UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CARACTERIZAÇÃO DA MORFOLOGIA
EXTERNA E DO SISTEMA REPRODUTOR
DE FÊMEAS DE Amblyomma brasiliense
Aragão, 1908 (ACARI: IXODIDAE).
GUSTAVO SERON SANCHES
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências do Campus de Rio
Claro,
Universidade
Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas (Biologia Celular
e Molecular).
Rio Claro/SP.
Junho – 2009.
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CARACTERIZAÇÃO DA MORFOLOGIA
EXTERNA E DO SISTEMA REPRODUTOR
DE FÊMEAS DE Amblyomma brasiliense
Aragão, 1908 (ACARI: IXODIDAE).
GUSTAVO SERON SANCHES
Orientadora: Profa. Dra. MARIA IZABEL CAMARGO MATHIAS
Co-Orientador: Prof. Dr. GERVÁSIO HENRIQUE BECHARA
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências do Campus de Rio
Claro,
Universidade
Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas (Biologia Celular
e Molecular).
Rio Claro/SP.
Junho – 2009.
595.42
S211c
Sanches, Gustavo Seron
Caracterização da morfologia externa e do sistema
reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense Aragão,
1908 (Acari : Ixodidae) / Gustavo Seron Sanches. - Rio Claro
: [s.n.], 2009
70 f. : il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Maria Izabel Camargo Mathias
Co-orientador: Gervásio Henrique Bechara
1. Ácaro. 2. Carrapatos. 3. Morfologia. 4. Ovário. 5.
Imaturos. 6. Descrição. I. Título
Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP
Campus de Rio Claro/SP
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5
SUMÁRIO
Pág.
RESUMO ..................................................................................................................... 1
ABSTRACT ................................................................................................................. 3
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA .............................................. 5
1.1 O carrapato e a importância de estudos de morfologia externa ............................... 5
1.2 Morfologia do sistema reprodutor feminino ............................................................ 9
1.3 Importância econômico-sanitária dos carrapatos .................................................. 11
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 14
2.1 Objetivos gerais ..................................................................................................... 14
2.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 14
3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 16
3.1 Carrapatos .............................................................................................................. 16
3.2 Morfometria ........................................................................................................... 17
3.3 Ultramorfologia externa ........................................................................................ 18
3.4 Ultramorfologia interna ......................................................................................... 18
3.4 Histologia dos Ovários .......................................................................................... 19
4. RESULTADOS ...................................................................................................... 20
Capítulo 1: Morphological description of Amblyomma brasiliense Aragão, 1908
(Acari: Ixodidae) larvae and nymphs ...................................................................... 22
1. Introduction ............................................................................................................. 24
2. Material and Methods ………………………………………………...…………... 25
2.1 Origin of ticks ……………………………………………………........................ 25
2.2 Material preparation ………………………………………………..…………… 25
3. Results ……………………………………………………………………...…….. 26
3.1 Larva …………………………………………………………………………….. 26
3.2 Nymph ……………………………………………………………………......…. 27
4. Discussion ……………………………………………………………….………... 29
5. Acknowledgements ……………………………………………………………..... 32
6. References ………………………………………………………………………... 32
Capítulo 2: Ovary and oocytes vitellogenesis description of the tick Amblyomma
brasiliense Aragão, 1908 (Acari: Ixodidae) ……………………………..........…. 39
1. Introduction ............................................................................................................. 41
2. Material and Methods ……………………………..………………...……………. 41
2.1 Ticks ……………………………………………………...................................... 41
2.2 Morphology ……………………………………………………………………... 41
2.3 Scanning electron microscopy ………………………………………..……….… 42
2.4 Histology …………………………………………………………………...….... 42
3. Results ………………………………………………………………………….… 42
3.1 Ultramorphology ………………………………………………………….….…. 42
3.2 Histology …………………………………………………………...…………… 42
3.3 Classification of oocytes ……………………………………………………….... 43
4. Discussion ……………………………………………………………….………... 44
5. Acknowledgements ……………………………………….........………………… 46
6. References ……………………………………............…………………………... 47
5. DISCUSSÃO GERAL …………………………………………………………... 53
6. CONCLUSÕES ………………………………………………………………….. 59
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………….... 61
ANEXOS ……………………………………………….....................……………… 68
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
1
RESUMO
O presente estudo apresenta a descrição da morfologia externa de
larvas e a redescrição de ninfas do carrapato Amblyomma brasiliense,
utilizando microscopia de luz, lupa estereoscópica e microscopia eletrônica de
varredura. As larvas apresentaram a base do capítulo retangular, palpos curtos
e idiossoma arredondado, coxa I com dois espinhos, sendo o externo mais
longo que o interno e coxas II e III com um espinho, enquanto as ninfas
apresentaram a base do capítulo também retangular, com córnua pontiaguda,
idiossoma oval, coxa I com dois espinhos evidentes, sendo o externo mais
longo que o interno, coxas II e III com um espinho curto em cada uma, e coxa
IV, com um espinho muito pequeno e a presença de tubérculos quitinosos na
superfície interna da borda posterior dos festões.
Além disso, a morfologia do ovário e o processo de dinâmica da
vitelogênese dos ovócitos de fêmeas ingurgiradas desta espécie de carrapato
também são apresentados. O ovário, classificado como panoístico por não
apresentar células foliculares e nutridoras, consiste em estrutura tubular única
e contínua com ovócitos de vários tamanhos e diferentes estádios de
desenvolvimento, presos a parede epitelial por meio do pedicelo. Tais ovócitos
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
2
são aqui classificados em cinco estádios de acordo com a aparência do
citoplasma, observação da vesícula germinal, aspecto dos grãos de vitelo e
deposição do córion. Pela primeira vez foi observado em carrapatos ovócitos
com o córion esculturado.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
3
ABSTRACT
The present study shows the external morphological description of
larvae and the redescription of nymphs of Amblyomma brasiliense ticks under
light microscope, stereoscopic microscope and scanning electron microscope.
Larvae present basis capituli rectangular, short palpi, idiosoma rounded, coxa I
with two spurs being the external longer than the internal one and coxae II and
III each with one short spur. Nymphs present basis capituli rectangular with a
sharp pointed cornua, oval idiosoma with scutum reaching coxa III and coxae I
with two evident spurs being the external longer than the internal one; coxae IIIII each with one short spur and coxae IV with a very short spur and chitinous
tubercles on internal surface of posterior border of festoons.
Furthermore,
the
ovary morphology
and
the
dynamics
of
the
vitellogenesis process in oocytes of Amblyomma brasiliense engorged females.
The ovary is classified as the panoistic type; therefore, it lacks nurse and
follicular cells. This organ consists of a single tubular structure, continuous, with
oocytes of various sizes and at different developmental stages remain attached
to the ovary through a cellular pedicel. The oocytes were classified into five
stages described according to cytoplasm appearance, presence of the germ
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
4
vesicle, yolk granules aspects, and chorion deposition. For the first time was
related in ticks oocytes chorium sculptured.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
5
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
1.1.
