MX2011002838A

MX2011002838A - Anticuerpos contra homologos sonic hedgehog y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2011002838A
Application number: MX2011002838A
Authority: MX
Inventors: David Jenkins; Jaspal Singh Kang; Naomi Laing; Neil Michaud
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-07-29
Also published as: WO2010032061A1; KR20110059755A; US20120328625A1; AU2009294416B2; JP2012502967A; US8207306B2; CA2734330A1; BRPI0918739A2; EP2344535A1; US8569459B2; AU2009294416A1; US20100196388A1; CN102203135A

Abstract

La invención se relaciona con agentes de unión identificados contra el homólogo sonic hedgehog humano (Shh) y los usos de esos agentes. Más específicamente, la invención se refiere a los anticuerpos monoclonales totalmente humanos dirigidos a Shh. Los agentes de unión identificados descritos son útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o superproducción de Shh y como diagnósticos.

Description

ANTICUERPOS CONTRA HOMOLOGOS SONIC HEDGEHOG Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los : agentes de unión identificados contra el homólogo de sonic hedgehog (Shh) y los usos de tales agentes. Más específicamente, la invención se refiere a los anticuerpos monoclonale's totalmente humanos dirigidos a Shh. Los agentes de unión identificados que se describen son útiles en el tratamiento de las enfermedades asociadas con la actividad y/o la sobreproducción de proteínas de hedgehog y como diagnósticadores .

Descripción de la técnica relacionada ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hedgehog se identificó en Drosophila como un mediador de desarrollo embrionario. Existen tres miembros de la familia del hedgehog en los mamíferos, Sonic hedgehog (Shh) , Hedgehog de la India (IHH) , y el Hedgehog del desierto (DHH) , los que se asocian a patrones específicos y regulan la homeostasis del órgano al afectar el crecimiento , y la diferenciación celular. Las proteínas de hedgehog son ligandos de la membrana de paso-doce que abarca al receptor Patched (Ptch en humanos, Ptc en el ratón), que reprime normalmente la función de la proteína de transmembrana similar a GCPR Smoothened (SMO) . Tras la unión de Shh, la REF.:217908 represión de la SMO por Patched se mitiga para permitir a SMO la señal a través de los miembros de la familia Gli de factores de transcripción. La activación de la transcripción conduce a la síntesis de los componentes de las vías, tales como Glil y Ptch.

La desregulación de la vía de señalización hedgehog/SMO está implicada en la tumorigénesis . Las mutaciones que inactivan Ptch o Smo constitutivamente activas se describieron en el carcinoma de células básales, el meduloblastoma y el rabdomiosarcoma . Estas mutaciones, resultan de forma presumible en la activación constitutiva de la vía y el control de la tumorigénesis. Además, la sobre-expresión de Shh se describe en numerosos tipos de tumores, tales como el de próstata, pancreático, pulmón de células pequeñas, colorrectal, esofágico, gástrico, melanoma y mieloma múltiple. En muchos casos, la sobre-regulación de Glil y Ptch se ha observado, junto con la sobre-expresión de Shh, lo que apoya la conclusión de que la activación de la vía constitutiva en las células tumorales podría promover, en algunos contextos, la tumorigénesis de Una forma dependiente del ligando. Este modelo se apoya en la observación de: que la sobre-expresión ectópica de Shh en las células LNCaP de cáncer de próstata aumentan el crecimiento del tumor In vivo (Fan 2004. Endocrinology 145:3961).

Se han propuesto varios modelos para explicar cómo la sobre-expresión de Shh podría conducir al desarrollo de cáncer. En el primer modelo, el Shh se sobre-expresa de forma ectópica por las células tumorales, qúe genera una señal autocrina sobre Ptch de unión en la superficie de las células tumorales e induce la proliferación celular. En el segundo modelo, el Shh secretado por las células tumorales activa la señalización de SMO en las células del estroma, que a su vez resulta en la producción de factores que mejoran el crecimiento celular del tumor. A favor de este modelo, se ha demostrado que las células tumorales que expresan Shh inducen la expresión de Glil en las células del estroma (Fan y otros 2004. Endocrinology 145:3961; Yauch y otros 2008. Isíature : 455, 406-410). Además, la coimplantación de fibroblastos de embrión de ratón (MEF) promovió la formación del tumor y el crecimiento de un número óptimo de las células tumorales HT-29 que expresan Shh (Yauch y otros 2008. Nature : 455, 406-410) . La capacidad de los MEF para mejorar el crecimiento del tumor requirió de la señalización de Shh/SMO intacto; según la supresión identificada de SMO en MEF que resultó en tumores sustancialmente menores. Por último, Shh ; se ha implicado en la proliferación y diferenciación de células madre en distintos tejidos (Taipale y Beachy. 2001. Nature 411:349-354). Como tal, se ha propuesto que Shh podría promover la tumorigénesis o recaída después del tratamiento con quimioterapia y/o la radiación para controlar la áuto- renovación de células madre del cáncer.

La dependencia de los tumores de la señalización Shh/Smo para el crecimiento y la supervivencia se ha demostrado en modelos preclínicos con ciclopamina, un antagonista de origen natural de la vía, que se deriva del maíz lilly que actúa a través de la unión directa a la SMO. La ciclopamina se ha reportado inhibir el crecimiento de numerosas líneas celulares tumorales in vitro e in vivo, que incluyen los tumores de melanoma y próstata, pancreáticos y de pulmón de células pequeñas. El efecto inhibidor de ciclopamina parece ser específico, porque aunque inhibe el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata 22RV-1, no inhibió el crecimiento de los tumores 22RV-1 que sobre-expresan de forma estable el factor de transcripción Glil corriente abajo (Karhadkar y otros 2004. Nature 431:707). Más recientemente, un antagonista sin relación con la pequeña molécula de SMO, el HhAntag, demostró inhibir el crecimiento de los tumores de meduloblastoma de aloinjerto en los que la vía de SMO se activa de forma constitutiva a través de la mutación de Ptcl y de los tumores de xenoinjertos humanos que sobre-expresan a Shh (Romer y otros 2004. Cáncer Cell 6:229; Yauch y otros 2008 Nature: 455, 406-410) .

Se describió un anticuerpo originado contra el dominio N-terminal de señalización de Shh de rata que reacciona de forma cruzada con la Shh humano (Ericson y otros 1996. Cell 87: 661-673). Este anticuerpo, denominado 5E1, se ha usado para demostrar que el bloqueo específico de la vía de Shh, según se midió por un gen reportero Glil, se correlaciona con la inhibición de la proliferación en células tumorales establecidas a partir de esófago, estómago y páncreas. El 5E1 disminuyó también el crecimiento in vitro y la viabilidad de las líneas celulares establecidas de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y de las células tumorales que se derivan del pase único de xenoinjertos pancreáticos (Watkins y otros Nature, 422:313-317 (2003); Bérman y otros 2003. Nature 426:846). Por último, el 5E1 demostró inhibir el crecimiento in vivo de los xenoinjertos de tumor colorrectal HT55 y HT-29 (Yauch et . 2008. Nature).

Además de inhibir el crecimiento y la viabilidad de las células tumorales como agentes únicos, los antagonistas de Shh/SMO pueden aumentar la actividad antitumoral dé la quimioterapia y la radiación (Chen y otros Cell · Cycle, 6:1826-1830 (2007)). Sims-Mourtada y otros, Clin Cáncer Res., 12:6565-6572, (2006) reportaron que el número de células positivas a Glil aumentó de manera drástica cuando los xenoinjertos de adenocarcinoma de esófago SEG-1 aumentaban de tamaño a continuación del tratamiento con radiación. La presentación de células teñidas Glil precedió al aumento de las células Ki67 positivas, lo cual sugiere que la señalización de Shh podría promover la expansión ;d una pequeña población de células refractarias, tales como las potenciales células madre del cáncer, que resultan al final en el aumento de tamaño del tumor. La combinación del tratamiento de los xenoinjertos SEG-1 con paclitaxel y ciclopamina resultó en un aumento de la eficacia en comparación con cada agente por separado.

La evidencia que se cita anteriormente apoya el argumento de que antagonizar la vía , de señalización de Shh/SMO con un anticuerpo neutralizante dirigido contra Shh podría ser una terapia eficaz para numerosos cánceres humanos. De este modo existe una necesidad de identificar nuevos inhibidores de la señalización de Shh.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con agentes de unión identificados que se unen específicamente a Shh e inhiben la actividad biológica de Shh. Las modalidades de la invención se relacionan con agentes de unión identificados que se unen específicamente a Shh e inhiben unión de Shh a su receptor Patched, por ejemplo, Patched- 1 y/o Patched 2. En una modalidad, el anticuerpo de la invención es específico para Shh .

Las modalidades de la invención; se relacionan con agentes de unión identificados que se unen específicamente a Shh e inhiben la unión de Shh a Patched- 1 y/o Patched-2. En una modalidad, el agente de unión identificado inhibe al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75% , al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de la unión de Shh a Patched-1 comparado con la unión que ocurriría en ausencia del agente de unión identificado.

En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se une a Shh. con una afinidad de unión (KD) de menos de 5 nanomolar (nM) . En otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 4 nM, 3 nM, 2 nM ó 1 nM . En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se une a Shh con una KD de menos de 950 picomolar (pM) . En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se une a Shh con una KD de menos de 900 pM. En otras modalidades, el agente de unión identificado^ se une con una KD de menos de 800 pM, 700 pM o 600 pM. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se une a Shh con una KD de menos dé 500 pM. En otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 400 pM. En aún otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 300 pM. En algunas otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 200 pM. En algunas otras modalidades, el agente de unión identificado se une con una KD de menos de 100 pM. En una modalidad específica, el agente de unión identificado de la invención puede unirse a Shh humano con una afinidad KD de menos de 50, 40, 30, 20 o 10 pM. En otra modalidad específica, el agente de unión identificado de la invención puede unirse a Shh humano con una afinidad KD de menos de 1 pM. La KD puede evaluarse usando un método descrito en la presente o conocido por una persona con conocimientos en la materia (por ejemplo, un ensayo BIAcore, ELISA, FACS) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia) .

Las propiedades de unión del agente de unión identificado o anticuerpo de la invención se pueden también medir con referencia a las tasas de disociación o asociación (koff y kon respectivamente) .

En una modalidad de la invención, un agente de unión identificado o un anticuerpo puede tener una tasa kon (anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag)k°"?Ab-Ag) de al menos 104 M^s" 1 , al menos 5 X 104 ^s"1, al menos 105 M^s"1, al menos 2 X 105 M^s"1, al menos 5 X 105 M^s"1, al menos 106 M^s"1, al menos 5 X 106 M^s"1, al menos 107 IVT 1, al menos 5 X 107 M^s"1, o al menos 108 M"1s"1.

En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado o un anticuerpo puede tener una tasa kQff ( (Ab-Ag)kf—> anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag) ) de menos de 5x10" 1 s'1, menos de 10"1 s"1, menos de 5xl0"2 s"1, menos de 10"2 s"1, menos de 5xl0~3 s"1, menos de 10~3 s"1, menos de 5xl0~4 s"1, menos de 10"4 s"1, menos de 5xl0~5 s"1, menos de 10"5 s"1, menos de 5xl0"6 s"1, menos de 10~6 s"1, menos de 5xl0"7 s"1, menos de 10"7 s"1, menos de 5xl0~8 s"1, menos de 1CT8 s"1, menos de 5xl0"9 s"1, menos de 10"9 s"1, o menos de 10~10 s"1.

El agente de unión identificado de la invención específicamente se une al Shh humano. En' algunos ejemplos, el agente de unión identificado de la invención tiene reactividad cruzada con otras proteínas Shh de otras especies. En una modalidad, el agente de unión identificado de la invención tiene reactividad cruzada con el Shh de ratón. En otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención tiene reactividad cruzada con el Shh del mono cynomolgus. En otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención tiene reactividad cruzada; con el Shh de nono cynomolgus y Shh de ratón.

En otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención tiene una afinidad casi equivalente por las proteínas Shh de otras especies. En un ejemplo específico, el agente de unión identificado al Shh humano de la invención tiene una afinidad casi equivalente por el Shh de ratón. Por un nivel equivalente de afinidad se entiende que cuando la afinidad con respecto al Shh4 humano es 1, la afinidad del anticuerpo con respecto al Shh del mono cynomolgus está entre 0.2-5 o entre 0.2-2.

En otra modalidad, algunos agentes de unión identificados de la invención se pueden unir a los miembros hedgehog relacionados. En una modalidad, el agente de unión identificado se puede unir al homólogo hedgehog indio humano (IHH) . Por ejemplo, 6D7 se puede unir al hedgehog indio humano y hedgehog indio de ratón.

En otra modalidad, algunos de los agentes de unión identificados de la invención fallan en unir los miembros Hedgehog relacionados. Por ejemplo, 3H8 y 1G1 no exhiben unión a IHH. Además, ninguno de los agentes de unión identificados de la invención se une a DHH. : En aún otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención inhibe diferenciación osteoblástica de células inducidas con Shh. En un ejemplo, la actividad poseída por el agente de unión identificado se puede demostrar a una concentración IC50 (una concentración para lograr 50% de inhibición) de por debajo de 10 µ?. En otro ejemplo, el agente de unión identificado de la invención puede tener una concentración IC50 de menos de 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 , 3, ó 2 nM.

En aún otra modalidad, el agente de unión identificado de la invención inhibe la inducción de Glil y Patched- 1 AR m. En un ejemplo, la actividad poseída por el agente de unión identificado se puede demostrar a una concentración IC50 (una concentración para lograr 50% de inhibición) por debajo de 10 µ?. En otro ejemplo, el agente de unión identificado de la invención puede tener una concentración IC50 de menos de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4 ó 2 nM .

En aún otra modalidad, el agente de unión identificado puede inhibir Glil y 2 y Patched-1 y 2. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden exhibir más que 50% de inhibición de Glil y Patched-1 AR en comparación con un control (agente de unión no identificado), por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ó 95%.

En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado compite con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos descritos en la presente para la unión a Patched-1.

Los agentes de unión identificados de la invención poseen propiedades farmacodinámicas y/o farmacocinéticas , beneficiosas, eficaces. En un ejemplo, los agentes dé unión identificados de la invención exhiben buenas propiedades de seguridad, por ejemplo, no exhiben efectos cardiovasculares tóxicos.

En algunas modalidades, el agente de unión identificado puede tratar o prevenir una afección asociada con una actividad anormal de Shh. En una modalidad de la invención, el agente de unión identificado inhibe proliferación de células tumorales. Los agentes de unión identificados se pueden usar en combinación con otras terapias anti cancerígenas tales como regímenes de quimioterapia, o solos para inhibir el crecimiento del tumores y/o metástasis.; Los anticuerpos de la invención se pueden usar en el tratamiento de (prevención y/o reducción de la gravedad; de) afecciones neurológicas que se derivan de: (i) lesión ' aguda, subaguda y crónica del sistema nervioso central, incluyendo lesión traumática, lesión química, deficiencias y \ lesión vascular (tales como la isquemia resultante de la apoplejía) , junto con lesión inducida por tumor e infecciones/inflamatorias; (ii) envejecimiento del sistema nervioso incluyendo la enfermedad de Alzheimer; (iii) enfermedades neurodegenerativas crónicas del sistema nervioso, incluyendo la enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y similares, así como degeneraciones espinocerebelares ; y (iv) enfermedades inmunológicas crónicas del sistema nervioso o que afectan el sistema nervioso, incluyendo la esclerosis múltiple.

En algunas modalidades de la /invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad ' de' la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En otra modalidad; de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4. En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgG2. Este isotipo tiene potencial reducido para provocar una función efectora en comparación con otros isotipos, lo que puede conducir a reducir la toxicidad. En otra modalidad de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente ; humano del isotipo IgGl. El isotipo IgGl tiene potencial aumentado para provocar ADCC en comparación con otros isotipos, lo; que puede conducir a una eficacia mejorada. El isotipo IgGl tiene estabilidad mejorada en comparación con otros isotipos, por ejemplo el IgG4 , lo que puede conducir a una biodisponibilidad mejorada, o facilidad de preparación mejorada o una media vida más larga. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgGl es del alotipo z, za o f. ; Una modalidad adicional es un agente de ; unión identificado o un anticuerpo que se une específicamente a Shh y que comprende una secuencia que comprende una de las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) mostradas en la Tabla 9. Las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende: cualquiera de una secuencia CDR1, una CDR2 o una CDR3 de un dominio variable de cadena pesada como se muestra en la Tabla 9. Una modalidad adicional es un agente de unión identificado o un anticuerpo que se une específicamente a Shh y comprende una secuencia que comprende dos de las secuencias CDR de un t dominio variable de cadena pesada como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una secuencia CDR1, una CDR2 y una CDR3 de un dominio variable de cadena pesada como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una de las secuencias CDR de un dominio variable de cadena ligera como se muestra en la Tabla 9. Las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende: cualquiera de una secuencia CDR1, una CDR2 o una CDR3 de un dominio variable de cadena ' pesada como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad, el > agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende dos de las secuencias CDR de un dominio variable de cadena pesada como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una secuencia CDR1, una CDR2 y una CDR3 de un dominio variable de cadena ligera como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una secuencia GDR1, una CDR2 y una CDR3 de un dominio variable de cadena pesada como se muestra en la Tabla 9 y una secuencia CDR1, una CDR2 y una CDR3 de un dominio variable de cadena ligera como se muestra en la Tabla 9. En algunas modalidades, el agente de unión identificado es un anticuerpo. En ciertas modalidades, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En una modalidad, la invención incluye un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a Shh e incluye: (a) una VH CDR1 de sec. con núm. de ident . : 50 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR1 de sec. con núm. de ident. :50; (b) una VH CDR2 de sec. con núm. de ident. : 50 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR2 de sec. con núm. de ident. : 50; (c) una VH CDR3 de sec. con núm. de ident.: 50 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR3 de sec. con núm. de ident. : 50; (d) una VL CDR1 de sec. con núm. de ident. : 54 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR1 de sec . con núm. de ident . : 54; (e) una VL CDR2 de sec. con núm. de ident.: 54 que tiéné una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, .2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación · coh la VL CDR2 de sec. con núm. de ident. : 54; y (f) una VL CDR3 de sec. con núm. de ident.: 54 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación · con la VL CDR3 de sec. con núm. de ident. : 54. ¦ En aún otra modalidad, la invención incluye un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a Shh e incluye: (a) una VH CDR1 de sec. con núm. de ident.: 14 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1,: 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación 1 con la VH CDR1 de sec. con núm. de ident. : 14 (b) una VH CDR2 de sec. con núm. de ident.: 14 que tiéné una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1,' 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR2 de sec. con núm. de ident. : 14; ' (c) una VH CDR3 de sec. con núm. de ident.: 14 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1,: 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación : con la VH CDR3 de sec. con núm. de ident. : 14; (d) una VL CDR1 de sec . con núm. de ident. : 16 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR1 de sec. con núm. de ident. -. 16; (e) una VL CDR2 de sec. con núm. de ident.: 16 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación j con la VL CDR2 de sec. con núm. de ident. : 16; y (f) una VL CDR3 de sec. con núm. de ident.: 16 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR3 de sec. con núm. de ident. : 16. j ' En aún otra modalidad, la invención incluye un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a Shh e incluye: (a) una VH CDR1 de sec. con núm. de ident.: 22 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1,1 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación! con la VH CDR1 de sec. con núm. de ident.: 22; ; (b) una VH CDR2 de sec. con núm. de ident. : 22 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1 ,' 2 ¡ ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación! con la VH CDR2 de sec. con núm. de ident.: 22; 1 (c) una VH CDR3 de sec. con núm. de ident.: 22 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación! cón la VH CDR3 de sec . con núm. de ident . : 22; (d) una VL CDRl de sec. con núm. de ident. : 24 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDRl de sec. con núm. de ident.: 24; (e) una VL CDR2 de sec. con núm. de ident. : 24 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR2 de sec. con núm. de ident. : 24; y (f) una VL CDR3 de sec. con núm. de ident. : 24 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR3 de sec. con núm. de ident. : 24. v En otra modalidad, el agente de unión identificado puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de la CDRl, CDR2 o CDR3 de las secuencias de cadena pesada variable codificada por un polinucleótido en un plásmido designado Mab6D7VHOP, MablGlVH, Mab3H8VH, y Mab6D7VH los cuales se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo los números PTA-9504, PTA-9506, PTA-9518, o. PTA-9506 el 17 de septiembre de 2008. En otra modalidad el agente de unión identificado puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de la CDRl, CDR2 o CDR3 de las secuencias de cadena ligera variable codificadas por un polinucleótido en un plásmido designado Mab6D7VLOP, MablGlVL, Mab3H8VL, y Mab6D7VL los cuales se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo los números PTA-9503, PTA-9509, PTA-9515, o PTA-9504 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9504 el : 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado ab6D7VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9504 el < 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9503 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9504 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9503 el ', 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VHOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9504 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos , o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9503 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CD 3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado MablGlVH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9507 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado MablGlVH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9507 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos dé cadena ligera variable que comprende una CDR3 codificada : por el polinucleótido en el plásmido designado MablGlVL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos, (ATCC) bajo el número PTA-9509 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado MablGlVH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9507 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado MablGlVL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número^ PTA-9509 el : 17 de septiembre de 2008. ! En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado MablGlVH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9507 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado : por el polinucleótido en el plásmido designado, MablGlVL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos¡ (ATCC) bajo el número PTA-9509 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable qüe comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab3H8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9518 el 17 de septiembre de 2008.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab3H8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9518 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende una CDR3 codificada por el polinucleótido en el plásmido designado Mab3H8VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9515 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab3H8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9518 el; 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab3H8VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9515 el 17 de septiembre de 2008.

En otra modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos una, al menos dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab3H8VH el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9518 el 17 de septiembre de 2008 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos una, al menos1 dos, o al menos tres de las CDR del anticuerpo codificado por el polinucleótido en el plásmido designado Mab3H8VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos, (ATCC) bajo el número PTA-9515 el 17 de septiembre de 2008. ' Debe destacarse que aquellos de conocimientos ordinarios en la materia pueden realizar fácilmente las determinaciones de las CDR. Ver por ejemplo, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. l-3¡ Kabat proporciona múltiples alineamientos de secuencia de cadenas de inmunoglobulinas de numerosos isotipos de especies de anticuerpos. Las secuencias alineadas se numeran de conformidad con un sistema de numeración sencillo, el sistema de numeración de Kabat . Las secuencias de Kabat se han actualizado desde la publicación en 1991 y están disponibles como una base de datos electrónica de secuencia (última versión descargable 1997) . Cualquier secuencia de inmunoglobulina se puede numerar de conformidad con Kabat realizando un alineamiento con la secuencia de referencia de Kabat. En consecuencia, el sistema de numeración de Kabat proporciona un sistema uniforme para numerar las cadenas de inmunoglobulinas.

En una modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada mostradas en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada de los anticuerpos 6D7, 3H8, 1G1, 6D70P2, 6D70P, o 3H80P.

La promiscuidad de la cadena ligera está bien establecida en la técnica, así, un agente de' unión identificado o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias, de cadena pesada de los anticuerpos 6D7, 3H8, 1G1, 6D70P, 6D70P2 , o 3H80P u otro anticuerpo descrito en la presente, puede comprender, además, cualquiera de las secuencias de cadena ligera mostradas en la Tabla 9 o de los anticuerpos 6D7, 3H8 o 1G1 , 6D70P, 6D70P2, 3H80P o 1G10P u otro anticuerpo descrito en la presente. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En una modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que . comprende cualquiera de las secuencias de cadena ligera mostradas en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende cualquiera de las secuencias de cadena ligera de los anticuerpos 6D7, 3H8 o 1G1, 6D70P, 6D70P2, 3H80P o: 1G10P . En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En algunas modalidades, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste de: 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1 , 1F4 , 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D70P, 6D70P2 , 3H80P o 1G10P . En una modalidad, el agente de unión identificado comprende uno o más de anticuerpos monoclonales completamente humanos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6 , 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8 , 1A5 , 6D7, 6D70P, 6D70P2, 3H80P o 1G10P . En ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 6D7. En otras ciertas modalidades, el agente :de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 3H8. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 1G1. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 6D70P. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 3H80P. En otras ciertas modalidades, el agente de unión identificado es el anticuerpo monoclonal 1G10P. , En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 9. En una modalidad un agente de unión identificado o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 9. En una modalidad a agente de unión identificado o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las CDR de los anticuerpos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6 , 1G1, 1F4, 1H8 , 1H12, 1C.8 , 1A5 , 6D7, o 6D70P2.

En una modalidad, un agente de unión identificado o un anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las CDR de los anticuerpos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5 , 6D7 , o 6D70P2.

En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de una CDR1, una CDR2 o una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 6D7 , 3H8, 1G1, 6D7, o 6D7 como los mostrados en la Tabla 9. En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende cualquiera de una CDR1, una CDR2 o una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 6D7, 3H8, 1G1 o 6D7 , como los mostrados en la Tabla 9. En una modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprendér una secuencia que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de anticuerpo monoclonal completamente humano 6D7, 3H8, 1G1 o 6D70P, como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1 , una CDR2 y una CDR3 de anticuerpo monoclonal completamente humano 6D7, 3H8, 1G1 o 6D70P, como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de anticuerpo monoclonal completamente humano 6D7, 3H8,: 1G1 o 6D7, como se muestra en la Tabla 9, y una secuencia CDR1, una CDR2 y una CDR3 de anticuerpo monoclonal completamente humano 6D7, 3H8, 1G1 o 6D7, como se muestra en la Tabla 9. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia CDRl, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal completamente humano 6D7, como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia CDRl, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal completamente humano 3H8 , como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia CDRl, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal completamente humano 1G1, como se muestra en la Tabla 9. En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la secuencia CDRl, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada variable y/o cadena : ligera variable de anticuerpo monoclonal completamente humano 6D70P2 o 6D70P, como se muestra en la Tabla 9.

En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión identificado o anticuerpo que comprende una secuencia que comprende la secuencia contigua que abarca las regiones marco y CDR, específicamente de FR1 a FR4 o CDR1 a CDR3 , de cualquiera de las secuencias como las mostradas en la Tabla 9. En una modalidad, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende las secuencias contiguas que abarcan las regiones marco y CDR, específicamente de FR1 a FR4 o CDR1 a CDR3, de cualquiera de las secuencias de los anticuerpos monoclonales 6D7, 3H8 , 1G1, como las mostradas en la Tabla 9. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident. : 14. En una modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident. : 16. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

Una modalidad proporciona un agente de unión identificado o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, en donde el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena: pesada que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 22. En una modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident . : 24. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident. :46. En otra modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident. :48. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porpión de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 50. En otra modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident. :52. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 50 En otra modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de sec . con núm. de ident.:56. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de! cadena pesada que comprende la secuencia dé sec. con núm. de ident.:22. En otra modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.:56. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En otra modalidad el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.:58. En otra modalidad, el agente o anticuerpo, o porción de unión al antígeno de éste, comprende, además, un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.:60. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En una modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo comprende tanto como veinte, dieciséis,' diez, nueve o menos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro o; cinco, adiciones, sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos dentro de las CDR descritas o secuencias de cadena pesada o ligera. Tales modificaciones se ; pueden realizar potencialmente en cualquier residuo dentro de las CDR. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En una modalidad, el. agente de unión identificado o anticuerpo comprende variantes o derivados de las CDR descritas en la presente, las secuencias contiguas abarcan las regiones marco y CDR (específicamente de FRl a FR4 o CDR1 a CDR3), las secuencias de cadena pesada o ligera descrita en la presente, o los anticuerpos descritos en la presente. Las variantes incluyen agentes de unión identificados o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen tanto como veinte, dieciséis, diez, nueve o menos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis adiciones, sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en cualquiera de las CDR1, CDR2 o CDR3 como las mostradas en la Tabla 9, las secuencias contiguas que abarca las regiones marco y CDR (específicamente de FRl a FR4 o CDR1 a CDR3) como las mostradas en la Tabla 9, las secuencias de cadena pesada o ligera descritas en la presente, o con los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. Las variantes incluyen agentes de unión identificados o anticuerpos que comprenden secuencias que tienen al menos aproximadamente 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con cualquiera de las CDR1, CDR2 o CDR3 como las mostradas en la Tabla 9, las secuencias contiguas abarcan las regiones marco y CDR (específicamente de FR1 a FR4 o CDR1 a CDR3) como las mostradas en la Tabla 9, las secuencias de cadena pesada o ligera descritas, en la presente, o con los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar por cualquier método conocido por una persona con experiencia en la materia, incluyendo, pero sin limitarse a, alineamiento de proteína por pares. En una modalidad, las variantes comprenden cambios en las secuencias CDR o polipéptidos de cadena pesada o ligera descritos en la presente que son de origen natural o se introducen por modificación in vitro de secuencias nativas usando técnicas de ADN recombinante o técnicas de mutagénesis. Las variantes de origen natural incluyen aquellas que se generan in vivo en las secuencias de nucleótidos de línea germinal correspondientes durante la generación de un anticuerpo a un antígeno externo. ; En una modalidad el derivado puede ser un heteroanticuerpo, : que es un anticuerpo en el cual dos o más anticuerpos están enlazados. Los derivados incluyen los anticuerpos que han sido químicamente modificados. Los ejemplos incluyen unión covalente de uno o más polímeros, tales como los polímeros solubles en agua, carbohidratos con enlace N, o con enlace O, azúcares, fosfatos, y/u otras moléculas de este tipo. Los derivados se modifican de una manera que es diferente del anticuerpo de partida o de origen natural, en el ¦ tipo o localización de las moléculas unidas. Los derivados además incluyen la deleción de uno o más grupos químicos qué están naturalmente presentes en el anticuerpo..

En una modalidad, el agente de unión identificado es un anticuerpo biespecífico . Un anticuerpo biespecífico. es un anticuerpo que tiene especificidad de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los métodos para preparar los anticuerpos biespecíficos se conocen en la materia. : (Ver, por ejemplo, Millstein y otros, Nature, 305:537-539 (1983); Traunecker y otros, EMBO J, 10:3655-3659 (1991); Suresh y otros, Methods in Enzymology, 121:210 (1986); Kostelny y otros, J. Immunol, 148 (5) : 1547-1553 (1992); Hollinger y otros, Proc. Nati Acad. Sci . Estados Unidos, 90:6444-6448 (1993); Gruber y otros, J. Immunol, 152:5368 (1994); las patentes de los Estados Unidos núms . 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 95,731,168; 4,676,980; y 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; y EP 03089.) En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado o anticuerpo comprende una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident . : 14. En ciertas modalidades, la sec. con núm. de ident.: 14 comprende cualquiera de las combinaciones de residuos de la línea germinal y no germinal indicados por cada fila de la Tabla 12. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident. : 14 comprende uno cualquiera, dos cualquiera, o tres, o todos los tres, de los residuos de la línea germinal como los indicados en la Tabla 12. En ciertas modalidades, la sec . con húm. de ident . : 14 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de la línea germinal y no germinal indicados por cada fila de la Tabla 12. En otras modalidades, el agente de unión identificado o anticuerpo se deriva de una secuencia de la línea germinal, en donde uno o más residuos se han mutado para producir el residuo de la línea germinal correspondiente en esa posición.

Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión identificado o anticuerpo que compite para la unión a Shh con el agente de unión identificado o anticuerpos de la invención. En otra modalidad de la invención hay un anticuerpo que compite para la unión a Shh con el agente de unión identificado o anticuerpos de la invención. En otra modalidad el agente de unión identificado o anticuerpo compite para la unión a Shh con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos. "Compite" indica que el agente de unión identificado o anticuerpo compite para la unión a Shh con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4 , 1H8, 1H12, 1C8, 1A5 , 6D7 , 6D70P, 6D70P2 , 3H80P, o 1G.10P, es decir, la competencia es unidireccional.

Las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo, el cual compite de manera cruzada con cualquiera de anticuerpos monoclonales completamente humanos 1A12 , 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4 , 1H8, 1H12, 1C8, 1A5 , 6D7 , 6D70P, 6D70P2 , 3H80P, o 1G10P, para la unión a Shh. "Compite de manera cruzada" indica que el agente de unión identificado o anticuerpo compite para la unión a Shh con cualquiera de anticuerpos monoclonales completamente humanos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1 , 1F4 , 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7 , 6D70P, 6D70P2 , 3H80P, o 1G10P, y vice versa, es decir, la competencia es bidireccional .

Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión identificado o anticuerpo que compite para la unión a Shh. En otra modalidad de la invención hay un agente de unión identificado o anticuerpo que compite de manera cruzada con el agente de unión identificado o anticuerpos de la invención para la unión a Shh-.

Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión identificado o anticuerpo que se une al mismo iepítopo en Shh como el agente de unión identificado o anticuerpos de la invención. Las modalidades de la invención también incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo! que se une al mismo epítopo en Shh como cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8 , 1H12, 1C8 , 1A5 , 6D7 , 6D70P, 6D70P2, 3H80P, o 1G10P .

Otras modalidades de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican cualquiera de los agentes de unión identificados o anticuerpos descritos en la presente, vectores que tienen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los agentes de unión identificados o anticuerpos descritos en la presente o una célula huésped transformada con cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico. Las modalidades de la invención incluyen una molécula de ácido nucleico que codifica un agente dé unión identificado aislado completamente humano que se unen específicamente a Shh e inhibe la unión de un Shh a Patched-1. La invención también abarca los polinucleótidos que hibridan bajo condiciones de hibridación rigurosas o de menos rigor, como se define en la presente, a los polinucleótidos que codifican para cualquiera de los agentes de unión identificados o anticuerpos descritos en la presente. Las modalidades de la invención también incluyen un vector que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el agente de unión. Las modalidades adicionales incluyen una célula huésped que comprende el vector que comprende la molécula de ácido nucleico.

Como se conoce en la materia, los anticuerpos pueden ser ventajosamente, por ejemplo, anticuerpos policlonales , oligoclonales , monoclonales , quiméricos, humanizados, y/o completamente humanos .

Se apreciará que las modalidades de la invención no se limitan a alguna forma particular de un anticuerpo o; método de generación o producción. En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado es un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano. Por ejemplo, el agente de unión identificado puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tiene una región Fe humana intacta) o un fragmento de unión al anticuerpo (por ejemplo, a Fab, Fab' o F(ab' )2# p o dAb).. Adicionalmente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos de un solo dominio tales como dominios VH o VL simples humanos o de camélidos que se unen al Shh, tales como un fragmento dAb.

Las modalidades de la invención descritos en la presente también proporcionan células para producir esos anticuerpos. Los ejemplos de células incluyen hibridomas, o células creadas recombinantemente, tales como células de ovario de hámster chino (CHO) , variantes de células CHO (por ejemplo DG44) y células NSO que producen anticuerpos contra Shh. Información adicional con relación a las variantes de células CHO se puede encontrar en Andersen y Reilly (2004) Current Opinión in Biotechnology 15, 456-462, el cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. El anticuerpo se puede preparar a partir de un hibridoma que segrega el anticuerpo, o a partir de una célula recombinantemente modificada que ha sido transformada o tr,ansfectada con un gen o genes que codifican el anticuerpo.

Adicionalmente , una modalidad de la invención es un método de producir un anticuerpo de la invención mediante el cultivo de las células huésped bajo las condiciones en donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo seguido por la recuperación del anticuerpo. Debe destacarse que las modalidades de la invención también incluyen cualquier molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo de la invención, incluyendo las secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para aumentar los rendimientos de los anticuerpos o fragmentos de éstos cuando se transfectan en células huésped para la producción del anticuerpo.

Una modalidad adicional en la presente incluye un método de producir anticuerpos que se unen específicamente a Shh e inhiben la actividad biológica de Shh, inmunizando un mamífero que expresa human Shh, membranas celulares aisladas que contienen Shh humano, Shh humano purificado,' o un fragmento de éstos, y/o una o más fragmentos o secuencias ortólogas de éstos . i En otras modalidades la invención proporciona composiciones, que incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención o fragmento de unión de éstos, y un diluente o portador farmacéuticamente aceptable.

Aún adicionalmente las modalidades de la invención incluyen métodos de tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad proliferativa angiogénica al administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a Shh. En ciertas modalidades, el método comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de un tumor, cáncer, y/o un trastorno proliferativo celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a Shh.

Aún adicionalmente , las modalidades de la invención incluyen métodos de tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad neoplásica al administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de ún agente de unión identificado que se une específicamente a Shh. En ciertas modalidades el método comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para una enfermedad neoplásica, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a Shh.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen métodos de tratar efectivamente un animal que sufre de un tumor maligno al administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a Shh. En ciertas modalidades, el método comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de un tumor maligno, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a Shh.

Aún adicionalmente , las modalidades de la invención incluyen métodos de tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de Shh al administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a Shh. En ciertas modalidades, el método comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la expresión de Shh, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que se une específicamente a Shh .

Un tumor maligno se puede seleccionar del grupo que consiste de: melanoma, cáncer de células pequeñas, cáncer de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado) , tumor de las tiroides, cáncer gástrico (estómago) , cáncer de próstata, cáncer de mamas, cáncer de ovario,; cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer del endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma esofágico, cáncer de cabeza y ¡cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinóma) , adenocarcinoma del intestino delgado, malignidades pediátricas y carcinoma epidermoide.

Las enfermedades angigénicas o proliferativas tratables incluyen enfermedades neoplásicas, tales como, melanoma, cáncer de células pequeñas, cáncer de células no pequeñas, glioma, cáncer de células no pequeñas avanzado, carcinoma hepatocelular (hígado), tumor de las tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de vejiga,; cáncer de próstata, cáncer de mamas, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de células renales, cáncer de pulmón, : glioblastoma, cáncer del endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma esofágico, cáncer de cabeza y cuéllo, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma) , adenocarcinoma del intestino delgado, malignidades pediátricas, carcinoma epidermoide y leucemia incluyendo leucemia mielógena crónica (CML) incluyendo CML resistente a Gleevec, linfoma incluyendo linfoma de Hodgkiny no Hodgkin; y mieloma incluyendo mieloma múltiple. En una modalidad, la presente invención es adecuada para el uso en inhibir Shh, en pacientes con un tumor que es sólo dependiente, o en' parte, de Shh.

Aún adicionalmente , las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación : de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad proliferativa o angiogénica relacionada. En ciertas modalidades, el uso comprende además seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad proliferativa o angiogénica relacionada.

Aún adicionalmente , las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad neoplásica. En ciertas modalidades él uso comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad neoplásica.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación , de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad no neoplásica. En ciertas modalidades el uso comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad no neoplásica.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de un tumor maligno. En ciertas modalidades, el uso comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de un tumor maligno.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen el uso de un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de Shh. En ciertas modalidades el uso comprende, además, seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la expresión de Shh.

Aún adicionalmente , las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad proliferativa o angiogénica relacionada.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad, neoplásica.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de un tumor maligno.

Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre de una enfermedad o afección asociada con la expresión de Shh. j Aún adicionalmente, las modalidades de la invención incluyen un agente de unión identificado o anticuerpo de la invención para el uso como un medicamento para el tratamiento de un animal que sufre una enfermedad inducida por Shh'.

En una modalidad tratamiento de una enfermedad neoplásica; un tumor maligno; una enfermedad neurológica ; una enfermedad ocular; una enfermedad inflamatoria crónica; una enfermedad o afección asociada con la expresión de Shh; o comprende gestionar, mejorar, prevenir, cualquiera de las condiciones o enfermedades antes mencionadas.

En una modalidad tratamiento de una enfermedad neoplásica comprende la inhibición del crecimiento del' tumor, retardo del crecimiento del tumor, regresión del tumor, encogimiento del tumor, incremento en el tiempo de recrecimiento tumoral en el cese del tratamiento, incremento en el tiempo de recurrencia tumoral, relentecer el progreso de la enfermedad.

En algunas modalidades de la invención, el animal a ser tratado es un humano.

En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado es un anticuerpo monoclonal completamente humano .

En algunas modalidades de la invención, el agente de unión identificado se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales completamente humanos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1 , 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5 , 6D7, 6D70P, 6D70P2, 3H80P, o 1G10P.

Las modalidades de la invención incluyen un conjugado que comprende el agente de unión identificado como los descritos en la presente, y un agente terapéutico. En algunas modalidades de la invención, el agente terapéutico es una toxina. En otras modalidades, el agente terapéutico es un radioisótopo. En aún otras modalidades, el agente terapéutico es una composición farmacéutica.

En otro aspecto, se proporciona un método para matar selectivamente una célula cancerosa en un paciente. El método comprende administrar un anticuerpo conjugado completamente humano a un paciente. El anticuerpo conjugado completamente humano comprende un anticuerpo que puede unirse a Shh y un agente. El agente es una toxina, un radioisótopo, u otra sustancia que mata una célula cancerosa. El anticuerpo conjugado, de este modo, mata selectivamente las 'células cancerosas. i En un aspecto, se proporciona un anticuerpo conjugado completamente humano que se une específicamente a Shh'. Unido al anticuerpo está un agente, y la unión del anticuerpo a una célula resulta en la entrega del agente a la célula., En una modalidad, el anticuerpo conjugado completamente humano anterior se une a un dominio extracelular de Shh. En otra modalidad, el anticuerpo y toxina conjugada se interiorizan por una célula que expresa Shh. En otra modalidad, el, agente es un agente citotóxico. En otra modalidad, el agente es, por ejemplo saporina, o auristatina, pseudomonas exqtoxina, gelonina, ricina, caliqueamicina o inmunoconjugados basados en maitnasina, y similares. En aún otra modalidad, el agente es un radioisótopo.

El agente de unión identificado o anticuerpo de la invención se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación. Por ejemplo, una mezcla de anticuerpos monoclonales , oligoclon les o policlonales Shh que bloquean la proliferación celular sé pueden administrar en combinación con un fármaco que inhiba la proliferación de células tumorales. Además, los agentes de identificación de Shh de la invención se pueden sar en pacientes que han fallado con otros tratamientos de quimioterapia, por ejemplo, tratamientos que incluyen agentes anti-VEGF.

Otra modalidad de la invención incluye un método de diagnosticar enfermedades o afecciones en los cuáles un anticuerpo como el descrito en la presente se utiliza para detectar el nivel de Shh en un paciente o muestra de un paciente. En una modalidad, la muestra de un paciénte es sangre o suero sanguíneo u orina. En modalidades adicionales, se presentan los métodos para la identificación de factores de riesgo, diagnóstico de enfermedades, y establecimiento de la enfermedad que incluyen la identificación de la expresión y/o sobreexpresión de Shh usando anticuerpos anti- Shh. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar a un paciente un anticuerpo conjugado completamente humano' que se une selectivamente a Shh en una célula. El anticuerpo conjugado comprende un anticuerpo que se une específicamente a Shh y un marcador. Los métodos comprenden además observar la presencia del marcador en el paciente. Una cantidad relativamente alta del marcador indicará un riesgo relativamente alto de la enfermedad y una cantidad relativamente baja del marcador indicará un ; riesgo relativamente bajo de la enfermedad. En una modalidad, el marcador es una proteína fluorescente verde. ' La invención proporciona, además, métodos para evaluar el nivel de Shh en una muestra de un paciente, que comprende contactar un anticuerpo como el descrito en la presente con una muestra biológica de un paciente, y, detectar el nivel de unión entre el anticuerpo y Shh en la muestra:. En modalidades más específicas, la muestra biológica es jsangre, plasma o suero.

Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnosticar una afección asociada con la expresión de Shh en una célula contactando el suero o una célula con un anticuerpo como el descrito en la presente, y posteriormente detectar la presencia de Shh. En una modalidad la afección puede ser una enfermedad proliferat iva relacionada que incluye, pero no se limita a, una enfermedad neoplásica.

En otra modalidad, la invención incluye un kit de ensayo para detectar la Shh en los tejidos de los mamíferos, las células o fluidos corporales para detectar las enfermedades relacionadas con Shh. El kit incluye un anticuerpo como el descrito en la presente y un medio para indicar la reacción del anticuerpo con Shh, si está presente. En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . , En una modalidad, el anticuerpo que se une a Shh es marcado. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo primario sin marcar y j el kit incluye además unos medios para detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, los medios de detección incluyen un segundo anticuerpo marcado que es una ! anti-inmunoglobulina . El anticuerpo puede ser marcado ¡con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un fluorocromo, una enzima, un radionúcleido y un material radiopaco.

En algunas modalidades, los agentes de ; unión identificados o anticuerpos como los descritos en la presente se pueden modificar para mejorar su capacidad de fijar el complemento y participar en citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En otras modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos se pueden modificar para mejorar su capacidad de activar las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) . En aún otras modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos como los descritos en la presente se pueden modificar para mejorar su capacidad de activar las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) y para mejorar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En algunas modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos como los descritos en la presente se pueden modificar para reducir su capacidad de fijar el complemento y participar en citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En otras modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos se pueden modificar para reducir su capacidad de activar las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) . ! En aún otras modalidades, los agentes de unión identificados o anticuerpos como los descritos en la presente se pueden modificar para reducir su capacidad de activar las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) y para reducir su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En ciertas modalidades, la media vida de un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito ; en la presente y de las composiciones de la invención es al menos aproximadamente 4 a 7 días. En ciertas modalidades, la vida media promedio de un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente y de las composiciones de la invención es al menos aproximadamente 2 a 5 días, 3 a 6 días, 4 a 7 días, 5 a 8 días, 6 a 9 días, 7 a 10 días, 8 a 11 días, 8 a 12, 9 a 13, 10 a 14, 11 a 15, 12 a 16, 13 a 17, 14 a 18, 15 a 19, ó 16 a 20 días. En otras modalidades, la vida media promedio de un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente y de las composiciones de la invención es al < menos aproximadamente 17 a 21 días, 18 a 22 días, 19 a 23 días, 20 a 24 días, 21 a 25 días, 22 a 26 días, 23 a 27 días, 24 a 28 días, 25 a 29 días, ó 26 a 30 días. En aún otras modalidades la vida media de un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente y de las composiciones de la invención puede ser de hasta aproximadamente 50 días. En ciertas modalidades, las vidas medias de los anticuerpos y de las composiciones de la invención pueden ser prolongadas por métodos conocidos en la técnica. Tal prolongación puede reducir a su vez la cantidad y/o frecuencia de la dosificación de las composiciones del anticuerpo. Los anticuerpos con vidas medias mejoradas in vivo y los métodos para prepararlos se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 6,277,375; y la publicación internacional núms . WO 98/23289 y WO 97/4661.

En otra modalidad, la invención proporciona un artículo de fabricación que incluye un contenedor. El contenedor incluye una composición que contiene un agente de unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente, y un inserto del paquete o etiqueta indicando que la composición se puede usar para tratar la enfermedades relacionadas con la proliferación celular, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad caracterizadas por la expresión o sobreexpresión de Shh.

En otras modalidades, la invención proporciona ; un kit que comprende una composición que contiene un agente dé unión identificado o anticuerpo como el descrito en la presente, e instrucciones para administrar la composición a un sujeto con necesidad de tratamiento.

La presente invención proporciona una formulación de proteínas que comprende una región Fe variante. Es dec'ir, una región Fe de origen no natural, por ejemplo una región Fe que comprende uno o más residuos de aminoácidos de origen no natural. Las regiones Fe variantes de la presente invención también abarcan las regiones Fe que comprenden deleciones, adiciones y/o modificaciones de aminoácidos.

La vida media en suero de las proteínas que comprénden regiones Fe se puede aumentar al aumentar la afinidad de unión de la región Fe por FcRn. En una modalidad, la proteína variante Fe tiene vida media aumentada en suero en relación con la molécula comparable.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 239, 330 y 332, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 239D, 330L y 332E, como se enumeró por el1 índice EU que se expone en Kabat. Opcionalmente , la región Fe puede comprender, además, aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252, 254, y 256, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 239D, 330L y 332E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252?, 254T y 256E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat .

En otra modalidad, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 234, 235 y 331, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y, y 331S, como se enumeró' por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica adicional, una variante Fe de la invención comprende los residuos de aminoácidos de origen no natural 234F, 235F, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En otra modalidad específica, una variante Fe de la invención comprende residuos de aminoácidos de origen no natural 234F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. Opcionalmente , la región Fe puede comprender, además, aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252, 254, y 256, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat; y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252Y, 254T y 256E, como se enumeró por, el índice EU que se expone en Kabat .

En otra modalidad, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 239, 330 y 332, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 239D, 330L y 332E, como se enumeró por el índice EU ' que se expone en Kabat. Opcionalmente, la región Fe puede comprender, además, aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252, 254, y 256, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al ménos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 239D, 330L y 332E, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252Y, 254T y 256E, como se enumeró , por el índice EU que se expone en Kabat.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 234, 235 y 331, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, én donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se; expone en Kabat. Opcionalmente , la región Fe puede comprender, además, aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252, 254, y 256, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y, y 331S, como se enumeró por el índice EU que se expone en Kabat; y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 252Y, 254T y 256E, como se enumeró por el índice EU¦ qué se expone en Kabat .

Métodos para generar regiones Fe de; origen no natural se conocen en la técnica. Por ejemplo, lás substituciones y/o deleciones de aminoácidos se pueden generar por métodos de mutagénesis, que incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos 82:488-492 (1985)), PCR mutagénesis (Higuchi, en "PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp . 177-183 (1990)), y mutagénesis por inserción de un cásete (Wells y otros, Gene 46:315-323 (1985) ) . Preferentemente, la mutagénesis dirigida al sitio se realizó por el método PCR de extensión con traslape (Higüchi, en "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplificatio ' ' , Stockton Press, Nueva York, pp- 61-70 (1989) ) . La técnica de PCR de extensión con traslape (Higuchi, ibid.) también puede usarse para introducir cualquier mutación (es) deseadas en una secuencia objetivo (el ADN de partida) . Por ejemplo, la primera ronda de PCR! en los métodos de extensión del traslape incluye amplificar la secuencia ob etivo con 'un cebador externo (cebador 1) y un cebador de mutagénesis interno (cebador 3) , y separadamente con un segundo cebador externo (cebador 4) y un ¡cebador interno (cebador 2) , provocando dos segmentos PCR (segmentos A y B) . El cebador de mutagénesis interno (cebador 3) se designa para contener desapareamientos con la secuencia objetivo, especificando la(s) mutación(es) deseada(s). En la segunda ronda de PCR, los productos de la primera ronda de PCR (segmentos A y B) se amplifican por PCR usando los dos cebadores externos (cebadores 1 y 4). El segmento PCR de longitud completa resultante (segmento C) se digiere con enzimas de restricción y el fragmento de restricción resultante se clona en un vector adecuado. Como primera etapa de mutagénesis, el ADN de partida (por ejemplo, que codifica una proteína de fusión Fe, un anticuerpo, o simplemente una región Fe) está operablemente clonado en un vector de mutagénesis. Los cebadores se designan para reflejar la sustitución de aminoácidos deseada. Otros métodos útiles para la generación de regiones Fe variantes se conocen! en la técnica (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms.5, 624, 821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; publicación de patente de los Estados Unidos núms . 2004/0002587 y publicaciones PCT WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351) . : En algunas modalidades de la invención, los patrones de glicosilación de los anticuerpos proporcionados en la presente se modifican para mejorar una función efectora ADCC y CDC. Ver Shields RL y otros, (2002) JBC. 277:26733; Shinkawa T y otros, (2003) JBC. 278:4666 y Okazaki A y otros, (2004) J. Mol. Biol . , 336: 1239. En algunas modalidades, una proteína variante Fe comprende uno o más glicoformas modificadas, es decir, una composición de carbohidrato que está covalentemente unida a la molécula que comprende una región Fe. Las glicoformas modificadas pueden ser útiles para una variedad de propósitos, que incluyen pero no se limitan a mejorar o reducir una función efectora. Las glicoformas modificadas se pueden generar por cualquier método conocido por una persona con experiencia en la materia, por ejemplo usando cepas con expresión variante o modificada, por coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) , al expresar una molécula que comprende una región Fe en varios organismos o líneas celulares a partir de varios organismos, o modificando carbohidrato (s) después que la molécula que comprende la región Fe se ha expresado. Los métodos para generar glicoformas modificadas se conocen en la técnica, e incluyen pero no se limitan a las descritas en Umana y otros:, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies y otros, 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields y otros, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa y otros, 2003, J Biol Chem 278:4666-4673) patente de los Estados Unidos núm. 6,602,684; serie de los Estados Unidos núm. 10/277,370; serie de los Estados Unidos núm. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, , N.J.); tecnología de modificación por glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza). Ver, por ejemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki y: otros, 2004, JMB, 336: 1239-49.

También se conoce en la técnica que la glicosilación de la región Fe se puede modificar para aumentar o disminuir una función efectora (ver por ejemplo, Umana y otros, 1999, Nat . Biotechnol 17:176-180; Davies y otros, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields y otros, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa y otros, 2003, J Bioí Chem 278:4666-4673) patente de los Estados Unidos núm. 6,602,684; serie de los Estados Unidos núm. 10/277,370; serie de los Estados Unidos núm. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; : PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1 ; PCT WO 02/3!?954?1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación por glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza) . En consecuencia, en una modalidad las regiones Fe de los anticuerpos de la invención comprenden una glicosilación alterada de los residuos de aminoácidos. En otra modalidad, la glicosilación alterada de líos residuos de aminoácidos resulta en una función efectora disminuida. En otra modalidad, la glicosilación alterada de los residuos de aminoácidos resulta en una función efectora aumentada. En una modalidad específica, la región Fe tiene fucosilación reducida. En otra modalidad, la región Fe es fucosilada (ver, por ejemplo, publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2005/0226867) .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa un gráfico de barras que muestra los resultados de la modulación farmacodinámica de Glil y Ptcl de ratón en el estroma de los tumores de xenoinjertos Colo205 por los anticuerpos en particular.

Las Figuras 2A a 2C representan la armacocinética de los anticuerpos en particular a continuación de una única dosis de 0.5 mg/kg según un gráfico de líneas con respecto a los niveles de la hedgehog del estroma que se dirige a Glil y Ptcl de ratón en los tumores de xenoinjertos Colo205 que se muestran en forma de gráfico de barras.

La Figura 3A representa un gráfico de línea que muestra la inhibición del crecimiento tumoral en el xenoinjérto en HT-29 por el anticuerpo 3H8.

La Figura 3B representa un gráfico de barras que 'muestra los efectos farmacodinámicos del anticuerpo 3H8 sobre los genes de hedgehog objetivo que se expresan en el estroma de los tumores de xenoinjérto HT-29, cuyo crecimiento se inhibió por el tratamiento del anticuerpo.

La Figura 4A representa un gráfico de línea que muestra la inhibición del crecimiento por los anticuerpos en particular del modelo de tumor primario de carcinoma de colon HCXF-001 en ratones desnudos.

La Figura 4B representa un gráfico de barras que muestra los resultados de la modulación farmacodinámica de los genes de la hedgehog objetivo en el estroma de los tumores del xenoinjerto en HXCF-001, cuyo crecimiento se inhibió por el tratamiento con los anticuerpos en particular.

La Figura 5 representa un gráfico de línea que muestra la inhibición del crecimiento tumoral del xenoinjerto HT-55 por el anticuerpo 6D7.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las modalidades de la invención se refieren a un conjunto nuevo de moléculas de bloqueo a Shh, tal como, por ejemplo, los anticuerpos, que inhiben la unión de; Shh a Patchet 1/2. Tales moléculas se pueden usar como agentes únicos, o de forma alternativa, en combinación con otros anticuerpos/agentes de unión. Ellos se pueden usar también en combinación con algún estándar o nuevos agentes anti-cáncer.

Las modalidades de la invención que se refieren a los agentes de unión identificado que se unen a Shh. En algunas modalidades, los agentes de unión identificado se unen a Shh e inhiben la unión de un Shh a su receptor Patched 1/2. En algunas modalidades, esta unión se puede neutralizar, bloquear, inhibir, anular o interferir con uno o más aspectos de los efectos asociados a Shh. En una modalidad, los agentes predefinidos son anticuerpos monoclonales , o fragmentos de unión de estos. Tales anticuerpos monoclonales se pueden referir a los anticuerpos anti-Shh en este documento. , Otras modalidades de la invención incluyen los anticuerpos anti-Shh completamente humanos, y las preparaciones del anticuerpo que son terapéuticamente útiles. En una modalidad, las preparaciones del anticuerpo anti-Shh de la invención tienen propiedades terapéuticas convenientes, que incluyen una fuerte afinidad de unión para la Shh, la capacidad de promover la apoptosis de células endoteliales o inhibir la proliferación de células endoteliales y la capacidad de inducir la citotoxicidad de las células endoteliales a través de ADCC y/o actividad de CDC. 1 Además, las modalidades de la invención incluyen los métodos para usar estos anticuerpos para tratar las enfermedades. Los anticuerpos anti-Shh de la invención son útiles para prevenir la proliferación celular del tumor mediado por Shh. Cualquier enfermedad que se caracterice por un tipo de tumor maligno, que incluyen los canceres metastásicos , los tumores linfáticos, y cánceres de la sangre, se pueden tratar también por este mecanismo de inhibición. Los canceres ejemplares en seres humanos incluyen a un tumor de vejiga; un cáncer celular renal; un tumor de mama; un tumor de próstata; un carcinoma celular basal; un cáncer del tracto biliar; un cáncer de vejiga; un cáncer de hueso; un cáncer de cerebro y SNC (por ejemplo, el tumor glioma) ; un cáncer cervical; un coriocarcinoma ; un cáncer de colon y recto; un cáncer de tejido conjuntivo; un cáncer del sistema digestivo; un cáncer de endometrio; un cáncer de esófago; un cáncer de ojo; un cáncer de cabeza y cuello; un cáncer gástrico; una neoplasia intraepitelial ; un cáncer de riñon; un cáncer de laringe; una leucemia; un cáncer de hígado; un pulmón cáncer (por ejemplo, de células pequeñas y de células no pequeñas) ; un linfoma que incluye un linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin; melanoma; mieloma que incluye un mieloma múltiple; neuroblastoma ; cáncer de la cavidad oral (por ejemplo, labio, lengua, boca y faringe) ; un cáncer de ovario; un cáncer pancreático; un retinoblastoma ; un rabdomiosarcoma; un cáncer de recto; un cáncer renal; un cáncer del sistema respiratorio; un sarcoma; un cáncer de piel; un cáncer de estómago; un cáncer testicular; uri cáncer de tiroides; un cáncer uterino; un cáncer del sistema urinario; así como otros carcinomas y sarcomas. Los trastornos malignos se diagnostican comúnmente en Iperros, gatos y otros animales domésticos que incluyen, pero no se limitan a, linfosarcoma, osteosarcoma, tumores mamarios, mastocitoma, tumor cerebral, melanoma, carcinoma adenoescamoso, tumor de pulmón carcihoide, tumor : de la glándula bronquial, adenocarcinoma bronquiolar, fibroma, mixocondroma, sarcoma pulmonar, neurosarcoma, dsteoma, papiloma, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, tumor de1 Wilms, linfoma de Burkitt, microglioma, neuroblastoma, osteoclastoma, neoplasia oral, fibrosarcoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma, carcinoma genital de célula escamosa, tumor venéreo transmisible, tumor testicular, seminoma, | tumor celular de Sertoli, hemangiopericitoma, histiocitoma , 'cloroma (por ejemplo, el sarcoma granulocítico) , papiloma de córnea, carcinoma de córnea de célula escamosa, hemangiosarcoma , mesotelioma pleural, tumor celular basal, timoma, tumor de estómago, carcinoma de la glándula suprarrenal, papildmatosis oral, hemangioendotelioma y cistoadenoma , linfoma folicular, linfosarcoma intestinal, fibrosarcoma y carcinoma pulmonar de célula escamosa. En los roedores, tales como un hurón, los cánceres ejemplares incluyen insulinoma, linfoma, sarcoma, neuroma, tumor de la célula de islote pancreático, linfoma de MALT gástrico y adenocarcinoma gástrico. Las neoplasias que afectan al ganado agrícola incluyen la leucemia, hemangiopericitoma y neoplasia ocular bovina (en el ganado) ; fibrosarcoma del prepucio, carcinoma ulceroso de célula escamosa, carcinoma de prepucio, neoplasia del tejido conjuntivo y mastocitoma (en los caballos) ; carcinoma hepatocelular (en los cerdos) ; linfoma y adenomatosis pulmonar (en la oveja) ; sarcoma pulmonar, linfoma, sarcoma de Rous, retículo-endoteliosis , fibrosarcoma, nefroblastoma, linfoma de célula B y leucosis linfoide (en las especies de aves) ; retinoblastoma, neoplasia hepática, linfosarcoma (linfoma linfoblástico) , leucemia plasmocitoide y sarcoma de vejiga natatoria (en el pescado), linfadenitis caseosa (CLA) : enfermedad crónica, infecciosa, contagiosa de la oveja y los carneros causada por la bacteria Corynebacterium pseudotuberculosis , y tumor pulmonar contagioso de la oveja causada por jaagsiekte.

Otras modalidades de la invención incluyen los énsayos de diagnóstico para determinar específicamente la cantidad de Shh en una muestra biológica. El kit de ensayo puede incluir un agente o anticuerpo de unión identificado como se divulga en este documento junto con los marcadores necesarios para la detectar tales anticuerpos. Estos ensayos de diagnóstico son útiles para detectar las enfermedades relacionadas ¡con la proliferación celular, que incluyen pero no se limitan a, las enfermedades neoplásicas.

Otro aspecto de la invención es un antagonista' de la actividad biológica de Shh en donde el antagonista se une a Shh. En una modalidad, el antagonista es un agente de unión identificado, tal como un anticuerpo. El antagonista se puede seleccionar de un anticuerpo descrito en la presente, por ejemplo, el anticuerpo 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4 , 1H8, 1H12, 1C8, 1A5 , 6D7, 6D70P, 6D70P2, 3?80?, o 1G10P.

En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de Shh se puede unir a Shh y de este modo inhibir o suprimir unión del ligando al receptor hedgehog, Patched-1, inhibiendo así la proliferación celular.

Una modalidad es un agente de unión identificado que se une al mismo epítopo o epítopos como el anticuerpo monoclonal completamente humano 1A12, 1G12, 1H10, : 3H8, 4B6, 1G1, 1F4 , 1H8, 1H12, 1C8, 1A5 , 6D7 , 6D70P, 6D70P2 , 3H80P, o 1G10P .

Una modalidad, es un anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopos que el anticuerpo monoclonal completamente humano 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1 , 1F4 , 1H8 , 1H12 , 1C8 , 1A5, 6D7, 6D70P, 6D70P2 , 3H80P, o 1G10P .

Una modalidad, es un hibridoma que produce el agente de unión identificado como es descrito en la presente anteriormente. En una modalidad es un hibridoma que produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de los anticuerpos como los descritos en la presente anteriormente. En una modalidad, el hibridoma produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. En otra modalidad, el hibridoma produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de anticuerpo monoclonal completamente; humano 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8 , 1H12, 1C8 , 1A5 , 6D7, 6D70P, 6D70P2 , 3H80P, o 1G10P. Alternativamente, el hibridoma puede producir un anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopos que el anticuerpo monoclonal completamente humano 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8 , 1H12, 1C8 , 1A5, 6D7, 6D70P, 6D70P2, 3H80P, o 1G10P .

Otra modalidad es una molécula de ácido nucleico que codifica al agente de unión identificado como se describió anteriormente en este documento. En una modalidad es una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo como se describió anteriormente en este documento. En una modalidad la molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera o- la , cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. Aún otra modalidad es una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano que se selecciona de los anticuerpos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4 , 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D70P , 6D70P2 , 3H80P o 1G10P . i Otra modalidad de la invención es un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico como se describió anteriormente en este documento, donde el' vector codifica un agente de unión identificado según se! define anteriormente este documento. En una modalidad de la invención, es un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico como se describió anteriormente en este documento, donde el vector codifica una cadena ligera y/o una cadena pesada de un anticuerpo como se definió anteriormente este documento.

Todavía otra modalidad de la invención es una célula huésped que comprende un vector como se describió anteriormente en este documento. Por otra parte, la^ célula huésped podría comprender más de un vector.

Además, una modalidad de la invención es un método para producir un agente de unión identificado de la invención mediante el cultivo de las células huésped bajo las condiciones donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producin el agente de unión identificado, seguido por la recuperación del agente de unión identificado. En una modalidad de la invención está un método para producir un anticuerpo de la invención mediante el cultivo de las ^células huésped bajo las condiciones donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo, seguido por la recuperación del anticuerpo. ! En una modalidad, la invención incluye un método para preparar un agente de unión identificado mediante la transfección de al menos una célula huésped con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica el agente de unión identificado como se describió anteriormente en este documento, para expresar la molécula de ácido nucleico en la célula huésped y aislar el agente de unión identificado. En una modalidad, la invención incluye un método para preparar un anticuerpo mediante la transfección de al menos una célula huésped con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se describió anteriormente en este documento, para expresar la molécula de ácido nucleico en la célula huésped y aislar el anticuerpo.

