NL1021258C2 - Werkwijze en inrichting voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof en toepassing daarvan. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze en inrichting voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof en toepassing daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof, op een inrichting voor een dergelijke werkwijze en op de toepassing daarvan.

Een belangrijke grootheid binnen het onderzoeksgebied van de 5 celbiologie en microbiologie is de celdichtheid. Deze grootheid, uitgedrukt in cellen/volume eenheid, bepaalt in hoge mate de voor de mens waarneembare effecten van celpopulaties. Een algenbloei, bijvoorbeeld, is gedefinieerd als de zichtbare verschijning van vrij drijvende algen of onderscheidenlijke verkleuring van oppervlaktewater en/of een celdichtheid van algen hoger 10 dan 2.000 cellen/ml water. Deze hoge dichtheden geven onder andere problemen voor oppervlaktewater op het moment dat de bloei eindigt doordat microbiële afbraak het water nagenoeg zuurstofloos maakt.

Het belang van het celdichtheid speelt behalve in de waterkwaliteitbewaking ook een rol in de snijbloemhandel. De bacteriële 15 besmetting van stengels en vaatstelsels en de dichtheid van bacteriële celpopulaties in het vaaswater hebben in hoge mate invloed op de duur van het vaasleven van snijbloemen.

Verder is een snelle bepaling van celdichtheden in het algemeen gewenst als onderdeel van productkwaliteitscontrole, hygiënebewaking, 20 afvalwaterzuivering, tuinbouwpraktijk, toxicologische (bodem-)onderzoek en HACCP procesbewaking en voedselveiligheid.

Als maat voor de celdichtheid van een celsuspensie kan bijvoorbeeld de lichtextinctie of lichttransmissie door een celsuspensie worden genomen. Een dergelijke aanpak komt tot uitdrukking in een 25 werkwijze waarin door uitdoving of doorlating van licht van een bepaalde 1021258 ' 2 golflengte (bijv. 550-600nm) de turbiditeit van een celsuspensie wordt vastgesteld.

Echter, bij lage cel dichtheden en/of bij zeer kleine cellen en/of aanwezigheid van andere deeltjes is de interactie met de lichtbundel niet 5 voldoende. Bacteriële celsuspensie van dichtheden onder 107 cellen/ml kunnen op die wijze dan ook niet worden onderzocht.

Er zijn in de afgelopen decennia vele methodieken ontwikkeld om de dichtheid van micro-organismen vast te stellen. Het is in dit verband belangrijk om te onderkennen dat er een verschil in urgentie is tussen het 10 bepalen van dichtheden van cellen zoals met de bovenbeschreven werkwijze voor het bepalen van de turbiditeit van een monster en dichtheden van levende cellen, die met turbiditeitsmetingen niet bepaald kunnen worden.

Voedingsmiddelen die bacteriën bevatten zijn in de meeste gevallen slechts gezondheidsbedreigend indien de bacteriën levend zijn. Dat laatste 15 is echter lang niet altijd het geval. Indien een voedingsmiddel met hoge bacteriële celdichtheid is gepasteuriseerd zijn daar middels microscopische methoden nog veel bacterie cellen in aan te treffen, maar deze vormen nauwelijks een gevaar voor de gezondheid. Hoewel het vanuit het oogpunt van hygiëne en kwaliteitscontrole ongewenst is dat grote aantallen dode 20 cellen in een voedingsmiddel aanwezig zijn, is in de meeste gevallen slechts het aantal levende cellen van interesse voor de onderzoeker.

Bacteriën, of in het algemeen gesteld, micro-organismen, komen het algemeen in het ons omringende milieu voor bij relatief lage populatiedichtheden van 103-107 cellen/ml. maar kunnen zelfs bij deze en 25 nog lagere dichtheden reeds gezondheidsbedreigend zijn.

Een zeer geschikte werkwijze voor het bepalen van het aantal levende cellen bij lage celdichtheid maakt gebruik van een kweekmethode. Als voorbeelden hiervan kunnen de MPN (most probable number) methode en plaattelling methode worden genoemd. Beide hebben het nadeel dat de 30 voor groei benodigde incubatietijd deze werkwijze zeer langzaam maakt.

1 o ? 1 2 5 8 j 3

Een bepaling van het aantal levende cellen bij lage dichtheid duurt middels kweektechnieken dan ook zeer lang en verbeteringen zijn zeer gewenst.

Indien bepalingen van het aantal levende cellen bij lage celdichtheid op een snelle wijze zou kunnen plaatsvinden zou reeds in een 5 vroeg stadium een eventuele besmetting zijn vast te stellen en zouden reeds in een vroeg stadium maatregelen genomen kunnen worden.