O carrapato e a importância de estudos de morfologia externa
Carrapatos são ectoparasitos que pertencem ao filo Arthropoda, classe
Arachnida, ordem Acari e subordem Ixodida. A subordem Ixodida compreende
três famílias: Argasidae, Nuttalliellidae e Ixodidae.
Dentro da família Ixodidae, o gênero Amblyomma Koch 1844 é estimado
em 127 espécies, das quais aproximadamente 57 estão descritas e
encontradas na região Neotropical, e destas, 33 são relatadas no Brasil
(GUIMARÃES et al., 2001; BARROS-BATTESTI et al., 2005). Entretanto, a
biologia da maioria dos carrapatos da fauna brasileira silvestre é ainda
desconhecida e muitas vezes até o hospedeiro ou seu nicho ecológico original
são ignorados.
Além disso, existem poucas informações a respeito das características
morfológicas desses carrapatos, principalmente dos estágios imaturos, o que
torna difícil sua identificação até o nível de espécie.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
6
Enquanto as descrições de estágios imaturos estão disponíveis para a
maioria das espécies africanas e australianas, estas são muito fragmentadas
para as de origens neotropicais. Das espécies descritas do Novo Mundo, a
maioria é para o estágio adulto, sendo muito incompleta para os imaturos
(CAMICAS et al., 1998).
Segundo Barros-Battesti et al. (2005), existem poucos estudos
morfológicos sobre as formas imaturas, e a maioria das descrições foram
realizadas utilizando-se apenas a microscopia de luz, porém, muitas estruturas
são melhor observadas com o auxílio da microscopia eletrônica de varredura.
Barbieri et al. (2007) relatam a escassez de estudos morfológicos
baseados na quetotaxia e na porotaxia de larvas e ninfas do gênero
Amblyomma.
A característica morfológica mais notável dos carrapatos é a aparente
ausência de divisões corporais. A segmentação abdominal desapareceu na
maioria das espécies ao longo da ontogenia e o abdômen fundiu-se ao
prossomo. O que pode ser erroneamente identificado como cabeça, trata-se de
um conjunto de peças bucais quitinizadas que formam o rostro ou capítulo
(STORER e STEBBINS, 2000; RUPPERT el al., 2005).
Coincidindo com essa fusão, o corpo inteiro se encontra revestido por
um único escudo esclerotizado de formato variável (RUPPERT el al., 2005).
Embora coriáceo, este tegumento é flexível e viabiliza um aumento
considerável de volume quando o animal se alimenta de sangue (REY, 2002;
RUPPERT el al., 2005).
Ventralmente, nos carrapatos podem ser observadas as seguintes
estruturas: abertura genital, abertura anal, placas ou escudos quitinosos e
placas espiraculares (REY, 2002).
O carrapato Amblyomma brasiliense, cujas ninfas e adultos foram
descritos pela primeira vez por Aragão (1908), é um dos representantes da
ixodidofauna silvestre brasileira e os poucos relatos existentes dizem respeito à
sua biologia e ecologia. Espécie comum parasitando o porco-do-mato (Tayassu
tajacu), também ocorre em menor número no queixada (Tayassu pecari), paca
(Agouti paca), cotia (Dasyprocta agouti), capivara (Hydrochaeris hydrochaeris)
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
7
e anta (Tapirus terrestris). Já foi assinalada também na ave jacu-pemba
(Penelope superciliaris) (GUIMARÃES et al., 2001).
Nas matas em que porcos-do-mato são abundantes, o homem é muito
atacado por esta espécie, principalmente pelas suas larvas, mas ainda
desconhece-se sua capacidade vetorial de bioagentes para seres humanos ou
mesmo para animais. Sua distribuição se dá na Argentina, Paraguai e Brasil
(RJ, SP, ES, PA, MG) (ARAGÃO, 1936).
Recentemente, esta espécie foi encontrada em trilhas de animais em
reserva de Mata Atlântica no Parque Estadual de Intervales, no sul do Estado
de São Paulo (SZABÓ et al., 2003).
Szabó et al. (2006) observaram que humanos poderiam servir de
hospedeiro para ninfas de A. brasiliense e de A. incisum, permitindo o
desenvolvimento destes. Reações às
picadas
dos
carrapatos variam
consideravelmente entre indivíduos, e o prurido é a principal resposta de
defesa primária e inata contra o ectoparasito, podendo ainda ocorrer a
hiperemia e o inchaço no local das picadas.
Estudos realizados no Departamento de Patologia Veterinária da
FCAV – UNESP Jaboticabal, SP mostraram que esta espécie de carrapato
possui um ciclo de vida de aproximadamente um ano em condições de
laboratório (20ºC, 90% de umidade e fotoperíodo de 12 horas) e que tais
condições seriam essenciais para o seu desenvolvimento, com sensibilidade à
variações de temperatura e de umidade (SANCHES et al., 2008).
Morfologicamente, os machos possuem a coxa I com dois espinhos,
coxas II e III com dois tubérculos, coxa IV com espinho externo e um interno
reduzido a um pequeno tubérculo, escudo castanho claro, com manchas
amareladas e festões prolongados por lâminas quitinosas, salientes, não
incisadas (GUIMARÃES et al., 2001).
Por seu lado, as fêmeas possuem tubérculos quitinosos nos ângulos
internos dos festões, base dorsal do gnatossoma retangular com os ângulos
posterolaterais salientes, tubérculos quitinosos em todos os festões, exceto no
situado ao centro, escudo com bordo escuro e centro acobreado, espinhos da
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
8
coxa I curtos, o interno correspondendo à metade do comprimento do externo
(GUIMARÃES et al., 2001).
Muitas
investigações
vêm
sendo
realizadas
com
carrapatos,
principalmente enfocando aspectos bioeconômicos, ecologia e estudos com
anatomia externa principalmente de carrapatos adultos, com vistas à taxonomia
(HOOGSTRAAL, 1956; TILL, 1961; OLIVEIRA et al., 2006).
Segundo Amorim e Serra Freire (1999) larvas do gênero Amblyomma são
de difícil identificação. Keirans e Durden (1998) apontam a mesma dificuldade
para as ninfas. Tal fato pode estar relacionado com a escassa quantidade de
informações disponíveis na literatura especializada sobre sua morfologia.
Clifford e Anastos (1960) apontam que as deficiências de conhecimento
sobre a sistemática de larvas podem ser atribuídas a alguns fatores: poucos
caracteres consistentes para a inclusão em chaves taxonômicas; descrições
inadequadas; relativamente poucas espécies criadas em laboratório e obtidas à
partir de fêmeas identificadas; e a virtual impossibilidade de associar larvas
coletadas no campo com adultos correspondentes.
Dessa
forma,
torna-se
necessário
alimentar
esses
instares
em
hospedeiros de laboratório e aguardar que sofram ecdise a fim de obter o
estágio adulto para só então realizar a identificação (LABRUNA et al., 2007).
