Protoplasto

Per ottenere un protoplasto da una cellula vegetale si eseguono normalmente le seguente procedure:

1) Pre-trattamento (induzione della plasmolisi)

2) Trattamento enzimatico

3) Recupero dei protoplasti

4) Verifica dalle loro purezza, vitalità e dimensione

5) Calcolo del numero di protoplasti isolati

Si preleva del materiale vegetale (normalmente una foglia) e si provvede alla sua sterilizzazione. La foglia ora sterilizzata viene tagliata in fette o dischi molto sottili e si tratta tale materiale con una soluzione di saccarosio e sorbitolo al 20%. Tale soluzione richiama acqua dalla cellula che quindi si sgonfia poca alla volta. Il pre-trattamento ha lo scopo di aumentare la vitalità dei protoplasti e può essere svolta o prima o durante il trattamento enzimatico. In questo secondo caso la soluzione di saccarosio e sorbitolo verrà aggiunto al mix di enzimi. Per aumentare la vitalità dei protoplasti è necessario partire da tessuti estremamente giovani caratterizzati da un'attiva divisione. A questo scopo sono spesso usati tessuti che derivano da colture in vitro di germogli.

Il materiale vegetale che ha subito il pre-trattamento viene ora trattato con spazzola, materiale quali carborundum e cutinasi allo scopo di aumentare la resa del trattamento enzimatico. Può rivelarsi anche utile incubare il materiale vegetale al buio, allo scopo di facilitare il distacco dell'epidermide inferiore, sul quale verrà svolto il trattamento enzimatico. Terminate queste operazioni preliminari, si trasferisce quindi l'epidermide inferiore su un substrato contenente un mix di enzimi idrolitici ossia cellulasi, emicellulasi e pectinasi. Tali enzimi degraderanno la parete cellulare facendoci ottenere un protoplasto. Tale trattamento viene svolto nelle seguenti condizioni:

-pH del substrato leggermente sub-acido (5,5-6,0)

-alla luce o al buio

-a temperature intorno ai 25 °C

-addizionando al substrato dei coaudiuvanti come PVP che svolge un'azione antiossidante e il solfato destrano di potassio che elimini gli eventuali contaminati derivanti dalla plasmolisi

Terminata la digestione enzimatica si devono recuperare i protoplasti. Essi non saranno isolati, ma si troveranno in contatto con numeroso materiale inquinante (resti della parete cellulari, organelli, corpi di riserva ecc.), per cui occorre precedere al loro isolamento. Per isolarli vengono usate le seguenti procedure:

-Filtrazione

La filtrazione viene svolta usando dei filtri aventi porosità di 100 micrometri. Normalmente tale procedure non ha un'alta resa di purificazione, per cui il filtrato viene centrifugato. Da questa centrifugazione si ottiene un supernatante che viene eliminato e un pellet che viene lavato con una soluzione ipotonica e risospeso.

-Flottazione

Si sfrutta la bassa densità per protoplasti per isolarli dal materiale inquinante. Si usano saccarosio e sorbitolo e si centrifuga il tutto ottenendo i protoplasti nella parte alta della provetta. Si possono anche creare gradienti continui o discontinui. In questo caso si usano sostanze ad alto peso molecolare come il polisaccaride Ficoll. In questo caso i protoplasti saranno posizionati tra il polisaccaride e la soluzione zuccherina

Una volta recuperati i protoplasti occorre valutare la loro purezza, ossia l'assenza di residui di parete cellulare. Per valutarne la purezza si utilizzano sostanze fluorescenti che evidenziano la presenza di cellulosa. Molto utilizzata è la molecola calcoflour white in concentrazione intorno all'1%. Viene poi valutata la vitalità dei protoplasti usando opportune molecole fluorescenti che evidenzino in maniera inequivocabile i protoplasti vivi. Molto usata è FDA (fluorescina diacetato), tale molecola entra nei protoplasti e qui viene idrolizzato a fluorescina, molecola fluorescente che viene trattenuta dalla membrana citoplasmatica dei soli protoplasti vivi. Si valuta infine la dimensione dei protoplasti, in quanto dalla dimensione dipenderà la loro resistenza all'elettroporazione. Nelle monocotiledoni il diametro dei protoplasti è sempre inferiore a 30 micrometri, nei protoplasti che derivano da colture cellulare in sospensione il diametro è superiore ai 30 micrometri e infine quelli che derivano da foglie hanno diametro variabile dai 20 ai 40 micrometri

Il conteggio va fatto su almeno 500 protoplasti. Tale conteggio viene fatto usando un emocitometro. Una buona resa si ha quando il 50% dei protoplasti risulta vitale. Essa normalmente diminuisce durante i primi giorni di coltura

resa = n x V tot sosp x PF (tessuto di partenza)-1

• Gabriella Pasqua. Biologia cellulare e biotecnologie vegetali. Edizioni Piccin
• (EN) K. N. Kao, F. Constabel e M. R. Michayluk, Plant protoplast fusion and growth of intergeneric hybrid cells, in Planta, vol. 120, n. 3, pp. 215–227, DOI:10.1007/BF00390290. URL consultato il 5 febbraio 2017.

• Sferoplasto

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• (EN) protoplast, su Enciclopedia Britannica, Encyclopædia Britannica, Inc.  

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