Een andere werkwijze voor het bepalen van de celdichtheid van levende cellen maakt gebruik van epifluorescentie microscopische technieken of een flow cytometrische methode waarbij individuele cellen 10 kunnen worden geteld en tevens specifiek kunnen worden aangekleurd om de levensvatbaarheid en/of de identiteit vast te stellen. Nadelen van deze werkwijzen zijn dat de bepalingen een zeer hoog niveau van expertise vereisen, dat de apparatuur daarvoor benodigd zeer kostbaar is, en dat de methoden zeer gevoelig zijn voor storende, met name deeltjesvormige, 15 substanties in de testvloeistof waardoor alleen bacteriepopulaties met een initiële dichtheid hoger dan 105 cellen/ml kunnen worden geanalyseerd.

Uit de stand der techniek zijn ook werkwijzen bekend waarbij de aanwezigheid van levende cellen kan worden vastgesteld door gebruikmaking van een specifieke bioluminescentie reactie tussen 20 luciferine/luciferase en ATP. Hierbij wordt de aanwezigheid van exclusief in levende cellen voorkomend ATP met behulp van een luminometer vastgesteld. De hoeveelheid licht die vrijkomt tijdens de reactie weerspiegelt het niveau van de aanwezige microbiële belading. Door toepassing van een microscopisch systeem in combinatie met vastleggen van de micro-25 organismen op een filter is het mogelijk om nauwkeurige tellingen van levende cellen uit te voeren. Nadeel van deze ATP bioluminescentie methode is echter dat zij kostbaar is vanwege de benodigde reagentia. Bovendien is het intracellulaire ATP niet beschikbaar voor het luciferase en moet uit de cellen worden vrijgemaakt voordat het kan worden gemeten. Dit 1091258 4 wordt bereikt middels lysis van de cellen met een geschikt detergens. Deze werkwijze is bijgevolg destructief.

Een algemeen probleem van de werkwijzen voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof is dat zij tijdrovend en/of duur 5 zijn.

De onderhavige uitvinding heeft ten doel een snelle en goedkope werkwijze voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof te verschaffen.

Aldus voorziet de onderhavige uitvinding in een werkwijze voor het 10 bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof waarbij voorafgaand aan het meten van een metabole snelheid van genoemde cellen met behulp van ten minste één meting, de cellen worden geconcentreerd in een gereduceerd volume van de testvloeistof.

Tevens voorziet de onderhavige uitvinding in een inrichting voor 15 het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof middels een werkwijze volgens de uitvinding.

Figuren 1 en 2 tonen uitvoeringsvormen van een inrichting voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof volgens de uitvinding.

20 Figuur 3 toont een voorbeeld van hoe een signaal van een meting in een inrichting volgens de uitvinding kan worden verkregen.

Figuur 4 toont een grafiek als resultaat van een meting van zuurstofconsumptie aan een testvloeistof voor en na concentratie van een bacteriële celsuspensie.

25 In een eerste aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof. Volgens de uitvinding omvat een dergelijke werkwijze de stap van het concentreren van cellen in een gereduceerd volume van de testvloeistof. In afwijking van de werkwijzen uit de stand der techniek heeft 30 deze stap het voordeel dat de cellen niet noodzakelijkerwijs gescheiden 1021258 5 worden van hun oorspronkelijke groeimilieu. Dit heeft tot gevolg dat niet slechts de potentiële activiteit van de cellen wordt gemeten, maar dat tevens de werkelijke activiteit van de cellen in hun milieu is vast te stellen.

Het concentreren van cellen in een gereduceerd volume van de 5 testvloeistof volgens de uitvinding wordt bij voorkeur uitgevoerd met behulp van een filtratie-inrichting, hierna te noemen een concentrator. Een geschikte concentrator omvat een vloeistofhouder en een plunjer, welke plunjer aan het uiteinde is voorzien van een voor de cellen ondoordringbaar filter. De stap van het concentreren volgens een werkwijze van de 10 uitvinding kan worden uitgevoerd door een testvloeistof in de vloeistofhouder te plaatsen en het filter met behulp van de plunjer door de testvloeistof te drukken. De positieve druk dwingt een deel van de testvloeistof door het filter waarbij de cellen in het afgenomen volume van de testvloeistof achterblijven.

15 Bij voorkeur wordt de stap van het concentreren van de cellen in een gereduceerd volume van de testvloeistof uitgevoerd tot een concentratie van 2 tot 100.000 maal de oorspronkelijke dichtheid, bij grotere voorkeur tot een concentratie van 100 tot 10.000 maal de oorspronkelijke dichtheid.