Szabó et al. (2006) utilizaram em seu estudo tal procedimento para identificar as
espécies que parasitaram humanos no Parque Estadual de Intervales – SP.
Ressalte-se que, tal metodologia muitas vezes torna-se de difícil
aplicação devido ao tempo prolongado do ciclo de vida de alguns carrapatos e a
dificuldade de sua manutenção em condições de laboratório, como é o caso do
A. brasiliense (SANCHES et al., 2008).
Ruppert et al. (2005) ressaltaram a importância de estudos morfológicos
de carrapatos e afirmaram que o número, a forma e a localização de cerdas do
órgão de Haller seriam constantes para um dado estágio de desenvolvimento de
uma espécie de carrapato. No entanto, poderiam variar de um estágio para
outro, assim como dentre espécies, o que, para eles, seria uma característica
ideal para a sua identificação e classificação.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense
9
De acordo com trabalho recente de Guglielmone et al. (2006), existem
diversos registros de larvas e ninfas não identificadas encontradas em humanos
de regiões neotropicais. Todavia, a inexistência de chaves taxonômicas
adequadas para formas imaturas de carrapatos torna difícil sua identificação.
1.2.
Morfologia do sistema reprodutor feminino
Os carrapatos são animais dióicos, ou seja, cada um dos sexos possui
suas respectivas gônadas (ovário e testículo), abertura genital e glândulas
anexas (NUÑES et al., 1982).
O sistema reprodutor feminino consiste fundamentalmente de um grande
ovário em forma de U localizado na região posterior do corpo, um par de
ovidutos,
útero,
tubo
conector
muscular,
vagina
e
abertura
genital
(SONENSHINE, 1991).
O ovário é um órgão que apresenta lúmen delimitado por células
epiteliais,
ovogônias
e
ovócitos.
desenvolvimento uniforme, sendo
Esses
últimos
encontrados
em
não
apresentam
diferentes
estágios
(SONENSHINE, 1991).
Trabalhos recentes realizados no Instituto de Biociências da UNESP de
Rio Claro, SP têm demonstrado por meio de técnicas histológicas e de
microscopia eletrônica, que o ovário de Boophilus microplus é do tipo
panoístico, único, tubular e localizado no terço posterior do corpo, e que os
ovócitos
aí presentes
se desenvolvem simultaneamente,
porém com
assincronica (SAITO et al., 2005).
Outra espécie de ixodídeo já estudada é a do Amblyomma triste, que
também apresentou ovário do tipo panoístico com ovócitos presos à sua
parede por meio de um pedicelo e desenvolvendo-se em quatro estágios,
sincronicamente (OLIVEIRA et al., 2006).
A vagina nos carrapatos divide-se em duas porções: a cervical, onde
desembocam os ovidutos, e a vestibular que se estende do receptáculo
seminal até a abertura genital. Na porção cervical, localiza-se um par de
glândulas acessórias cuja secreção produzida funciona como um lubrificante,
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 10
facilitando desse modo, a passagem dos ovos pelos ductos (NUÑES et al.,
1982).
A abertura genital se localiza na linha média do corpo e, por vezes,
próxima à base do capítulo. Apresenta-se como uma fenda transversal
protegida anteriormente por uma prega quitinizada e posteriormente pela
elevação da margem tegumentar (RUPPERT el al., 2005).
O processo de cópula, que na maioria dos ixodídeos ocorre durante o
repasto sangüíneo no hospedeiro é caracterizado pelo encontro do parceiro
sexual, sendo facilitado pela liberação de feromônios com conseqüente união
de macho e de fêmea que justapõem suas respectivas superfícies ventrais
(SONENSHINE et al., 1991).
Os machos não dispõem de um órgão copulador, utilizando tanto o
hipostômio quanto as quelíceras para dilatar o orifício genital da fêmea e forçar
a entrada do conteúdo do espermatóforo. Somente no interior do aparelho
genital
feminino
é
que
os
espermatozóides
ganharão
mobilidade
e
abandonarão o espermatóforo, fertilizando os óvulos (REY, 2002).
Depois de efetivada a fecundação, o ovário aumenta consideravelmente
de tamanho, exibindo ovos em todos os estágios de desenvolvimento (REY,
2002) e logo a seguir, as fêmeas desprender-se-ão do hospedeiro e cairão no
solo, onde realizarão a ovipostura (RUPPERT el al., 2005).
A reprodução em carrapatos é controlada por diversos fatores. O
processo de alimentação age como estímulo para reprodução, já que materiais
nutritivos são necessários para o desenvolvimento de embriões. Dessa forma,
alimentação e acasalamento são necessários para o sucesso reprodutivo da
maioria das espécies de carrapatos (OLIVER et al., 1984).
O número de ovos produzidos pelas fêmeas depende do volume de
sangue ingerido bem como do tamanho dos próprios ovos. Em geral, fêmeas
que consomem grande quantidade de sangue produzem mais ovos
(SONENSHINE, 1991).
Os ixodídeos possuem um elevado potencial reprodutivo, que tem
despertado o interesse de estudos sobre a reprodução de numerosas espécies
(DIEHL et al., 1982; OLIVER et al., 1984).
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 11
No que diz respeito à anatomia interna, os estudos são mais escassos e
a bibliografia muito antiga (DOUGLAS, 1943). Recentemente, alguns autores
têm se dedicado a realizar o estudo morfológico do sistema reprodutor e das
glândulas salivares de várias espécies de carrapatos de importância médicoveterinária (DENARDI et al., 2004; SAITO et al., 2005; NUNES et al., 2005 e
OLIVEIRA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2009).
1.3.
Importância econômico-sanitária dos carrapatos
Ressalte-se
que
os
carrapatos
são
ectoparasitos
hematófagos
obrigatórios. Diversas espécies são de interesse e importância na saúde
pública e animal, porquanto são vetores de patógenos para o homem e para
outros animais, o qual ocorre durante o processo de alimentação (WALKER et
al., 2000; HOOGSTRAAL, 1981). De fato, ixodídeos são vetores dos patógenos
causadores, dentre outras afecções, da febre maculosa, doença de Lyme,
erliquiose monocítica e granulocítica no homem, e teileriose, anaplasmose e
babesiose em bovinos (SAUER et al., 2000).
A crescente coexistência do homem, animais domésticos e animais
silvestres em um mesmo nicho ecológico, têm aumentado a possibilidade de
contato com carrapatos da fauna silvestre e com bioagentes que possam
albergar (FIGUEIREDO et al., 1999).
Mamíferos silvestres, principalmente capivaras e veados, vivem em
contato próximo à bovinos, eqüinos e cães, com quem compartilham os
mesmos carrapatos, oferecendo riscos de transmissão de doenças aos animais
domésticos e ao homem. Dessa forma, o homem e animais domésticos podem
acidentalmente ser parasitados e desenvolverem doenças infecciosas ou,
então, carrearem potenciais vetores para o meio urbano (FIGUEIREDO et al.,
1999).
