Trinder end point

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Il metodo Trinder end point è un test medico basato su una procedura enzimatico colorimetrica, per quantificare e identificare la presenza di colesterolo, glicemia, trigliceridi, zuccheri e altre sostanze specifiche in una soluzione.

Il metodo di Trinder ha come finalità la produzione di acqua ossigenata (H₂O₂) che verrà perossidata per formare un composto colorato la cui densità è direttamente proporzionale alla quantità di sostanza presente nel campione. La produzione di H₂O₂ proviene da molti composti biochimici presenti nel plasma o nel siero, attraverso diversi tipi di reattivi, ma l'ultima reazione di perossidasi è uguale per tutti i campioni e appunto per questo è definita "end point" ("punto finale" in inglese).

Per quanto riguarda il colesterolo, il metodo permette la sola determinazione del colesterolo totale, visto che gli esteri del colesterolo sono idrolizzati, e che successivamente, insieme a quelli non esterificati, verranno ossidati per formare H₂O₂. Dopo che è avvenuta la produzione di H₂O₂ si ha quindi la sua trasformazione in acqua e complesso chinonico colorato, avvenuta grazie alla reazione del cromogeno specifico per la determinazione e l'enzima perossidasi (POD).

I campioni di siero o plasma vengono aggiunti al reattivo contenente colesterolo esteri idrolasi, colesterolo ossidasi, perossidasi, acido 3,5-dicloro-2-idrossibenzen-solfonico (DHBS) e 4-aminoantipirina.

Anche per determinare la quantità di glucosio nel sangue e nelle urine si utilizza il test Trinder o GOD-POD. Per effettuarlo sono necessari due enzimi: il GOD (glucosio ossidasi) e il POD (perossidasi). Il primo enzima è estratto dall'Aspergillus niger, un genere di funghi della famiglia Trichocomaceae che comprende circa 200 muffe, e catalizza specificamente l'ossidazione del D-glucosio (Glu) formando acido gluconico (un acido aldonico con formula bruta C₆ H₁₂ O₇) e la produzione stechiometrica di perossido di idrogeno (H₂O₂), attraverso l'intermedio D-glucono-1,5-lattone che si idrolizza spontaneamente formando così l'acido.

Glu + O₂ + H₂O → Acido gluconico + H₂O₂

L' H₂O₂ viene ridotta ad acqua dal secondo enzima, la POD, un enzima di origine vegetale estratto dall'Armoraica rusticona o rafano, ossidando il 4-amminofenazone (C₁₃H₁₇N₂O) e il fenolo (C₆H₆O), composto aromatico derivante dal benzene, per formare il chinone più acqua. Questa sostanza assume una colorazione rossastra la cui intensità è proporzionale alla concentrazione di glucosio.

2H₂O₂ + fenolo + 4-amminofenazone → chinone + 4H₂O

Per ottenere informazioni relative alla quantità di glucosio del campione si applica la legge di Lambert-Beer che descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche. L'assorbanza è correlata alla frazione di energia radiante assorbita dal campione mediante la formula:

A = Ɛ x d x C

dove la Ɛ è il coefficiente di estinzione molare (mM^-1 x cm^-1), d è il cammino ottico della soluzione (cm) e la C è la concentrazione del soluto (mM). La determinazione della quantità di glucosio mediante il metodo GOD-POD è utilizzata nei sistemi di analisi automatizzata che consentono di analizzare in successione numerosi campioni. I valori normali di glucosio nel sangue sono tra i 76 e i 110 mg/dl mentre valori oltre i 200 mg/dl sono da considerarsi sintomi del diabete. (In condizioni di digiuno).

• P. Trinder, Determination of blood glucose using an oxidase-peroxidase system with a non-carcinogenic chromogen, J. Clin. Pathol., 22, 2, 1969, pp. 158-161