De acuerdo con otro aspecto, la invención incluye un método de antagonizar la actividad biológica de Shh al administrar un antagonista como el descrito en la presente. El método puede incluir seleccionar un , animal con necesidad de tratamiento para la proliferación celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de la actividad biológica de Shh.

Otro aspecto de la invención incluye un método de antagonizar la actividad biológica de Shh al administrar un agente de unión identificado como es descrito en la presente anteriormente. El método puede incluir seleccionar un, animal con necesidad de tratamiento para la proliferación celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de Shh.

Otro aspecto de la invención incluye un método de antagonizar la actividad biológica de Shh al administrar un anticuerpo como el descrito en la presente anteriormente. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento de proliferación celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método de tratar la proliferación celular en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de la actividad biológica de Shh. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para la proliferación celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de la actividad biológica de Shh.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método de tratar la proliferación celular en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de Shh. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para la proliferación celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de Shh. El agente de unión identificado se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos i adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de tratar la proliferación celular en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para la proliferación celular, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh. El anticuerpo se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de tratar el cáncer en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de la actividad biológica de Shh. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para el cáncer, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista que antagoniza la actividad biológica de Shh. El antagonista se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicioríalés o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación. ' De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de tratar el cáncer en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de Shh. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de tratamiento para el cáncer, y administrar al animal una; dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de Shh. El agente de unión identificado se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación. ; De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de tratar el cáncer en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de> tratamiento para el cáncer, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh. El anticuerpo se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de reducir o inhibir la proliferación de células tumorale!s en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de una reducción o inhibición de la proliferación y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh. El anticuerpo se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método de reducir el crecimiento del tumor y/o metástasis, en un animal al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh. El método puede incluir seleccionar un animal con necesidad de una reducción de crecimiento tumoral y/o metástasis, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh. El anticuerpo se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármacos quimioterapéuticos o terapia de radiación.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un antagonista de la actividad biológica de Shh para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la proliferación celular. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de; Shh es un agente de unión identificado de la invención. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de Shh es un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona allí un antagonista de la actividad biológica de Shh para su uso como medicamento para el tratamiento de la proliferación celular. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de Shh es un agente de unión identificado de la invención. En una modalidad, el antagonista; de la actividad biológica de Shh es un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona el uso de un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la proliferación celular.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para el uso como un medicamento para el tratamiento de proliferación celular.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona el uso de un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para la preparación de un medicamento para el tratamiento de proliferación celular relacionada con la enfermedad. : De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para el uso como un medicamento para el tratamiento de proliferación celular relacionada con la enfermedad. j De acuerdo con otro aspecto de la invenc'ión se proporciona el uso de un antagonista de la actividad biológica de Shh para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de Shh es un agente de unión identificado de la invención. En una modalidad el antagonista de la actividad biológica de Shh es un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un antagonista de la actividad biológica' de Shh para el uso como un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero. En una modalidad, el antagonista de la actividad biológica de Shh es un agente de unión identificado de la invención. En una modalidad el antagonista; de la actividad biológica de Shh es un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente de unión identificado que antagon za la actividad biológica de Shh para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer : en un mamífero.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un agente de unión identificado que antagoniza la actividad biológica de Shh para el uso como un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona el uso de un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para la preparación : de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para el uso como un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona el uso de un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para la preparación de un medicamento para la reducción o inhibición de la proliferación en un animal.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para el uso como un medicamento para la reducción o inhibición de la proliferación, y/o angiogénesis en un animal.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona el uso de un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para la preparación; de un medicamento para reducir el crecimiento del tumor y/o metástasis, en un animal. : De acuerdo con otro aspecto se proporciona un agente de unión identificado o un anticuerpo que antagoniza la actividad biológica de Shh para el uso como un medicamento para reducir el crecimiento del tumor y/o metástasis; en un animal .

En una modalidad, la presente invención es adecuada, en particular, para el uso en antagonizar a la Shh, en los pacientes con un tumor que es sólo dependiente, o en; parte, de la señalización del receptor de Shh.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un antagonista de la actividad biológica de Shh, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad el antagonista comprende un anticuerpo. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona allí una composición farmacéutica que comprende un antagonista de la actividad biológica de Shh, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad el antagonista comprende un anticuerpo.

En algunas modalidades, a continuación de la administración del anticuerpo que se une específicamente a Shh, se administra un agente de compensación, para eliminar el exceso de anticuerpos circulantes de la sangre.

Los anticuerpos anti-Shh son útiles en la detección de Shh en las muestras de pacientes y, en consecuencia son útiles como diagnosticadores de estados de la enfermedad según lo descrito en este documento. Además, en base a su capacidad para inhibir significativamente la actividad de señalización mediada por Shh (como se muestra en los Ejemplos a continuación) , los anticuerpos anti-Shh tienen ¡efectos terapéuticos en el tratamiento de los síntomas ¡ y las afecciones que resultan de la expresión de Shh'. En modalidades específicas, los anticuerpos y los métodos de este documento se refieren al tratamiento de los síntomas que resultan de la proliferación y/o señalización intracelular inducida por Shh. Las modalidades adicionales involucran usar los anticuerpos y los métodos descritos en este documento para tratar las enfermedades relacionadas con la proliferación celular, que incluyen las enfermedades neoplásicas, tales como, melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (estómago) , cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer de endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon y cáncer pancreático. ! Otra modalidad de la invención incluye un kit de ensayo para detectar el Shh en los tejidos de los mamíferos, las células o los fluidos corporales para la detección de enfermedades relacionadas con la proliferación celular. El kit incluye un agente de unión identificado que se une a Shh y medios para indicar si está presente la reacción del agente de unión identificado con Shh. En una modalidad, el agente de unión identificado que se une a Shh es marcado. En otra modalidad, el agente de unión identificado es un agente sin marcar y el kit incluye además unos medios para detectar el agente de unión identificado. De preferencia, el agente de unión identificado es marcado con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima , radionúclidos y un material radio-opaco.

Otra modalidad de la invención incluye un kit de ensayo para detectar Shh en los tejidos de los mamíferos, las células o fluidos corporales para detectar las enfermedades relacionadas con la proliferación. El kit incluye un anticuerpo que se une a Shh y unos medios para indicar si está presente la reacción del anticuerpo con Shh. El anticuerpo podría ser un anticuerpo ¡ monoclonal. En una modalidad, el anticuerpo que se une a Shh es marcado. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo primario sin marcar y el kit incluye además unos medios para detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, los medios incluyen un segundo anticuerpo marcado que es una anti-inmunoglobulina. De preferencia, el anticuerpo es marcado con un marcador seleccionado del grupo consistente de un fluorocromo, una enzima, radionúclidos y un material radiopaco. ; Las modalidades adicionales, características, y similares con respecto a los anticuerpos de acuerdo a lo descrito en este documento se proporcionan a continuación con detalles adicionales.

Listado de Secuencia Las modalidades de la invención incluyen los anticuerpos específicos enumerados a continuación en la Tabla i. Esta tabla reporta el número de identificación de cada anticuerpo anti-Shh, conjuntamente con el número de ident. de ía sec. del dominio de los polipéptidos y genes de cadena pesada y de cadena ligera correspondientes, respectivamente. Á cada anticuerpo se le ha dado un número de identificación. .

Tabla 1 Mab con Secuencia sec . núm. de con ident. : núm. de ident. : Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 1 Secuencia de aminoácidos que codifica la región 1A12 variable de la cadena pesada 2 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 3 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 4 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 5 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 6 1G12 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 7 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 8 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 9 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 10 1H10 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 11 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 12 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 13 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 4 H8 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 15 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 16 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 17 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 18 B6 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 19 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 20 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 21 .

Secuencia de aminoácidos- que codifica la región variable de la cadena pesada 22 G1 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 23 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 24 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 25 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 26 F4 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 27 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 28 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 29 H8 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 30 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 31 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 32 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 33 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 34 H12 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 35 , 1 Secuencia de aminoácidos que codifica la región i i variable de la cadena ligera 36 Secuencia de nucleótidos que codifica la región 1 variable de la cadena pesada 7 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 38 , < C8 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 39 ' Secuencia de aminoácidos que codifica la región i ' variable de la cadena ligera 40 1 Secuencia de nucleótidos que codifica la región 1 variable de la cadena pesada 41 Secuencia de aminoácidos que codifica la región i , . variable de la cadena pesada 42 A5 Secuencia de nucleótidos que codifica la región i ' ! 1 variable de la cadena ligera 43 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 44 Secuencia de nucleótidos que codifica la región i variable de la cadena pesada 45 Secuencia de aminoácidos que codifica la región 1 i variable de la cadena pesada D7 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 47 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 48 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 49 Secuencia de aminoácidos que codifica la región 6D7 variable de la cadena pesada 50 OP(2) Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 51 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 52 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 49 Secuencia de aminoácidos que codifica la región 6D7 variable de la cadena pesada 50 OP Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 53 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 54 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 21 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada 22 1G10P Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 55 Secuencia de aminoácidos que codifica la región i ; variable de la cadena ligera 56 Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 57 Secuencia de aminoácidos que codifica la región 3H8 variable de la cadena pesada 58 OP Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 59 Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera 60 DEFINICIONES A menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos usados en este documento tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica. Además, a menos se requiera lo contrario por el contexto, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y técnicas de, cultivo celular y de tejido, biología molecular y proteína y química de oligo-o polinucleótido y la hibridación que se describen n este documento son aquellas bien conocidas y se usan comúnmente en la técnica.

Las técnicas estándares se usan para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos y el cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como se ejecutan normalmente en la técnica o según se describe en este documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan, en general, de acuerdo a los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en las distintas referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a lo largo: de la presente descripción. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor¿ Nueva York (2001) ) , que se incorpora a este documento como referencia. Las nomenclaturas que se utilizan en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de la química analítica, la química orgánica sintética, y la química médica y farmacéutica que se describen en este documento son aquellas bien conocidas y que sé usan comúnmente en la técnica. Las técnicas estándares se usan para la síntesis química, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación y la entrega, y el tratamiento de los pacientes.

Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, se entenderán que tienen los siguientes significados: Un antagonista o un inhibidor podría ser un polipéptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, un lípido, un compuestos de peso molecular pequeño, un oligonucleótido, un oligopéptido, un ARN de interferencia (ARNi) , un antisentido, una proteína recombinante , un anticuerpo, o fragmentos de éstos o conjugados o proteínas de fusión de éstos. Para una revisión del ARNi, ver Milhavet 0, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev. 2003 Dec; 55 (4) : 629-48. Revisión) y del antisentido (ver Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKÉ . 2003 Oct 28; 2003 (206):pe47.) Un compuesto se refiere a cualquier compuesto de peso molecular pequeño con un peso molecular menor que aproximadamente 2000 Dalton.

El término "homólogo de sonic hedgehog" o "Shh" se refiere a la molécula que es la proteína homologa de sonic hedgehog, conocida también como HHG1, HHG-1, HLP3 ,'¦ HPE3 , SMMCI, TPT, TPTPS, MC0PCB5, y al precursor de la proteína sonic hedgehog.

Los términos "que neutraliza" o "inhibe" cuando se refieren a un agente de unión identificado, tal como un anticuerpo, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para eliminar, reducir, o reducir de forma significativa, la actividad de un antígeno objetivo. Por consiguiente, un anticuerpo anti-Shh de la invención "que neutraliza" es capaz de eliminar o reducir significativamente la actividad de Shh. Un anticuerpo neutralizante Shh podría, por ejemplo, actuar mediante el bloqueo de la unión de un Shh a su receptor Patched, por ejemplo, Patched-1 o Patched-2. Mediante el bloqueo de esta unión, la actividad mediada por la señal de Shh es significativamente o totalmente, eliminada.

Idealmente, un anticuerpo neutralizante contra Shh inhibe la proliferación celular tumoral, o inhibe la producción or las células del estroma de los factores que promueven la proliferación de células tumorales, o inhibe la autorrenovación de las células madre del cáncer. j Un "antagonista de la actividad biológica de Shh" es capaz de eliminar, reducir o reducir significativamente la actividad de Shh. Un "antagonista de la actividad biológica de Shh" es capaz de eliminar, reducir o reducir significativamente' la señalización de Shh. Un "antagonista de la actividad biológica de Shh" podría eliminar o reducir significativamente la proliferación de células tumoralés.

"Reducir la señalización Shh" abarca una reducción de la señalización de Shh por al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% en comparación con el nivel de señalización en ausencia de un agente de unión identificado, anticuerpo o antagonista de la invención.

El término "polipéptido" se usa en la presente como un término genérico para referirse a las proteínas nativa, fragmentos, o análogos de una secuencia de polipéptidos. Por lo tanto, la proteína nativa, los fragmentos, y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina humana de cadena pesada y las moléculas de inmunoglobulina humana de cadena ligera kappa, así como las moléculas del anticuerpo se forman por las combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como, las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa o lamda, y viceversa, así como los fragmentos y análogos de éstos. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención podrían comprender también únicamente las moléculas de inmunoglobulina humana de cadena pesada o fragmentos de éstas.

Una secuencia "optimizada" es una secuencia de anticuerpos donde la CDR y/o la secuencia marco : de la secuencia variable de cadena pesada o ligera se muta para I eliminar una o más secuencias de la secuencia de la línea no-germinal y puede incluir además la eliminación de las complicaciones estructurales de la secuencia tales como los sitios de glicosilación o cisteínas sin parear.

Los términos "nativos" o "de origen natural" se usan en este documento según se aplica a un objeto que refiere el hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo a los virus) que se pueden aislar de una fuente en la naturaleza y que no haya sido intencionalmente modificada por el hombre; en el laboratorio o de lo contrario sea de origen natural .

El término "enlazado de manera conveniente" como1 se usa en este documento, se refiere a las posiciones :de los componentes de modo que están descritos en una relación que les permite funcionar a la manera propuesta por estos. Por ejemplo, una secuencia de control "enlazada de manera conveniente" a una secuencia que codifica se conecta de tal manera que la expresión de la secuencia que codifica se alcanza bajo condiciones compatibles con las secuencias de control .

El término "polinucleótido" referido en este documento significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucTeótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido^ o los ARN-ADN-heterodúplex . El término incluye las formas de ADN simple o doble cadena.

El término "oligonucleótido" referido en el presente documento incluye los nucleótidos de origen natural, que se enlazan entre sí mediante los enlaces dé origen natural y los de origen no natural. Los oligonucleótidos son un subqonjunto del polinucleótido que en general comprende una longitud de 200 bases o menos. De preferencia, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y con máxima preferencia, de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son a menudo de una cadena simple, por ejemplo, para las sondas, aunque los oligonucleótidos podrían ser de doble cadena, por ejemplo, para usar en la construcción de un gen mutante . Los oligonucleótidos; pueden ser oligonucleótidos ya sea sentido o antisentido. ; El término "nucleótidos de origen natural" a que se refiere este documento incluye los desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos . El término "nucleótidos modificados" que refiere este documento incluye los nucleótidos con los grupos de azúcar modificados o sustituidos y los similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" a que se refiere este documento incluye los enlaces de los oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y los similares. Ver por ejemplo, LaPlanche y otros Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); 'Stec y otros. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein y otros. Nucí. Acid's Res. 16:3209 (1988); Zon y otros. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon y otros. Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp . 87-108 (F. Eckstein, Edición, Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec y otros Patente de los Estados Unidos núm. 5,151,510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), las divulgaciones de los cuales se incorporan a este documento como referencia. Un oligonucleótido puede incluir un mareaje para la detección, si se desea.

El término "hibridación selectiva" a que se refiere este documento significa la unión de forma detectable y específica. Los polinucleótidos , : oligonucleótidos; y fragmentos de éstos se hibridan selectivamente a las cadenas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y' lavado que minimicen en cantidades apreciables la unión detectable a los ácidos nucleicos no específicos. Se pueden usar condiciones de alta rigurosidad para alcanzar las condiciones de hibridación selectiva como se conoce en la técnica y se discute en este documento. En general, la homología en la secuencia de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos , los oligonucleótidos , o los fragmentos de anticuerpos \ y una secuencia de ácido nucleico de interés será al menos 80%, y más típicamente con homologías que de preferencia aumenten al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%.

Las condiciones rigurosas de hibridación incluyen, pero no se limitan a, la hibridación con el ADN unido al filtro en el cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) (0.9 M de NaCl , 90 mM de Citrato de Na, pH 7.0) a aproximadamente 45 °C seguido por uno o más lavados en SSC 0.2X, 0.1% de SDS a aproximadamente 50-65 °C, condiciones altamente rigurosas, tales como la hibridación de ADN unido al filtro en SlSC 6X a 45 °C seguido por uno o más lavados en SSC 0.1X, 0,2%; de SDS a aproximadamente 60 °C, o algunas otras condiciones rigurosas de hibridación conocidas por aquellas personas con conocimiento en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel, F.M. y otros, ediciones. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, Green Publishing Associates, Inc.; y John iley and Sons, Inc, NY en las páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3) . Dos secuencias de aminoácidos son "homologas" si existe una identidad parcial o total entre sus secuencias.

Por ejemplo, el 85% de homología significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para la coincidencia máxima. Las brechas (en cualquiera de las dos secuencias que se hacen coincidir) se permiten en la coincidencia máxima; se prefieren longitudes de brecha de 5 o menos, siendo de mayor preferencia 2 o menos. Por otra parte y de preferencia, dos secuencias de la proteína (o secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitüd) son homologas, según se usa este término en este documento, si tienen una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de la mutación de la matriz y una penalidad de brecha de 6 o mayor. Ver Dayhoff , .O, en Atlas of jPrótein Seguence and Structure, p . 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972) ) y suplemento 2 |de este volumen, pp . 1-10. Las dos secuencias o partes de éstas son homologas, con mayor preferencia, si sus aminoácidos son mayores que o iguales 50% idénticos cuando se alinean de manera óptima mediante el programa ALIGN. Se debe apreciar que pueden existir diferentes regiones de homología 1 en dos secuencias ortólogas. Por ejemplo, los sitios funcionales de ortólogos de ratón y humanos podrían tener un grado superior de homología que en las regiones no-funcionales .

El término "corresponde a" se usa en este documento para significar que una secuencia de polinucleótidos es homologa (es decir, es idéntica, sin relación estrictamente evolutiva) a toda o a una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia.

En contraposición, el término "complementario a" ( se usa en este documento para significar que la secuencia complementaria es homologa a toda o a una parte 'de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustrar, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" .

El término "identidad de la secuencia" significa !gue dos secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótidp o de residuo por residuo) en la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula por la comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de comparación, la determinación del numero de posiciones en las cuales la base idéntica de ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) o residuo de aminoácido tiene lugar en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño ; de la ventana) , y la multiplicación del resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" según se usa en este documento denota una característica de una secuencia de polinucleótido o de aminoácidos, donde el polinucleótido o ácido amino comprende una secuencia que tiene al menos 85 porciento de identidad de secuencia, de preferencia al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, con mayor preferencia al menos 99 porciento de identidad de secuencia, cuando se compara con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos) , a menudo sobre una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos) , donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula por la comparación de la secuencia de referencia con la secuencia que podría incluir supresiones o adiciones que suman en total 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la i ventana de comparación. La secuencia de referencia podría ser un subconjunto de una secuencia más grande.

Según se usa en este documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2da Edición, E.S. Golub; y .D.R.

Gren, Ediciones., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que se incorpora a este documento como referencia. Los estereoisómeros (por ejemplo, los D-aminoácidos) ; de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales tales como los aminoácidos a, a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales podrían ser también componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de los aminoácidos no convencionales incluyen: 4 -hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?, , -trimetillisiha, e-?-acetillisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina', 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la anotación de polipéptido que se usa en este documento, la dirección a la izquierda es la dirección del amino terminal y la dirección a la derecha ; es la dirección carboxi-terminal , de acuerdo con el uso y convención estándar.

Del mismo modo, a menos que se especifique lo contrario, el extremo a la izquierda de las secuencias de polinucleótidos de simple cadena es el extremo 5', la dirección a la izquierda de las secuencias de polinucleótidos de doble cadena se refiere como la dirección 5' . La dirección de adición 5' a 3' de transcriptos del ARN naciente se refiere como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia del ARN y que son 5' al extremo 5' del transcripto de ARN se refieren como "secuencias de corriente arriba"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia del ARN y que son 3' al extremo 3' del transcripto de ARN se denominan "secuencias de corriente abajo".

Según se aplica a los polipéptidos , el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean de manera óptima, tal como por los programas GAP. o BESTFIT mediante los pesos de brecha por defecto, comparten al menos 80 por ciento de la identidad de secuencia, de preferencia al menos 90 porciento de identidad de secuencia, con mayor preferencia al menos 95 porciento de identidad de secuencia, y con máxima preferencia al menos 99 porciento de identidad de secuencia. De preferencia, las posiciones de residuos que no son idénticos difieren por las sustituciones conservativas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la capacidad de Í intercambio de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que1 tienen cadenas laterales alifáticas es la glicina, la alanina, la valina, la léucina e la isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo-alifáticas es la serina y la treonina; un grupo de aminoácidos que, tienen cadenas laterales que contienen amida es la asparagina y la glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina, la tirosina y el triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen ¡cadenas laterales básicas es la lisina, la arginina y la histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y la metionina. De preferencia los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina , alanina-valina, glutámico-aspártico, y asparagina-glutamina . ; Según lo discutido en este documento, las variaciones pequeñas en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan según están incluidas por la presente invención, que proporciona que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos 75%, con mayor preferencia al menos 80%, 90%, 95%, y con máxima preferencia el 99% de identidad de secuencia con los anticuerpos o las moléculas de inmunoglobulina que se describen en este documento. En particular, los reemplazos conservativos de aminoácidos se contemplan. Los reemplazos conservativos son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en las familias: (1) ácida=aspartato, glutamato; (2) básica= lisina, arginina, histidina; (3) no polar=alanina , valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga=glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias de mayor preferencia son: serina y treonina son una familia hidroxi-alifáticos ; la asparagina y la glutamina son una familia que contiene, amida; la alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia de alifáticos; y la fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia de aromáticos. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido Icón un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un! efecto mayor sobre la función o las propiedades de unión, de la molécula resultante, en especial si el reemplazo no involucra un aminoácido dentro de un sitio marco. Se puede determinar fácilmente al ensayar la actividad específica del polipéptido derivado si un cambio de aminoácido resulta en un péptido funcional. Los ensayos se describen en detalle en este documento. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se pueden preparar fácilmente por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica. Los terminales amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos tienen lugar cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante la comparación de los datos de la secuencia del nucleótido y/o aminoácido con la base de datos de secuencia pública o privada. De preferencia, los métodos automatizados de comparación se usan para identificar los motivos de secuencia o predecir los dominios de conformación de la proteína que tienen lugar en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar las secuencias de proteínas \ que se pliegan en una estructura tridimensional conocida se conocen. Bowie y otros Science 253:164 (1991). De este modo, los ejemplos anteriores demuestran que aquellas personas con conocimiento en la técnica pueden reconocer los motivos de secuencia y conformaciones estructurales que se podrían usar para definir los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con los anticuerpos descritos en este documento.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo se desamidan a menudo a los residuos correspondientes glutamil y aspartil, respectivamente. Estos residuos se desamidan bajo condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos está dentro del alcance de esta invención.

En general, los residuos de cisteína en las proteínas están comprometidos en los enlaces cisteína-cisteína del disulfuro o estéricamente protegidos de la formación de enlaces disulfuro cuando son una parte de la región de la proteína plegada. La formación del enlace disulfuro ' en las proteínas es un proceso complejo, que se determina ¡ por el potencial redox del medio ambiente y las enzimas especializadas que intercambian el tiol -disulfuro (Creighton, Methods Enzymol . 107, 305-329, 1984; Houee-Levin, Methods Enzymol . 353, 35-44,2002). Cuando un residuo de cisteína no tiene un par en la estructura de proteínas y no se protege estéricamente por el plegado, puede formar un enlace disulfuro con la cisteína libre de la solución en un proceso conocido como la reorganización del disulfuro. En otro proceso conocido como la mezcla del disulfuro, las cisteínas libres pueden interferir también con los enlaces disulfuros de origen natural (tales como los presentes en las estructuras de los anticuerpos) y conducir a una baja unión, baja actividad biológica y/o baja estabilidad.

Las sustituciones de los aminoácidos preferidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir distintas mutaciones de una secuencia a parte de la secuencia del péptido de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones únicas o múltiples de aminoácidos (de preferencia sustituciones conservativas de aminoácidos) se pueden generar en la secuencia de origen natural (de preferencia en la región del polipéptido fuera de los contactos intermoleculares que forman el dominio (s). Una sustitución conservativa del aminoácido no debería modificar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un reemplazo del aminoácido no debería tender a romper una hélice que tiene lugar en la secuencia parental, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia parental) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias del polipéptido que se reconocen en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creight'on, Ed, . H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, ediciones, Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)), y Thornton y otros Wature 354:105 (1991), que se incorporan en este documento como referencia.

Además, tales métodos se podrían usar para generar sustituciones o supresiones de aminoácidos de uno o más residuos, de cisteína de la región variable que participan en un enlace de disulfuro intracatenario para generar moléculas de anticuerpos que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracatenarios .

El término "región CDR" o "CDR" se propone indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo que confieren al anticuerpo- la especificidad de unión al antígeno. Las CDR se podrían definir de acuerdo con el sistema de Kabat (Kabat, E.A. y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), y ediciones posteriores. Un anticuerpo contiene normalmente 3 regiones CDR de cadena pesada y 3 regiones CDR de cadena ligera. El término CDR o las CDR se usa aquí para indicar, de acuerdo con el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad de los anticuerpo por el antígeno o el epítopo que reconoce.

La tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad en esencia debido a los mecanismos de arreglo de los genes que dan lugar a la misma) . Esta podría ser tan corta como 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es de 26. La longitud de CDR podría variar también de acuerdo a la longitud en la que se puede acomodar por el marco subyacente en particular. Funcionalmente, la HCDR3 juega en parte un papel; en la determinación de la especificidad de los anticuerpos (Segal y otros, PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit y otros, Science, 233:747-753, 1986, Chothia y otros, J. Mol. Biol, 196:901- 917, 1987, Chothia y otros, Nature , 462:877- 883, 1989, Catón y otros, J. Immunol, 144:1965-1968, 1990, Sharon y; otros, PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon y otros, J. Immunol, 144:4863-4869, 1990, Kabat y otros, J. Immunol , 147:1709-1719, 1991) .

El término un "conjunto de las CDR" referido én este documento comprende CDR1, CDR2 y CDR3. De este modo, un conjunto de las HCDR se refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3 , y un conjunto de las LCDR se refiere a LCDRl, LCDR2 y LCDR3.

Las variantes de los dominios VH y VL y las CDR de la presente invención, incluyen aquellas cuyas secuencias de aminoácidos se exponen en este documento, y que se pueden emplear en los agentes y anticuerpos identificados para Shh se pueden obtener por medio de métodos de alteración o mutación de la secuencia y la detección para identificar el antígeno con las características convenientes. Los ejemplos de las características convenientes incluyen pero no se limitan a: la afinidad de unión aumentada para el antígeno con relación a los anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno; la neutralización aumentada de una actividad del antígeno con relación a los anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno ! si la actividad se conoce; la capacidad competitiva especifica con un anticuerpo o ligando conocido para el antígeno ; en una proporción molar específica; la capacidad para inmunoprecipitar el complejo 1igando-receptor ; la capacidad de unir a un epítopo específico; un epítopo lineal, por ejemplo, la secuencia de péptido identificada mediante la detección del péptido de unión, por ejemplo, usando los péptidos detectados en la conformación lineal : y/o restringida; el epítopo conformacional , formado por los residuos no continuos; la capacidad para modular una nueva actividad biológica de Shh, o molécula corriente abajo; la capacidad para unir y/o neutralizar a Shh y/o alguna otra propiedad conveniente. ' Las técnicas que se requieren para generar las sustituciones en las secuencias de aminoácidos de las CDR, los dominios VH o VL del anticuerpo y los sitios de unión al antígeno están disponibles en la técnica. Las variantes de las moléculas de anticuerpos divulgadas en este documento se podrían producir y usa en la presente invención. Continuando con la iniciativa de la química automatizada de aplicar las técnicas de análisis multivariante de datos a las relaciones entre la actividad- estructura/propiedad (Wold, y otros Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics athematics and Statistics in Chemistry (Ed. : B. Kowalski) , D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984) , las relaciones actividad cuantitativa-propiedad dé los anticuerpos se pueden derivar mediante técnicas matemáticas bien conocidas, tales como la regresión estadística, el reconocimiento y la clasificación del estándar (Norman y otros, Applied Regression Analysis. Wiley- Interscience ; 3ra edición (Abril 1998); Kandel, Abraham & Backer, '· Éric .

Coraputer-Assisted Reasonmg ?? Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (Mayo 11, 1995) ; Krzanowski, Wojtek. Principies de Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, Núm. 22 (manuscrito)) . ' Oxford University Press; (diciembre del 2000) ; itten, Ian' H & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations . Morgan Kaufmann; (11 de octubre de 1999); Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrián F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classif ication and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics) . John Wiley & Sons; (julio de 2002) ; Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Eva'luation Principies, Software, Tools, and Applications iñ Drug Discovery) . En algunos casos las propiedades de los anticuerpos se pueden derivar de los modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, el análisis de residuos similares de contacto o la propiedad fisicoquímica calculada) i de la secuencia del anticuerpo, las estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades se pueden considerar por separado y en combinación. ¡ Un sitio del anticuerpo de unión al antígeno co'mpuesto de un dominio VH y un dominio VL se forma normalmente por seis lazos del polipéptido: tres del dominio variable de cadena ligera (VL) y tres del dominio variable de ; cadena pesada (VH) . El análisis de anticuerpos de estructura atómica conocida ha aclarado las relaciones entre la secuencia y estructura tridimensional de los sitios de combinación del anticuerpo. Estas relaciones implican que, a excepción de la tercera región (lazo) en los dominios VH, los lazos del sitio de unión tienen uno con un pequeño número de conformaciones de la cadena principal : estructuras canónicas . Se ha demostrado que la estructura canónica formada en un lazo en particular está determinada por su tamaño y la presencia de determinados residuos en sitios claves tanto en el lazo como en las regiones marco.

Este estudio de la relación secuencia-estructura se puede usar para la predicción de aquellos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, los cuales son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus lazos CDR y por lo tanto mantienen la especificidad de i unión. Estas predicciones pueden estar respaldadas a diferencia de las predicciones para el resultado de : los experimentos de optimización conducidos. En un enfoque estructural, un¡ modelo de la molécula del anticuerpo se puede crear mediante cualquier paquete libremente disponible o comercial,- tales como WAM. Una visual i zación de la proteína y un paquete de programa de análisis, tales como Insight II (Accelrys,, Inc.) o Deep View se podrían usar después para evaluar las posibles sustituciones en cada posición en la CDR. Esta información se podría usar después para generar sustituciones probables a tener un efecto mínimo o beneficioso en la actividad o conferir otras propiedades convenientes.

El término "fragmento del polipéptido" como se usa en este documento, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión del amino-terminal y/o carboxi-terminal , perb donde la secuencia de aminoácido remanente1 es idéntica ¡ a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen atural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc completo. Los fragmentos normalmente son al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo, de preferencia al menos 14 aminoácidos de largo, con mayor preferencia al menos 20 aminoácidos de largo, por lo general al menos 50 aminoácidos de largo, y aún con mayor preferencia al menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo" como se usa eh. este documento, se refiere a los polipéptidos que comprenden un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoácido deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a Shh bajo las condiciones de unión adecuadas,, (2) capacidad para bloquear la unión apropiada Shh/Patched- 1 , o (3) capacidad para promover la actividad Gli. Normalmente, los análogos del polipéptido comprenden una sustitución conservativa de aminoácido (o adición o supresión) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos normalmente son al menos 20 aminoácidos de largo, de preferencia al menos 50 aminoácidos de largo o más largo, y puede ser a menudo tan largo como un polipéptido de origen natural completo.