No Brasil, a febre maculosa, causada pela Rickettsia rickettsii, é a
principal zoonose associada a carrapatos, e sua manutenção também está
associada a mamíferos silvestres (CAMPOS PEREIRA e LABRUNA, 1998).
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 12
Casos fatais de febre maculosa têm sido registrados desde a primeira
metade do século XX e sua transmissão ao homem é atribuída principalmente
às espécies Amblyomma cajennense e A. aureolatum (LABRUNA et al., 2004).
Essa doença leva ao aparecimento de casos desde assintomáticos a
enfermidades severas com presença de febre repentina, cefaléia, prostração,
mialgia e confusão mental, com um curso de aproximadamente duas a três
semanas, tendo a necrose vascular como uma complicação comum. É uma
doença endêmica em São Paulo e Minas Gerais (FIGUEIREDO et al., 1999).
Mais recentemente, no Uruguai, detectou-se em seres humanos a Febre
Botonosa do Mediterrâneo, causada pela Rickettsia conorii, a qual parece ser
transmitida pelo Amblyomma triste (CONTI DIAZ, 2001), espécie de carrapato
que, no Brasil, está associada ao cervo-do-pantanal (Blastocerus dichotomus)
(SZABÓ et al., 2003). Embora esse hospedeiro seja já extinto no Uruguai,
carrapatos A. triste ainda são encontrados naquele país (LABRUNA et al.,
2004).
Além de sua importância na Sanidade Animal e na Saúde Pública, esses
ectoparasitos possuem grande relevância econômica. Os carrapatos espoliam
seus hospedeiros e induzem soluções de continuidade cutânea durante seu
repasto sangüíneo, determinando perdas econômicas consideráveis na
produção animal (RECHAV, 1992).
De fato, somando-se os gastos mundiais com programas de controle do
carrapato, especialmente os químicos, os prejuízos são bastante elevados,
estimando-se uma perda global anual em cerca de US$ 8 bilhões (RECHAV,
1992).
No Brasil, segundo Veríssimo (1993), o carrapato Boophilus microplus
ocasiona as maiores perdas econômicas, e os prejuízos são decorrentes da
morte de animais, doenças transmitidas, diminuição na produção de proteína
animal, custos com carrapaticidas e, na indústria do couro, por perda na
qualidade de matéria-prima. Grisi et al. (2002) estimaram o prejuízo causado
pelo Boophilus microplus no Brasil em aproximadamente US$ 2 bilhões anuais.
Levando-se em conta a situação apontada, tanto do ponto de vista
econômico como do de saúdes pública e animal, têm-se tentado várias formas
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Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 13
alternativas de controle ao método químico, como o biológico utilizando fungos
e o imunológico pela indução de resistência ao carrapato por meio de vacinas
(WIKEL, 1996).
Estudos biológicos mais avançados sobre a identificação, isolamento e
síntese de proteínas
protetoras de tecidos
e órgãos
de carrapato,
principalmente do aparelho reprodutor e seu emprego em vacinas, tem aberto
uma perspectiva interessante e promissora para o seu controle imunológico
(TELLAM et al., 1992).
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Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 14
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos Gerais
•
Descrever a morfologia externa de larvas e de ninfas do carrapato
Amblyomma brasiliense;
•
Estudar a morfologia interna do sistema reprodutor feminino e dinâmica
da ovogênese em A. brasiliense.
2.2. Objetivos Específicos
•
Realizar o estudo morfométrico de larvas e ninfas do carrapato A.
brasiliense;
•
Realizar estudo ultramorfológico externo de larvas e ninfas de
A. brasiliense por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV).
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Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 15
•
Realizar estudo ultramorfológico e histológico do ovário de fêmeas
ingurgitadas de A. brasiliense por meio da aplicação de técnicas de
microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de rotina histológica em
historesina, respectivamente.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 16
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Carrapatos
Foram utilizadas 30 larvas, 30 ninfas e cinco fêmeas de A. brasiliense
obtidos a partir da colônia de carrapatos mantida no Laboratório de
Imunopatologia do Departamento de Patologia Veterinária da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV–UNESP, campus de Jaboticabal,
iniciada a partir de exemplares adultos coletados em trilhas de animais no
Parque Estadual de Intervales, São Paulo. Os carrapatos foram identificados
como A. brasiliense, sob lupa estereoscópica, segundo critérios morfológicos e
chave dicotômica proposta por Jones et al., (1972) e modificada por BarrosBattesti et al. (2006).
Para a manutenção da colônia, os carrapatos foram alimentados em
hospedeiros
virgens
de
contato
(naive)
com
carrapato,
utilizando-se
preferencialmente coelhos fornecidos pelo Biotério Central da UNESP –
Botucatu, SP. Em caso de dificuldades na manutenção da colônia, adultos de
A. brasiliense foram alimentados em suínos fornecidos pelo setor de
Suinocultura da, FCAV-UNESP, câmpus de Jaboticabal, SP já que nesses
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 17
hospedeiros a espécie em questão possui melhor desempenho alimentar e
reprodutivo.
Os hospedeiros foram alimentados com ração apropriada e água ad
libitum e mantidos em locais isentos de carrapatos.
Para o repasto sangüíneo, os carrapatos ficaram restritos aos
hospedeiros por câmaras de plástico transparente coladas com material atóxico
(Britannia Adhesives® P4104 Latex, Inglaterra) ao seu dorso depilado, de
acordo
com
técnica
descrita
por
Bechara
et
al.
(1995).
Para
o
acompanhamento da metamorfose dos instares ingurgitados, bem como a sua
manutenção, os ácaros foram acondicionados em estufa para B.O.D. (modelo
CD 347, FANEM) à temperatura de 20oC, umidade de 90% e fotoperíodo de 12
horas.
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa e
Mérito Científico conforme parecer n° 012/2009 (Anexo A).
3.2. Morfometria
Utilizou-se 20 larvas e 20 ninfas selecionadas de diferentes lotes da
colônia para serem mensuradas e fotografadas. As larvas foram medidas
utilizando-se microscópio de luz (modelo MC80DX) com câmera de captura
acoplada e com o auxílio do software Motic Image Plus 2.0 ML. Para tal, larvas
com aproximadamente trinta dias foram fixadas em álcool 70% e montadas em
lâminas de vidro com bálsamo do Canadá. As ninfas também foram fixadas em
álcool 70%, porém medidos diretamente em placas de Petri com a utilização de
um estereomicroscópio (modelo Leica MZ12). O período de trinta dias foi
respeitado para que ocorresse a consolidação completa do exoesqueleto dos
exemplares.