Een werkwijze volgens de uitvinding omvat voorts de stap van het 20 meten van een metabole snelheid van de cellen met behulp van ten minste één meting in het gereduceerd volume van de testvloeistof.

Voor het bepalen van een metabole snelheid van de cellen kan een meting op een groot aantal parameters worden uitgevoerd. Zo kan zeer geschikt de vorming van zuur worden bepaald door het meten van de pH.

25 Ook kan de omzetsnelheid of opnamesnelheid van een natuurlijk of synthetisch voedingssubstraat worden bepaald. De vakman is in staat om geschikte (voedings-)substraten te kiezen die kunnen worden toegepast om de metabole snelheid van de cellen vast te stellen. Hiertoe zijn onder andere fluorescente analogen van enzymsubstraten in de handel verkrijgbaar. Bij 30 voorkeur wordt de ademhalingssnelheid bepaald door het meten van het 1 n 9 1 2 5 8 i 6 veranderende zuurstofgehalte in het gereduceerd volume van de testvloeistof.

Aangezien het in veel gevallen mogelijk is om de beginwaarde van de te meten parameter op een andere wijze dan door meting te bepalen kan 5 een metabole snelheid in principe reeds worden vastgesteld middels het uitvoeren van slechts één meting.

Een dergelijke meting kan een elektrische meting, zoals een conductiviteitsmeting, een electrochemische meting, zoals middels een pH meting, een optische meting, zoals een fluorescente of chemoluminescente 10 meting of een optochemische meting omvatten. Bij voorkeur wordt in de onderhavige uitvinding een optochemische meting toegepast.

Het is algemeen bekend dat voor het vaststellen van de metabole snelheid van de cellen middels optische meting specifieke kleurstoffen kunnen worden toegepast. Zo kan de dehydrogenase activiteit van de cellen 15 worden vastgesteld met behulp van een tetrazolium zout, zoals 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride(CTC), 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride (INT), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) of 2,3-bis-20 (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT). Tevens is het mogelijk om bijvoorbeeld een intracellulair esterase assay met fluoresceïne diacetaat (FDA) toe te passen om de metabole snelheid van de cellen te bepalen. Ook kan ontkleuring van methyleen blauw of trypaan blauw, een fluorescente vetzuur probe zoals 11-dansylaminoundecaanzuur 25 (DAUDA) of een redox indicator als resazurine worden toegepast. Een uitgebreide beschrijving van geschikte kleurstoffen kan onder andere worden gevonden in de product catalogus van Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, VS. In het algemeen worden geschikte kleurstoffen voorafgaand aan de meting in een door de fabrikant voorgeschreven 30 hoeveelheid aan de testvloeistof toegevoegd. Over het gebruik en de wijze •109 1 2 5 8 ' 7 van toepassing van kleurstoffen voor het bepalen van metabole snelheden en activiteiten is zeer veel literatuur beschikbaar.

Bij voorkeur worden extracellulaire pH indicatoren of zuurstof indicatoren in combinatie met een optische meting volgens de uitvinding 5 toe gepast om de snelheid van zuurvorming of de ademhalingssnelheid als maat voor de metabole snelheid van cellen vast te stellen.

Grote voorkeur heeft een werkwijze voor het bepalen van een metabole snelheid van cellen waarbij een optochemische of chemo-optische sensor wordt toegepast om een verandering in de chemische samenstelling 10 van de testvloeistof als gevolg van metabole activiteit van de cellen vast te stellen. Hierbij dient de optische sensor in contact te staan met het gereduceerde volume van de testvloeistof.

Een optochemische sensor kan worden toegepast om bijvoorbeeld het zuurstofgehalte, de glucose concentratie of de pH of een andere 15 geschikte chemische parameter van de testvloeistof te meten.

Optochemische sensoren zijn bij de vakman bekend. Zo kunnen optochemische sensoren worden toe gepast zoals beschreven in US 5.541.113, US 5.611.998, US 5.866.433, EP 1 199 556, of US 6.254.829. Bij voorkeur wordt een optochemische sensor toegepast zoals beschreven in 20 WO 01/69243 en omvat een meting volgens de uitvinding de meting van het zuurstofgehalte of een verandering daarvan in een gereduceerd volume van de testvloeistof.

Een werkwijze volgens de uitvinding omvat voorts de stap van het berekenen van het aantal levende cellen in de testvloeistof. Voor het 25 berekenen van het aantal levende cellen in de testvloeistof met een eerste volume voorziet de onderhavige uitvinding in een werkwijzestap, waarin een waarde voor de metabole snelheid van de cellen in het gereduceerde volume wordt bepaald. Deze waarde kan worden bepaald door het vergelijken van de gemeten metabole snelheid in het gereduceerde volume 30 met corresponderende waarde in een tevoren gemaakte ijklijn. In deze ijlijn 1021258 1 8 is de waarde van de metabole snelheid van de cellen uitgezet als functie van hun dichtheid in een referentievloeistof.

