Lipopolisaharid

Lipopolisaharidi (LPS), poznat i kao lipoglikani i endotoksini, su velike molekule koje se sastoje od lipida i polisaharida, sastavljeni od O-antigena, vanjskog i unutrašnjeg jezgra povezanih kovalentnom vezom. Nalaze se u vanjskom membranama gram negativnih bakterija i izazivaju snažan imuni odgovor kod životinja. Termin lipooligosaharid ("los") se koristi za oblik bakterijskih lipopolisaharida male molekulske težine.^[1]^[2]

Otkriće

Toksičnu aktivnost LPS je prvi put otkrio (i označio kao "endotoksin") Richard Friedrich Johannes Pfeiffer. Za razliku od eksotoksina, koji je klasificiran kao otrov koji bakterije oslobađaju u okolinu, za endotoksin je smatrao da otrov zadržava "unutar" bakterijskih ćelija, a ispušta ga tek nakon uništenja bakterijskog ćelijog zida. Kasniji rad je pokazao je da oslobađanje LPS iz gram negativnih mikroba ne mora nužno zahtijevati uništavanje bakterijskog ćelijog zida, već se LPS luči kao dio normalne fiziološke aktivnosti membrane ljudskih vezikula (ćelijskih mjehurića) u obliku vezikula bakterijske vanjski membrane (OMV), koji također mogu sadržavati i druge faktore virulencije i proteina.

Danas se pojam 'endotoksin' uglavnom koristi kao sinonim za LPS, iako postoji nekoliko molekula koje izlučuju druge bakterije koje se ne odnose na LPS, kao što je tzv. delta endotoksin – protein koji luči Bacillus thuringiensis.

Funkcije u bakterija

LPS je glavna komponenta vanjske membrane Gram-negativnih bakterija; u velikoj mjeri doprinosi strukturnom integritetu bakterija, a štiti membranu od nekih vrsta hemijskih napada. LPS također povećava negativni naboj za ćelijska membranawćelijske membrane i pomaže stabiliziranju ukupne strukture membrane. To je od ključne važnosti za gram-negativne bakterije, koje uginu ako je mutirao ili uklonjen. LPS izaziva snažan odgovor imunog sistema normalnih životinja Također je upleten u ekologiju nepatogenih bakterija, uključujući površinsko prianjanje, osjetljivost na bakteriofage i interakcije sa predatorima, kao što su amebe.

LPS je neophodan za pravilnu konformaciju djelovanja omptina; međutim, glatki LPS će sterno ometati omptine.^[3]^[4]^[5]^[6]

Sastav

Šećerni lipid Kdo₂-Lipid A. Glukozaminski ostaci u plavoj, Kdo ostaci u crvenoj, acil lanci crno i fosfatne grupe u zelenoj.

Lipopolisaharid se sastoji od tri dijela:

O antigen (ili O polisaharid)
Oligosaharidno jezgro
Lipid A

O-antigen

Ponavljajući polimer glikana unutar LPS se naziva O antigen, O polisaharid ili O karika bakterijskog lanca. O antigen je pričvršćen za oligosaharidno jezgro, a sastoji se od najudaljenije domene LPS molekula. Sastav O lanca varira od tipa do tipa. Primjerice, postoji više od 160 različitih struktura O antigena samo u produkciji različitih sojeva E. colii. Prisustvo ili odsustvo O lanaca određuje da li se LPS smatra hrapavim ili glatkim. Puna dužina O-lance LPS čini glatkim, dok njen izostanak smanjenje O-lanace LPS i postaju hrapavi. Bakterije sa hrapavim LPS obično imaju probojnija ćelijske membrane za hidrofobne antibiotike, jer je hrapavi LPS hidrofobniji. O antigen je izložen na samoj vanjskoj površini bakterijske ćelija, i, kao posljedica toga, je meta za prepoznavanje odbrambenog sistema antitijela domaćina-

Jezgro

Jezgro domene uvijek sadrži oligosaharidnu komponentu koja se montira izravno na lipid A i obično sadrži šećere kao što su heptoza i 3-deoksi-D-manooktulosonska kiselina (također poznata kao KDO, keto-deoksioktulosonat). LPS jezgro mnogih bakterija također sadrž neugljične hidratne komponente, kao što su fosfat, aminokiseline i supstituenti etanolamina.