As estruturas mensuradas foram: comprimento do gnatossoma (do ápice
do palpo até a margem da base do capítulo), largura da base do capítulo,
comprimento do hipostômio (do ápice até as cerdas pós-hipostomais), largura
do hipostômio, comprimento do palpo (do ápice do segmento tibiotarsal até a
margem posterior do trocanter), comprimento e largura dos segmentos palpais,
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 18
comprimento do idiossoma (do ápice da escápula até a margem posterior do
idiossoma), largura máxima do idiossoma, comprimento do escudo (na linha
média), largura máxima do escudo, comprimento e largura do tarso I para
larvas e comprimento dos tarsos I e IV para ninfas e adultos. As medidas
foram obtidas em milímetros e calculou-se a média e o desvio padrão para
cada medida, inclusive, os valores mínimo e máximo para cada medida,
fornecidos entre parênteses.
3.3. Ultramorfologia Externa
Cinco larvas e cinco ninfas do carrapato A. brasiliense foram fixadas por
24 horas em solução fixadora de Karnovsky e então tratados em banhos de 30
minutos cada, em série crescente de álcool 70%, 80%, 90% e 100%, sendo
três vezes na última concentração. Em seguida, o material foi levado ao ponto
crítico para completar o processo de desidratação e fixado em suporte de metal
com fita adesiva dupla face para o bombardeamento com ouro e carbono.
O material preparado foi então analisado e fotografado em microscópio
eletrônico de varredura (modelo PHILIPS 505) no Laboratório de Microscopia
Eletrônica do Departamento de Biologia no Instituto de Biociências – UNESP,
Rio Claro, SP, e também no Laboratório de Microscopia Eletrônica da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV – UNESP, Jaboticabal,
SP, utilizando o microscópio eletrônico de varredura (modelo JEOL JSM 5410).
À partir das micrografias obtidas foram realizadas as descrições.
3.4. Ultramorfologia Interna
Foram utilizados, para o estudo da ultramorfologia interna, ovários de
duas fêmeas adultas e ingurgitadas de Amblyomma brasiliense. Para a
dissecção e retirada dos ovários, os indivíduos foram colocados em placas de
Petri contendo solução fisiológica tamponada com fosfato-PBS (NaCl 7.5 g/L,
Na2HPO4 2.38 g/L e KH2PO4 2.72 g/L).
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 19
Sob estereomicroscópio, os ovários foram retirados com auxílio de
pinças e micro-tesouras e colocados em solução fixadora de Karnovsky onde
permaneceram por 2 horas. A seguir, foram desidratados em banhos de 30
minutos cada, em série crescente de álcool 70%, 80%, 90%, 95% e 100%,
sendo duas vezes na última concentração e levados ao ponto crítico para
completar a desidratação.
Finalmente, os ovários foram fixados em suporte de metal com fita
adesiva dupla face, bombardeados com ouro e carbono e analisados e
fotografado em Microscópio Eletrônico de Varredura (modelo JEOL JSM 5410)
para posterior descrição.
3.5. Histologia dos Ovários
Para a realização da histologia, três fêmeas de A. brasiliense depois de
sofrerem choque térmico em geladeira foram colocadas em placas de Petri
contendo solução fisiológica tamponada com fosfatos-PBS (NaCl 7.5 g/L,
Na2HPO4 2.38 g/L e KH2PO4 2.72 g/L).
Sob estereomicroscópio, os ovários foram retirados com auxílio de
pinças e micro-tesouras e, colocados em solução fixadora de paraformaldeído
4% durante 24 horas.
A seguir, foram desidratados em banhos de 30 minutos cada, em série
crescente de álcool etílico a 70%, 80%, 90%, 95%. Logo após, o material foi
embebido em historesina Leica e incluído no mesmo material em moldes
plásticos. Os blocos foram colados em suportes para serem seccionados em
micrótomo de onde foram obtidos cortes com a espessura de 6 μm, os quais
foram posteriormente recolhidos em lâminas de vidro previamente limpas.
Depois de secas, as lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina
(HE) conforme rotina histológica, montadas com bálsamo do Canadá em
lamínula,
para
posterior
observação
e
documentação
fotográfica
fotomicroscópio MOTIC BA 300 acoplado em microcomputador INTEL.
Gustavo Seron Sanches
em
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 20
4. RESULTADOS
Os resultados estão apresentados sob a forma de capítulos onde cada
um contém um artigo já publicado ou submetido a periódico especializado na
área.
O primeiro artigo traz a descrição da morfologia externa de larvas e de
ninfas do carrapato Amblyomma brasiliense, e o segundo, aspectos
morfológicos dos ovários de fêmeas de Amblyomma brasiliense ingurgitadas.
Desta forma, a dissertação está composta por dois capítulos, onde são
apresentados os seguintes artigos:
Capítulo 1:
Título do artigo: Morphological description of Amblyomma brasiliense Aragão,
1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs.
Autores: Gustavo Seron Sanches, Gervásio Henrique Bechara e Maria Izabel
Camargo Mathias.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 21
Periódico: Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária.
Situação: Submetido e aceito (Anexo B).
Capítulo 2:
Título do artigo: Ovary and oocytes vitellogenesis description of the tick
Amblyomma brasiliense Aragão, 1908 (Acari: Ixodidae).
Autores: Gustavo Seron Sanches, Gervásio Henrique Bechara e Maria Izabel
Camargo Mathias.
Periódico: Micron.
Situação: Submetido.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 22
Capítulo 1:
Título do artigo: Morphological description of Amblyomma brasiliense Aragão,
1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs.
Autores: Gustavo Seron Sanches, Gervásio Henrique Bechara e Maria Izabel
Camargo Mathias.
Periódico: Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária.
Situação: Submetido e aceito (Anexo B).
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 23
Resumo: Os estágios imaturos dos carrapatos Neotropicais são pouco
conhecidos e, em muitos casos, não estão descritos. Este trabalho apresenta
uma descrição morfológica de larvas (F1) e redescrição de ninfas (F1) do
carrapato Amblyomma brasiliense, relatado como um dos ixodídeos mais
agressivos ao homem no Brasil. Para este fim, carrapatos imaturos de uma
colônia iniciada com espécimes adultos do Parque Estadual de Intervales, São
Paulo, Brasil foram analisados sob microscopia eletrônica de varredura,
microscopia de luz e lupa estereoscópica. Observou-se que larvas têm a base
do capítulo retangular, palpos curtos e idiossoma arredondado, coxa I com dois
espinhos, sendo o externo mais longo que o interno e coxas II e III com um
espinho. Ninfas têm a base do capítulo retangular com córnua pontiaguda,
idiossoma oval, coxa I com dois espinhos evidentes, sendo o externo mais
longo que o interno, coxas II e III com um espinho curto em cada uma e coxa IV
com um espinho muito pequeno, presença de tubérculos quitinosos na
superfície interna da borda posterior do idiosoma. Estas características,
associadas à quetotaxia e porotaxia, poderão tornar possível a identificação
dos estágios imaturos de carrapatos do gênero Amblyomma.