Een voorbeeld van een dergelijke ijklijn omvat waarden voor de ademhalingssnelheid of voor een andere metabole snelheid van cellen zoals 5 die voorkomen of zoals die verwacht worden voor te komen in het te testen monster. De ijklijn dient metabole snelheden te omvatten zoals die in de testsituatie zullen worden bepaald. Om deze werkwijzestap volgens de uitvinding uit te voeren dient vooraf een parameter van de testvloeistof die zal worden gemeten te worden bepaald of gekozen.

10 De ijklijn geeft in een werkwijze volgens de uitvinding de referentiewaarden voor de te meten metabole snelheid weer als functie van de dichtheid van de cellen. Een ijklijn kan daarom zeer geschikt worden opgesteld door metabole snelheden te meten bij verschillende celdichtheden. De ijklijn zal ten minste de metabole snelheid gemeten bij twee 15 celdichtheden omvatten. Bij voorkeur omvat de ijklijn tevens waarden voor de metabole snelheid in de buurt van de te verwachten celdichtheid in het gereduceerde volume van de testvloeistof.

Bij het opstellen van een ijklijn kan gebruik worden gemaakt van dezelfde testvloeistof als die waarin de testmeting plaatsvindt, maar ook een 20 andere geschikte vloeistof waarin een metabole snelheid kan worden gemeten kan dienen als referentievloeistof voor het opstellen van een ijklijn. Bij voorkeur wordt de testvloeistof zelf toegepast bij de vervaardiging van een ijklijn.

Een werkwijze volgens de uitvinding kan in principe met alle 25 celtypen worden uitgevoerd. Zowel van humane cellen als dierlijke en plantaardige cellen, en tevens van celorganellen (zoals bijvoorbeeld mitochondria), maar ook van protozoën, schimmels, gisten, archaea of bacteriën kan het aantal levende cellen in een testvloeistof bepaald worden. De onderhavige uitvinding is uitermate geschikt voor toepassing in 30 microbiologische vakgebieden. Bij voorkeur worden daarom in een 1 02 i 2 5 8 ' 9 werkwijze volgens de uitvinding de aantallen van levende bacteriën bepaald.

In een tweede aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een inrichting voor het bepalen van het aantal levende cellen in een 5 testvloeistof middels een hierboven omschreven werkwijze.

Mogelijke uitvoeringsvormen van een dergelijke inrichting zijn weergegeven in de Figuren 1 en 2. De inrichting omvat een concentrator (1) en een meetinrichting (7). De concentrator (1) zelf omvat een vloeistofhouder (2) voor het ontvangen van een testvloeistof met cellen. De houder (2) is 10 voorzien van een bodem (3) en daarop aansluitende wanden (4). Een geschikt volume van de vloeistofhouder (2) kan variëren tussen ongeveer 10 μΐ en ongeveer 1 liter. Bij voorkeur is het volume van de vloeistofhouder (2) tussen ongeveer 1 ml en ongeveer 250 ml, bij grotere voorkeur tussen 10 ml en 60 ml.

15 Ingeval van toepassing van een optochemische sensor die in contact staat met het gereduceerd volume kan een optochemische sensor zeer geschikt worden aangebracht op de bodem (3) van de vloeistofhouder (2). In dat geval zal de meetinrichting (7) gepositioneerd zijn ten opzichte van de bodem (3) van de vloeistofhouder (2) zoals zichtbaar in Figuur 1.

20 Echter, een optochemische sensor kan ook op andere posities in een vloeistofhouder (2) volgens de uitvinding worden aangebracht zolang contact tussen de sensor en het gereduceerd volume van de testvloeistof plaatsvindt. Corresponderend zal de meetinrichting (7) in dat geval ten opzichte van de optochemische sensor worden gepositioneerd.

25 In alle gevallen waarin middels toepassing van optische werkwijzen een meting aan een gereduceerd volume van de testvloeistof wordt uitgevoerd dient vloeistofhouder (2) ten minste gedeeltelijk optisch transparant te zijn om een optische meting middels meetinrichting (7) mogelijk te maken.