Los análogos del péptido se usan en común . en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellos del péptido patrón. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "péptidos miméticos" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J. Adv. Orug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans y otros J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que se incorporan^ a ; este documento como referencia) . Tales compuestos se desarrollan, a menudo, con la ayuda del modelaje molecular automatizado. Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se podrían usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tales como los anticuerpos humanos, pero tiene uno o más enlaces peptídicos reemplazados de forma opcional por un enlace seleccionado del grupo consistente de: --CH2NH--, CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH-- (cis y trans) , --COCH2--, --CH(0H)CH2--, y -CH2S0-- mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de la L-lisina) se ¡ podría usar para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso; o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica se podrían generar por los métodos conocidos en la ;técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), que se incorpora a este documento como referencia) ; por ejemplo, por la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclen el péptido.

Un anticuerpo podría ser oligoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo multi-específico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo catalítico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano , un anticuerpo anti - idiotípico y los anticuerpos que sel pueden marcar en forma soluble o enlazada, así como fragmentos, variantes o derivados de éstos, ya sea solos o en combinación con otras secuencias de aminoácidos que se proporcionan por las técnicas conocidas. Un anticuerpo podría ser de cualquier especie.

Como se usa en este documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" (inmunoglobulinas) incluyen los anticuerpos monoclonales (que incluyen los anticuerpos monoclonales completos), los anticuerpos policlonales , los anticuerpos camélidos y los anticuerpos quiméricos. Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" o "anticuerpos" se refiere a un polipéptido o un grupo de polipéptidos que comprende al menos un dominio de unión que se forma a partir del plegamiento de las cadenas del polipéptido que tienen espacios de unión tridimensional con las formas superficiales internas y las distribuciones de carga complementarias con las propiedades de un determinante antigénico de unaj cadena de antígeno. Los anticuerpos nativos son, en general, glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente de 150,000 dalton, compuestos por dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) . Cada cadena; ligera se enlaza con una cadena pesada por un enlace covalente de disulfuro, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera tiene, por lo regular, también espaciados los puentes disulfuro intracatenarios . Cada cadena pesada tiene un dominio variable (VH) en un extremo, seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado '< con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el idominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea en las cadenas la bda o cadenas kappa basado en la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena de ligera. El dominio variable de una, cadena ligera kappa se podría denominar también como VK en este documento. El término "región variable" se puede usar (también para describir el dominio variable de una cadena pesada o una cadena ligera. Los residuos de aminoácidos en particular se creen formar una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman un sitio de unión del anticuerpo. Tales anticuerpos se podrían derivar de cualquier mamífero, que incluye pero no se limita a, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc.

El término "anticuerpo" o "anticuerpos" incluye los fragmentos de unión de los anticuerpos de la invención, los fragmentos ejemplares incluyen Fvs de cadena simple ¡(scFv) , los anticuerpos de cadena simple, los anticuerpos de dominio único, los anticuerpos de dominio, los fragmentos Fv, los fragmentos Fab, los fragmentos F(ab'), los fragmentos F(ab')2, los fragmentos de anticuerpos que presentan la actividad biológica conveniente, la región variable estabilizada por enlace disulfuro (dsFv) , la región variable dimérica (Diacuerpo) , los anticuerpos anti - idiotipo (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, los anticuerpos anti-Id para los anticuerpos de la invención), los intracuerpos , los anticuerpos lineales, las moléculas de anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpos y fragmentos de unión al epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen las moléculas de inmunoglobulinas , y los fragmentos inmunológicamente activos de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno. Las moléculas de inmunoglobulinas pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl , IgG2, IgG3;, IgG4 , IgAl e IgA2) o subclase. : La digestión de los anticuerpos con la enzima, papaína, resulta en dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, conocidos también como fragmentos "Fab" , y un fragmento "Fe" , que no tiene actividad de unión al antígeno, pero tiene la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos; con la enzima, pepsina, resulta en un fragmento F (ab' )2 fragmento en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen enlazados y comprenden dos sitios de unión al antígeno. El fragmento F(ab' )2 tiene la capacidad de entrecruzarse con el antígeno. ·' El "Fv" cuando se usa en este documento, se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que retiene tanto el reconocimiento al antígeno como los sitios de unión al antígeno. Esta región consiste de un dímero de dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en estrecha, asociación no covalente o covalente. Es én esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren al anticuerpo la especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende, sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir al antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión completo.

El "Fab" cuando se usa en este documento, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la: cadena pesada. i El "dAb" cuando se usa en este documento, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que es la unidad funcional de unión más pequeña de unos anticuerpos humanos. Un "dAb," es un anticuerpo de dominio único y comprende tanto el dominio variable de una cadena pesada del anticuerpo (dominio VH) como el dominio variable de una cadena ligera del anticuerpo (dominio VL) . Cada dAb contiene tres de las seis CDR de origen natural (Ward y otros, Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nafcure 461, 544-546 (1989); Holt, y otros, Domain antibodies: protein for therapy, Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003)). Con pesos moleculares en el intervalo de 11 a 15 kDa, son cuatro veces más pequeñas que un fragmento de unión al antígeno (Fab)2 y la mitad del tamaño de una molécula Fv de cadena simple (scFv) .

Cuando se usa "camélido" en este documento, se refiere a las moléculas de anticuerpos que se componen de dímeros de cadenas pesadas que están desprovistos de cadenas ligeras, pero sin embargo tiene un amplio repertorio de unión al antígeno (Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R' (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains.; Nature 363 :446-448) . ! El término "diacuerpos" se refiere a los fragmentos pequeños del anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de ; cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena: ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL) . Al usar un ligando que es demasiado corto para permitir el aparcamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a parear con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404,097; O 93/11161; y Hollinger y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Se demostró que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unión a los antígenos. Los ejemplos de fragmentos de unión son (Ward, E.S. y; otros, (1989) Nature 461, 544-546) el fragmento Fab consistente de VL, VH, CL y los dominios CH1 ; ( cCafferty y otros (1990) Nature, 468, 552-554) el fragmento Fd consistente | de los dominios VH y CH1 ,- (Holt y otros (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) el fragmento Fv consistente; de los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento de dAb (Ward, E.S. y otros, Nature 461, 544-546 1(1989), McCafferty y otros (1990) Nature, 468, 552-554, Holt y otros (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490] , que consiste de un dominio VH o un dominio VL; (v) las regiones CDR aisladas; (vi) los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas de Fv de simple cadena (scFv) , donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un ligando de péptido que permite asociar a los dos dominios para formar un sitio de unión al antígeno (Bird y otros, (1988) Science, 242, 423-426, Huston y otros, (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883), (viii) los ;dímeros biespecíficos de Fv de simple cadena (PCT/US92/09965) y1 (ix) los "diacuerpos" , fragmentos multivalentes o multiespecífieos construidos por fusión genética (WO94/13804; Holliger, P. (1993) y otros, Proc . Nati. Acad. Sci. USA. 90 6444-6448,). El Fv, scFv o moléculas diacuerpo se podrían estabilizar por la incorporación de los puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter, Y. y otros, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Los minicuerpos que comprenden ün scFv unido a un dominio CH3 se podrían generar también (Hú, S. y otros, (1996) Cáncer Res, 56, 3055-3061) . Otros ejemplos de fragmentos de unión son el Fab' , que difiere ele los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el terminal carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo, y el Fab' -SH, que es un fragmento Fab' en ¡el cual el residuo (s) de cisteína de los dominios constantes porta un grupo tiol libre. ¡ El término "variable" se refiere al hecho ¡de que determinadas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos ? ?· son responsables de la especificidad de unión de cada anticuerpo en particular por su antígeno en particular. Sin embargo, la i variabilidad no se distribuye uniforme a través ¡de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en segmentos llamados regiones determinantes: de complementariedad (CDR) , tanto en los dominios variables de la cadena ligera como los de la cadena pesada. Las regiones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan, regiones marco (FR) . Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden, cada uno, cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida la configuración de hoja-ß, conectadas por tres CDR, que forman lazos que se conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja-ß. Las CDR en cada cadena se mantienen unidas a corta distancia por las regiones FR y, con las CDR de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (ver, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición.! Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, D (1991)). Los dominios constantes, en general, j no se involucran directamente en la unión del antígeno;, pero podrían influir en la afinidad de unión al antígeno y podrían presentar diversas funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la ADCC, CDC, y/o apoptosis.

El término "región hipervariable" cuando se usa en este documento, se refiere a los residuos de aminoácidos1 de un anticuerpo que se asocian con su unión al antígeno. Las regiones hipervariables incluyen los residuos de aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" p "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-46 (Ll) ,; 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y los residuos 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991;) ) y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) : en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; . Chothia y Lesk, J. Mol. Biol . , 196:901-917 (1987)) . Los residuos "marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable que flanquean las COR. Los residuos FR están presentes en los anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos, anticuerpos de dominio, diacuerpos, vacicuerpos, anticuerpos lineales, y biespecífieos .

Según se usa en este documento, el agente dé únión identificado, proteína de unión identificada, proteína de unión específica y los términos similares se refieren a un anticuerpo, o fragmento de unión de éste que de preferencia se une a un sitio objetivo. En una modalidad, el agente de unión identificado es específico para un único sitio objetivo. En otras modalidades, el agente de. unión identificado es específico para más de un sitio objetivo. En una modalidad, el agente de unión identificado podría! ser un anticuerpo -jnonoclonal y el sitio objetivo podría !ser un epítopo.

Los "fragmentos de unión" de un anticuerpo se producen por técnicas de ADN recombinante , o por escisión enzimática o química de los anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab' , F(ab')2# F , dAb y anticuerpos de cadena simple. Un anticuerpo además de un anticuerpo "biespe!cifico" o "bifuncional" se entiende que tenga cada uno de sus: sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialm nte la adhesión de un receptor a un contra-receptor cuando un exceso de anticuerpos reduce la cantidad de receptor unido al contra-receptor por al menos aproximadamente 20%, 40%, 60% ó 80%, y más en general mayor que aproximadamente 85% (según se mide en un ensayo in vitro de unión competitiva) .

El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína con capacidad de unión específica ¡a una inmunoglob lina o receptor celular T. Los determinantes epitópicos por lo general consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activa tales como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y podrían, pero no siempre, tener características específicas de estructura tridimensional, así como las características específicas de carga. Se dice que un anticuerpo se une de manera específica a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 µ?, de preferencia < 100 nM y con máxima preferencia < 10 nM.

El término "agente" se usa en este documento para denominar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto generado de materiales biológicos. ¡ "Activo" o "activida" en cuanto a un polipéptido de Shh se refiere a una parte de un polipéptido de Shh que tiene una actividad biológica o inmunológica de un polipéptido ; de Shh nativo. Cuando se usa "biológico" en este documento, se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido de Shh nativo. Una actividad biológica! de Shh preferida incluye, por ejemplo, que Shh induce la proliferación celular. I Cuando se usa "mamífero" en este documento se refiere a cualquier animal que se considera un mamífero. De preferencia, el mamífero es el humano.

Cuando se usa "animal" en este documento incluye los animales que se consideran un mamífero. De preferencia, el animal es el humano.

El término "mAb" se refiere al anticuerpo monoclonal .

Cuando se usa "liposoma" en este documento, se re;fiére a una pequeña vesícula que podría ser útil para entregar los fármacos que podrían incluir el polipéptido de Shh; de la invención o los anticuerpos para tal polipéptido Shh de un mamífero. ' Como se usa en este documento "mareaje" o "marcado", se refiere a la adición de una región detectable a un polipéptido, por ejemplo, un radiomarcado, un mareaje fluorescente, un marcado con marcador enz|imático quimioluminiscente o un grupo biotinilo. Los radioisótopos o radionúclidos podrían incluir 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, mIn( 125I, 131i, los marcadores fluorescentes podrían Incluir rodamina, fósforos de lantánida o FITC y los marcadores enzimáticos podrán incluir la peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina.

Los marcadores adicionales incluyen, a modo de ilustración, pero sin limitarse a: enzimas, tales como glucosa-6-fosfato dehidrogenasa ("G6PDH"), alfa-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa y peroxidasa, tintes los marcadores fluorescentes adicionales o de fluorescencia incluyen, fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, GFP (GFP para "proteína fluorescente verde"), dansilo, umbel^ferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina ; fluoróforos tales como por ejemplo los criptatos y quelatos de lantánidos por ejemplo, europio, ¡etc. (Perkin Elmer y Cis Biointernational ) , los marcadores quimioluminiscentes o de quimioluminiscencia, : como isoluminol, luminol y dioxetanos; sensibilizadores, coenzimas, sustratos enzimáticos, partículas, tales como partículas de látex o de carbono; metal sol; crisitalito; liposomas; células, etc., que podrían ser marcadas, además, con un colorante, catalizador u otro grupo detectable; moléculas tales como la biotina, digoxigenina ' o 5- bromodesoxiuridina ; regiones de toxinas, como por ejemplo un región de toxina seleccionada de un grupo de exotoxina de Pseudomonas (PE o una fragmento citotóxico o su imitante de éste) , toxina de Difteria o un fragmento citotóxico o mutante de éste, una toxina botulínica A, B, C, D, E o F, ricina o un fragmento citotóxico de ésta por ejemplo, ricina A, abrina o un fragmento citotóxico de ésta, saporina o un fragmento citotóxico de ésta, toxina antiviral de la hierba carmín o un fragmento citotóxico de ésta y citotóxicos de briodina1 1 o un I fragmento citotóxico de ésta.

El término "agente farmacéutico o fármaco" según se usa aquí, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico conveniente cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos químicos en este documento se usan de acuerdo con los usos convencionales en la técnica, como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, ¡S, Ed, McGraw-Hill, San Francisco (1985)), (incorporado en este documento como referencia) .

Como se usa en este documento, "sustancialmente pura", denota que una especie objeto es la especie presente predominante (es decir, en una base molar ésta ;es más abundante que cualquier otra especie individual ! en la composición) , y, de preferencia, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composición sustancialmente pura comprenderá más que aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, con mayor preferencia más que aproximadamente 85%, 90%, 95% y 99%. Con máxima preferencia, la especie objeto se purifica para la homogeneidad fundamental (la especie contaminante no se puede detectar en la composición por los métodos de detección convencionales) donde la composición consta en esencia de una única especie macromolecular .

El término "paciente" incluye los sujetos humanos y i veterinarios . ' "Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por célula en la que las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores de IgFc (FcRs) (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK) , monocitos, neutrófilos y macrófagos ) reconocen el anticuerpo unido en una ¡ célula objetivo y, posteriormente, causa la lisis de la | célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, expresan sólo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI , FcRII y Fc/RIII. La expresión de los¡ FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3: página ' 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal cómo ese descrito en las patentes de los Estados Unidos, núms . 5,500,362, ó 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PB C) y las células citolíticas naturales (NK) . Por otra parte, o aún más, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluar, in vivo, por ejemplo,' en un modelo animal, tal como ese descrito en Clynes y otros PNAS (USA) 95:652-656 (1988). "Citotoxicidad dependiente de complemento" y "CDC" se refieren al mecanismo por el cual los anticuerpos llevan a cabo su función citolítica en la 'célula. Esta se inicia por la unión de Clq, un constituyente del primer componente del complemento, al dominio Fe de las Igs, IgG o IgM, que están en el complejo con el antígeno !(Húghs-Jones, NC, y B. Gardner. 1979. Mol. Immunol. 16:697).: La Clq es una gran, glicoproteína estructuralmente compleja de ~410 kDa presente en el suero humano a una concentración de 70 pg/ml (Cooper, N. . 1985. Adv. Immunol. 37:151). Junto con dos serina proteasas, Clr y Cls, la Clq forma el complejo Cl, el primer componente del complemento. Al menos dos de las cabezas globulares N-terminal de Clq deberían estar unidas a la Fe de las Ig para la activación de Cl, y por lo: tanto, para la iniciación de la cascada del complemento (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol . 37:151).

El término "vida media del anticuerpo" como! se usa en este documento denota una propiedad farmacocinética de un anticuerpo que es una medida del tiempo de supervivencia medio de las moléculas de anticuerpos a continuación de su administración. La vida media del anticuerpo se; puede expresar como el tiempo requerido para eliminar j el 50 porciento de una cantidad conocida de la inmunoglobulina del cuerpo del paciente o de un compartimento específico de éste, por ejemplo, según lo medido en suero o plasma, es decir, la vida media de circulación, o en otros tejidos. La vida media puede variar de una inmunoglobulina o clase i de inmunoglobulina a otro. En general, un aumento en la vida media del anticuerpo resulta en un aumento del tiempo medio de residencia (MRT) en circulación para el anticuerpo administrado.

El término "isotipo" se refiere a la clasificación de una región constante de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Los dominios constantes de los anticuerpos no se involucran en la unión al antígeno, sino distintas funciones efectoras. En dependencia de la secuencia de aminoácido de la región constante de cadena pesada, un anticuerpo humano o inmunoglobulina dada se pueden asignar a una de las cinco clases principales de inmunoglobulinas : IgA, IgD, IgE, IgG e Ig . Varias de estas clases se pueden dividir además en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl (gamma 1) , IgG2 (gamma 2), IgG3 (gamma 3), e IgG4 (gamma 4), e IgAl e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. De las distintas^ clases de inmunoglobulinas humanas, sólo las IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 e IgM humanas se conocen para activar el complemento. jLa IgGl e IgG3 humanas se conocen para mediar en los humanos. Las regiones constantes de la cadena ligera humana se podrían clasificar en dos clases principales, kappa y lambda. ; Si conveniente, el isotipo de un anticuerpo que une específicamente a Shh se puede cambiar, por ejemplo, para sacar beneficio de una propiedad biológica de un isotipo diferente. Por ejemplo, en algunas circunstancias puede ser conveniente en relación con la generación de anticuerpos como los anticuerpos terapéuticos contra Shh que los anticuerpos sean capaces de fijar complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Existe un número de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, que incluyen, sin limitación, los siguientes: IgM murina, IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgM humana, IgA humana, IgGl humana, IgG3 humana. En otras modalidades que puede ser conveniente en relación con la generación de anticuerpos como los anticuerpos terapéuticos contra Shh que los anticuerpos sean capaces de unirse a los receptores Fe en las células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) . Existe un número de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, que incluyen, sin limitación, los siguientes: IgG2a murina,, IgG2b murina, lgG3 murina, IgGl humana e lgG3 humana. Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan de inicio que posean tal isotipo, sino, más bien, el anticuerpo según se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede ser cambiado de isotipo después mediante técnicas convencionales, que son bien conocidas, en la técnica'. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes dirigidas (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos, núm. 4,816,397), las técnicas de fusión célula-célula {ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos, núm. 5,916,771 y 6,207,418), entre otras. 1 A modo de ejemplo, los anticuerpos anti-Shh analizados en este documento son anticuerpos completamente humanos . Si un anticuerpo posee la unión conveniente a Shh, se; podría fácilmente cambiar de isotipo para generar un isotipo, de IgM humana, IgGl humana, o IgG3 humana, mientras que posea¡ aún la región misma variable (que define la especificidad del anticuerpo y algo de su afinidad) . Tal molécula sería capaz después de fijar el complemento y participar en la CDC y/o sería capaz de unirse a los receptores Fe en las células efectoras y participar en la ADCC.

Los "ensayos de sangre completa/total" usan la: sangre sin fraccionar como fuente de efectores naturales. La sangre contiene el complemento en el plasma, junto con efectores celulares que expresan FcR, tales como las oélulas polimorfonucleares (PMN) y las células mononucleares (MNC) . De este modo, los ensayos de sangre completa/total permiten la evaluación simultánea de la sinergia in vitro de ambos mecanismos efectores ADCC y CDC.

Una cantidad "terapéuticamente efectiva" según se' usa en este documento es una cantidad que proporciona alguna mejoría o beneficio al sujeto. El de otra manera, una cantidad "terapéuticamente efectiva" es una cantidad que proporciona algún alivio, mitigación y/o disminución de al menos un síntoma clínico. Los síntomas clínicos asociados con' los i trastornos que se pueden tratar mediante los métodos de la invención se conocen bien por aquellas personas con conocimiento en la técnica. Además, aquellas personas con conocimiento en la técnica apreciarán que los efectos terapéuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre y cuando se proporciona algún beneficio al sujeto.

El término "y/o" según se usa en este documento !se debe tomar como la divulgación específica de cada una de las dos características específicas o componentes con o sin el otro.

Por ejemplo, "A y/o B" se debe tomar como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, tal como si cada uno se expusiese de forma individual n este documento .

Estructura del Anticuerpo ! Se conoce que la unidad estructural básijca del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero se ¡compone I de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas , cada pareja tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principales ' por el reconocimiento de antígeno. La parte carboxi -terminal de cada cadena define una región constante responsable principal de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas: se i clasifican como cadenas ligeras kappa y cadenas ^ligeras lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, ; delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo de anticuerpos como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. Dentro ¡de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que ¡incluye también una región "D" de aproximadamente 10 ! o más aminoácidos. Ver, en general, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W, ed., 2da ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado como referencia en sü totalidad para todos los propósitos) . Las regiones de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo.

De este modo, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecífieos , los dos sitios de unión son los mismos.

Todas las cadenas presentan la misma estructura 'general de las regiones marco relativamente conservada (FR) unidas mediante tres regiones hipervariables , denominadas también las COR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. Desde la N-terminal a C-terminal, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FRl, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos de cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987); Chothia y ; otros . Nature 462:878-883 (1989).

Un anticuerpo biespecífico o bifuncional íes un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de< cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecífieos se pueden producir por una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o enlace de los fragmentos Fab' . Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny y otros. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Los anticuerpos i biespecíficos no existen en forma de fragmentos que tienen un único sitio de unión (por ejemplo, Fab, Fab 1 , y Fv) .

Normalmente, un dominio VH está pareado con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión antígeno-anticuerpo, aunque un sólo dominio VH o VL se podría usar para unir al antígeno. El dominio VH (ver la Tabla 12) puede estar pareado con el dominio VL (ver la Tabla 13) , para que un sitio de unión antígeno-anticuerpo se forme comprendiendo; ambos dominios VH y VL.

Anticuerpos Humanos y Humanización de los Anticuerpos.1 Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes del ratón o la rata. La presencia de i tales I proteínas derivadas del ratón o la rata puede conducir a la compensación rápida de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo, por un paciente. Para evitar el uso de los anticuerpos derivados de ratón o rata, los anticuerpos humanos completos se; pueden generar a través de la introducción del loci de anticuerpo humano funcional dentro de un roedor, otro mamífero o animal, de manera que el roedor, otro mamífero o animal produzca los anticuerpos humanos completos. ¡ Un método para generar anticuerpos humanos completos es a través del uso de cepas de ratones XenoMouse® que se han diseñados para contener hastalOOO kb, pero menos ;que el tamaño de los fragmentos configurados de la línea germinal del locus de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa . Ver Méndez y otros Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green and Jakobovits J". Exp. Med. 188:483-495 (1998) . Las cepas XenoMouse® están disponibles de Amgen, Inc. (Fremont, California, EE.UU.) .

Tales ratones, después, son capaces de producir las moléculas de inmunoglobulina y los anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglbbulina y anticuerpos murinos . Los métodos utilizados para el logro de los mismos se divulgan en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie 08/759, 620, presentada él 3 de diciembre de 1996 y la solicitud internacional de patente i núm. WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998:, y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, las divulgaciones de las cuales se incorporan por la piresente como referencia. Ver también Méndez y otros Nature Genetics 15:146-156 (1997), la divulgación de la cual se incorpora por la presente como referencia. j © La producción de cepas XenoMouse de ratón se discute adicionalmente y se esboza en la solicitud de patente¡ de los Estados Unidos serie núm. 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610,515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de julio dei 1992, 07/922,649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031,801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/246,145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero dé 1995, 08/430, 938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464,584, i presentada el 5 de junio de 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463,191, presentada el 5 de júnio de 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre de 1996, 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996, publicación de Estados Unidos 2003/0093820, presentada el 30 de noviembre de 2001 y las patentes de los Estados Unidos núms . 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, y 5,939,598 y las patentes japonesas núms. 3 068 180 B2 , 3 068 506 B2 , y 3 068 507 B2. Ver también patente europea núm. EP 0 463 151 Bl, concesión publicada el 12 de junio de 1996, solicitud de patente internacional núm. WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de í 1994 , solicitud de patente internacional núm . WO 96/46096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el ; 21 de diciembre de 2000. La descripción de cada una de las referencias, solicitudes, y patentes antes citadas se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc, han utilizado un enfoque "minilocíis" . En la aproximación minilocus, un locus Ig exógeno se imita a través de la inclusión de piezas ( genes individuales ) del locus Ig. Así, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y usualmente una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma) se forman en un constructo por inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente de los Estados; Unidos núm. 5,545,807 de Surani y otros y las patentes !de los Estados Unidos núms . 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, i 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,8¡14,'318, í 5,877,397, 5,874,299, y 6,255,458 todas de Lonberg y Kay, las patentes de los Estados Unidos núms. 5,591,669 y 6,023j.010 de Krimpenfort y Berns, las patentes de los Estados Unidos núms. 5,612,205, 5,721,367, y 5,789,215 de Berns y otros, y la patente de los Estados Unidos núm. 5,643,763 de Choi y Dunn, y solicitud de patente de los Estados Unidos serie núm. 07/574,748 de GenPharm International, presentada el, 29 de agosto de 1990, 07/575,962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810,279, presentada el 17 de diciembre dé 1991, 07/853,408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904,068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990,860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053,131, presentada el: 26 de abril de 1993, 08/096,762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155,301, presentada el 18 de noviembre de; 1993, 08/161,739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/Í65,699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209,741, presentada el 9 de marzo de 1994, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. Ver también la patente europea núm. 0 546 073 Bl, solicitudes internacionales de patente núms. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97¡/l3852, y WO 98/24884 y la patente de los Estados Unidos núm. 5,981,175, las descripciones de las mismas se incorporan como referencia en su totalidad. Ver también Taylor y otros, 1992, Chen y otros, 1993, Tuaillon y otros, 1993, 1 Choi y otros, 1993, Lonberg y otros, (1994), Taylor y otros, '(1994) , y Tuaillon y otros, (1995) , Fishwild y otros, (1996) > cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. j Kirin has también demostró la generación de anticuerpos humanos a partir de ratón en los cuales, a través| de la fusión microcelular , se introducen largas piezas de cromosomas, o cromosomas enteros. Ver solicitudes de patente europeas núms. 773 288 y 843 961, cuyas descripciones se -incorporan como referencia .- Además , se generaron los ratones- KM™, que son el resultado del mestizaje de los ratones Te de Kirin con ratones minilocus (Humab) de Medarex. Estos ratones poseen el transeromosoma de IgH humano de los ratones de Kirin y el transgen de cadena kappa de los ratones Genpharm (Ishida y otros., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

Los anticuerpos humanos se pueden obtener también por métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a la exposición del fago (Medimmune, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (antes Proliferon) , Affimed) exposición de ribosoma (Medimmune) , exposición de levadura, y similares. , Preparación de los Anticuerpos Los anticuerpos, como se describe en este documento, se prepararon a través del uso de la metodología de XenoMouse®, según se describe a continuación. Tales ratones son ^capaces de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos . Los métodos utilizados para lograr los mismos se divulgan en las patentes, solicitudes y referencias que se divulgan en este documento en la sección de antecedentes. En particular, sin embargo, una modalidad preferida de la producción transgénica ', de los ratones y anticuerpos de éstos se divulga en la solicitud de patente de los Estados Unidos, núm. de serie 08/759, 620, presentada 03 de diciembre, 1996 y las solicitudes internacionales de patente núms.WO 98/24893, publicada el 11 de junio, 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre, 2000, cuya descripción se incorpora como referencia. Ver también Méndez y otros Nature Genetics 15:146-156 (1997), la divulgación de la cual se incorpora por la presente como referencia A través del uso de tal método, se han producido los anticuerpos monoclonales humanos completos para una diversidad de antígenos. En lo esencial, las ¡ líneas XenoMouse® de ratones se inmunizan con un antígeno de; líneas de interés (por ejemplo Shh) , las células linfáticas (tal como las células B) se recuperan de los ratones i hiper-inmunizados, y los linfocitos recuperados se fusionan con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares inmortales de hibridoma. Estas líneas celulares de hibridoma se detectan y seleccionan para identificar las ¦ líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En este documento se proporcionan los métodos para la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos específicos para Shh. Además, en este documento la caracterización de los anticuerpos producidos por tales líneas celulares incluyen los análisis de las secuencias de I nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de tales anticuerpos.

Por otra parte, en lugar de ser fusionadas con 'células de mieloma para generar hibridomas, las células B se; pueden ensayar de forma directa. Por ejemplo, las células B CD19+ se pueden aislar de los ratones hiperinmunes XenoMouse® y i permitir para la proliferación y diferenciación en células 1 plasmáticas que secretan el anticuerpo. Los anticuerpos de los sobrenadantes celulares se detectan después por ELISA i para la reactividad contra el inmunógeno Shh. Los sobrenadantes se podrían detectar también pór la inmunoreactividad contra los fragmentos de Shh para' mapear además los diferentes anticuerpos por la unión a los dominios de interés funcional en Shh. Los anticuerpos se podrían detectar también por otras endoglicosidasas humanas relacionadas y en contra de los ortólogos de Shh de rata, ratón, y primates no humanos, tales como el mono Cynot Inolgus, 1 el último para determinar las especies de reactividad cruzada. Las células B de los pocilios que contienen anticuerpos de interés podrían ser inmortalizadas por distintos métodos, incluidos la fusión para generar los hibridomas ya sea de los pocilios individuales o de ppcillos mezclados, o por la infección con EBV o la transfección de genes de inmortalización conocidos y se cultivaron después en un medio adecuado. Por otra parte, las células plasmáticas únicas que secretan los anticuerpos con las especificidades convenientes se aislaron después mediante un ensayo de placa hemolítica específico a Shh (ver, por ejemplo, Babcook y otros, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 93:7843-48 (1996)). Las células identificadas para la lisis son de preferencia los eritrocitos de carnero (SRBCs) recubiertos con el antígeno Shh. : En presencia de un cultivo celular de B que contiene las células plasmáticas que secretan la inmunoglobulina de interés y el complemento, la formación de una placa indica la lisis específica mediada por Shh de los eritrocitos de carnero que rodean la célula plasmática de interés. La célula plasmática individual específica al antígeno en el centro de la placa se puede aislar y la información genética que codifica la especificidad del anticuerpo se aisla 1 de la célula plasmática individual. Mediante la transcripción inversa seguida de PCR (RT-PCR) , se puede clonar el ADN que codifica para las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo. Tal ADN clonado se puede insertar después, además, en un vector de expresión adecuado; de preferencia un cásete de vector tal como pcDNA, con mayor preferencia tal un vector pcDNA que contiene los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina. El vector generado se puede transfectar después en las células huésped, por ejemplo, en las ¡células HEK293, las células CHO, y cultivarse en los , medios convencionales de nutrientes modificado según lo apropiado para la inducción de la transcripción, la selección de transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias convenientes.

Según se apreciará, los anticuerpos que se unen específicamente a Shh se pueden expresar en líneas celulares aparte de las líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican para los anticuerpos en particular se; pueden usar para transformar una célula huésped de mamífero adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para la introducción de los polinucleótidos , en una célula huésped, que incluyen, por ejemplo, el empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y la transducción de una célula huésped con el virus (o vector) o por los procedimientos de transfección conocidos : en la técnica, como lo ejemplifica la paténte de los Estados Unidos, núm. 4,399,216; 4,912,040; 4740461 y 4959455! (cuyas patentes en este documento se incorporan por la presente como referencia) . El procedimiento de transformación que se usa depende del huésped que se transforma. Los métodos para la introducción de los polinucleótidos heterólogos en las células de mamíferos son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextranb, la precipitación de fosfato de calcio, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos , la electroporación, la encapsulación del polinucleótido (s) en liposomas, y la microinyección directa del ADN en los núcleos. ; Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivo Tipo (ATCC() , que incluyen pero no se limitan a las células de ovario de hámster chino (CHO) , las células HeLa, riñon de cría de hámster (BHK) , las células de riñon de mono (COS) , las células humanas del carcinoma hepatocelular (por ejemplo, Hep G2) , células epiteliales de riñon humano 293, y una serie de otras líneas celulares. Las líneas celulares de particular preferencia, se seleccionan a través de la determinación de las líneas celulares que tienen altos niveles de expresión y producción de anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a Shh.

En la técnica de fusión célula-célula, un mielóma, la célula CHO u otra línea celular se prepara que posea una cadena pesada con cualquier isotipo conveniente y otro mieloma, la célula CHO u otra línea celular se prepara que posea la cadena ligera. Tales células se pueden fusionar después, y se puede aislar una línea celular que expresa un anticuerpo intacto.