Lipid A

Lipid A je, u normalnim okolnostima, fosforilisani glukozamin disaharid obogaćen sa više masnih kiselina. Ovi lanci hidrofobnih masnih kiselina vežu LPS u bakterijske membrana, a ostatak LPS struktura uz površinu ćelije. Domena lipida je odgovorna za većinu toksičnosti gram-negativnih bakterija. Kada bakterijske ćelije pored nasumičnog imunog sistema, sa fragmentima membrane koje sadrže lipid A uđu u krvotok, izazivaju groznicu, proljev, a moguć je i fatalni endotoksinski šok (također nazvan septički šok). Polovina lipid A je vrlo konzervirana komponenta LPS.

Lipooligosaharidi

Lipooligosaharidi (LOS) su glikolipidi u vanjskim membranama nekih vrsta gram negativnih bakterija, kao što su Neisseria spp. i Haemophilus spp. Termin je sinonim za nizak oblik molekulske težine bakterijskih LPS. LOS imaju centralnu ulogu u održavanju integriteta i funkcionalnosti vanjske membrane Gram negativnih ćelija. Lipooligosaharidi su važni i u patogenezi pojedinih bakterijskih infekcija, jer su sposobni da djeluju kao imunostimulatori i imunomodulatori. Osim toga, LOS molekule su odgovorne za sposobnost nekih sojeva bakterija ispoljavaju molekulske mimikrije i antigene različitosti, pomaganje u izbjegavanju imune odbrane i na taj način doprinosi virulentnosti ovih bakterijskih sojeva. Hemijski, lipooligosaharidima nedostaje O-antigen i imaju samo vanjsku membransku komču, baziranu na polovini A-lipida, kao i oligosaharidno jezgro. U slučaju Neisseria meningitidis lipid A je dio molekula koji ima simetrične strukture, a unutrašnje jezgro se sastoji od 3-deoksi-D-Manno-2-oktulosonske kiseline (KDO) i polovina heptoze (HEP). Vanjsko jezgro oligosaharidnog lanca varira ovisno o bakterijskom soju. Termin lipooligosaharid se koristi za nizak oblik molekularne težine bakterijskih lipopolisaharida, koji se mogu svrstati u dva oblika:

visoke molekularne težine (g, ili glatki) oblik posjeduje visoke molekularne težine, ponavljajući polisaharid O-lanca, dok
niske molekularne mase (nisko-g, hrapavi ili grub) oblik, kojem nedostaje O-lanac, ali na svom mjestu ima kratki oligosaharid.

Modifikacije lipopolisaharida

LPS mogu biti modificirane kako bi se ispoljile specifične strukture šećera. Oni se mogu prepoznati od drugih LPS (koji omogućavaju inhibiciju LPS toksina) ili glikoziltransferaze koje koriste te strukturne šećere dodavanjem više specifičnih šećera. Nedavno je pokazano da specifični enzim u crijevima (alkalna fosfataza) može detoksificirati LPS uklanjanjem dvije fosfatne grupe koje se nalaze na LPS ugljikohidratu. To može funkcionirati kao adaptivni mehanizam u pomoći domaćinu za upravljanje potencijalno toksičnim efekatima gram negativnih bakterija, koje se normalno nalaze u tankom crijevu. Različiti enzimi mogu obaviti detoksikaciju LPS kada uđe ili se proizvodi u životinjskom tkivu. Neutrofili, makrofagi, i dendritske ćelije proizvode lipaze, aciloksiacil hidrolaze (AOAH), da iz lipida A deaktiviraji LPS, uklanjanjem dva srednja acil lanca. Ako im se daje LPS parenteralno, miševi koji nemaju AOAH razvijaju visok titar nespecifičnih antitijela, razvijaju produženu hepatomegaliju i produženu endotoksinsku toleranciju. Nakon parenteralne izloženosti LPS, za povratak životinja u homeostazu, može biti potrebna inaktivacija LPS.