1021258 < 10

In geval van toepassing van een kleurstof voor het meten van een metabole snelheid van cellen in een gereduceerd volume van de testvloeistof zal de kleurstof in de meeste gevallen homogeen over het gereduceerde volume van de testvloeistof zijn verdeeld. Voor het uitvoeren van een 5 optische meting zal ten minste een gedeelte van vloeistofhouder (2) het karakter van een cuvet (9) met optische eigenschappen kunnen hebben, bijvoorbeeld doordat in ten minste een deel van de wanden (4) en/of de bodem (3) een kwartsglas is toegepast (zie Figuur 2). Hiertoe kan in principe ieder lichtdoorlatend materiaal worden toegepast. Tevens kan het in 10 bepaalde gevallen zinvol zijn om de vloeistofhouder (2), op de positie waar meting aan het gereduceerde volume van de testvloeistof plaatsvindt, zo in te richten, dat een lichtweg met eventueel bekende lengte wordt verschaft.

Voorts omvat de concentrator (1) een plunjer (5) die in de vloeistofhouder (2) kan worden ingebracht en die vloeistofafsluitend langs 15 de wanden (4) van de vloeistofhouder (2) in de richting van de bodem (3) van de vloeistofhouder (2) beweegbaar is. De plunjer (5) is voorzien van een voor de cellen ondoordringbaar filter (6). Het filter (6) dient doorlaatbaar te zijn voor de testvloeistof. Hierdoor is het mogelijk om de cellen in een afnemend volume van de testvloeistof te concentreren. Afhankelijk van de grootte van 20 de cellen waarvan de metabole snelheid gemeten zal gaan worden kan de poriegrootte van het filter worden aangepast.

Het is van belang dat in een werkwijze volgens de uitvinding de plunjer (5) niet volledig tot op de bodem (3) van vloeistofhouder (2) wordt bewogen. Door de plunjer (5) met filter (6) op enige afstand van bodem (3) te 25 houden wordt een gereduceerd volume van de testvloeistof gerealiseerd. De mate waarin het de testvloeistof kan worden geconcentreerd kan zeer geschikt worden gedefinieerd door de beweging van de plunjer (5) op een tevoren gedefinieerde vaste afstand van de bodem (3) te stoppen. Hiertoe kunnen bijvoorbeeld in de wanden (4) van de vloeistofhouder (2) of aan de 30 plunjer (5) zelf nokken (8) worden aangebracht (zie Fig. 2). Bij voorkeur 1091258 ' 11 wordt de beweging van de plunjer (5) langs de wanden (4) van de vloeistofhouder (2) gelimiteerd tot op een afstand van bodem (3) dat een gereduceerd volume van tussen 1 μΐ en 10 ml, bij voorkeur tussen 10 μΐ en 1 ml, bij grotere voorkeur tussen 50 μΐ en 150 μΐ resteert.

5 Behalve dat in een werkwijze volgens de uitvinding een inrichting als hierboven omschreven kan worden toegepast waarin de vloeistofstroom ten opzichte van het filter in hoofdzaak loodrecht is, kan een alternatieve uitvoeringsvorm de toepassing van bijvoorbeeld tangentiële flow filtratie voor de concentratie van cellen in een gereduceerd volume van de 10 testvloeistof omvatten. Op die wijze kan een zeer grote hoeveelheid vloeistof van 10 - 100 liter in korte tijd worden geconcentreerd en verder worden bewerkt volgens een werkwijze van de uitvinding.

Filters die toegepast kunnen worden in een werkwijze of inrichting volgens de uitvinding zijn in staat om cellen van vloeistof te scheiden.

15 Geschikte filters zijn bijvoorbeeld membraanfilters van polycarbonaat, polyethyleen terephtalaat (PET), celluloseacetaat, nitrocellulose of teflon, eventueel in combinatie met een grof voorfilter, zoals een glasvezelfilter, of in combinatie met een supportfilter, zoals een polycarbonaat filter met een onderliggend nitrocellulose membraan.

20 De poriegrootte kan afhankelijk van de grootte van de te concentreren cellen door de vakman zo gekozen worden dat een scheiding tussen cellen en vloeistof plaatsvindt.

Een voor meting van bacteriën geschikt filter zal een poriegrootte van tussen 0,05 en 5 μια bezitten. Bij voorkeur wordt voor meting van 25 bacteriën een filter met een poriegrootte van 0,1 tot 1 μηα, bij grotere voorkeur tussen 0,25 en 0,4 pm toegepast.

Het is volgens een alternatieve uitvoeringsvorm van een inrichting volgens de uitvinding mogelijk om filters met verschillende poriegroottes op een vaste afstand van elkaar toe te passen waardoor verschillende 30 compartimenten met daarin verschillende celgroottes kunnen worden 1021258 < 12 verkregen. Door meting van de metabole snelheid van de cellen in verschillende compartimenten kunnen celaantallen van verschillende organismen bepaald worden.