En consecuencia, según se generan los candidatos de anticuerpos que reúnen los atributos "estructurales" convenientes como lo discutido anteriormente, se '., pueden proporcionar por lo general, con al menos determinados atributos "f ncionales" convenientes a través del cambio de isotipo. í Administración Terapéutica y Formulaciones Las modalidades de la invención incluyen las formulaciones farmacéuticas estériles de los anticuerpos anti-Shh que son útiles como tratamientos para las enfermedades. Tales formulaciones podrían inhibir la unión de una Shh nativa a Patched-1, por consiguiente, el tratamiento eficaz de los trastornos patológicos donde, por ejemplo, la expresión de Shh en suero o tejido es anormalmente elevada. Los anticuerpos anti-Shh, de preferencia, poseen una afinidad adecuada para inhibir potentemente la unión de la Shh nativa a Patched-1 y, de preferencia, tienen una duración ajdecuada de la acción a tener en cuenta para la dosificación poco frecuente en los seres humanos. Una duración prolongada de la acción permitirá regímenes de dosificación menos frecuentes y más convenientes por las vías parenterales alternativas, tales como la inyección subcutánea o intramuscular.

Las formulaciones estériles se pueden crear, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estéril, antes o después de la liofilización y la reconstitución del anticuerpo. El anticuerpo normalmente se almacenará en forma liofilizada o en solución. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo, por lo general, se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, como un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica . ; La vía de administración del anticuerpo está de ¡acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, la inyección o infusión por las vías intravenosa, intraperitoneal , intracerebral , intramuscular, intraocular, intraarterial , intratecal, inhalación o intralesional , inyección directa a un sitio del tumor, o por los sistemas de liberación sostenida según se indica a continuación. El anticuerpo se administra, de preferencia, por infusión continua ; o por inyección del bolo.

Una cantidad eficaz del anticuerpo que se ¡ emplea terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos i terapéuticos, la vía de administración, y el estado del paciente. En consecuencia, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y modifique la vía de administración según sea necesario para obtener el efecto terapéutico 'óptimo. Normalmente, el médico administrará el anticuerpo hasta que se alcance una dosis que logre el efecto conveniente. El avance de esta terapia se controla fácilmente por los ensayos convencionales o por los ensayos descritos en este documento.

Los anticuerpos, según lo descrito en este documento, se pueden preparar en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica se puede administrar por vía intravenosa o a través de la nariz o el pulmón, de preferencia como un aerosol líquido o en polvo (liofilizado) . La composición se podría administrar también por vía parenteral o por vía subcutánea según sea conveniente. Cuando se administra de forma sistémica, la composición terapéutica debería ser estéril, libre de pirógenos y en una solución parenteral aceptable teniendo en cuenta el pH, la isotonicidad, y la estabilidad. Estas condiciones son conocidas por aquellas personas con conocimiento en la técnica. En resumen, las formulaciones de las dosis de los compuestos descritos en este documento se preparan para el almacenamiento o la administración por la mezcla del compuesto que tiene el grado de pureza conveniente con los vehículos, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables. Tales materiales no son ¡tóxicos para los destinatarios a las dosis y las concentraciones empleadas, e incluyen los tampones tales como TRIS HC1, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos que aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas, tales como la albúmina sérica, la gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidinona ; aminoácidos tales como la glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen la celulosa o sus derivados, la glucosa, la ma osa, o dextrina; agentes quelantes tales como; EDTA; alcoholes de azúcares tales como el manitol o sqrbitol; contraiones tales como el sodio y/o tensioactivos no liónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol .

Las composiciones estériles para la inyección se: pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional según lo descrito en Re ington: The Science and Practice de Pharmacy (20 Va edición, Lippincott Williams& y Editores Wilkens (2003) ) . Por ejemplo, la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como el agua o el aceite vegetal de origen jnatural similar al sésamo, maní, o aceite de semilla de algodón o de un vehículo graso sintético similar al oleato de etilo o los similares podrían convenientes. Los tampones, conservantes, antioxidantes y similares se pueden incorporar de acuerdo con la práctica farmacéutica aceptada.

Los ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de los polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, cuyas matrices están en la forma de artículos, películas o microcápsulas configuradas. Los ejemplos de las matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2 -hidroxietil-metacrilato) según lo descrito por Langer y otros, J. Biomed Mater. Res, (1981) 15:167-277 y Langer, Chem. Tech, (1982) 12:98rl05, o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas (patente de los Estados Unidos núm. 3,773,919, EP 58,481) , los copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y otros, Biopolymers, (1983) 22:547-556) , acetato de etileno-vinilo no degradable de (Langer y otros, supra) , copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) , y poli-D-(-)- ácido 3 -hidroxibutírieo (EP 133, 988) .

Mientras que los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de las moléculas durante más de 100; días, determinados hidrogeles liberan las proteínas durante períodos de tiempo más corto. Cuando las protéínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, ellas se podrían desnaturalizar o agregar como un resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que resulta en una pérdida de la actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales se ; pueden concebir para la estabilización de la proteína en función de los mecanismos involucrados. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación está en la formación del! enlace intermolecular S-S mediante el intercambio de disul'furo, la estabilización se podría lograr mediante la modificación de los residuos sulfidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, mediante aditivos apropiados, y el desarrollo de las composiciones específicas de la matriz del polímero. ¡ i Las composiciones de liberación-sostenida incluyen también las preparaciones de los cristales del anticuerpo en suspensión en formulaciones adecuadas capaces de mantener los cristales en suspensión. Estas preparaciones, cuando se inyectan por vía subcutánea o intraperitoneal , ! pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones incluyen también los anticuerpos atrapados en liposomas. Los liposomas que contienen tales anticuerpos se preparan por los métodos conocidos per se: patente 'de los Estados Unidos, núm DE 3,218,121; Epstein y otros/ Proc . Nati. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang y! otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1980) 77:4030-4046; EP l52,322; 36,676; EP 88,046; EP 143 , 9 9 ; 142 , 641 ; solicitud de ¡patente japonesa 83-118008; patente de los Estados Unidos, núms . 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324.

La dosis de la formulación de anticuerpo para un paciente dado se determinará por el médico que trata teniendo en consideración varios factores conocidos para modificar la acción de los fármacos que incluyen la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, otros medicamentos y otros factores clínicos relevantes. Las dosis terapéuticamente I eficaces se pueden determinar por métodos ya sea in yitro o in vivo. ; Una cantidad efectiva de los anticuerpos, descritos en la presente, a ser empleados terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la rüta de administración, y la condición del paciente'. Por consiguiente, el terapeuta prefiere valorar la dosificación y modificar la ruta de administración como sea necesario para obtener un óptimo efecto terapéutico. Una dosis típica; diaria se puede encontrar en el intervalo de aproximadamente 0.0001mg/kg, O.OOlmg/kg, O.Olmg/kg, O.lmg/kg, lmg/kg, 10mg/kg hasta 100mg/kgf 1000mg/kg, 10000mg/kg o más, del peso corporal del paciente dependiendo de los factores mencionados anteriormente. La dosis puede estar entre 0.0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0.0001 y 2 mg/kg, 0.0001 y 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg a 0.25 mg/kg, 0.0001 a 0.15 mg/kg, 0.0001 a 0.10 mg/kg, 0.001 a 0.5 mg/kg, 0.01 a 0.25 mg/kg o 0.01 a 0.10 mg/kg del peso corporal del paciente dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Típicamente, el clínico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se llegue a una dosis que alcance el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante ensayos convencionales o: com se describe en la presente.

La dosificación de los anticuerpos de la invención se puede repetir y las administraciones se pueden separar; por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, o al menos 6: meses.

Se apreciará que la administración de las entidades terapéuticas de acuerdo con las composiciones y los métodos en este documento se administrará con los vehículos adecuados, excipientes y otros agentes que se incorporan en las formulaciones para proporcionar mejor transferencia, entrega, tolerancia, y los similares. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, : geles, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen i lípido (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin™) , los conjugados de ADN, pastas anhidras de absorción, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carboceras (glicoles de polietileno de distintos pesos moleculares) , geles semi-sólido, y mezclas semi-sólidas que contienen carbocera. Cualquiera de las mezclas anteriores podría ser apropiada en los tratamientos y las terapias de acuerdo con la presente invención, se proporciona que el ingrediente activo en la formulación no se inactiva por la formulación y la formulación es compatible fisiológicamente y tolerable con la vía de administración. Ver también Baldr ck P. "Pharmaceutical excipient development : the need for preclinical guidance . " Regul . Toxicol . Pharmacol . (2):210-8 (2000) , Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals . " Int. J. Pharm. 203 (l-2):l-60 (2000) , Charman "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts" . J Pharm Sci .89 (8) ¡: 967-78 (2000) , Powell y otros "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol . 52:;238-311 (1998) y en ese sentido las citas para la información adicional relacionada con las formulaciones, excipientes y los vehículos bien ,conocidos por los químicos farmacéuticos. Diseño y Generación de Otra Terapéutica J De acuerdo con la presente invención y basado en la actividad de los anticuerpos que se producen ; y se caracterizan en este documento con respecto a Shh, se facilita el diseño de otras modalidades terapéuticas mas allá de las regiones del anticuerpo. Tales modalidades incluyen, sin limitación, la terapéutica avanzada de anticuerpo;, tales como los anticuerpos biespecífieos , inmunotoxiñas , y terapéutica radiomarcada, anticuerpos de dominio |simple, fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab' , F(ab')2, Fv o dAb, generación de terapéutica de péptidos, dominios de unión al Shh en andamios nuevos, terapias génicas, en particular intracuerpos, terapéutica antisentido, y moléculas pequeñas .

Un sitio de uión al antígeno se puede proporcionar por medio de arreglos de CDR en andamios de proteínas no anticuerpos, tales como fibronectina o citocromo B etc. (Haan Se Maggos (2004) BioCentury, 12 (5): A1-A6; Koide y otros (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren y otros (1997) Current Opinión in Structural Biology, 7: 463- 469) o por selección al azar o mutación de los residuos de aminoácidos de un lazo dentro de un andamio proteico para conferir especificidad de unión por un objetivo conveniente. Los andamios para la ingeniería de los sitios nuevos de unión en las proteínas se han revisado en detalle por Nygren y otros (Nygren y otros (1997) Current Opinión in Structural j Biology, 7: 463-469) . Los andamios de proteína para los mimetizadores del anticuerpo se describen en O/0046784, que se incorpora como referencia en su totalidad, y en el que los inventores describen las proteínas (mimetizadores del anticuerpo) que incluyen un dominio tipo III de fibronectina que tiene al menos un lazo al azar. Un andamio adecuado en cual injertar uno o más CDR, por ejemplo, un conjunto; de las i HCDR, se podría proporcionar por cualquier miembro del dominio de la superfamilia de genes de las inmunoglobiilinas .

El andamio podría ser una proteína humana o no humana. Una ventaja del andamio proteico que no es anticuerpo es que podría proporcionar un sitio de unión al antígeno jen. una molécula andamio que es más pequeña y/o más fácil de fabricar que al menos algunas moléculas del anticuerpo. El ; tamaño pequeño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como una capacidad para entrar en las células, penetrar profundo en los tejidos o alcanzar los objetivos dentro de otras estructuras, o para unirse1 dentro de las cavidades proteicas del antígeno objetivo. Típicas son las proteínas que tienen un esqueleto estable y uno o más lazos variables, en los que la secuencia de aminoácidos del lazo o lazos se muta de forma específica o al azar para crear un sitio de unión al antígeno que se une el antígeno objetivo. Tales proteínas incluyen los dominios de unión a i IgG de la proteína A de S. aureus, transferrina , albúmina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, lOmo dominio :de tipo III de fibronectina) , lipocalinas, así como la ¡ gamma-cristalina y otros andamios Affilin™ (Proteínas Sci ) . Los ejemplos de otros enfoques incluyen "Microcuerpos " sintéticos, basado en pequeñas proteínas-ciclotidas que tienen enlaces disulfuro intra-moleculares , Microproteínas (Versabodies ™, Amunix) y proteínas de repetición ankirina (DARPins, Molecular Partners) . : Además, para las secuencias de anticuerpos y/o uh sitio de unión al antígeno, un agente de unión identificado de acuerdo con la presente invención podría comprender otros aminoácidos, por ejemplo, formar un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad ; para unir al antígeno. Los agentes de unión identificados de la invención podrían llevar una marcador detectable, o se podrían conjugar con una toxina o una región o ; enzima identificada (por ejemplo, a través de un enlace peptidilo o ligando) . El sitio catalítico podría inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, por escisión.

Con respecto a la generación de terapéutica avanzada de anticuerpo, donde la fijación del complemento es un atributo conveniente, podría ser factible evitar la dependencia del complemento para la muerte celular mediante por ejemplo el uso de anticuerpos biespecífieos , inmunoto inas o radiomarcadores : Por ejemplo, los anticuerpos biespecífieos se j pueden generar que comprendan (i) dos anticuerpos uno con una especificidad para Shh y otro a una segunda molécula que se conjugan juntos, (ii) un anticuerpo simple que tiéne una cadena específica a Shh y una segunda cadena específica a una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de simple cadena que tiene especificidad a Shh y a la otra molécula. Tales anticuerpos biespecífieos se pueden generar mediante las técnicas que son bien conocidas; por ejemplo, con respecto a (i) y (ii) véase por ejemplo, Fanger y otros. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, supra . y con respecto a (iii) ver, por ejemplo, Traunecker y otros, Int. J. Cáncer (Suplemento) 7:51-52 (1992) . En cada caso, la ¡segunda especificidad, se puede preparar con los receptores de la activación de la cadena pesada, que incluyen, sin limitación, CD16 o CD64 (ver, por ejemplo, Deo y otros. Immunol . Today 18:127 (1997)) o CD89 (ver, por ejemplo, Valerius y otros. Blood 90:4485-4492 (1997)).

Los anticuerpos se pueden modificar también para actuar como inmunotoxinas , que utilizan métodos que son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Vitetta 'Immunol Today 14:252 (1993). Ver también la patente de los Estados Unidos núm. 5,194,594. Con respecto a la preparación de I anticuerpos radiomarcados, tales anticuerpos modificados se pueden preparar fácilmente también utilizando los métodos que son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Junghans y otros, en Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2da edición, Chafner y Longo, ediciones, Lippincott1 Raven I (1996))). Ver también las patentes de los Estados: Unidos núms. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 3¡5,500), 5,648,471 y 5,697,902. Cada inmunotoxina o molécula radiomarcada podría ser similar a las células de muerte que expresan el dominio de oligomerización en la subunidad de la enzima multimérica conveniente.

Cuando un anticuerpo está enlazado a un agente (por ejemplo, radioisótopos, composición farmacéutica, ; o una toxina) , se contempla que el agente posee una propiedad farmacéutica seleccionada del grupo de agentes antimitóticos , alquilantes, antimetabolitos , antiangiogénicos , apoptóticos, alcaloides, el COX-2, y antibióticos y com inaciones de éstos. El fármaco se puede seleccionar del grupo ! de las mostazas de nitrógeno, los derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas , triacenos, análogos del ácido fólico, antraciclinas , taxanos, inhibidores | COX-2, análogos de pirimidina, análogos de la purina, antimetabolitos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas , complejos de coordinación de platino, alcaloides de la vinca, ureas sustituidas, los derivados de metil hidracina, inhibidores adrenocorticales , los antagonistas, endostatina, taxols, camptotecinas , oxaliplatino, doxorrubicinas \ y sus análogos, y una combinación de éstos.

Los ejemplos de toxinas incluyen además gelonina, exotoxina de Pseudomonas (PE), PE40, PE38, toxina i de la difteria, la ricina, abrina, la toxina alfa, saporina, ribonucleasa (RNasa) , DNasa I, enterotoxina-A estafilqcócica , proteínas antivirales de la hierba carmín, gelonina, endotoxinas de Pseudomonas, los miembros de la familia de moléculas enediyna, tales como calicheamicina y esperamicina, así como los derivados, las combinaciones y modificaciones de éstos. Las toxinas químicas se pueden también tomar del grupo que consiste de duocarmicina (ver, por ejemplo, la patjente de los Estados Unidos núm. 5,703,080 y la patente ;de los Estados Unidos núm. 4,923,990), metotrexato, doxorrubicina, melfalán, clorambucil, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platino , etopósido, bleomicina y 5-fluorouracilp. Los ejemplos de los agentes quimioterapéuticos incluyen ¡también adriamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina (Ara-C) , ciclofosfamida, tiotepa, taxotere (docetaxel) , busulfán, citoxina, taxol, metot'rexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincreistina , vinorelbina, carboplatino, teniposido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitom.icinas , esperamicinas (ver, la patente de los Estados Unidos núm. 4,675,187), melfalán y otras mostazas de nitrógeno relacionadas. De preferencia, el anti-cáncer o anti-Ieucemia es doxorrubicina, morfolinodoxorrubicina ¡ o morfolinodaunorrubicina . Las toxinas y agentes quimioterapéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19mah Ed. (Mack Publishing Co. 1995), y in Goodman And Gilman' s The Pharmacological B sis of Therapeutics , 7ma Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985). Otras toxinas adecuadas y/o agentes quimioterapéuticos se 'conocen por aquellos con conocimientos en la materia.

Los ejemplos de radioisótopos incluyen emisores'-gamma , emisores de positrones, y los emisores de rayos X ¡qúe se pueden usar para la localización y/o la terapia, ; y los emisores-beta y los emisores-alfa que se pueden usar para la terapia. Los radioisótopos descritos anteriormente como útiles para el diagnóstico, pronóstico y andamiaje son útiles también para la terapéutica. 1 Los ejemplos no limitativos de agentes anti-cáncer o anti-leucemia incluyen antraciclinas tales como la doxorrubicina (adriamicina) , daunorrubicina (daunomicina) , idarrubicina, detorrubicin, carminomicina, epirrubicina , esorrubicina y morfolino y derivados sustituidos, combinaciones y modificaciones de éstos. Los agentes farmacéuticos ejemplares incluyen cisplatino, i taxol, j calicheamicina, vincristina, citarabina (Ara-C) , i ciclofosfamida, prednisona, daunorrubicina, idarrubicina, fludarabina, clorambucilo, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida , talidomida, y bleomicina y derivados, combinaciones y modificaciones de éstos. De preferencia, el anti-cáncer o anti-leucemia es doxorrubicina, morfolinodoxorrubicina o morfolinodaunorrubicina. ! Los anticuerpos de la invención también incluyen anticuerpos que tienen una vida media (por ejemplo, vida media en el suero) en un mamífero, de preferencia un humano, de mayor que la de un anticuerpo sin modificar. La vida media del anticuerpo podría ser mayor que aproximadamente 15 días, mayor que aproximadamente 20 días, mayor que aproximadamente 25 días, mayor que aproximadamente 30 días, mayor que aproximadamente 35 días, mayor que aproximadamente 4,0 días, mayor que aproximadamente 45 días, mayor que aproximadamente 2 meses, mayor que aproximadamente 3 meses, mayor que aproximadamente 4 meses, mayor que aproximadamente 5: meses. El aumento de la vida media de los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de éstos en un mamífero, de preferencia un humano, resulta en un título de suero supérior de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos , en el mamífero, y de este modo, reduce la frecuencia de la administración de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpos y/o reduce la concentración de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo que se administran. ; Los anticuerpos o fragmentos de éstos que tienen vida media in vivo aumentada se pueden generar mediante las i técnicas conocidas por aquellas personas con conocimi nto en la técnica. Los agentes farmacéuticos ejemplares incluyen cisplatino, taxol, calicheamicina , vincristina, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, prednisona, daunorrubicina, idarrubicina , fludarabina, clorambucilo, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida, y bleomi ina y derivados, combinaciones y modificaciones de ésto's. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de éstos con vida media in vivo aumentada se pueden generar por la modificación de (por ejemplo, sustitución, supresión o adición) los residuos de aminoácidos identificados como involucrados 'en la interacción entre el dominio Fe y el receptor FcRn (ver, por ejemplo, publicación internacional núms . O 97/46631 y WO I 02/060919, que se incorporan como · referencia ¡en su totalidad) . Los anticuerpos o fragmentos de éstos con la vida media in vivo aumentada se pueden generar por la fijación de las moléculas del polímero a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tales como polietilenglicol de alto peso molecular (PEG) . El PEG se puede fijar a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, con o sin un ligando multifunctional , ya sea a través de la conjugación sitio-específica del PEG con el N-o C-terminal de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o por los grupos amino-'épsilon presentes en los residuos de lisina. El grado de conjugación se supervisará estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar la correcta conjugación cié las moléculas PEG a los anticuerpos. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo la cromatografía de exclusión molecular o ¡ la de intercambio- iónico . i Se apreciará por una persona con conocimiento; en la técnica, que en las modalidades anteriores, aunque los valores de afinidad pueden ser importantes, otros factores pueden ser tan importantes o más, dependiendo de la función particular del anticuerpo. Por ejemplo, para una inmunotoxina (toxina asociada con un anticuerpo) , el acto de unión del anticuerpo al objetivo puede ser útil, sin embarcjo, en algunas modalidades, es la internalización de la toxina en la célula el resultado final que es conveniente. Como tal, los anticuerpos con un alto porciento de internalizado^ pueden ser convenientes en estas situaciones. De este modo, en una modalidad, los anticuerpos con una alta eficiencia; en la internalización se contemplan. Una alta eficiencia; en la internalización se puede medir como un por ciento de anticuerpo internalizado, y puede ser desde un valor bajo hasta 100%. Por ejemplo, en distintas modalidades, ' 0.1-5, 50-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99 y 99-100% pueden ser una eficacia alta. Como se apreciará por una persona con conocimiento en la técnica, la eficacia conveniente puede ser diferente en las divérsas modalidades, dependiendo de, por ejemplo, el agente asociado, la cantidad de anticuerpo que se puede administrar; a una zona, los efectos secundarios del complejo anticuerpo-'agente , el tipo (por ejemplo, el tipo de cáncer) y la gravedad del problema que se trata.

En otras modalidades, los anticuerpos divulgados en este documento proporcionan un kit de ensayo para la detección de la expresión de Shh en los tejidos o células de mamífero para detectar una enfermedad o un trastorno asociado con ¡cambios en la expresión de Shh. El kit comprende un anticuerpo! que se une a Shh y los medios para indicar si está presente la reacción del anticuerpo con el antígeno.

Combinaciones El agente de unión identificado o anticuerpo definido en la presente puede aplicarse como una terapia única o puede involucrar, adicionalmente a los compuestos de la invención, cirugía convencional o radioterapia o quimioterapia. La quimioterapia puede incluir uno o más de las siguientes categorías de agentes antitumorales : ' (i) otros fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y las combinaciones de éstos, como se usa en oncología médica, tales como los agentes alquilatantes (por ejemplo cis-platino, oxaliplatino, carboplatino, ciclofosfamida , mostaza de nitrógeno, melfalano, clorambucil, busulfán, temozjolamide y nitrosoureas) ; antimetabolitos (por ejemplo gemcitabina y antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracil y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina, e hidroxiurea) ; antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, I daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina) agentes antimitóticds (por ejemplo alcaloides vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxotere e inhibidores de polocinasa) ; e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecan y camptotecina) ; (ii) agentes citostático tales como antioest¡rógenos (por ejemplo tamoxifeno, fulvestrant ,' toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno) , antiandrógenos (por ejemplo bicalutamia, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona) , antagonistas LHRH o agonistas LHRH (por ejemplo goserelina, leuprorelina y buserelina) , progestogenas (por ejemplo acetato de megestrol) , inhibidores de aromatasa (por ejemplo como anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5-reductasa tales como finasteride; (iii) agentes anti-invasión (por ejemplo, inhibidores de la familia de c-Src cinasa como 4- (6-cloro-2 , 3 -metilenodioxianilino) - 7 - [2 - (4 -metilpiperazin-1- il) étoxi] -5-tetrahidropiran-4-iloxiquinazolina (AZD0530; solicitud de patente internacional WO 01/94461) y N- (2-cloro-6-metilfenilo) -2-{6- [4- ( 2 -hidroxietilo) iperazin-l-il] -2r metilpirimidin-4 - ilamino} tiazol - 5-carboxamida (das.atinib, BMS-354825; J. ed. Chem, 2004, 47, 6658-6661), e inhibidores de la metaloproteinasa como marimastat, inhibidores de función del receptor activador de plasminógeno de urocinasa o, inhibidores de catepsinas, inhibidores de serina pr.oteasas por ejemplo matriptasa, hepsina, urokinasa, inhibidores de heparanasa) ; ¦ (iv) agentes citotóxicos tales como fludarabina, 2-clorodeoxiadenosina, clorambucil o doxorrubicina y combinación de éstos tales como Fludarabina + ciclofosfamida , CVP: ciclofosfamida + vincristina + prednisona, :!ACVBP:. doxorrubicina + ciclofosfamida + vindesina + bleomicina + prednisona, CHOP: ciclofos amida + doxorrubicina + vincristina + prednisona, CNOP : ciclofosfamida + mitoxantrona + vincristina + prednisona, m-BACOD: metotrexato + bleomicina + doxorrubicina + ciclofosfamida + vincristina + dexamétasona + leucovorina, MACOP-B: metotrexato + doxorrubicina + ciclofosfamida + vincristina + dosis fija de prednisona + bleomicina + leucovorina, o ProMACE CytaBOM: prednisona + doxorrubicina + ciclofosfamida + etoposido + citarábina + bleomicina + vincristina + metotrexato + leucovorina. (v) inhibidores de función del factor de crecimiento, por ejemplo, como los inhibidores que incluyen anticuerpos del factor de crecimiento y anticuerpos del receptor del factor de crecimiento (por ejemplo el anticuerpo ant,i-erbB2 trastuzumab [Herceptin™] , el anticuerpo an,ti^EGFR panitumumab, el anticuerpo anti-erbBl cetuximab [Erbitux, C225] y cualquier factor de crecimiento o anticuerpos del receptor del factor de crecimiento descrito por Stern y otros. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol . 54, ppll-29) ; tal como los inhibidores, también incluyen inhibidores de tirosma cinasa, por ejemplo, inhibidores del familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo inhibidores de la familia EGFR de tirosina cinasa tales como N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxi-6- (3-morfolinopropoxi) quinazolin-4-amina (gefitinib, ZD1839) , N-(3-etinilfenil) -6, 7-bis (2-metoxietoxi) quinazolin-4 -amina (erlotinib, OSI-774) y 6 -acrilamido-N- (3-cloro-4-fluorofenilo) -7- (3 -morfolinopropoxi) -quinazolin-4 -amina (CI 1033), inhibidores de tirosina cinasa erbB2 tales como lapatinib, inhibidores del familia del factor de crecimiento de hapatocitos, inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas tales como imatinib, inhibidores de serina/treonina cinasa (por ejemplo Ras/Raf inhibidores de señalización tales como inhibidores de farnesil transferasa, por ejemplo sorafenib (BAY 43-9006) ) , inhibidores de señalización celular a través de cinasas MEK y/o AKT, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hapatocitos, inhibidores c-kit, inhibidores de cinasa abl, inhibidores de cinasa del receptor IGF (factor de crecimiento tipo insulina) , inhibidores de cinasa aurora (por ejemplo AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 y AX39459) , inhibidores de cinasa dependientes de ¡ciclina tales como inhibidores CDK2 y/o CDK4 , e inhibidores de proteínas de señalización de supervivencia tales como; Bcl-2, Bcl-XL por ejemplo ABT-737; (vi) agentes antiangiogénicos tales como los que inhiben los efectos del factor de crecimiento vascular endotelial, [por ejemplo el anticuerpo del factor de crecimiento 'celular I endotelial anti-vascular bevacizumab (Avastin™) y inhibidores tirosina cinasa del receptor VEGF tales como 4-(4 -bromo-2 -fluoroanilino) -6-metoxi-7- ( l-metilpiperidin†4-ilmetoxi) quinazolina (ZD6474; Ejemplo 2 en WO 01/32651), 4-(4-fluoro-2 -metilindol-5-iloxi) -6-metoxi-7- (3-pirrolidin-l-ilpropoxi) quinazolina (AZD2171; Ejemplo 240 en WO 00/47212), vatalanib (PTK787; WO 98/35985) y SU11248 (sunitinib; WO 01/60814) , los compuestos tales como los descritos en las solicitudes internacionales de patente W097/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WO00/47212 y WOOl/32651 y los compuestos que funcionan por otros mecanismos (por ejemplo, linomide, inhibidores de la función de la in^egrina a?ß3 y angiostatina) ] o receptor CSF1 o del factor 1 estimulante de colonias (CSF1) ; (vii) agentes de daño vascular tales ; como combretastatina A4 y los compuesto descritos en las i solicitudes internacionales de patente WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04446^ y WO 02/08213; 1 (viii) terapias antisentido, por ejemplo los ;que se dirigen a los objetivos enumerados anteriormente, tales como G-3139 (Genasense) , un anti bcl2 antisentido; i (ix) aproximaciones a la terapia de genes, incluyendo por ejemplo aproximaciones para reemplazar genes aberrantes tales como p53 aberrante o BRCA1 o BRCA2 aberrantes GDEPT (terapia génica dirigida enzima-profármaco) aproximaciones i tales como aquellas que usan citosina deaminasa, timidina cinasa o una enzima nitroreductasa bacteriana y aproximaciones para aumentar la tolerancia del paciente a la quimioterapia o radioterapia tales como terapia génica de reistencia a múltiples fármacos; y (x) aproximaciones de inmunoterapias, incluyendo por ejemplo el tratamiento con Alemtuzumab (campath- 1H™) , un anticuerpo monoclonal dirigido a CD52, o tratamiento con anticuerpos dirigidos a CD22, ex vivo e in vivo aproximaciones para aumentar la inmunogenicidad de células tumorales del paciente, transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante; de la colonia granulocito macrofago, aproximaciones para disminuir la anergia de células T tales como el tratamiento con i anticuerpo monoclonales que inhiben la función de ,CTLA-4, i aproximaciones usando células inmuno transíectadas tales como células dendríticas transíectadas con citocina, aproximaciones usando líneas celulares tumorales transíectadas con citocinas y aproximaciones ; usando anticuerpos anti - idiotípicos . : (xi) inhibidores de degradación de proteínas tales como inhibidores de proteasoma tales como Velcade (bortezomib) . (xii) aproximaciones terapéuticas bioterapéuticás , por ejemplo, las que usan péptidos o proteínas (tales como anticuerpos o construcciones del dominio del receptor externo soluble) que secuestran los ligandos receptores, bloquean la unión del ligando al receptor o disminuyen la señalización del receptor (por ejemplo debido a la degradación del receptor aumentada o niveles de expresión disminuidos) .

En una modalidad, el tratamiento anti-tumoral definido en la presente puede incluir, adicionalmente a los compuestos de la invención, el tratamiento con otros fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de, éstos, como se usa en oncología médica, tales como agentes alquilatantes (por ejemplo cis-platino, oxalip atino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalano, clorambucil, busulfán, temozolamide y nitrosoureas) ; antimetabolitos (por ejemplo, gemcitábina y antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5- fluor uracil y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina, e hidroxiurea) ; antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina) ; agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxótere e inhibidores de polocinasa) ; e inhibidores de topoispmerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecan y camptotecina .

En una modalidad, el tratamiento anti-tumoral definido en la presente puede involucrar, adicionalmente a los compuestos de la invención, el tratamiento con gemcitabina.

Tal tratamiento conjunto se puede lograr por medib de la dosificación simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales del tratamiento. Tales productos de ? combinación emplean los compuestos de esta invención, b sales farmacéuticamente aceptables de éstos, dentro de los intervalos de dosificación descritos en la presente antes y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de sus intervalos de dosificación aprobados.

EJEMPLOS Los ejemplos a continuación, incluyendo los experjiméntos I realizados y los resultados logrados se proporcionan solamente con propósitos ilustrativos y no deben ser interpretados en este documento como limitativos ¡de las enseñanzas .

EJEMPLO 1 , INMUNIZACIÓN Y TITULACIÓN j Inmunización I Los anticuerpos monoclonales contra el sonic hedgehog humano (Shh) se desarrollaron por las inmunizaciones secuenciales de los ratones XenoMouse . Las inmunizaciones para la campaña 1 se realizaron usando Shh soluble; humano recombinante (Catálogo # 1314-SH/CF, R & D Systems); y, Shh conjugado con KLH (Shh-KLH) . En la campaña 1, Shh: humano recombinante (10 g/ratón) se administró a través de inyección intraperitoneal (IP) con TiterMax Gold ; (Sigma Catálago # T2684) en el refuerzo inicial. Los siguientes seis i refuerzos usaron 5µg de Shh por ratón, que alternan inyecciones en la cola con una mezcla de ADN CpG (Adyuvante ImmunEasy de ratón, Catálogo # 303101, Qiagen) y el adju-Phos (gel de fosfato de aluminio, catálogo # 1452-250, Biosector HCI) con inyecciones IP de Shh en combinación con TiterMax Gold. Estos seis refuerzos se administraron dos veces a la semana. Otros nueve refuerzos se realizaron con 5µg de Shh-KLH por ratón entregados de una manera alternativa a; través de la cola con CpG de ADN y Adju Phos y a través de inyección IP con TiterMax Gold. Los primeros seis de estos nueve refuerzos se administraron dos veces a la semana y los tres últimos se entregaron semanalmente . El refuerzo final de 5 µg de Shh-KLH en PBS se entregó en la base de la cola IP.