Biosinteza i transport

**Finalni sklop LPS:** O-antigen podjedinica je premještena preko unutrašnje membrane (putem Wzx) gdje se polimerizia (po Wzy, dužina lanca određena po Wzz) i razgrađena (po WaaL) na kompletnoj jezgro-Lipid A molekulama (koje su translociraneputem MsbA).^[7]

**Transport LPS**: Kompletirana molekula LPS se transportira preko periplazme i vanjske membrane pomoću proteina LptA, B, C, D, E, F i G.^[8]

Imuni odgovor

LPS se ponaša kao prototip endotoksina jer vezuje kompleks CD14 / TLR4 / MD2 receptora u mnogim vrstama ćelija, ali posebno u monocitima, dendritskim ćelijama, makrofagima i B ćelijama, kojiđi promoviraju izlučivanje pro-upalnih citokina, dušik oksida i eikosanoida . Kao dio ćelijskog odgovora na stres, superoksid je jedan od glavnih ROS vrsta izazvana LPS u raznim vrstama ćelija TLR, u izražavanjima. LPS je i egzogeni pirogen (vanjska supstanca za izazivanje groznice). Budući da su od ključnog značaja za gram negativne bakterije, ove molekule su ciljni kandiditi za nove antimikrobne agense.

Neki istraživači sumnjaju u generalizaciju da se svi toksični efekti mogu pripisati lipopolisaharidima, posebno za cijanobakterije.

Funkcija LPS je nekoliko godina važna tema u eksperimentalnim istraživanjima, zbog svoje uloge u aktiviranju mnogh faktora transkripcije. LPS proizvodi mnoge vrste posrednika uključenih u septički šok. Ljudi su osjetljivijiji na LPS od drugih životinja (npr. miševa). Doza od 1 g/kg izaziva šok kod ljudi, ali miševi će tolerirati doze i do hiljadu puta veće. Ovo se može objasniti razlikama u nivou cirkulirajućih prirodnih antitijela između dvije vrste. Pokazalo se da LPS uzrokuje IL-10-ovisnu inhibiciju širenja i funkcije CD4 T-ćelija, kije reguliraju PD-1 etaže na monocitima, što dovodi do proizvodnje IL-10 u monocitima, nakon vezivanja PD-1 iz PD-L1. Endotoksini su velikim dijelom odgovorni za dramatične kliničke manifestacije infekcija patogenim gram-negativnim bakterijama, kao što su Neisseria meningitidis, patogen koji izaziva meningokokne bolesti, uključujući [[meningokokemija|mwningokokemiju, Waterhouse-Friderichsenov sindrom i meningitis.

Bruce Beutler je dobila dio Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu, 2011. godine za svoj rad koji pokazuje da je LPS receptor – TLR4. Dijelovi LPS iz nekoliko sojeva bakterija su pokazali hemijsku sličnost sa molekulama površine ljudskih ćelija domaćina. Sposobnost nekih bakterija da na njihovoj površini ispolje molekule koje su hemijski identične ili slične površinskim molekulama nekih vrsta ćelija domaćina se naziva molekulska mimikrija. Naprimjer, u Neisseria meningitidis L2,3,5,7,9 , terminalni tetrasaharidni dio oligosaharida (lakto-N-neotetraoza) je isti tetrasaharid koji se nalazi u paraglobozidu, prekursoru za ABH glikolipidni antigen na ljudskim eritrocitima (vidi: ABO sistem krvnih grupa). U drugom primjeru, terminalni trisaharid je dio (laktotriaoze) oligosaharida iz patogenih Neisseria spp. LOS se također nalazi i u laktoneoserijama glikosfingolipida ljudskih ćelija. Većina meningokoka iz grupe B i C, kao i gonokokom, pokazali su da je ovaj trisaharid dio njihove LOS strukture. Pojava da se površina ljudskih ćelija 'imitira', pored ostalog, djeluje kao "kamuflaža" od imunog sistema, što ima ulogu u ukidanju imunološkog tolerancije kada se domaćina zarazi određenim ljudskim leukocitnim antigenim (HLA) genotipovima, kao što je HLA-B35.