Abstract: The immature stages of Neotropical ticks are poorly known and in
many cases have not been described. This work presents a morphological
description of Amblyomma brasiliense larvae (F1) and a redescription of
nymphs (F1). A. brasiliense is reported as one of the most aggressive ticks to
humans in Brazil. Immature ticks obtained from a laboratory colony initiated
from adult specimens collected in the Parque Estadual Intervales (24o18’S,
48o24’W), São Paulo, Brazil, were analyzed under scanning electron
microscope, and also under light and stereoscopic microscopes. A. brasiliense
larvae present basis capituli rectangular; short palpi; rounded idiosoma; coxa I
with two spurs, the external one being longer than the internal one; and coxae II
and III each with one short spur. Nymphs present basis capituli rectangular with
a sharp pointed cornua; oval idiosoma with scutum reaching coxa III; coxae I
with two evident spurs, the external one being longer than the internal one;
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 24
coxae II-III each with one short spur; and coxae IV with a very short spur and
chitinous tubercles on internal surface of posterior border of idiosoma.
Key words: Amblyomma brasiliense, morphology, description, larva, nymph
1. Introduction
The tick genus Amblyomma Koch 1844 is estimated to include 127
species, 57 of which are found in the Neotropical region, with 33 reported in
Brazil (Barros-Battesti et al. 2006). However there are few morphological
studies about immature stages of this genus, with larvae and nymphs still
undescribed for the majority of the species. Unfortunately, most of the existing
descriptions were made only under light microscope, and many structures
would be better observed with scanning electron microscopy (Barros-Battesti et
al. 2005).
The tick Amblyomma brasiliense Aragão (1908) is endemic to South
America with reports in Argentina, Paraguay and Brazil (Guglielmone et al.
2003), (Rio de Janeiro, São Paulo, Minas Gerais, Pará and Espírito Santo
States) (Aragão 1936; Szabó et al. 2006; Ogrzewalska et al. 2007). Previous
studies reported that larvae and nymphs of A. brasiliense are among the most
aggressive ticks to humans in Brazil (Aragão 1936), with local reaction to tick
attachment varying from almost imperceptible to intense. Itching especially, but
hyperemia and swelling as well, were prominent features of the reaction (Szabó
et al. 2006). Nevertheless, morphological descriptions of the larval stage of this
tick are unknown and nymphal stage descriptions are restricted to a study by
Aragão (1908) using light microscopy.
Therefore, the present study aims to describe immature stages of A.
brasiliense by means of light and scanning electron microscopy, thus to enable
making fast, accurate identifications of immature stages of this tick.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 25
2. Material and Methods
2.1 Origin of ticks
Larvae and nymphs were obtained from a laboratory colony derived from
unfed adult A. brasiliense ticks collected in the Intervales State Park (24o18’S,
48o24’W), São Paulo state, Brazil, from December 2003 to January 2006 and
identified to species using the taxonomic keys proposed by Barros-Battesti et al.
(2006). The procedures used to obtain larvae and nymphs have been described
elsewhere (Sanches et al. 2008).
2.2 Material preparation
A sample of 30 larvae and 30 nymphs originated from different engorged
females were kept starving for 30 days, so that the consolidation of exoskeleton
took place; afterwards they were preserved in 70% ethanol. Of these, 20 larvae
were prepared according to Famadas et al. (1996) to be measured
electronically under a MC80DX light microscope coupled with a capture digital
camera, using the software Motic Image Plus 2.0 ML. Twenty nymphs were
measured under a Leica MZ12 stereomicroscope using the same method and
all measurements are given in millimeters, with the mean followed by standard
deviation and range in brackets.
Five specimens of each immature stage were prepared for scanning
electron microscopy. The material was dehydrated for 30 minutes in each of the
following concentrations of alcohol: 70%, 80%, 90%, and 100% (three times).
They were then kept in acetone until undergoing critical point drying.
Micrographs were taken in the Electron Microscopy Laboratory of the Biology
Department at the Bioscience Institute, São Paulo State University (UNESP),
Rio Claro, São Paulo, and Laboratory of Electron Microscopy, São Paulo State
University, Jaboticabal, São Paulo, using a PHILLIPS 505 scanning electron
microscope and a JEOL JSM 5410.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 26
The terminology followed Clifford and Anastos (1960) and Hess and
Vlimant (1983) for larval idiosomal chaetotaxy, Barbieri et al. (2007) for porotaxy
and Famadas et al. (1997) for palpal and Haller´s organ terminology
The larvae and nymphs used for the description and the slide-mounted
specimens were deposited at the Department of Biology, Bioscience Institute,
São Paulo State University (UNESP), Rio Claro, São Paulo for follow-up studies
focusing on cuticular structures.
3. Results
3.1 Larva (Figures 1-6)
Gnathosoma: total length from palpal apices to posterior margin of basis
capituli 0.221 ± 0.007 (0.202 – 0.231). Dorsal basis capituli (Figure 1) width
0.182 ± 0.005 (0.175 – 0.192), rectangular shape with a lyrifissure pair on
median line, postero-lateral angles broad, cornua absent. Ventral basis (Figure
2) with posterior margin slightly convex, lateral angles rounded, auriculae
absent. The hypostome length from apices to post hypostomal seta (Ph1) 0.116
± 0.008 (0.100 – 0.129), width 0.046 ± 0.004 (0.040 – 0.054), spatulate and
compact, with a dental formula of 2/2. Short palpi with segments well defined,
length from apices of tibiotarsal segment to posterior margin of trochanter 0.139
± 0.007 (0.126 – 0.148), width 0.049 ± 0.003 (0.043 – 0.054); palpal trochanter
(article I) length 0.012 ± 0.002 (0.011 – 0.015), width 0.036 ± 0.002 (0.032 –
0.042); palpal femur (article II) length 0.055 ± 0.004 (0.050 – 0.061), width
0.047 ± 0.004 (0.040 – 0.053) and palpal genu (article III) length 0.047 ± 0.003
(0.040 – 0.054), width 0.040 ± 0.001 (0.038 – 0.042). Palpal setae (Figures 1,2):
12 setae on tibiotarsus; 6 genual setae - 1 antiaxial (Ga1), 3 dorsal (Gd1, Gd2,
Gd3), 1 paraxial (Gp1), 1 ventral (Gv1); 6 femoral setae - 1 paraxial (Fp1), 1
dorsal (Fd1, Fd2), 2 antiaxial (Fa1, Fa2), 2 ventral (Fv1, Fv2). Palpal femur with
a lyrifissure near the second femoral antiaxial seta (Fa1).
Idiosoma: dorsal surface (Figure 3) rounded, with 11 festoons and a pair of
large wax gland near lateral margin of idiosoma, anterior to the festoons. Length
from scapular apices to posterior margin of idiosoma 0.598 ± 0.012 (0.584 –
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 27
0.620), greatest width 0.598 ± 0.015 (0.575 – 0.628). Scutum outline
subtriangular, length along median line 0.273 ± 0.007 (0.260 – 0.289), width
0.448 ± 0.010 (0.435 – 0.480), irregular integument, few punctuations,
superficial cervical grooves and shallow and flat eyes on lateral scutum surface.