In geval van optische meting omvat de meetinrichting (7) optische 5 omzetorganen voor het omzetten van de testvloeistof afkomstig licht in een meetsignaal dat correspondeert met de vooraf bepaalde parameter van de testvloeistof die de metabole snelheid van de cellen bepaald.

De meetinrichting (7) meet bij voorkeur het verbruik van zuurstof als metabole parameter middels toe passing van een fluorescente 10 zuurstofgevoelige coating als optochemische sensor. Deze coating kan bijvoorbeeld bestaan uit een gasdoorlatende polymeer met daarin ingebed een fluorescente kleurstof. De fluorescentie van deze kleurstof kan bijvoorbeeld zeer geschikt omgekeerd evenredig met de zuurstofspanning in de te meten vloeistof. De fluorescente kleurstof kan bijvoorbeeld werken op 15 basis van het principe van dynamische quenching. Zonder gebonden te willen zijn aan theorie werkt dit principe zo dat fluorescente moleculen in de aangeslagen toestand na een botsing met het zuurstofmolecuul weer terugvallen naar de grondtoestand zonder dat daarbij fluorescente straling vrijkomt. Des te meer zuurstofmoleculen, des te groter de kans op een 20 botsing en des te lager de gemeten fluorescentie.

Het is in een werkwijze en inrichting volgens de onderhavige uitvinding mogelijk om de fluorescentieintensiteit van de fluorescente kleurstof in de fluorescente zuurstofgevoelige coating of optochemische sensor te bepalen. Bij grotere voorkeur wordt echter de 25 fluorescentielevensduur bepaald. In het geval van toepassing van bijvoorbeeld dynamische quenching in combinatie met een fluorescente zuurstofgevoelige coating is de fluorescentielevensduur eveneens omgekeerd evenredig met de zuurstofconcentratie. Het meten van de fluorescentielevensduur heeft het voordeel dat deze uitvoeringsvorm minder 30 gevoelig is voor storingen.

1021259 ' 13

In een meetopstelling voor het bepalen van bijvoorbeeld zuurstofmetabolisme zou de zuurstofgevoelige coating die daartoe kan worden toe gepast zeer geschikt aangebracht kunnen worden in het deel van de concentrator waar de bacteriën geconcentreerd worden, dat wil zeggen in 5 dat deel van de vloeistofhouder (2) dat in contact staat met het gereduceerde volume van de testvloeistof.

Voor het uitvoeren van een meting kan de concentrator (1) , of dat deel waaraan zeer geschikt de meting kan plaatsvinden, in contact worden gebracht met een meetinrichting (7). Bij voorkeur is deze meetinrickiting (7) 10 in staat om de verandering in zuurstofconcentratie in het gereduceerde volume van de testvloeistof te meten. Bij voorkeur omvat een meetinrichting (7) daartoe een lichtbron, bijvoorbeeld een LED, en een detector, bijvoorbeeld een Si fotodiode. Een dergelijke meetinrichting is onder andere beschreven in WO 01/69243. Het licht uit de lichtbron kan continu, maar 15 ook zeer geschikt gepulseerd worden toegediend aan bijvoorbeeld een optochemische sensor aanwezig in de concentrator (1). De vakman wordt geacht bekend te zijn met de verschillende optische technieken om fluorescentie metingen uit te voeren aan een optochemische sensor zoals toegepast in een werkwijze en inrichting volgens de uitvinding. Zo kan 20 bijvoorbeeld gepulst licht uit de lichtbron voor het meten van fluorescentie levensduur via een zgn. excitatiefïlter (7A in Figuur 3) op een zuurstofgevoelige coating (10 in Figuur 3) worden ingestraald. Het fluorescentielicht uitgestraald door de fluorescente zuurstofgevoelige coating kan via een emissiefilter door de detector worden ingevangen (7B in 25 Figuur 3). Uit dit ingevangen licht kan zeer geschikt met behulp van daartoe bestemde elektronica en een centrale gegevensverwerkingseenheid een verandering in bijvoorbeeld de zuurstofconcentratie, en daaruit bijvoorbeeld een bacteriële celdichtheid worden bepaald. Een voorbeeld van hoe een signaal uit een dergelijke meting kan worden verkregen is 30 weergegeven in Figuur 3.

1021258 14

Een werkwijze en inrichting volgens de uitvinding kunnen worden toegepast voor het bepalen van het aantal levende cellen in een vaste stof, zoals een vleesproduct, een bloemenstengel, een bodemmonster, een bezinksel, een biofilter of reactorbed of een meelproduct.

5 Een werkwijze en inrichting volgens de uitvinding kunnen tevens worden toegepast voor het bepalen van het aantal levende cellen in een semi-vaste stof zoals een pudding, een tandpasta, een boter of maar ook in een vloeistof zoals een olie of een waterige vloeistof.