Las células CHO transíectadas transitoriamente con Shh humano completa se usaron como inmunógeno en la campaña 2. La primera inyección de 2 x 10 células mezcladas con adju-i-Phos se administró IP. Para los próximos 16 refuerzos, 1 x 106 células se inyectaron con Adju-Phos en ya sea la cola o IP, y por último los dos últimos refuerzos se inyectaron en la base de la cola IP. Los primeros 14 refuerzos se entregaron dos veces por semana, y los 5 restantes refuerzos se entregaron semanalmente .

Selección de los animales por el título para la cosecha Los títulos de los anticuerpos contra Shh humano se determinaron mediante ensayos de unión al Shh. Se emplearon dos métodos : la unión del anticuerpo a Shh expresado de forma transitoria en las células 293T se midió mediante citbmetría de flujo y la unión del anticuerpo al Shh biotínilado inmovilizado se evaluó en un formato ELISA. Al final del programa de inmunización, las fusiones se realizaron! usando células de mieloma de ratón y los linfocitos aislados de los bazos y los ganglios linfáticos de los ratones inmunizados por medio de la electroporación, según lo descrito en el Ejemplo 2. i EJEMPLO 2 RECUPERACIÓN DE LOS LINFOCITOS, AISLAMIENTOS DE CÉLULAS B, FUSIONES Y GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS I Los ratones inmunizados se sacrificaron por dislocación cervical, y los ganglios linfáticos de drenaje se cosecharon y se mezclaron de cada cohorte. Para este programa se realizaron dos cosechas. La cosecha 1 usó seis ratones con números de identificación 159507, 159508, 159821, ¡159823, 163273 y 163325. La cosecha 2 usó seis ratones con números de identificación 159184, 159533, 159534, 159885, 16!3335 y 163337.

Las células linfoides se disociaron por macerado en DMEM para liberar las células de los tejidos y las células se suspendieron en DMEM. Las células se contaron, y 0.9 mi de DMEM por 100 millones de linfocitos se adicionaron al sedimento de células para resuspender las células suavemente pero de forma completa. Usando 100 µ? de CD90+perlas magnéticas por 100 millones de células, las células se marcaron para la incubación con las perlas magnéticas a 4°C durante 15 minutos. La suspensión celular marcada de forma magnética conteniendo hasta 108 células positivas (o hasta 2xl09 células en total) se cargó en una columna LS '+ y la columna se lavó con DMEM. El efluente total se colecto én la fracción negativa de CD90- (la mayoría de estas células se esperaron fuesen células B) . ¡ La fusión se realizó por la mezcla de células B ^lavadas del día 6 enriquecidas con células no secretoras de imieloma P3X63Ag8.653 compradas de ATCC, cátalogo # CRL 1580 (:Keárney y otros, J. Immunol . 123, 1979, 1548-1550) en una proporción de 1:4. La mezcla celular se sedimentó por centrifugación suave a 400 x g durante 4 minutos. Después de la decantación del sobrenadante, las células se mezclan suavemente! usando una pipeta de 1 mi. El PEG precalentado (1 mi por cada 106 células B) se adicionó despacio con agitación suave durante 1 minuto seguido por un minuto de mezcla. El IDMEM precalentado (2 mi por cada 106 células B) se adicionó después! pór 2 minutos más con agitación suave. Por último el IDMEM precalentado (8 mi por cada 106 células B) se adicionó por 3 minutos más . i Las células fusionadas se centrifugaron a 400 x g durante 6 minutos y se resuspendieron en 20 mi de medios de selección [DMEM (Invitrogen) , 15% de suero fetal bovino (FBS) i (Hyclone) , suplementado con L-glutamina, pen/estrep., : MÉM de aminoácidos no-esenciales, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol (todos de Invitrogen) , hipoxantiría HA-azaserina y OPI (oxalacetato, piruvato, insulina bovina) (ambos de Sigma) y la IL-6 (Boehringer Mannheim) ] por 106 células B. Las células se incubaron durante 20-30 minutos a 37 °C y se resuspendieron después en 200 mi de medios de í selección y se cultivaron durante 3-4 días en un frasco de T175. j El día 3 posterior a la fusión las células se colectaron, se centrifugaron durante 8 minutos a 400 x g y se resuspendieron en 10 mi de medios de selección por 106 células B fusionadas. El análisis FACS de la población de hibridoma se realizó, y las células se congelaron posteriormente.

Los hibridomas se cultivaron de forma rutinaria en el medio selectivo. Los sobrenadantes exhaustivos colectados de los hibridomas que potencialmente producen anticuerpos anti-Shh humano se sometieron a ensayos de detección posterior.

EJEMPLO 3 '.

MEDICIÓN DEL TÍTULO DE ANTICUERPO: UNIÓN AL ANTÍGENO NATIVO DE LAS CÉLULAS 293T TRANSFECTADAS DE FORMA TRANSITORIA CON SHH El análisis FACS se realizó en células 293T transfectadas de forma transitoria con Shh humano en comparación con las células 293T parentales para medir los títulos de anticuerpo contra el Shh humano producido según lo descrito en los Ejemplos 1 y 2. Las células transfectadas o parentales se sembraron a 50,000 células/pocilio; y se incubaron con 2µ1 de la muestra (a la dilución 1:50) 'durante una hora a 4°C. Los pocilios se lavaron después y se incubaron con anticuerpos de carnero anti-humano conjugado con Cy5 a 2µg/ml y 7-amino-actinomicina (7AAD) a 5 durante 30 minutos a 4 °C. La Shh unida se detectó mediante el análisis de FACS. El control positivo fue el anticuerpo de rata anti-Shh (catálogo # MAB4641, R & D Systems, Ihc), y los controles negativos incluyen suero : virgen XMG2 y suero virgen XMG4 (XM3C-1) . La Tabla 2 lista los datos; de la citometría de flujo obtenidos a partir del análisis ! de los sueros de los animales seleccionados para la generación posterior de los hibridomas . ! Tabla 2. Títulos de anticuerpo contra Shh humano como se determinó por el análisis de citometría de flujo de células 293T transitoriamente transfectadas . ¡ EJEMPLO 4 MEDICIÓN DEL TÍTULO DE ANTICUERPO: UNION A LA SHH-BIOTINA ? INMOVILIZADA ' Un ensayo de ELISA de unión para Shh humano biotjinilado inmovilizado se usó para medir los títulos de anticuerpo producido según lo descrito en los Ejemplos 1 y 2. ' Para medir los títulos de anticuerpo, las placas ' (placas de 96 pocilios de unión a medio Costar 3368) se recubrieron con neutravadina a 8 µ9/p?1 en PBS IX, 0.05% de azidaj por la incubación a 37 °C durante 1 hora. Las placas se bloquearon con 250µ1/????11? de 1% de leche en PBS durante 30, min a temperatura ambiente. Posteriormente, 50µ1 de 500 ng/ml Shh biotinilada en PBS1X, 1% de leche (peso/volumen) se adicionaron por pocilio y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos se titularon 1:3 después por duplicado a partir de una dilución 1:100 en tampón de bloqueo (PBS IX, 1% de leche) y se adicionaron a cada pocilio. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente, se lavaron y posteriormente se incubaron con el anticuerpo secundario diluido 1:1000! (anti-Fc de IgG humana en carnero con POD Laboratorios Jackson) durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron posteriormente, y la solución TMB de un paso se adicionó ( 50µ1/????11?) y se permitió desarrollar durante 30 min a temperatura ambiente. Las reacciones de desarrollo se apagaron con un volumen igual de HCl 1 N. La absorbañcia se midió a 450 nm. Los controles positivos fueron de antii-Shh en carnero (catálogo# AF464, R & D Systems) y anti-Shh én rata (catálogo # MAB4641, R & D Systems) titulado 1:3 de ^g/ml (anticuerpos secundarios: a partir de 1 anti- Fe de: IgG de rata en conejo con POD diluida 1:1250 y anti-Fc de ¡IgG de carnero en conejo con POD diluida 1:1000, respectivamente). Los controles negativos incluyen sueros vírgenes ;XMG2 y sueros vírgenes XMG4 (XM3C-1) . La Tabla 3 proporciona un resumen de las lecturas de ELISA obtenidas del análisis de los anticuerpos unidos. Los valores indican la dilución calculada que rinde una medida de 2 a DO450. Para los sueros que rindieron una DO <2 en una dilución de 1:1!00/ se proporciona la DO obtenida a 1:100 1 Tabla 3. Títulos de anticuerpo contra Shh biotiinilado inmovilizado como se midió por ensayo ELISA ': EJEMPLO 5 DETECCIÓN DEL SOBRENADANTE DE HIBRIDOMA MEDIANTE LOS ENSAYOS DE UNIÓN Los sobrenadantes del hibridoma que contiene el anticuerpo producidos según lo descrito en los Ejemplos 1 y 2, se detectaron por los ensayos que miden la unión a Shh biotinilada e inmovilizada i Para detectar los sobrenadantes dé los hibridomas para la actividad de unión al Shh, la unión del anticuerpo: a Shh-biotina inmovilizada en un formato ELISA se realizó esencialmente según lo descrito en el Ejemplo 4. Las placas (placas de 384 pocilios de unión a medio Costar 3702) se recubrieron con neutravadina a en PBS IX, 0.05% de azida por la incubación toda la noche a 4 °C. Después de bloquear con 1% de leche en PBS, 40µ1 de 500 ng /mi de Shh biotinilado en PBS1X, 1% de leche (peso/volumen) se adicionó a cada pocilio y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes del hibridoma (10 µ?/pocillo) se adicionaron a 40µ1 de 1% de leche, 0.05% de Tween-20| en PBS por pocilio y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. A continuación del lavado y la incubación con el anticuerpo secundario (100 ng/ml anti- Fe de IgG humana en carnero con HRP) , los pocilios se desarrollaron con el sustrato TMB y posteriormente, se apagó con HCl 1 N. La Tabla 4 proporciona un resumen de las lecturas ELISA obtenida del análisis de los anticuerpos unidos.

Tabla 4. Unión del anticuerpo en sobrenadante de hibridoma para biotina-Shh inmovilizado en un formato ELISA.

MAb ID OD450 1A5 6.000 1A8 3.935 1A12 4.094 1B4 1.148 1B5 0.217 1B7 3.543 1B11 0.270 1C4 2.686 1C6 0.183 1C7 0.071 1C8 0.264 5 1D11 1.237 1E1 1.604 1E3 0.222 1E5 6.000 1F4 6.000 10 1F6 1.409 1F8 0.423 1F9 0.203 1F11 0.256 1G1 4.301 15 1G2 0.337 1G4 3.886 1G5 1.182 1G12 2.488 1H2 3.668 20 1H4 2.463 1H8 4.044 1H10 3.464 1H12 3.732 3H8 3.809 4B1 6.000 4B6 5.141 4C7 0.374 4D2 2.337 4G1 2.351 Los sobrenadantes del hibridoma se detectaron también para la actividad de unión con la Shh ¡humano nativa expresada en la superficie de las células 293T t ransfectadas de forma transitoria mediante1 FMAT (Tecnología Fluorométrica de Ensayo ¡ con microvolúmenes ) . La transfección transitoria de las células 293T se realizó usando 1 µ9 de ADN y 1 µ? de 293 fectina (Invitrogen) por 1 x 106 células. Las células se mantuvieron a 1 x 106 células/ml durante toda la noche a 37°C, 5% de C02. Las células transíectadas se sembraron en placas de 384 pocilios a 2500 células/pocilio junto con 17,500 células parentales sin transfectar/pocillo. Los sobrenadantes se adicionaron a cada pocilio ( 1 ?µ? /poc i 1 lo ) ¡ y se incubaron 1.5 horas a temperatura ambientp . El anticuerpo secundario anti- Fe de IgG humana en í carnero marcado con Cy5 se adicionó a cada pocilio ( ??µ?/pocillo) a una concentración final de 4.25 µ9/??1 y se incubaron 3 horas a temperatura ambiente . Las placas se leyeron en el sistema' FMAT 8100 HTS de Applied Biosystems . Los resultados se describen en la Tabla 5. La señal total (FL1 x conteo) se define como el número de células positivas en un pocilio (conteo) multiplicado por la intensidad media de la fluorescencia de las células positivas (FL1) .

Tabla 5. Resultados FMAT para la unión de los sobrenadantes del hibridoma a las células 293T que expresan Shh humano I Por último, la unión del anticuerpo a Shh nativo: en los sobrenadantes exhaustos de hibridomas se evaluó mediante citometría de flujo. El Shh humano se expresó : en la superficie de las células HEK 293T transfectadas dé forma transitoria según lo descrito anteriormente en el Ejemplo 5. Las células transfectadas o parentales se sembraron ; en las placas con pocilios de fondo V (50,000 células/pocillp) . Los sobrenadantes exhaustos (50µ1 de una dilución 1:10) se adicionaron a cada pocilio y se incubaron a 4°C durante 1 hora. El anti-Shh MAB4641 en rata se usó como control positivo. Se adicionó a una concentración 2 µ9/p?1 ! en un volumen de 50 µ? . Las células se lavaron y 50µ1 ¡de; una solución de 2 µ9/p?1 de anticuerpo secundario (anti-IgGÍ humano en carnero marcado con Cy5 o anti-IgG conejo en carnero marcado con Cy5) se adicionaron a cada pocilio. El 7AAD se adicionó a una concentración de 5µg/ mi y la mezcla se! incubó durante 30 min a temperatura ambiente. La fluorescencia media para cada muestra se determinó después mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Tabla 6. ' Tabla 6. Unión del anticuerpo anti-Shh en sobrenadantes del i hibridoma exhausto al Shh expresado en la superficie celular.

EJEMPLO 6 I DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD RELATIVA DE LOS SOBRENADANTES i QUE CONTIENEN EL ANTICUERPO ! La potencia relativa de los distintos sobrenadantes que contienen el anticuerpo se comparó para medir que tan adecuadamente inhibieron la inducción de un reportero Glilluciferasa expresado en las células NIH 3T3 en un sistema í de ensayo de co-cultivo. Las células NIH 3T3 expresan de forma estable un constructo del reportero de luciferasa de luciérnaga que contiene múltiples copias del sitio de unión Glil corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción de la luciferasa en la región promotora.; Las células contienen también un constructo Renilla luciferasa que se usa para normalizar los efectos no específicos..

Las células NIH 3T3-G1Í1 se sembraron a; 6000 células/pocilio en DMEM libre de rojo fenol con 10% j de FBS en placas de 96 pocilios y se incubaron durante toda la noche a 37°C, 5% de C02. Las células HEK 293T se transíectaron de forma transitoria con pJPUO, una constructo de expresión de mamíferos basado en pCR3.1 (catálogo # 12347019, Invitrogen) para la Shh humano completa. Las células se transíectaron con ^g de ADN por 106 células usando reactivo 293 fectin lípido, y ellas se incubaron durante toda la noche con balanceo a 37 °C, 5% de C02. Las células 293T transfretadas con Shh (24,000 células/pocilio) se preincubaron con 20 % (vol/vol) de sobrenadante de hibridoma en un volumen total de ???µ? de medio a 37 °C durante 2 horas. El medio se eliminó de las células NIH 3T3-G1Í1 y se reemplazó con 75µ1 de células 293T transfectadas en medio que contiene el sobrenadante del hibridoma. Las células se co-culjtivaron durante toda la noche a 37°C, 5% de C02. Al día siguiente, 75 µ? de reactivo Dual-Glo luciferasa (catálogo # i E2940, Promega) se adicionaron a cada pocilio y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. La señal de la luciferasa de luciérnaga se midió inmediatamente después usando un tiempo de lectura de 500 milisegundos en el luminómetro Tecan. La solución de parada Dual-Glo (40ul/pocil;lo) se adicionó a cada pocilio y se incubó durante 10 minutos. La señal de Renilla luciferasa se obtuvo después de una lectura de 500 milisegundo usando el instrumento Tecan. Los resultados de los experimentos duplicados cón 40 sobrenadantes de hibridoma anti-Shh se muestran en la Tabla 7. : La actividad neutralizante de los sobrenadantes de hibridomas anti-Shh se examinó también en un ensayo similar de reportero usando medio condicionado (CM) que contiene Shh-N soluble, el dominio N-terminal de señalización de la Shh, para estimular la actividad del reportero Glil.

El ensayo reportero de CM se llevó a cabo mediante los mismos protocolos que el ensayo de reportero de co-pultivo con distintas modificaciones. El medio condicionado Shh que contiene (12.5% vol/vol) se pre incubó con sobrenadánte de hibridoma (20% vol/vol) en DMEM libre de fenol-rojo que contiene 10% de SFB durante 2 horas a 37°C. Las células NIH 3T3-G1Í1 (sembradas a 6000 células/pocilio) se trataron con 75 µ? de la mezcla CM-sobrenadante Shh durante toda la noche a 37°C, 5% de C02. Al día siguiente, las actividades de la luciferasa de luciérnagas y Renilla se determinaron según lo descrito anteriormente. Los resultados de los experimentos duplicados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Los sobrenadantes del hibridoma inhiben la estimulación dependiente de Shh del reportero Glil en células NIH 3T3 EJEMPLO 7 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD RELATIVA DEL ANTICUERPO PURIFICADO EN LOS ENSAYOS DEL REPORTERO GLI¡1 La actividad del material de anticuerpo purificado derivado de los subclones del hibrid ma de anticuerpos candidatos se evaluó en el ensayo del reportero Glil. Estos ensayos se realizaron según lo descrito en el Ejemplo 6. Los anticuerpos purificados se diluyeron en serie 1:5 a partir dé una I concentración de 20 ug/ml . Los resultados de los experimentos duplicados en ambos formatos de ejnsayo, en los que la fuente de Shh se suministra por c.élulas 293T transí ectadas co - cul t ivadas o en ' medio condicionado, se informa en la Tabla 8. La inhibición significativa se observó en sólo 20ug/ml, y como resultado, sólo aquellos datos se muestran. · Tabla 8. El anticuerpo derivado del subclon purificado inhibe la estimulación dependiente de Shh del reportero Glil en células NIH 3T3 EJEMPLO 8 ¡ I ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LOS ANTICUERPOS SHH ; Las cadenas variables pesadas y las qadenas variables ligeras de los anticuerpos se secuericiaron para determinar sus secuencias de ADN . La información de la secuencia completa de los anticuerpos anti-Shh se proporciona en la lista de secuencias con las 1 i secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para cada combinación de la cadena kappa y gama. Las secuencias variables pesadas se analizaron para determinar la familia de VH , la secuencia de la región D y la secuencia de la región J. Las secuencias se tradujeron después para determinar la secuencia primaria de los aminoácidos y se compararon con las secuencias de la regiones VH , D y J de la ¡ línea germinal para evaluar las hipermutaciones somáticas .

La Tabla 9 a continuación es una tabla que compara las regiones de cadena pesada de los anticuerpos con su emparentada región de ¡cadena pesada de la línea germinal y las regiones de cadena ligera de los anticuerpos con su emparentada región de cadena ligera de la línea germinal. 10 15 10 15 Los genes de la inmunoglobulina sufren distintas modificaciones durante la maduración de la respuesta ¡inmune, que incluyen la recombinación entre los segmentos de genes V, D y J, cambio de isotipo e hipermutación en las regiones variables. La recombinación y la hipermutación somática son la base para la generación de la diversidad de los anticuerpos y la maduración de la afinidad, pero elloS pueden provocar también complicaciones en la secuencia que podrían generar la producción comercial de tales inmunoglobulinas como agentes terapéuticos difíciles, o aumentar el riesgo de inmunogenicidad del anticuerpo. En general, es probable que las mutaciones en las regiones CDR contribuyan a mejorar la i afinidad y la función, mientras que las mutaciones 1 en las regiones marco podrían aumentar el riesgo de inmunogenicidad. Este riesgo se puede reducir por la regresión de las mutaciones del marco a la línea germinal, mientras que garantiza que la actividad de los anticuerpos no se1 afecte i negativamente. Algunas complicaciones estructurales se podrían provocar por la diversificación de los procesos, o ellos podrían existir dentro de las secuencias de la línea germinal que contribuyen a los dominios variables de¡ cadena pesada y ligera. A pesar de la fuente, podría ser conveniente eliminar las posibles complicaciones estructurales que; pueden resultar en la inestabilidad, la agregación, la heterogeneidad del producto, o aumento de la inmunogenicidad.

Los ejemplos de las complicaciones no deseadas incluyen cisteínas desapareadas (que podría conducir a la mezcla de enlace disulfuro, o la formación de aductos variables sulfidrilo) , sitios de glicosilación enlazados a N ' (dando lugar a la heterogeneidad de la estructura y la actividad) , así como la desamidación (por ejemplo, GN, NS) , isomerización i (DG) , la oxidación (metionina expuestas) , y los sitios de hidrólisis (DP) . ' Para reducir el riesgo de inmunogenicidad, y mejorar las propiedades farmacéuticas de los anticuerpos protagónicos , podría ser conveniente reducir el número de mutaciones de la línea germinal y/o eliminar las complicaciones estructúrales.

De este modo, en una modalidad, donde un ant!icuerpo particular difiere de su respectiva secuencia de la línea germinal en el nivel de aminoácidos, la secuencia de anticuerpos se puede transformar de nuevo a la secuencia de i la línea germinal. Tales mutaciones correctivas puede 'ocurrir en una, dos, tres o más posiciones, o una combinación de cualquiera de las posiciones mutadas, mediante técnicas de i biología molecular. A modo de ejemplo no limitativo, lia Tabla 12 muestra que la secuencia de la cadena pesada del mAb 3H8 (sec. con núm. de ident . : 14. ) difiere de la secuencia de la línea germinal correspondiente (ver Tabla 9) a través: de una mutación T a una S (mutación 1) en el residuo número 31 y una N a una Y en el residuos número 80, o una P a una Y en el número de residuo 108. De este modo, la secuencia de nucleótidos o aminoácidos que codifica la cadena pesada del mAb 3H8 se puede modificar para cambiar la mutación : 1 para producir la secuencia de la línea germinal en el sitio de la mutación 1. Además, la secuencia de nucleótidos o aminoácidos que codifica la cadena pesada del mAb 3H8 se puede modificar para cambiar la mutación 2 para producir la secuencia de la línea germinal en el sitio de la mutación 2. Además, la secuencia de nucleótidos o de aminoácido que codifica la cadena pesada del mAb 3H8 se puede modificar para cambiar la mutación 3 para producir la secuencia de la línea germinal en el sitio de la mutación 3. Aún así, además, la secuencia de nucleótidos o de aminoácido que codifica la cadena pes'ada del mAb 3H8 se puede modificar para cambiar en la mutación 1, la mutación 2 y la mutación 3, o cualquier otra combinación de dos o más mutaciones para producir la secuencia de la línea germinal en esos sitios en particular. Las Tablas 10-15 a continuación ilustran las posiciones de tales variaciones de la línea germinal para los mAb 6D7 , 3H8, y 1G1. Cada fila representa una combinación única de los residuos de la línea germinal y la línea no germinal en la posición indicada por letra negrita.

En otra modalidad, la invención incluye el reemplazo de cualquier complicación estructural en la secuencia que podría afectar la heterogeneidad de los anticuerpos de la invención.

Tales complicaciones incluyen los sitios de glicosilación, cisteínas sin parear, metioninas expuestas en la superficie, etc . Para reducir el riesgo de tal heterogeneidad se propone que los cambios se generen para eliminar uno o más de tales complicaciones estructurales.

En una modalidad, puede ser conveniente eliminar uno o más sitios consenso de glicosilación enlazados a I de la línea germinal de anticuerpo o de la secuencia de anticuerpo.

Una persona con conocimientos en la técnica podr¡ía ser i fácilmente capaz de identificar tal sitio de glicosilación. Normalmente, una secuencia del sitio consenso de glicosilación enlazado a N tiene la secuencia de Asn-cualquier AA-Ser o Thr donde el aminoácido del medio no puede ser una prolina (Pro) . Un ejemplo de un caso de un sitio de glicosilación es NDS en la cadena pesada de 6D7 (séc. con núm. de ident. :46 en el número de residuos 101-3) . En este ejemplo, el N en la posición 101 del sitio de glicosilación NDS se mutó a una Q- Sin embargo, el N se podría haberj mutado a cualquier aminoácido apropiado que tiene propiedades comparables de la cadena lateral. Se debería señalar ? que la modificación de la S en la posición 103 en el sitio de glicosilación NDS causó una reducción en la unión a Shh.

En otro ejemplo, las cisteínas sin parear se ; pueden remplazar solas o junto con otros cambios estructurales. Un ejemplo de una cisteína sin parear tiené lugar en la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo 6D7 en la posición 33. Esta cisteína sin parear se puede mutar con un aminoácido apropiado tal como una serina que tiene propiedades comparables de la cadena lateral. En otro ejemplo, una cisteína sin parear tiene lugar en la CDR1 de la : cadena ligera del anticuerpolGl en la posición 33. Esta cisteína sin parear se puede mutar también con un aminoácido apropiado como una serina que tiene propiedades comparables ; de la cadena lateral .

Como se describe en este documento, una secuenciaj que se optimiza es una secuencia que ha mutado en una ] o más posiciones regresando a su secuencia de la línea germinal o se puede modificar para eliminar una o más complicaciones estructurales. Una secuencia optimizada puede incluir también una secuencia que ha mutado en una o más posiciones regresando a su secuencia de la línea germinal y que se ha modificado también además para eliminar una 'o más complicaciones estructurales.

Tabla 10. Mutaciones ilustrativas de la cadena pesada; dé mAB 6D7 (sec. con núm. de ident. : 46) a la línea germinal en el número de residuo indicado. '· 30 34 46 52 58 85 103 107 ; S F N S N T s D N F N S N T s D s Y N S N T s D N Y N S N T s D S F G S N T s D N F G S N T s D S Y G S N T s D N Y G S N T s D S F N Y N T s D N F N Y N T s D S Y N Y N T s D N Y > N Y N T s D S F G Y N T s D N F G Y N T s D S Y G Y N T s D N Y G Y N T s D S F N S S T s D N F N S S T s D S Y N S S T s D N Y N s S T s D S F G s S T s D N F G s S T s D S Y G s S T s D N Y G s S T s D S F N Y S T s D N F N Y S T s D S Y N Y S T s D N Y N Y S T s D s F G Y s T s D N F G Y s T s D ; S Y G Y s T s D N Y G Y s T s D S F N s N s s D N F N s N s s D S Y N s N s s D N Y N s N s s D S F G s N s · s D N F G s N s s D S Y G s N s s D N Y G s N s s D S F N Y N s s D N F N Y N s s D S Y N Y N s s D N Y N Y N s s D S F G Y N s s D N F G Y N s s D S Y G Y N s s D N Y G Y N s s D S F N s S s s D N F N s S s s D S Y N s S s s D N Y N s S s s D S F G s S s s D N F G s S s s D s Y G S s S s N Y G S s S s D i S F N Y s S s D ! N F N Y s S s D ; S Y N Y s S s D N Y N Y s S s D S F G Y s S s D N F G Y s S s S Y G Y s S s D N Y G Y ' s S s D S F N s N T Y D : N F N s N T Y D i 1 S Y N s N T Y D N Y N s N T Y D ; S F G s N T Y D N F G s N T Y D ' 1 S Y G s N T Y D i N Y G s N T Y D 1 S F N Y N T Y D : N F N Y N T Y D ; S Y N Y N T Y D ; N Y N Y N T Y D ! S F G Y N T Y D ; N F G Y N T Y D S Y G Y N T Y D i N Y G Y N T Y D : s Y N Y N s Y D 1 N Y N Y N s Y D ; S F G Y N s Y D N F G Y N s Y D , S Y G Y N s Y D N Y G Y N s Y D S F N S S s Y D N F N S S s Y D S Y N S S s Y D N Y N s S s Y D S F G s S s Y D N F G s S s Y D S Y G s S s Y D N Y G s S s Y D S F N Y S s Y D N F N Y S s Y D S Y N Y S s Y D N Y N Y S s Y D S F G Y S s Y D N F G Y S s Y D S Y G Y S s Y D N Y G Y S s Y D S F N s N T s Y N F N s N T s Y S Y N s N T ! s Y N Y N s N T s Y s F N Y s S s Y N F N Y s S s Y S Y N Y s S s Y N Y N Y s S s Y S F G Y s S s Y N F G Y s S s Y S Y G Y s S s Y N Y G Y s S s Y S F N S N T Y Y N F N S N T Y Y S Y N S N T Y Y N Y N S N T Y Y S F G S N T Y Y N F G S N T Y Y S Y G S N T Y Y N Y G S N T Y Y S F N Y N T Y Y N F N Y N T Y Y S Y N Y N T Y Y N Y N Y N T Y Y S F G Y N T Y Y N F G Y N T Y Y S Y G Y N T Y Y N Y G Y N T Y Y S F N s S T Y Y N F N s S T Y Y I s Y N S s T Y Y N Y N S s T Y Y S F G S s T Y Y N F G S s T Y Y S Y G S s T Y Y N Y G S s T Y Y S F N Y s T Y Y N F N Y s T Y Y S Y N Y s T Y Y N Y N Y s T Y Y S F G Y s T Y Y N F G Y s \ T Y Y S Y G Y s T Y Y N Y G Y s T Y Y S F N S N S Y Y N F N S N S Y Y S Y N S N s Y Y N Y N S N s Y Y S F G S N s Y Y N F G S N s Y Y S Y G S N s Y Y N Y G S N s Y Y S F N Y N s Y Y N F N Y N s Y Y S Y N Y N s Y Y N Y N Y N s Y Y s F G Y N s Y Y ! N F G Y N s Y Y ¦ S Y G Y N s Y Y N Y G Y N s Y Y S F N S S s Y Y N F N s S s Y Y S Y N s S s Y Y N Y N s S s Y Y S F G s . s s Y Y N F G s s s Y Y S Y G s s s Y Y N Y G s s s Y Y S F N Y s s Y Y N F N Y s s Y Y S Y N Y s s ¦ Y Y N Y N Y s s Y Y S F G Y s s Y Y N F G Y s s Y Y S Y G Y s s Y Y N Y G Y s s Y Y En algunas modalidades de la invención, el agentee de unión o el anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende la sec. con núm. de ident : 46. En déterminadas modalidades, la sec. con núm. de ident: 46 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados p'or cada fila de la Tabla 10. En algunas modalidades, la sec . con núm. de ident : 46 comprende cualquiera de uno, cualquiera !de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, cualquiera de siete, cualquiera de ocho o todos los ocho residuos de la línea germinal, 'como se indica en el Tabla 10. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 46 comprende cualquiera de una ¡de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla i 10. Sin embargo, se debería señalar que la modificación de la S en la posición 103 a un residuo aminoácido Y resultó! en una reducción de la unión del anticuerpo a Shh. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se derivan de una secuencia de la línea germinal con dominios VH4-31, D4-17 y JH2 , donde uno o más residuos, mutarón para i producir el residuo correspondiente de la línea germinal en esa posición. En un ejemplo específico del dominio variable de pesada de 6D7 que ha mutado a las secuencias de la línea germinal particular incluye 6D7 VHOP (optimizado donde la secuencia de la línea no germinal N se mutó a una G en la posición 46 y una T mutó a una S en la posición 85 ) . La secuencia modificada se modifica/optimiza también además para eliminar el sitio de glicosilación NDS- la N que tiene lugar en la posición 101 se muta a una Q. Distintas 3??µ??s?33 variable optimizadas de la cadena pesada de 6D7 se muestran en la Tabla 16. Además, se debería señalar que la modificación de N30 a la línea germinal S resultó en una pérdida de potencia.

Tabla 11. Mutaciones ilustrativas de la cadena ligera de mAB 6D7 (sec. con núm. de ident.: 48) a la línea germinal en el número de residuo indicado.

?? O L G? En algunas modalidades de la invención, el agente de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende la sec . con núm. de ident : 48. En modalidades i determinadas, la sec. con núm. de ident: 48 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada i fila de la Tabla 11. En algunas modalidades, la sec. con núm.