Dorsal setae: 3 scutal setae pairs (Sc1-Sc3), 2 central dorsal setae pairs (Cd1Cd2), and 8 marginal dorsal setae pairs (Md1-Md8). Ventral surface (Figure 4)
with a large wax gland under each coxa and on the 5th festoon of each side, 3
sternal setae pairs (St1-St3), 2 preanal setae pairs (Pa1-Pa2), 1 anal setae pair
(A), 4 premarginal setae pairs (Pm1-Pm4), 5 marginal setae pairs (Mv1-Mv5).
Legs (Figure 5): Coxa I with two spurs, the external 2.0 times longer
than internal and 3 setae, 1 anterior (CIa), 1 posterior (CIp), and 1 paraxial
(CIpa). Coxae II and III each with 1 short spur and 2 setae, 1 anterior (CIIa,
CIIIa) and 1 posterior (CIIp, CIIIp). Tarsus I (Figure 6) length 0.232 ± 0.009
(0.222 – 0.252), width 0.080 ± 0.002 (0.076 – 0.083). Setae: Dorsal - 2 in dorsal
I group (dI), 7 dorsal II (dII), 2 dorsal III (dIII), 2 dorsal IV (dIV), 0 dorsal V, 2
dorsal VI (dVI). Ventral - 2 in group 1 (vI), 2 in group 2 (vII), 2 in group IV (vIV);
lateral - 1 lateral paraxial in group I (LpI) and 1 lateral antiaxial (LaI), 1 lateral
paraxial in group II (LpII) and 1 lateral antiaxial in the same group (LaII).
3.2 Nymph (Figures 7-18)
Gnathosoma: total length from palpal apices to posterior margin of basis
capituli 0.384 ± 0.028 (0.34 – 0.42). Dorsal basis capituli (Figure 7) width 0.328
± 0.011 (0.31 – 0.35), rectangular shape, with a sharp pointed cornua and long
emargination. Ventral basis (Figure 8) with posterior margin slightly convex,
auriculae short and rounded. Short palpi with segments well defined, length
from apices of tibiotarsal segment to posterior margin of trochanter 0.250 ±
0.031 (0.2 – 0.3), width 0.093 ± 0.005 (0.09 – 0.1), palpal trochanter (article I)
length 0.036 ± 0.002 (0.032 – 0.042), width 0.054 ± 0.003 (0.052 – 0.058);
palpal femur (article II) length 0.123 ± 0.004 (0.119 – 0.125), width 0.098 ±
0.009 (0.09 – 0.111) and palpal genu (article III) length 0.118 ± 0.006 (0.105 –
0.122), width 0.082 ± 0.007 (0.068 – 0.085). Palpal setae (Figures 7, 10): 12
setae on tibiotarsus, 5 dorsal genual setae - 1 antiaxial (Ga1), 2 dorsal (Gd1,
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 28
Gd2), 2 paraxial (Gp1, Gp2); 3 ventral genual setae - 1 ventral (Gv1), 1 genual
ventral paraxial (Gp1), 1 genual ventral antiaxial (Ga1); 3 femoral dorsal setae 1 paraxial (Fp1), 1 dorsal (Fd1), 1 antiaxial (Fa1); 4 femoral ventral setae - 2
ventral (Fv1, Fv2), 2 ventral paraxial (Fp1, Fp2). The hypostome (Figure 9)
length from apices to post hypostomal seta (Ph1) 0.220 ± 0.023 (0.190 – 0.250)
width 0.109 ± 0.009 (0.090 – 0.120), spatulate and compact, with a dental
formula of 2/2; both paraxial and antiaxial files with 9 teeth each.
Idiosoma: dorsal surface (Figure 11) oval, with 11 festoons and few small
setae dispersed; many large and superficial punctuations with regular distribution.
Length from scapular apices to posterior margin of idiosoma 1.52 ± 0.072 (1.38 –
1.66), greatest width 1.27 ± 0.055 (1.22 – 1.38). Scutum dark chestnut brown
color, outline subtriangular, length along median line 0.273 ± 0.007 (0.260 –
0.289), width 0.448 ± 0.010 (0.435 – 0.480), irregular integument, punctuations
large and superficial on lateral region of scutum and fine punctuations on scutal
central short region and superficial cervical grooves, opaque and flat eyes on
lateral scutum surface. Ventral surface (Figure 12) with few small setae
dispersed, festoons with small chitinous tubercle on internal surface of posterior
border, anal aperture illustrated (Figure 15), anal groove rounded, posterior to
anus, 5 anal setae, spiracular plate (Figure 16) oval with dorsal prolongation,
eccentric macula.
Legs: moderately long, coxa I with two spurs, the external longer than the
internal and 4 setae, 2 anterior (CIa1, CIa2), 1 posterior (CIp) and 1 paraxial
(CIpa). Coxae II and III each with 1 short spur and 3 setae, 1 anterior (CIIa,
CIIIa), 1 posterior (CIIp, CIIIp) and 1 paraxial (CIIpa, CIIIpa). Coxa IV with a
very short spur and 3 setae, 1 anterior (CIVa), 1 posterior (CIVp), and 1 paraxial
(CIVpa) (Figures 13-14). Tarsus I (Figure 17) length 0.408 ± 0.024 (0.370 –
0.450), width 0.151 ± 0.003 (0.148 – 0.153), with a pair of lyrifissures on lateral
posterior region. Haller´s organ capsule aperture mainly transversely slit-like.
Tarsus IV (Figure 18) length 0.298 ± 0.026 (0.260 – 0.340), width 0.102 ± 0.014
(0.084 – 0.126).
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 29
4. Discussion
Many times, immature stages of ticks are collected from naturally
infested animals and to be identified into species are reared in laboratory hosts
and molting until the adult stage, given that taxonomic keys to larvae and
nymphs of Neotropic are inexistent or incomplete. This procedure was used by
Szabó et al. (2006) and Labruna et al. (2007). Nevertheless, considering that
some A. brasiliense-like tick species have larvae and nymphs with a long premolting period and a low molting success in laboratory (Sanches et al. 2008), it
becomes important to be able to make fast, accurate identifications of immature
stages by mean of morphological characters.
Some Brazilian studies (Szabó et al. 2006; Ogrzewalska et al. 2007)
show that in this country, A. brasiliense has been sympatric mainly with A.
incisum and A. naponense with immature stages until now not described
(Barros-Battesti et al. 2006), and A. ovale with larvae described by Barbieri et
al. (2008a).
Therefore, morphological characters and measurements of the idiosoma,
gnathosoma, and tarsus I of A. brasiliense larva were compared with other
previously described species of Neotropic such as A. parvum and A.
pseudoparvum (Guglielmone et al. 1990), A. cajennense (Famadas et al. 1997),
A. longirostre (Barros-Battesti et al. 2005), A. triste (Estrada-Peña et al. 2002),
A. parvitarsum (Estrada-Peña et al. 2005), A. nodosum (Amorim & Serra-Freire
1994), A. ovale (Barbieri et al. 2008a), and A. pacae (Barbieri et al. 2008b).
