 minuten 390.

De gemiddelde FT/I verhouding is over de eerste 30 minuten 14,5, van 30-60 minuten 14, van 60-120 minuten 9,5, van 120-180 minuten 8,5 en van 180-240 minuten 5,4.

Bij vergelijking met voorbeeld 1 dat bij 55**C werd uitgevoerd blijkt dat gedurende het eerste uur de activiteit meer dan tweemaal zo groot en de FT/I verhouding bijna tweemaal zo groot is.

8701616

Claims (9)

1. Werkwijze voor de bereiding van een fructosyltransferase-enzympreparaat door een Aspergillus-soort te kweken en uit de kweek een preparaat met fructosyltransferase-activiteit te winnen, met het kenmerk, dat men Aspergillus phoenicis kweekt en uit het 5 kweekmedium het mycelium wint.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men Aspergillus phoenicis CBS 294.80 of een mutant of variant daarvan kweekt en het mycelium wint.

3. Werkwijze volgens conclusies 1-2, met het kenmerk, dat het kweek- 10 medium sucrose bevat.

4. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men het mycelium absorbeert op resp. in, adsorbeert aan, of anderzins bindt aan een vast dragermedium.

5. Werkwijze voor het bereiden van fructose-oligomeren, die bestaan 15 uit één glucose-eenheid en ten minste twee fructose-eenheden door transfructosylering van sucrose met behulp van fructosyltrans-ferase, met het kenmerk, dat men een fructosyltransferase-enzympreparaat volgens één van de conclusies 1-4 toepast.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men de trans- 20 fructosylering uitvoert in een oplossing met een pH van 5,5-9,5.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men de trans- fructosylering uitvoert in een oplossing met een pH van 7,0-9,0.

8. Fructosyltransferase-enzympreparaat zoals verkregen volgens één van de conclusies 1-4. 25

9. Fructosyltransferase-enzympreparaat waarvan de fructosyl- transferase-activiteit in afhankelijkheid van de pH een maximale waarde doorloopt in het pH gebied van 7,0 tot 9,0. 8701616