I de ident: 48 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, cualquiera de siete, cualquiera de ocho, cualquiera de nueve o todos los nueve residuos de la línea germinal, como lo indicado en el Tabla il. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 48 comprende cualquiera de una de las combinaciones únicas de I los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicadas por cada fila de la Tabla 11. Los ejemplos específicos del dominio variable de la cadena ligera; de 6D7 que mutó a las secuencias de la línea germinal,; en particular, incluyen 6D7 VL0P2 (optimizado donde el A' mütó a una T en la posición 77) o 6D7 VL0P3 (optimizado donde la secuencia F de la línea no germinal mutó a una Y: en la posición 48 y una A mutó a una T en la posición 77) , bonio se muestra en el Tabla 11. Adicionalmente , la cadena ligera de 6D7 se puede modificar, además, para eliminar la cisteína sin i parear. Un ejemplo de una cisteína sin parear tiene lugar en la CDR1 de la cadena ligera de 6D7 del anticuerpo en la posición 33. Esta cisteína sin parear se puede mutar a un i aminoácido apropiado tal como una serina que ! tiene propiedades comparables de la cadena lateral. El VL0P2i de 6D7 y VL0P3 de 6D7 se optimizaron, además, para eliminar esta complicación estructural. j i Tabla 12. Mutaciones ilustrativas de la cadena pesada j de mAB 3H8 (sec. con núm. de ident . : 14) a la línea germinal en el número de residuo indicado. ' En algunas modalidades de la invención, el agente de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia I que comprende la sec . con núm . de ident : 14. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de idént : 14 comprende cualquiera de una de las combinaciones ¡de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 12. En lgunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 14 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, o todos los tres residuos de la línea germinal, como lo indicado en la Tabla 12. En modalidades i determinadas, la sec. con núm. de ident: 14 corhprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicadas por cada fila de la Tabla 12. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se der,iv de una secuencia de la línea germinal con los dominios VH3- 33, D3-10 y JH4 , donde uno o más residuos, mutarón para i producir el residuo correspondiente de la línea gé irminal en esa posición. Los ejemplos específicos del dominio variable de la cadena pesada de 3H8 que mutó ¡ a las secuencias de la línea germinal, en particular, incluyen 3H8VL OP (optimizado donde la secuencia N de la línea no i germinal mutó con una Y en la posición 80) se muestra en la Tabla 16.

Tabla 13. Mutaciones ilustrativas de la cadena ligera de mAB 3H8 (sec. con núm. de ident.:16) a la linea germinal en el i número de residuo indicado. : ? En algunas modalidades de la invención, el agente de ¡ unión o I anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende1 la sec. con núm. de ident: 16. En modalidades determinadas, la sec. pon núm. de ident : 16 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 13. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 16 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco o todos los cinco residuos de la línea germinal, como lo indicado en la Tabla 13. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 16 comprende cualquiera de una de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 13. Los ejemplos específicos de dominio variable de la cadena ligera de 3H8 que mutó a las secuencias de la línea germinal, en particular, incluyen 3H8 VLOP (optimizado donde la secuencia [ F de la línea no germinal mutó con una Y en la posición 49) se muestra en la i Tabla 16. I i Tabla 14. Mutaciones ilustrativas de la cadena pesada del mAB 1G1 (sec. con núm. de ident.: 22) a la línea germinal en el número de residuo indicado ; En algunas modalidades de la invención, el agente de j unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende; la sec. con núm. de ident: 22. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de ident: 22 comprende cualquiera de una de las combinaciones^ de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 13. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 22 comprende cualquiera de uno, cualquiera de dos, cualquiera de tres, o todos los tres residuos de la línea germinal, como lo jindicado en la Tabla 14. En modalidades determinadas, la sec. con núm. d Ie i 'dent: I 22 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila de la Tabla 14. En otras modalidades, el agente de unión o anticuerpo identificado se deriva de una secuencia de la línea germinal j con los dominios VH3-21, D4-17 y JH6, donde uno o más residuos, mutaron para í producir el residuo correspondiente de la línea germinal ¡ en esa posición. Se debería señalar que una modificación de complicación estructural de la secuencia de RGD, cuando G muta con un A resulta en la eliminación de la actividad. ! Tabla 15. Mutaciones ilustrativas de la cadena ligera de mAB 1G1 (sec. con núm. de ident.: 24) a la línea germinal en el número de¡ residuo indicado. ¦ D D I I N P L G D I I N P L D Y A I N P L G Y A I N P L D D A I N P L G D A I N P L D Y I s N P L G Y I s N P L D D I s N P L G D I s N P L D Y A s N P L G Y A s N P L D D A s N P L G D A s N P L D Y I I S P L G Y I I S P L D D I I S P L G D I I ? P L D Y A I S P L G Y A I S P L D D A I S P L G D A I S P L D Y I s S P L G Y I s S P L D D I s S P L G D I s S P L D Y A S s P L G Y A S s P L D D A S s P L G D A S s P L D Y I I N A L G Y I I N A L D D I I N A L G D I I N A L D Y A I N A L G Y A I N A L D D A I N A L G D A I N A L D Y I s N A L G Y I s N A L D D I s N A L G D I s N A L D Y A s N A L G Y A s N A L D D A s N A L G D · A s N A L D Y I I S A L G Y I I S A L D D I I S A L G D I I S A L D Y A I S A L G Y A I S A L D D A I s A L G D A I s A L D Y I s s A L G Y I s s A L D D I s s A L G D I s s A L D Y A s s A L G Y A s s A L D D A s s A L G D A s s A L D Y I I N P V G Y I I N P V D D I I N P V G D I I N P V D Y A I N P V G Y A I N P V D D A I N P V G D A I N P V D Y I s N P V G Y I s N P V D D I s N P V G D I s N P V D Y A s N P V G Y A s N P V D D A s N P V G D A s N P V I D Y I I s P V G Y I I s P V D D I I s P V G D I I s P V D Y A I s P V G Y A I s P V D D A I s P V G D A I s P V D Y I s s P V G Y I s s P V D D I s s P V G D I s s P V D Y A s s P V G Y A s s P V D D A s s P V G D A s s P V D Y I I N A V G Y I I N A V D D I I N A V G D I I N A V D Y A I N A V G Y A I N A V D D A I N A V G D A I N A V D Y I s N A V G Y I s N A V D D I S N A V G D I S N A V D Y A S N A V G Y A S N A V D D A S N A V G D A S N A V D Y I I S A V G Y I I S A V D D I I S A V G D I I S A V D Y A I S A V G Y A I S A V D D A I S A V G D A I S A V D Y I s S A V G Y I s S A V D D I s S A V G D I s S A V D Y A s S A V G Y A s S A V D D A s S A V G D A s s A V En algunas modalidades de la invención, el lagente I de unión o anticuerpo identificado comprende una secuencia que comprende la sec . con núm . de ¡idént : 24. En modalidades determinadas, la sec. con n;úm . de ident : 24 comprende cualquiera de una de las combinaciones de los residuos de la línea germinal y de la línea no germinal indicados por cada fila' de la Tabla 15. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident: 24 comprende cualquiera de uno, cualqui!era de dos, cualquiera de tres, cualquiera de cuatro, cualquiera de cinco, cualquiera de seis, cualquiera de siete, o todos los siete residuos de la ¡ línea germinal, como lo indicado en la Tabla l!5. En modalidades determinadas, la sec. con núm. de jident : 24 comprende cualquiera de una de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y! de la línea no germinal indicados por cada fila de la: Tabla i 15. i ¡ ? TABLA 16 La persona con conocimiento estará consciente ¡de que existen métodos alternativos para definir los límites; de las CDR. El residuo de partida de CDR1 de VH en la Tabla 1 se definió de acuerdo con el método según lo descrito en Scaviner D, Barbie V, Ruiz M., Lefranc MP. Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy, Kappa and Lambda Variable and Joining Regions. Exp Clin Immunogenet 1999, 16:246-240. Los límites restantes de las CDR en la Tabla 9 se definen de acuerdo a la definición Kabat . ¡ i Todos los limites de las CDR en la Tabla 9 se definen de acuerdo con la definición Kabat. i EJEMPLO 9 ' DETERMINACIÓN DE LA POTENCIA FUNCIONAL POR LOS ANTICUERPOS SHH j La potencia de los anticuerpos purificados Shh se determinó en unos ensayos de diferenciación osteoblástica en los que Shh induce osteogénesis de las células CBHIOTI^.

Las células C3H10T1/2 se sembraron en placas de fondo claro de 384 pocilios (catálogo # 4336, Matrix) ja 5000 células/pocilio en los medios de siembra (MEM, 10% de SFB, 1% de L-glutamina) y se incubaron durante toda la noche a¡ 37 °C, j 5% de C02. Los anticuerpos se diluyeron en series cre ientes de la media logarítmica en el medio de ensayo y se combinaron con un volumen igual de 10% (vol/vol) medio condicionado (CM) que contiene Shh. Los anticuerpos titulados se preiricubaron con Shh durante 45 minutos en una placa de dilución de polipropileno a 37°C, 5% de C02. La concentración final de anticuerpos estaba en el intervalo de 50 µ9/p?1 a 20 ng/ml . El CM que contiene Shh se usó a una concentración final de 5% i (vol/vol) . La concentración del dominio N-terminal de i señalización de Shh en 5% de CM se determinó está i aproximadamente en 10 nM. La etapa de preincubadión se completó después, el medio de siembra se eliminó de todos los pozos y se reemplazó con 30 µ? de medio que contiene una mezcla de Shh y anticuerpo. Las células se incubaron durante 72 horas a 37°C, 5% de C02. i i i La diferenciación osteoblastica se evaluó por la producción de fosfatasa alcalina. Las células se lavaron dos veces con PBS helado y, posteriormente se lisarbn con 15µ1/????11? de tampón de extracción y lisis RIPA (catalogo # 89900, Pierce) . Las placas se congelaron a -80°C durante 20 i min y se descongelaron en la parte superior del banco. La solución sustrato (1 mg/ml de p-nitrofenil fosfato, catálogo # N2765, Sigma-Aldrich) , 1M de dietanolamina (catalogo # D8885, Sigma-Aldrich), 0.5 mM de MgCl2, pH 9.8, preparado fresco) se adicionó a cada pocilio (45µ1/????11?) . Las! placas se incubaron durante al menos 90 min a 37°C y la absoirbancia se midió a 405 nm. El análisis de los datos se realizó con GraphPad Prism. Los valores de IC50 se calcularon de las curvas de dosis-respuesta y se reportan en la Tabla 17 Tabla 17. Inhibición de diferenciación osteoblástica por el anticuerpo purificado.

Ensayo para medir la capacidad de los anticuerpos purificados para inhibir la inducción de ARNm de Glil y Ptcl jen las células C3H10T1 / 2 tratadas con Shh Las células C3H10T1/2 se sembraron en placas j de 96 i pocilios (200 µ?/pocillo) a 10,000 células/pocilio en medio de siembra (MEM, 0.5% de FBS, 1% de L-Glut) y se incubaron durante toda la noche a 37°C, 5% de C02. Los anticuerpos se diluyeron en serie y se preincubaron según lo descrito anteriormente en el Ejemplo 9. Después que la preinc'ubación se completó, el medio de siembra se eliminó de todos los pozos y se reemplazó con 100 µ? de medio conteniendo una 5 ¡ mezcla de Shh y anticuerpo. Las células se incubaron durante 72 horas a 37°C, 5% de C02.

El ARN se preparó para el RT-PCR cuantitativo (qRT-PCR) usando el kit de células para cT (catálogo # AM1728, ABI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resurgen,, las 0 ! células se lavaron con PBS frío. La solución de lisis se preparó por la adición de DNasa I, y 50 µ? de solución de lisis se adicionaron por pocilio y se incubaron durant;e 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se adicionaron; 5µ1 de la solución de parada a cada pocilio y se incubó durante 2 5 ; min a temperatura ambiente . Las placas se almacenaron a - 80°C. El ADNc se preparó con ??µ? de lisado celular,' 25 µ? de tampón 2X de transcriptasa inversa (RT) , y 2.5µ1; de la I mezcla de enzima RT 20X en un volumen final de 40µ1 por Q muestra. La reacción RT se llevó a cabo a 37 °C durante 60 minutos y terminó por la incubación de la reacció : a 95°C durante 5 minutos. Las muestras se almacenaron a-80°C durante toda la noche. j Las reacciones de PCR cuantitativa se realizaron para i ^ medir la cantidad de Glil y Ptcl de ratón respecto a¡ HPRT1. i I Los siguientes conjuntos de cebadores/sondas ABI Ta Man se usaron: Glil de ratón, Mm00 94654_ml ; Ptcl de j ratón, Mm00436026_ml ; y HPRT1 de ratón, Mm00446968_ml . La rjeacción i de ciclos térmicos se preparó por la combinación de ??µ? de i la mezcla maestra de PCR Universal 2X, 1 µ? de la mezcla sonda/cebador 20X, y 5µ1 de la plantilla de ADNcj en un volumen final de 20 µ? . Las muestras se calentaron a 50 °C i durante 2 minutos, seguido por el calentamiento a! 95 °C í durante 10 minutos. Los ciclos se llevaron a cabo ¡a 95°C I durante 15 segundos y a 60 °C durante 1 minuto ¡durante I cuarenta ciclos en el sistema rápido de PCR a tiempo real ABI 7900HT. La cantidad de AR de ratón Glil y Ptcl ein cada muestra se determinó mediante el cálculo del valor delta del Ct delta para cada muestra usando el HPRT1 de ratón como estándar interno (ver la Tabla 18) . j Tabla 18. Inhibición de células Glil endógenas y Ptclj AR min C3H10T1/2 por el anticuerpo purificado. ; EJEMPLO 10 j UNIÓN DE LOS ANTICUERPOS SHH PURIFICADOS A LA ? SHH HUMANO ¡ La unión de los anticuerpos purificados a la Shh humano recombinante se determinó mediante un método basado en ELISA. El dominio N-terminál de señalización de Shh, Shh-N, se presentó en dos formas: como una proteína purificada aislajda de bacteria que carece de modificaciones de lípidos y como un componente de medio condicionado en unai forma que contiene la modificación palmitoil dél N-terminal, pero carece de la región colesterol del C-terminal .

Las placas (placas de ELISA de pol i e s t i reno! marco oscuro, de afinidad alta para la unión de prbteína pocilio blanco B & W IsoPlate, catálogo #60¡05580, ¡ PerkinElmer) se recubrieron con 1.5 i µg/ml ( 10 ?µ? /poc i 1 lo ) de Shh humano recombinante (peptido recombinante de amino terminal de sonic heclgehog humano C24II, catálogo # 1845 - SH - 025 /CF , R&D Systems) ! en PBS o con 100 µ?/pocillo de 3% (vol/voil) de medios acondicionados Shh (CM) diluido en PBS. Las placas se sellaron y se colocaron en un agitador durante toda la noche a 5°C. Al día siguiente, las : placas se lavaron 4 veces con PBS con 0.05% de! Tween 20 (PBS-T) . Las placas se bloquearon con 1% de BSA esencialmente libre de globulina ( S igma - ldri ch I catálogo # 3156) diluido en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron ¡cuatro veces con PBS-T. Las titulaciones de los anticuerpos purificados (diluciones en serie de la | media logarítmica al menos por encima de 6 logaritmos con una concentración inicial de 30µg/ml) se prep'aráron en ???µ? de PBS-T y se adicionaron en los pozos y se incubaron con agitación durante toda la noche 'a 4°C . Los controles del anticuerpo incluyen IgG2 e IgG4 humanas ( S igma -Aldrich , catálogo # 15404 y # ÍI4639, respectivamente) . Las placas se lavaron cuatro; veces con PBS-T. Una alícuota de ???µ? anti-IgG H+L humana en carnero (KPL catálogo #074-1006) diluido en 1:50,000 en PBS-T se adicionó a cada pocilio ¡y ] las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora con agitación. A continuación del lavaelo con PBS-T, el sustrato quimioluminiscente perojxidasa (Sigma catálogo # CPS-2-60) se adicionó a temperatura i ambiente y se incubó durante diez minutos con la í placa cubierta con papel de aluminio. Cada pocilio se leyó durante 100 milisegundo en el Spectromax 5e para determinar RLU. La afinidad de unión aparente (KD) de cada anticuerpo se determinó mediante el programa GraphPad Prism y se muestran en la Tabla 19. Tabla 19: Afinidad de unión aparente de los anticuerpos purificados para inmovilizar Shh en un ELISA. ¡ EJEMPLO 11 \ DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE UNIÓN DE LOS ANTICUERPOS PURIFICADOS POR EL DOMINIO N-TERMINAL DE LA SEÑALIZACIÓN DE SHH j ; La afinidad de unión de los cuatro anticuerpos recombinantes purificados expresada en un entorno del dominio constante de la IgG2 humana se midió por Biacore de alta resolución. Todos los experimentos se realizaron usando un instrumento Biacore T100 a 23°C. Cada anticuerpo recombinante IgG2 (6D7, 3H8, 1G1 y 1H8) se diluyó en 10 mM de acetato de i I sodio H 4.0 (GE Healthcare, BR-1003-49) a una concentración de 2(^g/ml. Todos los mAbs se acoplaron de forma covalente con un chip biosensor CM5 mediante la química de rutina de acoplamiento de la amina. Los niveles de inmovilización para cada anticuerpo abarcaron de 177 a 838 RU. El tampón de corrida HBS-P (GE Healthcare, BR-1003-68, 0.01 M de | HEPES , 0.15 M de NaCl, 0.005% de P-20) se preparó por desgasificación seguido por la adición de BSA a partir de un concentrado filtrado con una concentración final ¡de 100 i g/ml. Para los experimentos con medios acondicionados que contienen Shh (CM) , una alícuota de 1.5 mi se centrifugó durante 10 minutos a 13,200 rpm. Todas las muestras de medios acondicionados con Shh y Shh C24II humano recombinante (R&D Systems, Catálogo # 1845-SH/CF, Lote # MJC09) se diluyeron en la corrida con el tampón de corrida HBS-P. Las muestras Shh se inyectaron al azar, por triplicado con varios ciclos de inyección de tampón intercalados para la referencia; doble. i Todos los datos sensorgrama se procesaron mediante el Scrubber y se ajustaron para un modelo de interacción 1:1 (que incluyen un término km para el transporte de masa) mediante el CLAMP. Un factor del índice de refraccbión de masa fue necesario para ajustar los sensorgramas j dé la concentración superior de los medios acondicionados para el mAb 1H8 debido a la diferencia significativa del índice de refracción de masa entre los medios acondicionados y el tampón de corrida. Las constantes de unión resultantes se listan en la Tabla 20. j Los asteriscos en la Tabla 20 indican que la cinética no es completamente confiable ya que las reacciones para estos mAbs son limitadas en extremo por el transporte de masa debido a la difusión casi controlada en asociación <on las I velocidades/asociación con las velocidades casi controladas i por la difusión. Sin embargo, las constantes de disociación de equilibrio que resultan (KD=kd*km/ka* km) son confiables ya i que cualquiera de los efectos de transporte de masa, km, sobre las cinéticas medidas se anulan cuando el cociente se toma para calcular un KD confiable. Además, la unión! de Shh (ambas formas peptídicas en CM y C24II) para mAb 6D7Í mostró cierta complejidad en los sensorgramas , y por lo tanto la KD determinada se debería considerar solo una estimación. j I Tabla 20. Afinidades de unión para los anticuerpos purificados a Shh determinadas con Biacore dé alta resolución. ! MAb SHH Rmáx ka (M-ls-1) kd (s-1) KD (pM) 1G1 CM 75 9.00 X 107 2.85 X 10"2 317¡ 1 * * 1G1 péptido 53 1.73 X 107 6.53 X 10"3 377 C24II * * EJEMPLO 12 I DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE UNIÓN DE ANTICUERPOS ' PURIFICADOS PARA LA SHH COMPLETA EXPRESADA EN LA SUPERFICIE CELULAR í La afinidad de la unión de los anticuerpos puri icados para la Shh completa expresada de forma ectópica! en la i superficie de una mezcla de células estables HEK :293 se i determinó mediante la citometría de flujo. Las células; HEK 293-Shh-FL se mezclaron con distintas diluciones de anticuerpo derivado de hibridoma en PBS tal que la concentración final de anticuerpo abarcó de 20 nM a 80; pM. El anticuerpo se mezcló con las células en aproximadamente 74,000 células/pocilio en un volumen final de 300µ1 | en una placa de microtitulacion de polipropileno. La placa sej incubó con agitación durante 5 horas a 4°C. Después de lavar con PBS helado, 225 µ? de 99 nM del anticuerpo policlonal 0C-humano Cy5 en carnero (Laboratorios Jackson ImmunoResearch, catálogo # 109-175-008) se adicionaron a las células : unidas I con 3H8 y 6D7. Las placas se agitaron durante 20 minutos a 4°C. La fluorescencia media de 10,000 eventos se registró para cada muestra mediante el instrumento de citometría de flujo FACS Canto II HTS . Un gráfico de la fluorescencia media como una función de la concentración de anticuerpo se; ajustó de manera no lineal con el programa Scientist 3.0 para estimar la KD. Los resultados son mostrados a continuación en la Tabla 21. j ( Tabla 21. Afinidad de unión/Avidez de anticuerpos purificados por el Shh establemente expresado ¡en la superficie de células HE 293. ; La afinidad de unión de anticuerpos recombinantes purificados construida con una región constante de IgG2 humano se determinó para el Shh completo expresado en la superficie de un clon estable de CAOV3 de células de cáncer de ovario mediante la citometría de flujo de acuerdo con el método descrito anteriormente. Las células se mezclaron con distintas diluciones de anticuerpos en un volumen final de 300 µ? de PBS y se incubaron a una concentración de 84,000 células/pocilio. La placa se inóubó con agitación durante 5 horas a 4°C. Después de lavar con PBS i helado, las células unidas con el anticuerpo humano anti-Shh se tiñéroh con anticuerpos secundarios a humanos Cy5 en carnero según lo descrito i anteriormente. Un gráfico de la fluorescencia media cómo una i función de la concentración de anticuerpo se ajustó de manera no lineal con el programa Scientist 3.0 para estimar la ]¾. Los resultados se presentan en el Tabla 22. ¡ Tabla 22. Afinidad de unión/avidez de anticuerpos purificados pór el Shh establemente sobreexpresado en la superficie de células CA0V31.

EJEMPLO 13 DILUCIDACION DE LOS SITIOS DEL EPITOPO DE LOS ANTICUERPOS SHH PURIFICADOS MEDIANTE ENSAYOS DE UNIÓN COMPETITIVA La unión de los anticuerpos purificados biotinilados al Shh-N humano recombinante se determinó en la presencia de cantidades excesivas de anticuerpo competidor sin ; marcar mediante un método basado en ELISA (en esencia según lo i descrito en el Ejemplo 10) . i Los anticuerpos 6D7 y 3H8 se biotinilaron con [el kit I Pierce EZ- Link NHS PEG4-biotina (Catálogo # 21329) ; de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, a una alícuota de 500 g de cada anticuerpo se le intercambió i el tampón a tampón fosfato salino BupH (Pierce catálogo # i 28372) mediante una columna Zeba Desalt Spin. El agua ultrapura (170 µ?) se usó para disolver 2 mg de NHS PEG4-Biotina para la preparación de una solución concentrada de 20 mM. La cantidad apropiada de IgG y biotina para marcar los anticuerpos con de 3 a 5 moléculas de biotina por molécula de IgG se calculó basado en la recomendación del fabricante. La IgG y la biotina se mezclaron y se incubaron en hielo (durante 2 horas, y la NHS PEG4 -biotina sin reaccionar se eliminó con I una columna de Zeba Desalt. La eficiencia del marcádor se i determinó por la medición del cambio en la absorbancia a 500 nm de la solución de HABA/Avidina a continuación ¡ de la adición de la IgG biotinilada y se calculó de acuerdo ¡con las instrucciones del fabricante. ; Las placas (placas de ELISA de poliestireno; marco i oscuro, de afinidad alta para la unión de proteína pocilio blanco B & W IsoPlate, catálogo #6005580, PerkinElmer) se j recubrieron con 100 µ?/pocillo de 3% (vol/vol) de : medios acondicionados Shh (CM) diluido en PBS por la incubación durante toda la noche a 5°C con agitación. Al día siguiente, las placas se lavaron cuatro veces con PBS-T se bloquearon después con 1% de BSA en PBS-T durante 5 horas a 5°C. ! Las diluciones diez veces de cada anticuerpo biotjinilado se prepararon en un intervalo de concentración logarítmica seis (entre 3 g/ml y 1 pg/ml) y la unión de cada dilución del anticuerpo biotinilado se midió en un ELISA de unión a Shh en la ausencia o presencia de exceso de anticuerpo competidor sin marcar. Cada anticuerpo competidor sin! marcar se incluyo a distintas concentraciones por encima de la KD medida para este anticuerpo competidor. Las concentraciones de KD+1, KD+2, KD+4 , KD+8, y KD+16 de cada anticuerpo competidor se mezclaron con las diluciones distintas de cada anticuerpo biotinilado. Las diluciones de anticuerpo i biotinilado con o sin anticuerpo competidor sin marcar se adicionaron en un volumen final de 100 µ? de PBS-T después de lavar y bloquear las placas con PBS-T y se incubaron con agitación durante toda la noche a 5°C. Al día siguiente, las placas se lavaron cuatro veces con 200 µ? de PBS-T. La estreptavidina-HRP (Sistema R&D Catálogo # DY998 lotl¡157772) se diluyó a 1:400 en PBS-T y se adicionó 100 µ? |a cada pocilio seguido por la incubación a temperatura ambiente durante dos horas con agitación. Después de lavar con PBS-T, el sustrato quimioluminiscente peroxidasá (Sigma CPS-2Í-60) se adicionó (100 µ?/pocillo) y se incubó a temperatura ambiente I durante diez minutos con la placa cubierta con pa'peí de í aluminio. Cada pocilio se leyó durante 100 milisegundo en el Spectromax 5e para determinar RLU. ¡ i La competencia se demostró por el desplazamiento de la i I curva de unión para cada anticuerpo marcado a la derecha a lo i largo del eje x (concentración de anticuerpo biotinilado) , que resulta en un aumento de la KD aparente para el anticuerpo marcado. Los anticuerpos que mostraron competencia cruzada se definieron según ocuparon el sitio común del epítopo. j El 6D7- sin marcar compitió con éxito en la unión del 6D7 biotinilado, según lo , esperado. Las concentraciones i crecientes del exceso de 3H8 desplazó progresivamente a la derecha la curva de unión de 3H8 biotinilado, lo que resulta \ I en un aumento de cinco veces en la KD aparente para j el, 6D7 i marcado a la más alta concentración de 3H8 sin marcar L Ni el 1G1 ni tampoco el 1H8 tuvieron algún efecto sobre la unión de 6D7. La unión de 3H8 marcado compitió por el exceso 3H8 sin marcar. El exceso de 6D7 sin marcar compitió de ! manera efectiva en la unión de 3H8 biotinilado, lo que resulta en un aumento de nueve veces en la KD aparente a la más alta concentración de 6D7 sin marcar. Ni 1G1 ni el 1H8 compitieron con 3H8 marcado por la unión de Shh inmovilizada. Estos resultados indican que 6D7 y 3H8 comparten un epítopó común superpuesto que no está compartido por ya sea 1G1 o 1H8.

EJEMPLO 14 I REACTIVIDAD CRUZADA DE LOS ANTICUERPOS SHH PURIFICADOS PARA LOS IHH Y DHH HUMANO Y SHH/IHH DE RATÓN La reactividad cruzada de los anticuerpos purificados se probó contra los miembros de la familia de hedgehog ! humano Ihh y Dhh y contra los ortólogos de ratón, de Shh, Ihhj y Dhh. Las Ihh humanas y de ratón comparten el 100% de identidad de la secuencia en el dominio N-terminal de la señalización, de éste modo, sólo una proteína se usó para evaluar la unión del anticuerpo. ¡ Los experimentos de reactividad cruzada se llevaron a cabo y se midieron mediante un ensayo basado en ELISA, (según lo descrito en el E emplo 10) . En resumen, las placas se recubrieron con ???µ? de una solución de PBS conteniendo 1-2 g/ml de Ihh humana recombinante (recombinante de hedgehog indio humano/ratón C28II, péptido amino terminal, catalogo # 1705-HH/CF, R&D Systems) , Dhh humano (recombinante de hedgehog del desierto humano C23II, péptido amino terminal, catálogo # 4777-HH, Sistemas R & ) o el Shh dé ratón (recombinante de sonic hedgehog de ratón C25II, N-terminal , catálogo # 464-SH/CF, R&D Systems) y se incubaron con agitación durante toda la noche a 4°C. Después de lavar con PBS-T y bloquear con 1% de BSA, las titulaciones de anticuerpos que abarcan las concentraciones de 30 µg ml a 1 el Shh inmovilizado de ratón y para los miembros | dé la familia de hedgehog humano en un formato basado en ELISA La reactividad cruzada de los anticuerpos purificados de secuencia optimizada anticuerpos 6D70P y 3H80P para Shh e Ihh de ratón se corroboró, además, mediante Biacore de alta resolución. La unión de las formas optimizadas de 6D70P y 3H80P para Shh humano se confirmó en estos experimentos. La proteína G se acopló a la superficie del chip CM 5 mediante la química estándar del enlace amino. La proteína; G' se despejó de Tris usando una columna PD-10 equilibrada con PBS de Dulbecco. La fracción principal 2.75-3.94 mi (~ 0.78 mg/ml) se colectó y una alícuota se diluyó a 2C^g/ml en 10 mM de tampón acetato pH 3.65. Aproximadamente la 500 RU de proteína G se enlazaron de forma covalente a la superfjicie de la cámara de flujo 2 (Fc2) . Al comienzo de cada ciclo, la IgG relevante (6D70P o 3H80P) , diluida en tampón HBS-P a 0.5 µ9/p?1 se circuló por encima de la superficie de la proteína G a 5 µ?/min durante 50 segundos, seguido por un periodo de 60 segundos de estabilización. Los niveles de inmovilización se ¡ reprodujeron entre ciclos. Los niveles de inmovilización de I IgG se mantuvieron bajos para evitar los efectos : del transporte de masa en la determinación de la afinidad !(100 RU para 6D7 y 135 RU para 3H8) . Para minimizar cualquiera! de los efectos potenciales del transporte de masa, el anaíito se inyectó a una velocidad alta de flujo de 50 µ?/min durante 300 segundos, y la disociación se supervisó durante 1200 segundos, después que la superficie se regeneró con dos, pulsos de 40 segundos de glicina de pH 1.75 a una velocidad dé flujo de 30 µ?/min. Todos los sensorgramas se ajustaron ¡ en el programa de evaluación T-100 mediante el modelo de Liangmuir 1:1, con las posiciones RI = 0, kon global, koff global y la Rmáx global (los datos se referenciaron dobles; de ahí que no hubo cambio en el índice de refracción de masa RI) . [ La afinidad de la unión de los anticuerpos purificados i para la Shh humano (Tabla 24) fue casi idéntica j a las i observaciones anteriores con 6D7 y 3H8 antes ¡de la optimización de la secuencia (en comparación con la Tabla 20) . Además, la afinidad de la unión de cada secuencia optimizada del anticuerpo para Shh de ratón fue casi la misma que la observada para Shh humano, lo que se esperaba en base a la diferencia del único aminoácido entre las dos proteínas ¡ en el dominio N-terminal de la señalización.

Tabla 24. Afinidades de unión por los anticuerpos purificados optimizados de secuencia al Shh de ratón y humano e IHH determinado con Biacore de alta resolución.

Shh humano mAb k D Chí2 (cantidad de Ab inmob) (1/Ms) (1/s) (pM) (RU2) . 3H80P IgGl 5.4 x 106 0.00014 26.1 0.1 (135 RU) 6D70P IgGl 8.4 x 107* 0.00025* 3.0 0.09 (100 RU) M^s"1) . Esas interacciones rápidas están completamente limitadas al transporte de masa, es decir, la difusión del analito a la superficie sensora se vuelve la etapa limitante i de la tasa en la formación de complejo. ] ! indica que se obtuvieron valores absurdos para las constantes velocidad, en el orden de 1011 para la constante de asociación, y > ls-1 para la constante de disociación EJEMPLO 15 i NEUTRALIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD IHH POR LOS ANTICUERPOS SHH I PURIFICADOS ! Este ensayo se realizó para medir la capacidad del anticuerpo purificado para inhibir la diferenciación i de los i osteoblastos de las células C3H10T1/2 inducidas por h'edgehog de la India.