Uticaj varijabilnosti na imuni odgovor

Naplatnoliki receptori urođenog imunog sistema prepoznaju LPS i pokreću imuni odgovor.

O-antigeni (vanjski ugljukohidrati) su najvarijabilniji dio LPS molekula, prenoseći antigene specifičnosti. Nasuprot tome, lipid A je najkonzerviraniji dio. Međutim, sastav lipida A također može varirati (npr. u broju i prirodi acil lanaca, čak unutar ili između rodova). Neke od tih varijacija mogu prenositi antagonističke osobine ove ploče. Na primjer, difosforil lipid A (RsDPLA) Rhodobacter sphaeroides je moćan antagonist LPS u ljudskim ćelijama, ali je agonist u ćelijama hrčka i konja.

Spekuliše se da je stožasti lipid A (npr. iz E. coli) više agonističan nego manje stožast lipid A kao kod Porphyromonas gingivalis, što može aktivirati drugačiji signal (TLR2 umjesto TLR4) i potpuno cilindričnog lipida A, kao što je kod Rhodobacter sphaeroides koji je antagonističan za TLR.

Klaster LPS gena jako varira između različitih sojeva, podvrsta, vrsta bakterijskih patogena biljaka i životinja.

Normalnan ljudski krvni serum sadrži anti LOS antitela, koja su baktericidna i kod pacijenata koji imaju infekcije uzrokovane serotipski različitih sojeva koji posjeduju anti-LOS antitijela koja se razlikuju u specifičnosti u usporedbi sa normalnim serumu. Ove razlike u humoralnom imunom odgovoru na različite vrste LOS, mogu se pripisati strukturu LOS molekula, prije svega u strukturi oligosaharidnog dijela LOS molekula. U Neisseria gonorrhoeae je dokazano da se antigenost LOS molekula može promijeniti tokom infekcija, zbog sposobnosti ove bakterije da sintetizira više od jedne vrste LOS. Ta karakteristika je poznata kao fazna varijacija. Pored toga, Neisseria gonorrhoeae, kao i Neisseria meningitidis i Haemophilus influenzae, su sposobni da dalje menjaju svoje LOS in vitro, naprimjer, putem sialijlacije (modifikacije ostataka sijalične kiseline), a kao rezultat toga su u mogućnosti da povećaju svoju otpornost na dopunski posrediovan ubijanje ili čak reguliranja aktiviranja dopuna ili izbjegavanje efekta baktericidnih antitijela. Sialijlacija može doprinijeti otežavanju vezanja nneutrofila i fagocitoze preko ćelija imunog sistema, kao i smanjenje oksidativnog rafala. Haemophilus somnus, patogen goveda, također je pokazao LOS fazu varijacija, što je osobina koja može pomoći u imunološkoj obrani goveda – domaćina. Uzeto zajedno, ova zapažanja ukazuju na to da varijacije u molekulama bakterijske površine, kao što su LOS može pomoći patogenima da izbjegnu oba humoralna (antitijela i komplement-posredovani) i ćelijski posredovane (ubijanje po neutrofili, na primjer) imunie odbrane domaćina.

Zdravlje

Endotoksemija

Prisustvo endotoksina u krvi se zove endotoksemija. Ako se ozbiljno ne ispolji imuni odgovor, može dovesti do septičkog šoka. Osim toga, smatra se da je endotoksemija crijevnog porijekla, posebno u domaćin-patogen sučeljavanju, važan faktor u razvoja alkoholnog hepatitisa, koji se vjerovatno razvija na osnovu sindroma prekomjernih bakterija tankog crijeva i povećane crijevne propusnosti.