In het geval van een vaste stof, een semi-vaste stof of een olie zal het 10 wenselijk zijn om uit deze te testen monsters een testvloeistof te bereiden die toegepast kan worden in de onderhavige uitvinding. De vakman is bekend met werkwijzen om uit de verschillende monsters een testvloeistof voor toepassing in de onderhavige uitvinding te bereiden. In veel gevallen zullen de cellen uit een vaste of semi-vaste fase met een geschikte 15 hoeveelheid testvloeistof worden geëxtraheerd Een zeer bruikbare werkwijze maakt daartoe gebruik van een stomacher, maar ook andere wijzen van extractie, zoals schudden, blenden, pureren of mixen met water of met een testvloeistof eventueel in combinatie met een filtratiestap waarbij de te testen cellen het filter kunnen passeren en in het fïltraat 20 terechtkomen ter afscheiding van grotere verontreinigende deeltjes zoals zand, zullen toegepast kunnen worden om een testvloeistof met daarin de te testen cellen te bereiden.

In de meeste gevallen zal het mogelijk zijn om de teststof zonder verder bewerking toe te passen als testvloeistof in de onderhavige 25 uitvinding. Met name watermonsters zoals zeewater-, oppervlaktewater- of grondwatermonsters, bloemenwatermonsters of water uit een afvalwaterzuiveringsinstallatie of een kweekmedium kunnen zonder noemenswaardige bewerking direct worden toegepast. Zonodig kan een grove filtratie worden uitgevoerd om de gesuspendeerde fractie zoveel als 30 mogelijk te reduceren tot de vrij gesuspendeerde cellen. Echter, dit is niet 1021258 i 15 noodzakelijk en dus is het mogelijk om tevens de aantallen van aan detritus of aan ander materiaal aangehechte cellen te bepalen middels een werkwijze volgens de uitvinding.

Indien een te testen monster een vaste of semi-vaste teststof of olie 5 is, omvat een testvloeistof volgens de uitvinding bij voorkeur een waterige vloeistof dat een extract is van een dergelijk monster. Indien een te testen monster een waterige teststof is, kan de teststof direct worden toegepast als testvloeistof in een werkwijze volgens de uitvinding.

De teststof, of het te testen monster, zoals dat wordt bewerkt tot een 10 testvloeistof die in een werkwijze of inrichting volgens de uitvinding kan worden toegepast, kan tussen de 1 en 10n cellen per ml of gram van de teststof bevatten. Zeer geschikt voor toepassing in een werkwijze en inrichting volgens de uitvinding is een testvloeistof die tussen 102 en 105, bij voorkeur tussen 103 en 104 cellen per ml testvloeistof bevat. De vakman 15 wordt geacht bekend te zijn met de te verwachten aantallen cellen zoals die kunnen voorkomen in de monsters die binnen zijn vakgebied worden onderzocht. De vakman zal daarom in staat zijn om een geschikt volume van teststof te kiezen om op basis daarvan een testvloeistof te bereiden voor toepassing in een werkwijze en inrichting volgens de uitvinding.

20 Op ieder moment voor of tijdens de werkwijze kunnen aan een eerste of gereduceerd volume van de testvloeistof verbindingen of stoffen worden toegevoegd. Zo kunnen bijvoorbeeld voorafgaand aan de concentratie-stap kleurstoffen aan de testvloeistof worden toegevoegd. Ook bepaalde groeisubstraten of groeiremmers kunnen worden toegevoegd om hun invloed 25 op de metabole snelheid van de cellen te onderzoeken. Dit kan met name van belang zijn indien gewenst is om de aantallen van een specifieke subpopulatie van cellen in een testvloeistof te bepalen middels een werkwijze volgens de uitvinding. Zo kunnen aantallen van anaerobe cellen worden bepaald door toepassing van stoffen die het metabolisme van aerobe 30 cellen remmen. De vakman zal in staat zijn geschikte variaties van de 1021258 i 16 werkwijze volgens de uitvinding uit te voeren, welke variaties geacht worden te vallen onder de uitvindingsgedachte van de onderhavige uitvinding.

Uitvoeringsvormen van werkwijzen en de inrichting van de 5 onderhavige uitvinding vinden onder andere toepassing in productkwaliteitscontrole, hygiënebewaking, waterkwaliteitbewaking, afvalwaterzuivering, tuinbouwpraktijk, snijbloemenhandel, toxicologische assays (bijvoorbeeld in bodemonderzoek), wetenschappelijk onderzoek, procesbewaking als onderdeel van een HACCP programma in velerlei 10 industrieën, waaronder de farmaceutica-, cosmetica- en toiletartikelenindustrie, de voedsel-, zuivel- en dranken industrie, en binnen het water- en milieuonderzoek.