El anticuerpo purificado 6D70P se mostró unirse al i hedgehog de la India humano y de ratón (Ihh) , tanto ¡ en los formatos ELISA como Biacore. La actividad de neutralización de este anticuerpo se evaluó en el ensayo de diferenciación de los osteoblastos. j El ensayo de diferenciación de los osteoblastos se realizó en I esencia según lo descrito anteriormente en el Ejemplo 9 con unas pocas modificaciones. Las células C3H10T1/2 se sembraron en placas de fondo claro de 384 a 5000 células/pocilio en medios de siembra y se incubaron durante toda la noche a 37°C, 5% de G02- Los anticuerpos se diluyeron en series crecientes de la media logarítmica o de dos veces en el medio de ensayo y se combinaron con un volumen I igual de una forma modificada del dominio N-terminal de señalización de Ihh en el que la cisteína en la posición 28 se reemplaza ! con dos residuos de isoleucina (IHH-N C28II, R&D Systems, catálogo #1705-HH) . La concentración final de Ihh-N C28II usada en el ensayo fue de 2 |Lig/ml. Los anticuerpos titulados se preincubaron con Ihh-N C28II durante 45 minutos en una placa de dilución de polipropileno^ a 37°C, 5% de C02. La concentración final de los anticuerpos abarcó de 25 |ig/ml a 30 ng/ml. Después de que la etapa de preincubáción se completó, los medios de siembra se removieron de todos los pocilios y se reemplazaron con 30µ1 de medio que contiene una mezcla de Ihh y anticuerpo. Las células se incubaron durante 72 horas a 37°C, 5% de C02.

La diferenciación osteoblástica se evaluó por la producción de fosfatasa alcalina según lo descrito anteriormente. El análisis de los datos se realizó con GraphPad Prism y los valores de IC50 se reportan en la Tabla 25. El 6D70P inhibe la diferenciación osteoblástica inducida por Ihh, lo que indica que la unión del ligando por el anticuerpo resulta en la neutralización, de la actividad biológica, mientras que 3H80P, que no se une a Ihh, ¡ no tuvo efecto sobre su actividad. ' i Tabla 25. 6D70P pero no 3H80P neutraliza la actividad de Ihhi en el ensayo de osteogénesis de la célula C3H10T1/2. ' EJEMPLO 16 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD IN VIVO DE LOS ANTICUERPOS PURIFICADOS: EVALUACIÓN DE LA MODULACIÓN FARMACODINAMICA DE GLIl Y PTCl DE RATÓN EN EL ESTROMA DE TUMORES DE XENOINJERTO COLO205 Las células humanas de adenocarcinoma colorectal Colo205 se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en RP I 1640,; 10% de SFB y el 1% de L-glutamina. Los tumores de xenoinjérto se establecieron en ratones desnudos hembras a continuación de la implantación subcutánea de 4 x 106 células/ratón' en el lado derecho. Los tumores crecieron hasta aproximadamente 200 mm3 en cada punto los ratones recibieron una dosis única intraperitoneal de vehículo o de anticuerpo a l, 3, ó 10 mg/kg. Los ratones se sacrificaron tres días posterioras a la dosis y se extirparon los tumores. Los tumores colectados se cortaron y de inmediato se conservaron en 5 mi de RNALater a 4°C durante toda la noche. Posteriormente, los tumores conservados se almacenaron a -20°C hasta que tuvo lugar el aislamiento de ARN. | El ARN se extrajo de los tumores usando los kit! RNeasy I (catálogo # 74104, Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un pedazo del tumor se homogeneizó usando el i instrumento homogeneizador Fast Prep 24 seleccionado; a 6.0 durante 40 segundos. El desecho celular se sedimentó por centrifugación a 4000 RCF durante 5 minutos a temperatura ambiente. Un volumen igual de 70% de etanol se adicionó al i sobrenadante y la mezcla se adicionó a la columna RNeasy. La columna se equilibró con 4 mi del tampón RW1 y dos veces con 2 mi tampón RPE . El ARN se eluyó con 270 µ? de agua labre de RNasa y se almacenó a -80°C. La cantidad de ARN y la calidad se evaluaron mediante el kit Agilent RNA 6000 Nano (Catálogo. # 5067-1511) .

Los niveles de Glil y Ptcl de ratón en los tumores se determinaron con respecto al HPRT1 de ratón mediante ! el RT- i PCR cuantitativo. El ADNc se sintetizó de 2x,q de AR ^ usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (catálogo # 4368814, ABI) . Las reacciones se incubaron; a 25°C durante 15 minutos, a 37°C durante 2 horas, a 85°C durante 5 minutos, antes del almacenamiento a 4°¡C.:¡ Las muestras de ADNc se diluyeron con un volumen de. 200µ1 con agua libre de RNasa . Las mezclas de reacción para qRT-PCR contenían 5µ1 de ADNc de cada muestra,. µ? de cada conjunto cebador/sonda y 10 µ? de tampón TaqMan 2 X (ABI catálogo # 4369514) y un volumen final de ¡20 µ? .

I Los conjuntos cebador/sonda ABI incluyeron el gen de control murino HPRT (MmO 0446968_ml ) , Glil ¡murino (Mm00494654 mi), y Ptcl murino (Mm00436026 mi)1. Las i i ¦ ; muestras se calentaron a 50 °C durante 2 minutos, seguido por el calentamiento a 95 °C durante 10 minutos.

Los ciclos se llevaron a cabo a 95°C durante 15 segundos y a 60 °C durante 1 minuto durante cuarenta ciclos' en el Sistema Rápido de PCR a tiempo Real ABI 7900HT. La cantidad de ARN de Glil y Ptcl de ratón en cada muestra se determinó por el cálculo del valor delta del jet , del delta para cada muestra utilizando HPRT1 como el estándar interno. : Una reducción significativa en los niveles de ¡Glil y Ptcl de ratón se observó (Figura 1) , aun en la dosis más baja probada (1 mg/kg) , que presenta la actividad 1 robusta neutralizante de cada anticuerpo. Cada anticuerpo redujo de forma consistente los niveles de mGlil en mayor medida que mPtcl .

EJEMPLO 17 DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN FARMACOCINÉTICA-FARMACODÍNÁMICA DE LOS ANTICUERPOS PURIFICADOS MEDIANTE EL MODELO ¡DE XENOINJERTO COLO205 i Los tumores de Colo205 se establecieron en el costado de i ratones desnudos hembras según lo descrito en el Ejemplo 14. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3 en tamaño, los ratones recibieron una dosis única IP de 6D7 , 3H8, o 1G1 ya sea de 0.5 o 1.0 mg/kg. Los grupos dé cinco ratones se sacrificaron en distintas tiempos despuési de la dosis (0.5, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, horas y 7 y 14 días). El suero se colectó por punción cardiaca y 500 a 800 ¡ mi de i I sangre se transfirió a tubos separadores de suero Micrptainer i (catálogo BD # 365956) . Las muestras de sangre se dejaron coagular durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron después a 13000 rpm durante 10 minutos. La cantidad total del suero se colectó en tubos Eppendorf : de 1.7 mi y se almacenaron a -80°C hasta su procesamiento adicional i para determinar la concentración del anticuerpo de ¡ prueba i inyectado. El tejido del tumor se extirpó de los an males sacrificados y se conservó en R Alater según lo descrito anteriormente hasta tuvo lugar el aislamiento de ARN. ! Las concentraciones de suero de anticuerpo humano se determinaron usando un protocolo de ELISA competente qiae mide la IgG humana total que emplea una captura con HC+LC antihumano y la detección con HC+LC anti-humano. Las placas de ELISA se recubrieron con 0.5 g/ml de IgG anti-humaná en carnero (Fe específica) durante toda la noche de 2-8°C, se lavaron con PBS, 0.05% de Tween 20 y se bloquearon durante 1- I 2 horas a temperatura ambiente con tampón Blojqueo-I- (Tropix) . El Mab estándar de referencia, el contlrol de í I calidad (QC) y las diluciones de la muestra de prueba se j prepararon en 10% de suero (matriz de ensayo) j y se I adicionaron a las placas bloqueadas durante 2 h'orás a temperatura ambiente. Las placas se lavaron j según anteriormente y se incubaron una 1 hora adicionál a temperatura ambiente con una dilución de 1:20000 de anta Fe de IgG humano en carnero con HRP. La detección; del anticuerpo sin unir se eliminó por lavado y 100 ; µ? de sustrato TMB se adicionó a los pocilios de la placa durante 5 minutos . El color desarrollado se detuvo por la adic ¡ión de 50µ1 de 2M - de H2S04. Las placas se leyeron dentro; de 15 minutos a 450 nm con el lector de placas SpectraMaxPlus 384 (Molecular Devices) . Las concentraciones del anticuerpo en QC y las diluciones de la muestra de prueba en cada placa se cuantificaron usando la curva de referencia estándar para esa placa. El intervalo del ensayo fue de 31 a 4000 ng [ /mi en 100% de suero. El análisis farmacocinético (PK) se realizó mediante WinNonlin (versión 5.2, Pharsight Inc., Mpuñtain View, CA) . Los parámetros farmacocinéticos determinados para cada anticuerpo se muestran en la Tabla 26. Cada anticuerpo presentó la máxima reducción de los niveles de mGlil y mPtcl para 80-90% a las 24 horas posterior a la dosis (Figura 2) . Niveles de inhibición similares se mantuvieron por 72 ¡ horas. Sin embargo los niveles de mGlil y Ptcl comenzaron a recuperarse dentro de los 7 días de la dosificación para cada anticuerpo. | Tabla 26. Parámetros PK para 6D7, 3H8, y 1G1 en ¡ratones desnudos .

Dosis Tmáx AUCall AUCINF CL, Tl/2 mAb (mg/kg) (día) ng/ml ng*d/ml ng*d/ml ml/kg/d (día) 6D7 0.5 0.17 3060 3640 3850 129.9 0:.72 IgG4 1.0 0.17 7650 11050 11090 90.19 0.82 3H8 0.5 0.083 3730 4410 6870 72.8 2.13 IgG4 1.0 0.25 7470 17700 19200 52.1 1.88 1G1 0.5 0.17 6323 23672 24199 20.7 2.55 IgG2 1.0 1.0 13920 57378 58603 17.1 2.49 I i EJEMPLO 18 I DETERMINACIÓN DE LA FARMACOC INETI CA DE LOS ANTICUERPOS PURIFICADOS CON SECUENCIA OPTIMIZADA , EN LA RATA ' El análisis farmacocinét ico de 6D70P y 3H80P también fue realizado en ratas. Una dosis única en bolo intravenosa de 1, 10, 30 mg/kg de 6D70P ó ;1 , 10, 28 mg /kg de 3H80P se administró a ratas Hans wjistar. Las muestras de sangre se tomaron a través de una vena de la cola sin ningún agente ant i - coagulahte en los siguientes tiempos: 0, 1, 4, 8 y 24 horas y 2, 4, 7, 10, 15, 21 y 28 días posteriores a la I .¦ dosificación. Las muestras de sangre se centrifugaron y 100 µ? de suero se alicuotaron y congelaron. Las concentraciones de suero de mAb se determinaron mediante el método de ELISA descrito anteriojrmént e que mide el total de IgG humana. El análisis j de no compartimentación se realizó sobre los datos ¡de la concentración de suero de un animal individual j mediante el WinNonlin Professional (versiónj 5.2, Pharsight Inc. , Mountain View, CA) y un resumen de los datos farmacocinét icos se presentan en la Tabla 27. j Tabla 27. Parámetreos farmacocinéticos para 3H80P y 6D70P en! Rata AUCftLL área bajo la curva de concentración -tiempo del tiempo cero al último punto de tiempo medible; ¡ I ¡ AUCinf área bajo la curva de concentración - tiempo de i cero al infinito; j CL depuración sistémica; j Cmax concentración del pcico observada; !; T 1/.2 vida media de eliminación en fase terminal 'I i El PK de 6D70P parece ser no lineal con respecto a la dosis en la rata. El CL disminuyó con el aumento de la dosis de 38.552 mi /kg/d en el nivel de dosis 1 mg/kg a 101.049 mi i /kg/d en los 10 mg /kg. La no linealidad de 3H80P no fue tan i evidente como para 6D70P. En los grupos de dosis de 10 mg/kg o más, el CL de 6D70P y 3H80P estuvo dentro del intervalo esperado para una IgG humana en rata. La vida media de la fase terminal de 3H80P en la rata es de aproximadamente 12 y 13 días para los grupos de 10 y 28 mg/kg , respectivamente. La vida media de la fase terminal de 6D70P en la rata es de aproximadamente 9 y 10 días para los grupos de 10 y 30; mg/kg, respectivamente. 1 EJEMPLO 19 ¡ i INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL DE LOS ANTICUERPOS PURIFICADOS QUE CORRESPONDEN A LA MODULACIÓN FARMACODINAMICA DE LOS GENES OBJETIVOS HEDGEHOG EN CÉLULAS ESTROMALES DE RATÓN EN DISTINTOS MODELOS TUMORALES DE XENOINJERTO (i) Demostración in vivo de la actividad antiitumoral usando el modelo de xenoinjerto de carcinoma de colon fcon HT- 29.

Las células del tumor colorrectal HT-29 se obtuvieron de la ATCC y se mantuvieron a 37°C en 5% de C02 en el medio McCoy's 5a conteniendo 10% de Suero Fetal Bovino y 1% de L-glutamina. Estas células se probaron y se encontraron; que estaban libres de micoplasma y contaminación viral. Los tumores de xenoinjerto de HT-29 se establecieron en ratones desnudos hembras a continuación de la implantación subcutánea de 3 x 106 células/ratón en 100 µ? de medio McCoy 5a libre de suero fetal bovino en la región del lado derecho 'de los ratones NCr desnudos hembras de 6-7 semanas de edad (Taconic, Hudson, NY) . Los tumores crecieron hasta aproximadamente 100 mm3 y se seleccionaron al azar basados en el tamaño del tumor antes de iniciada la dosificación. Los anticuerpos se dosificaron en 0.9% de solución salina a 10 mg /kg cada dos semanas durante cuatro semanas por medio de la entrega intraperitoneal . El volumen tumoral se supervisó por la medición del calibre dos veces por semana mediante la fórmula de 0.5 x (largo) x (ancho)2. El análisis estadístico se realizó principalmente sobre la media del volumen tumbral al final del estudio mediante una prueba t de una cola. El tratamiento con 3H8 inhibió el crecimiento de los tumores del xenoinjerto HT-29 en un 55% (P <0.05) en comparación ! con el tratamiento del vehículo (Figura 3) . j El efecto farmacodinámico de 3H8 se evaluó en los tumores extirpados al final del estudio tres días posteriores a la última dosis. Los tumores colectados se dividieron en dos y se conservaron de inmediato en 5 mi de RNAlater a 4°C durante toda la noche o la congelación súbita en nitrógeno líquido. Los tumores conservados en RNAlater se almacenaron posteriormente a -20 ° C hasta que tuvo lugar el aislamiento de ARN. Los niveles Glil, Gli2, Gli3, Ptcl, Ptc2, Hhip|, y Smo de ratón se determinaron con respecto al HPRT1 de ratón mediante RT-PCR cuantitativo según lo descrito en el -Ejemplo i : 9. A continuación, los conjuntos cebadores/sonda ABI ¡ TaqMan se usaron: Glilde ratón, Mm00494654_ml ; Gli2 de | ratón, Mm01293117_ml; Gli3 de ratón, Mm00492333_ml ; Ptcl de i ratón, Mm00436026_ml; Ptc2 de ratón, Mm00436047_ml ; Hhip de ratón , Mm01241503_ml ; Smoothened de ratón, Mm01162705_ml ; y HPRT1 de ^ ratón , Mm00446968_ml . El tratamiento con 3H8 resultó jen una disminución aproximadamente de 50% en los niveles de Glil, Ptcl y Ptc2 de ratón (Figura 3B) . j (ii) Demostración in vivo de la actividad antitumoral ^ usando el modelo de explante de carcinoma primario de colon j HCXF-001. I Un carcinoma primario de colon de aproximadamente 1 g extraído de forma quirúrgica de un hombre caucásico! de 66 años de edad se obtuvo a través de Asterand (Detroit,; MI) y 15 se implantó en ratones SCID para establecer un modelo de xenoinjerto de explante primario. El tumor primario se enjuagó con medio RPMI 1640 que contiene 10% de SFB, 100 Ul/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina y se cortó i con bisturí. La muestra del tumor cortado se almacenó en 20 hielo hasta su implantación. El -tumor se cargó en , los trocares de calibre 13 de implante de cáncer y se implantó en cuatro ratones por la inserción del trocar por vía subcutánea en el lado derecho y por la dispensación de los contenidos del trocar en la almohadilla de grasa dorsal. Cuando los i 25 tumores (definidos como el pase 0, P0) alcanzaron de 8Ó0-1000 mm3, se extirparon y se diseccionaron en aproximadamente fragmentos de 3x3x3 mm. Los fragmentos de tumor únicos PO se pasaron sucesivamente en ratones individuales. Los estudios de eficacia se generan típicamente con los tumores más allá del pase 2 (P2) . ¡ Los ratones SCID individuales se implantaron por vía subcutánea con un fragmento de tumor único y el tratamiento con anticuerpo anti-Shh se inició cuando el promedio del volumen tumoral alcanzó aproximadamente 100-200 mm3. Los anticuerpos se administraron en 0.9% de solución salina IP a 10 mg/kg cada dos semanas durante cuatro semanas lina vez iniciado el tratamiento. El volumen tumoral se supervisó por la medición del calibre dos veces por semana y el análisis estadístico se realizó con la media geométrica de los volúmenes tumorales para cada grupo de tratamiento al final del estudio mediante una prueba t de una cola. Los animales en los que los tumores no prendieron se eliminaron de cada grupo. La inhibición moderada del crecimiento del tumor se observó con el tratamiento de 6D70P o 3H80P como agentes únicos, en particular cuando se comparó con el crecimiento de los tumores en los animales tratados con el mAb de control IgGl (Figura 4A) . El tratamiento con 6D70P o 3H80P resultó en una reducción de 48-59% en el tamaño del tumor con respecto al control de IgGl (P <0.05). ¡ El efecto farmacodinámico de los anticuerpos antirShh se evaluó en los tumores recogidos tres días posteriores a la última dosis según lo descrito anteriormente. Los niveles de los genes objetivos del estroma de hedgehog (mGlil, j mGli2, mGli3, mPtcl, mPtc2 y mHhip) se determinaron con respecto al ^ mHPRTl mediante RT-PCR cuantitativo según lo descrito en el Ejemplo 9 usando los conjuntos de cebadores/sondas i Taq an descritos anteriormente en el Ejemplo 19. El 6D70P causó una j drástica reducción (> 80%) en el nivel de mGlil, mientras que, el tratamiento con 3H80P resulta en una disminución 50% ^ más moderada en los niveles de mGlil. La inhibición más moderada de mGli2, mPtcl y Ptc2 se observó con, ambos anticuerpos. | (iii) Demostración in vivo de la actividad ant -tumor usando el modelo de xenoinjerto de colon HT-55. ^ i 15 Las células de carcinoma de colon HT-55 se obtuvieron de I la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC)! y se i mantuvieron a 37 °C en 5% de C02 en EMEM (EBSS) , 2¡ mM de glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA) , y j el; 20% del Suero Fetal bovino (FBS) . Estas células se probaron y se 20 encontraron que están libres de micoplasma y contaminación viral. (MAP) . Los tumores de xenoinjerto se establecieron en ratones desnudos hembras esencialmente según lo descrito anteriormente a continuación de la implantación subcutánea de 5x 106 células/ratón en 100 µ? de medio EMEM libre dé suero 25 fetal bovino en el costado de los ratones desnudos hembra de i 6-7 . semanas de edad. Los tumores crecieron ¡ hasta aproximadamente 100 mm3 y se seleccionaron al azar antes de la dosificación. Los anticuerpos se dosificaron en IP ¡en 0.9% de solución salina a 10 mg /kg cada dos semanas durante 3.5 semanas. El volumen tumoral se supervisó por la medición del calibre dos veces por semana y el análisis estadístico se realizó sobre la media geométrica del volumen tumoral para I cada grupo de tratamiento al final del estudio mediante un prueba t de una cola. El tratamiento con 6D70P inhibió el crecimiento del xenoinjerto por 32% con respecto al vehículo control y por 52% (P < 0.05) con respecto al control de IgG 1 Í (Figura 5) . El 3H80P tuvo poco o ningún efecto sobre el crecimiento de los tumores HT-55. ' ¡ 1 INCORPORACION COMO REFERENCIA \ Todas las referencias citadas en este documento, incluyendo patentes, solicitudes de patentes, manuscritos, libros de texto, y similares, y las referencias citadas en la I presente, se incorporan en este documento como referencia en su totalidad. : Equivalentes ! La descripción anterior se considera suficiente para permitir que una persona con conocimiento en la técnica pueda practicar la invención. La descripción y los Ejemplos anteriores detallan determinadas modalidades preferidas de la invención y describen la mejor manera prevista pór los inventores. Se apreciará, sin embargo, que no importa cuán detallado podría aparecer lo anterior en el texto, la invención se podría practicar de muchas maneras j y la í invención se debería interpretar de acuerdo con las reivindicaciones adjuntadas y cualquiera de los equivalentes de éstas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invenció. ¡

Claims

? ¡ ? REIVINDICACIONES | Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes ^ reivindicaciones: ¡

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente al homólogo sonic hedgehog (Shh) , en donde el anticuerpo, exhibe una o más de las siguientes propiedades, caracterizado! porque comprende : | ^ se une al Shh humano con una KD de menos de 120; pM por BIAcore ; ; ' inhibe la diferenciación osteoblástica de células i inducidas con Shh; ? i j exhibe una reducción en el nivel del ARNm Glil de I 15 ratón mayor que 80% en un tumor en xenoinjerto colo205; exhibe una reducción en el nivel del ARNm Patched-1 de ratón mayor que 70% en un tumor en xenoinjerto colo205; o i no exhibe unión al hedgehog del desierto. ¡ i

2. El anticuerpo aislado de de conformidad 'con la 20 reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo j inhibe el crecimiento del tumor y/o metástasis en un mamífero.;

3. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera i de las reivindicaciones precedentes, caracterizad porque el anticuerpo se une a Shh con una KD de menos de 100 25

4. Un anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera i i de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo es cualquiera de los anticuerpos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12 , 1C8 , 1A5 , 6D7 , 6D70P, 6D70P2 o cualquier versión optimizada de éstos. ;

5. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo es el i anticuerpo monoclonal 1G12. ,

6. El anticuerpo aislado de conformidad con la i reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 3H8. ¡

7. El anticuerpo aislado de conformidad don la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 6D7. j

8. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo! eS el anticuerpo monoclonal 6D70P. j

9. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera I de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porqu'e el anticuerpo comprende una secuencia de sec. con num. de ident.: 46, en donde la sec. con núm. de ident.:46 comprende i cualquiera de las combinaciones únicas de residuos ¡ de la línea germinal y no germinal indicados por cada fila de la í Tabla 10. ; I

10. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de sec. con núm. de ident . : 48, y en donde la sec. con núm. de ident. : 48 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de la línea germinal y no germinal indicados por cada jfila de la Tabla 11. !

11. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de sec. con riúm¡, de ident.: 14, en donde la sec. con núm. de ident .: 14 comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de la línea germinal y no germinal indicados por cada fila de la Tabla 12.

12. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el i anticuerpo comprende la sec. con núm. de ident. : 16, en donde la sec. con núm. de ident. :16 comprende cualquiera j de las combinaciones únicas de residuos de la línea germinal y no germinal indicados por cada fila de la Tabla 13.

13. Un anticuerpo monoclonal completamente humano caracterizado porque compite con cualquiera de los siguientes anticuerpos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8 i 1H12, 1C8, 1A5 , 6D7, 6D70P o cualquier versión optimizada dé éstos para la unión a Shh.

14. Un anticuerpo monoclonal completamente ¡humano caracterizado porque se une al mismo epítopo en Shh como I cualquiera de los siguientes anticuerpos 1A12, 1G12;, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8 , 1H12, 1C8 , 1A5 , 6D7, 6D70P o cualquier versión optimizada de éstos. j

15. Un anticuerpo aislado caracterizado i porque comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: ! a) una secuencia CDR3 como se muestra en la Tabla 9; b) cualquiera de una secuencia CDR1 , una CDR¿ o una 1 CDR3 como se muestra en la Tabla 9; ¡ c) una secuencia CDR1, una CDR2 y una CDR3 ¡de: una secuencia de cadena ligera variable como se muestra en la Tabla 9; o d) una secuencia CDR1, una CDR2 y una CDR3 ! de una secuencia de cadena pesada variable como se muestra en la Tabla 9. ¡

16. Un anticuerpo que se une inmunoespecíricamente a Shh y caracterizado porque comprende: i (a) una VH CDR1 de sec. con núm. de ident . : ¡50 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR1 de sec. con núm. de ident. :50; ! (b) una VH CDR2 de sec. con núm. de ident.: ;50 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR2 de sec. con núm. de ident. : 50; (c) una VH CDR3 de sec. con núm. de ident. : '50 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende i 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR3 de sec . con núm. de ident . : 50'; (d) una VL CDR1 de sec. con núm. de ident. : ! 54 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que cómprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR1 de sec. con núm., de ident. : 54; (e) una VL CDR2 de sec. con núm. de ident. : \ 54 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR2 de sec. con núm. de ident. : 54; y (f) una VL CDR3 de sec. con núm. de ident. : 54 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR3 de sec. con núm. de ident. : 54;

17. El anticuerpo aislado de de conformidad icón la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo comprende : : (a) una VH CDR1, CDR2 y CDR3 de sec. con núm; de ident . : 50 ; y ; (b) una VL CDR1 CDR2 y CDR3 de sec. con núm. de ident.: i 54.

18. Un anticuerpo que se une inmunoespecíficartiente a Shh y caracterizado porque comprende: ¡ (a) una VH CDR1 de sec. con núm. de ident. : ¡14 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR1 de sec . con núm. de ident . :14;; (b) una VH CDR2 de sec. con núm. de ident. : ¡ 14 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR2 de sec. con num. de ident.: 14; (c) una VH CDR3 de sec. con núm. de ident. : ¡ 14, que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en i relación con la VH CDR3 de sec. con núm. de ident. : 14; (d) una VL CDR1 de sec. con núm. de ident. : ¡16 que i tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR1 de sec. con núm. de' ident. : 16; i (e) una VL CDR2 de sec. con núm. de ident.: ¡16 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en i relación con la VL CDR2 de sec. con núm. de ident. : 16; y,. (f) una VL CDR3 de sec. con núm. de ident.: j 16 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR3 de sec. con núm. de ident.: 16 i

19. El anticuerpo aislado de conformidad 'con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente comprende: (a) una VH CDR1, CDR2 y CDR3 de sec . con ñúm. de ident . : 14 y (b) una VL CDR1 CDR2 y CDR3 de sec. con núm. de ¡ident. : 16.

20. Un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a Shh y caracterizado porque comprende: (a) una VH CDR1 de sec. con núm. de ident. : i 22 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende i < 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR1 de sec. con núm. de ident. :22; (b) una VH CDR2 de sec. con núm. de ident. : ¡22 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que cqmprende i 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR2 de sec. con núm. de ident. : 22; (c) una VH CDR3 de sec. con núm. de ident. : ¡22' que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VH CDR3 de sec. con núm. de ident. : 22; (d) una VL CDR1 de sec. con núm. de ident. : ¡24 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR1 de sec. con núm. de ident. : 24; ! (e) una VL CDR2 de sec. con núm. de ident. : ; 24 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, ó 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR2 de sec . con núm. de ident . : 24; y (f) una VL CDR3 de sec. con núm. de ident. : ¡24 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la VL CDR3 de sec. con núm. de ident.: 24 L

21. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo (a) una VH CDR1, CDR2 y CDR3 de sec. con núm. de ident. : 22; y j (b) una VL CDR1 CDR2 y CDR3 de sec. con núm. de ident.: 24. '

22. Un anticuerpo caracterizado porque se une inmunoespecíficamente a Shh y comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad ! con el aminoácido de la sec. con núm. de ident. :22 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos \ 90% de i identidad con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident . : 24. ¡

23. Un anticuerpo caracterizado porque se ! une inmunoespecíficamente a Shh y comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad ¡ con el aminoácido de la sec. con núm. de ident. :50 y comprénde un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos j 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident . : 54. !

24. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal . j

25. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

26. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de a Fab, Fab' , F(ab Fv y fragmento dAb. j

27. Un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizado porque comprende cualquiera 1 de los siguientes: ; una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable I i que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena ligera codificadas por el polinucleótido '· en el plásmido designado Mab6D7VL el cual se depositó j en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el! numero PTA-9505; ' una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tires CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido j en el plásmido designado Mab6D7VH el cual se depositó ¡ en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el: número PTA-9506; o ! I una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres de ^ CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VH el cual se depositó : en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el; número PTA-9506 y una secuencia de aminoácidos de cadena ! ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos ^ tres CDR de cadena ligera codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el número PTA-9505. ;

28. Un anticuerpo caracterizado porque comprende una 15 secuencia de aminoácidos que comprende cualquiera ¡de los siguientes: i I una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido! en el 20 plásmido designado Mab6D7VHOP el cual se depositó ! en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el ; número PTA-9504; 1 una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR 25 de cadena ligera codificadas por el polinucleótido! en el plásmido designado Mab6D7VLOP el cual se depositó ¡ en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el| número PTA-9503; o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable ^ que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido; en el plásmido designado Mab6D7VHOP el cual se depositó I en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el; número i PTA-9504 y una secuencia de aminoácidos de cadena ! ligera ^ variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena ligera codificadas por el polinucleótido en el plásmido designado Mab6D7VLOP el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el ¡ número PTA-9503. j 15

29. Un anticuerpo caracterizado porque comprende una I secuencia de aminoácidos que comprende: ! una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable i que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótido ; en el i 20 plásmido designado MablGlVH el cual se depositó \ en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el ! número PTA-9507; j una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR i 25 de cadena ligera codificadas por el polinucleótido en el ¡ plásmido designado MablGlVL el cual se depositó i en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo el: número I PTA-9509; o ¡ una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable ' que comprende al menos uno, al menos dos, o al menos tres de CDR de cadena pesada codificadas por el polinucleótidp en el plásmido designado MablGlVH el cual se depositó [ en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) bajo elj número PTA-9507 y una secuencia de aminoácidos de cadena ! ligera variable que comprende al menos uno, al menos dos, o a'jí menos tres CDR de cadena ligera del anticuerpo codificado ¡ por el I polinucleótido en el plásmido designado MablGlVL el cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipos; (ATCC) bajo el número PTA-9509. :

30. Una composición caracterizada porque comprende el agente identificado o anticuerpo de conformidad . ! con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

31. Una composición farmacéutica caracterizada! porque comprende el anticuerpo o anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes. j

32. Una molécula de ácido nucleico caracterizada; porque codifica el anticuerpo o anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes. ;

33. Un método de tratar un tumor maligno en un animal, caracterizado porque comprende: seleccionar un animal con i ¡ necesidad de tratar un tumor maligno; y administrar al! animal una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes. I

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, i caracterizado porque el animal es un humano.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales completamente humanos 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4 , 1H8 , 1?G2 , 1C8, 1A5 , 6D7, 6D70P o cualquier versión optimizada de éstos.

36. El método de conformidad con las reivindicaciones 33-35, caracterizado porque el tumor maligno se selecciona del grupo que consiste de: melanoma, cáncer de |células I pequeñas, cáncer de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado) , tumor de tiroides, cáncer gastirico ! (estómago), cáncer de próstata, cáncer de mamas, cáncer de i ovario, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer del endometrio, cáncer de riñon, cáncer de | colon, cáncer de páncreas, carcinoma esofágico, cáncer de cabe|za y i cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma) , adenocarcinoma del intestino delgado, malignidades pediátricas y carcinoma epidermoide. j

37. Uso de la composición de conformidad con la I reivindicación 30 para tratar un tumor maligno. ¡

38. Uso de la composición de conformidad con la j reivindicación 37, en donde el tumor maligno se selecciona del grupo que consiste de: melanoma, cáncer de células pequeñas, cáncer de células no pequeñas, glioma, carcinoma i hepatocelular (hígado) , tumor de tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer ' de próstata, cáncer de mamas, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblástoma, cáncer del endometrio, cáncer de riñon, cáncer de ¡ colon, cáncer de páncreas, carcinoma esofágico, cáncer de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarc!inpma) , adenocarcinoma del intestino delgado, malignidades pediátricas y carcinoma epidermoide. |