Lipid A može dovesti do nekontroliranog aktiviranja imunog sistema sisara s proizvodnjom upalnih medijatora koji mogu dovesti do septičkog šoka. Ova upalna reakcija je posredovana Toll-sličnim receptorom 4 koji je odgovoran za aktiviranje ćelija imunološkog sistema. Oštećenja endotelnog sloja krvnih sudova uzrokovana ovim upalnim medijatorima mogu dovesti do sindroma kapilarnog curenja, širenja krvnih sudova i smanjenja srčane funkcije, pa može izazvati septički šok. Takvo dopunsko aktiviranje može se uočiti kasnije u toku procesa, kada se bakterije razmnožavaju u krvi. Velika bakterijska proliferacija izazva destruktivna oštećenja endotela, što može dovesti do diseminirane intravaskularne koagulacije (DIK). uz gubitak funkcije pojedinih unutrašnjih organa kao što su bubrezi, nadbubrežne žlijezde i pluća, a zbog ugroženog dotoka krvi. Koža može ispoljiti efekte vaskularnog oštećenja, često u kombinaciji sa iscrpljivanjem koagulacije u obliku petehije, purpura i ekhimoze. Udovi mogu također biti pogođeni, ponekad sa štetnim posljedicama, kao što su razvoj gangrene, koja zahtijeva naknadnu amputaciju. Gubitak funkcije nadbubrežne žlijezde može uzrokovati adrenalnsku insuficijenciju, a dodatno krvarenje u nadbubrežnoj žlijezdi uzrokuje Waterhouse-Friderichsenov sindrom; oba oboljenja mogu biti opasna po život. Također je izviješteno da gonokokni LOS može dovesti do oštećenja ljudske Fallopijeve tube.

Auto-imuna bolest

Molekulska mimikrija nekih LOS molekula se smatra izazivačem autoimuno baziranih odgovora domaćina, kao što su napadi multiple skleroze. Drugi primjeri bakterijske mimikrije struktura domaćina putem LOS nalaze se kod infekcije bakterijom Helicobacter pylori ili Campylobacter jejuni, organizmi koji izazivaju gastrointestinalne bolesti kod ljudi i Haemophilus ducreyi koji uzrokuje kankroid. Određeni C. jejuni LPS serotipovi (sa polovinama određenih tetra- i pentasaharidnih jezgara oligosaharida), također su uključeni u Guillain-Barre sindrom i varijantu Guillain-Barre zvani Miller-Fisher sindrom.

Link za gojaznost

Epidemiološke studije su prethodno pokazale da je povećana opterećenja endotoksinima, što može biti posljedica povećane populacije endotoksinskih bakterija u probavnom traktu, povezana sa određenim vezane za gojaznost u proučavanoj grupi pacijenata. Druge studije su pokazale da pročišćeni endotoksini iz Escherichia coli mogu izazvati gojaznost i insulin-otporne fenotipove kada su ubrizgavani u zametke modela miš. Nedavna studija je otkrila ulogu potencijalnog doprinosa Enterobacter cloacae B29 pretilosti i otpornosti na insulin u ljudskih pacijenta. Pretpostavljeni mehanizam za asocijaciju endotoksina sa gojaznosti je da endotoksin izaziva posredovani put zapaljenja i doprinosi podložnosti za gojaznost i otpornost na insulin.

Bakterijski rodovi koji su povezani sa endotoksinima u vezi sa pretilosti su: Escherichia, Enterobacter.

Laboratorijska istraživanja i biotehnološki sistemi

Lipopolisaharidi su česte kontaminanat u plazmidnoj DNK u manipulaciji bakterijama ili proteinima izazvana je od bakterija, i moraju se ukloniti iz DNK ili proteina da se izbjegne zagađenje eksperimenta i toksičnost proizvoda pomoću industrijske fermentacije.