De uitvinding zal nu worden geïllustreerd aan de hand van de volgende, niet als beperkend op te vatten voorbeelden.

15

Voorbeeld 1.

Een suspensie van 105 Escherichia coli bacteriën per ml werd in de vloeistofhouder in een inrichting volgens Figuur 1 (bijv. een Uniprep filter van de firma Whatman) geplaatst. Op de bodem van de vloeistofhouder was 20 een zuurstofgevoelige fluorescente kleurstof aangebracht. Zonder de plunjer neerwaarts te duwen werd het zuurstofgehalte in de suspensie gemeten in de tijd. Hiertoe werd een fluorescentie levensduur meting toegepast. De kleurstof en wijze van meting waren zoals beschreven in WO 01/69243. Het verloop van de zuurstofconcentratieafname door zuurstofconsumptie van de 25 bacteriën is weergegeven in Figuur 4 (gestippelde lijn).

Hierna werd dit experiment herhaald met een zelfde suspensie (105 bacteriën/ml) waarbij nu door middel van het neerwaarts duwen van de plunjer welke was voorzien van een voor genoemde cellen ondoordringbaar filter de celsuspensie werd geconcentreerd tot 107 cellen per ml. Hierna 1 n 9 1 ) h R i 17 werd eveneens het verloop van de zuurstofconcentratie in de testvloeistof gemeten. De ononderbroken lijn in Figuur 4 laat zien dat afname van het zuurstofniveau in dit geval veel sneller verloopt dan in de ongeconcentreerde suspensie. Dit illustreert dat met het principe van 5 concentreren van de suspensie in combinatie met het meten van een metabole parameter de relatie tussen metabole activiteit en initiële celdichtheid sneller en nauwkeuriger kan worden bepaald.

1021258 (

Claims (12)

1. Werkwijze voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof door het meten van een metabole snelheid van genoemde cellen met behulp van ten minste één meting, de cellen worden geconcentreerd in een gereduceerd volume van de testvloeistof met het 5 kenmerk dat monstername, concentratie en meting in één compartiment plaatsvindt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het aantal levende cellen in de testvloeistof wordt bepaald door vergelijking van de gemeten metabole snelheid met een tevoren gemaakte ijklijn, waarin de waarde 10 van genoemde metabole snelheid van genoemde cellen is uitgezet als functie van hun dichtheid.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarin genoemde cellen humane cellen, dierlijke cellen, plantaardige cellen, celorganellen, protozoën, schimmels, gisten, archaea of bacteriën zijn.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarin genoemde cellen bacteriën zijn.

5. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemde ten minste één meting een optische meting omvat.

6. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin 20 genoemde metabole snelheid de ademhalingssnelheid, of de omzetsnelheid of opnamesnelheid van een natuurlijk of synthetisch substraat of een kleurstof omvat.

7. Werkwijze volgens conclusie 5 of 6, waarin de optische meting een fluorescente of chemiluminescente meting omvat.

8. Werkwijze volgens één van de conclusies 5-7, waarin een optische sensor wordt toegepast die in contact staat met genoemd gereduceerd volume van genoemde testvloeistof. 1021258

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarin genoemde optische sensor een chemo-optische substantie omvat.

10. Werkwijze één van de voorgaande conclusies, waarin zuurstof wordt gemeten.

11. Inrichting voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof middels een werkwijze volgens één van de conclusies 1-10, omvattende een concentrator (1) en een meetinrichting (7), welke concentrator (1) een vloeistofhouder (2) voor het ontvangen van een testvloeistof met cellen omvat, welke houder (2) is voorzien van een bodem 10 (3) en daarop aansluitende wanden (4), welke concentrator (1) voorts een plunjer (5) omvat die in de vloeistofhouder (2) kan worden ingebracht en die vloeistofafsluitend langs de wanden (4) van de vloeistofhouder (2) in de richting van de bodem (3) van de vloeistofhouder (2) beweegbaar is en voorzien is van een voor genoemde cellen ondoordringbaar filter (6), welke 15 meetinrichting (7) optische omzetorganen omvat voor het omzetten van van de testvloeistof afkomstig licht in een meetsignaal dat coxrespondeert met een vooraf bepaalde parameter van de testvloeistof.

12. Toepassing van een inrichting of werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies in productkwaliteitscontrole, hygiënebewaking, 20 waterkwaliteitbewaking, afvalwaterzuivering, tuinbouwpraktijk, snijbloemenhandel, toxicologische assays (bijvoorbeeld in bodemonderzoek) of in procesbewaking als onderdeel van een HACCP programma. 102122¾