Također je i ovalbumin često kontaminiran endotoksinima. To je jedan od intenzivno proučavanih proteina u životinjskim modelima i uspostavljeni model testiranja alergena za disajne puteve (AHR). Komercijalno dostupan ovalbumin koji je kontaminiran LPS može u potpunosti aktivirati endotelne stanice u in vitro testu prvog koraka upale, a to falsifikuje rezultate istraživanja, jer neprecizno odražava učinak jedinog proteinskog antigena u fiziologiji životinja.

U farmaceutskoj proizvodnji, iz kontejnera za proizvodnju lijeka je potrebno ukloniti sve tragove endotoksina, jer čak i njegove male količine će uzrokovati bolest kod ljudi. U tu svhu se koriste pećnica za depirogenaciju. Temperature su u njima više od 300 °C i mogu destruirati ovu supstancu. Definirana stopa smanjenja endotoksina je korelacija između vremena i temperature. Na temelju primarne ambalaže kao šprice ili bočice, čašu, na temperaturi od 250 °C i vrijeme održavanja 30 minuta, tipski se postigne smanjenje nivoa endotoksina za faktor od 1000.

Standardni test za otkrivanje prisutnosti endotoksina je limulus amebocit lizat (LAL) test, koristeći krv iz Horseshoe rakova. Veoma nizak nivo LPS može uzrokovati koagulaciju u limulus lizata, zbog moćnog povećanja kroz enzimske kaskade. Međutim, s obzirom na sve manjih populacija potrebnih rakova, kao i činjenicu da postoje faktori koji ometaju LAL test, učinjeni su napori da se razviju alternativnih testovi, sa onima koji najviše obećavaju, kao što su ELISA testovi pomoću rekombinantne verziju proteina u LAL testu, Faktor C.

Također pogledajte

Reference

^ Laidler K. J. (1978): Physical chemistry with biological applications. Benjamin/Cummings, Menlo Park, ISBN 0-8053-5680-0.
^ Hunter G. K. (2000): Vital Forces. The discovery of the molecular basis of life. Academic Press, London 2000, ISBN 0-12-361811-8.
^ Nelson D. L., Cox M. M. (2013): Lehninger principles of biochemistry. W. H. Freeman and Co., ISBN 978-1-4641-0962-1.
^ Hall J. E., Guyton A. C. (2006): Textbook of medical physiology, 11th edition. Elsevier Saunders, St. Louis, Mo, ISBN 0-7216-0240-1.
^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
^ Lindhorst T. K. (2007): Essentials of carbohydrate chemistry and biochemistry. Wiley-VCH, ISBN 3527315284.
^ Wang X., Quinn P. J. (2010): Lipopolysaccharide: Biosynthetic pathway and structure modification. Prog. Lipid Res., 49 (2): 97–107.
^ Ruiz N., Kahne D., Silhavy T. J. (2009): Transport of lipopolysaccharide across the cell envelope: the long road of discovery. Nat. Rev. Microbiol.. 7 (9): 677–683.

Vanjski linkovi

[1] Laidler K. J. (1978): Physical chemistry with biological applications. Benjamin/Cummings, Menlo Park, ISBN 0-8053-5680-0.

[2] Hunter G. K. (2000): Vital Forces. The discovery of the molecular basis of life. Academic Press, London 2000, ISBN 0-12-361811-8.

[3] Nelson D. L., Cox M. M. (2013): Lehninger principles of biochemistry. W. H. Freeman and Co., ISBN 978-1-4641-0962-1.

[4] Hall J. E., Guyton A. C. (2006): Textbook of medical physiology, 11th edition. Elsevier Saunders, St. Louis, Mo, ISBN 0-7216-0240-1.

[5] Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.

[6] Lindhorst T. K. (2007): Essentials of carbohydrate chemistry and biochemistry. Wiley-VCH, ISBN 3527315284.

[7] Wang X., Quinn P. J. (2010): Lipopolysaccharide: Biosynthetic pathway and structure modification. Prog. Lipid Res., 49 (2): 97–107.

[8] Ruiz N., Kahne D., Silhavy T. J. (2009): Transport of lipopolysaccharide across the cell envelope: the long road of discovery. Nat. Rev. Microbiol.. 7 (9): 677–683.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]