The basis capituli of A. brasiliense larvae is rectangular like in A.
parvitarsum, with dimensions similar to that tick species, but differs in the length
of the palpi - longer in A. parvitarsum. On the other hand, A. parvum and A.
pseudoparvum have a basis capituli that is slightly subtriangular or triangular
like in A. pacae and A. ovale. All species used for comparison show a spatulate
hypostome with a dental formula of 2/2 and dimensions very close to those in A.
cajennense, A. parvum, A. pacae, and A. ovale but shorter than in A. triste, A.
longirostre, and A. parvitarsum.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 30
The idiosoma of A. brasiliense larvae is rounded, with dimensions similar
to A. parvum, as measured by Barbieri et al. (2007), and chaetotaxy highly
similar and conserved among larvae of Amblyomma spp. for idiosoma
(exception for tibiotarsus and setae dII on Tarsus I).
Clifford and Anastos (1960) described the presence of four pairs of large
wax glands on the idiosoma: one pair located dorsally on the posterior lateral
margin of the body, and the others located behind each coxa. Famadas et al.
(1997) recorded for the first time a pair of these large wax glands on the fifth
festoon of A. cajennense larvae and later on Barbieri et al. (2007, 2008b)
recorded these pairs in larvae of A. parvum and A. rotundatum and A. pacae
like in A. brasiliense larvae. A. longirostre presents these pairs and an
additional pair on the fourth festoon like A. ovale larvae (Barbieri et al. 2008a).
A. brasiliense larvae have two spurs on coxa I, with the external one
being longer than the internal one. Coxae II and III each have one short spur,
as in A. cajennense, A. parvum, A. pseudoparvum, and A. nodosum, but in A.
brasiliense, the external spur is twice as long as the internal one.
According to the formula proposed by Clifford and Anastos (1960) for the
genus Amblyomma Koch, 1844, the dorsal setae of tarsus I of A. brasiliense
larvae display the 2:2:2:2:2 arrangement.
Summarizing, the main morphological characteristics of A. brasiliense
larvae are rectangular basis capituli, short palpi, rounded idiosoma, large wax
glands recorded on the fifth festoon, and spurs on coxae and chaetotaxy as
discussed.
The current re-description using electron microscope complements the
one made by Aragão (1908) of the nymphal stage of A. brasiliense using light
microscopy.
Morphological characteristics and measurements of the idiosoma,
gnathosoma, and tarsus I of A. brasiliense nymph were compared with other
previously described species such as A. parvum and A. pseudoparvum
(Guglielmone et al. 1990), A. dubitatum and A. triste (Estrada-Peña et al. 2002),
and with characteristics of A. neumanni, A. tigrinum, and A. maculatum as listed
in a taxonomic key (Estrada-Peña et al. 2005).
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 31
The basis capituli of A. brasiliense nymphs is rectangular with sharp
pointed cornua and short, rounded auriculae, similar to A. pseudoparvum.
Amblyomma neumanii also presents rectangular basis capituli, but differs in
cornua shape (rounded) and in palpi (stronger than in A. brasiliense). The
hypostome is spatulate, with a dental formula of 2/2 for all Amblyomma species
used for comparison. These characteristics corroborate Aragão (1908).
Idiosoma of A. brasiliense nymphs shows oval dorsal surface, with
measurements very close to A. parvum but differring in the length of scutum
(shorter in A. brasiliense). Aragão (1908) reported measurements that are
relatively bigger, but it is important to consider that (1) in this study the
specimens were collected in different geographic regions and (2) Aragão did not
specify the exact site of starting and ending measurements.
Amblyomma brasiliense nymphs have long legs, coxa I with two evident
spurs, the external longer than the internal; coxae II-III each with one short spur;
and coxae IV with a very short spur, consistent with Aragão (1908). These
characteristics are similar to A. parvum, and differ from A. dubitatum in the
length of spur on coxa IV (shorter in A. brasiliense). The same distribution of
spurs is observed in A. neumanii but the spurs in A. brasiliense are larger.
Amblyomma triste with triangular external spur on coxa I, A. tigrinum with
narrow external spur and small internal spur on coxa I, and A. maculatum with
narrow external spur, all present different numerical and morphological
distribution of spurs in comparison with A. brasiliense.
Summarizing, the main morphological characteristics of A. brasiliense
nymphs are rectangular basis capituli with a sharp pointed cornua, oval
idiosoma with scutum reaching coxa III, and coxae I with two evident spurs, the
external one being longer than the internal one; coxae II-III each with one short
spur; and coxae IV with a very short spur and chitinous tubercles on internal
surface of posterior border of idiosoma.
The morphological characteristics presented here must be used with
caution because larvae of many Amblyomma species from the Neotropical
region are still unknown. Additional studies of immature stages of other species
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 32
of this genus are required to allow accurate identification of Amblyomma larvae
and nymphs.
5. Acknowledgments
This research was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa no
Estado de São Paulo – FAPESP (G.S. Sanches’ scholarship 2007/52046-3,
Grant 2007/59020-0) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq (Grant 308733/2006-1; G.H. Bechara and M.I. Camargo
Mathias researcher fellowships); thanks are extended to these entities, as well
as to Monika Iamonte, Ronaldo del Vecchio, and Antonio Teruyoshi Yabuki for
technical support.
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Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 36
Figure 1-6. Amblyomma brasiliense larva. 1. Gnathosoma (dorsal view); 2. Gnathosoma (ventral view); 3.
Idiosoma (dorsal view), showing large wax gland (arrowed); 4. Idiosoma (ventral view), showing large
wax gland (arrowed); 5. Idiosoma (ventral view), showing coxae I-III spurs (arrowed); 6. Tarsus I,
showing Haller´s organ capsule (arrowed). Abbreviations: Bc, basis capituli; F, femoral; G, genual; a,
antiaxial; p, paraxial; d, dorsal; v, ventral; L, lateral; m, marginal; Tt, tibiotarsus; Ph, post hypostomal; Sc,
scutal; C, central; M, marginal, St, sternal; Pa, preanal; Pm, premarginal; A, anal; CIa, CIIa, CIIIa,
anterior setae; CIp, CIIp, CIIIp, posterior setae; CIpa, CIIpa, CIIIpa, paraxial setae. Scale bars: 0.1 mm.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 37
Figures 7-12. Amblyomma brasiliense nymph. 7. Gnathosoma (dorsal view); showing sharp
pointed cornua (arrowed); 8. Gnathosoma (ventral view); 9. Hypostome (ventral view), showing
a dental formula 2/2 (arrowed); 10. Palpi (ventral view); 11. Idiosoma (dorsal view); 12.
Idiosoma (ventral view), showing small chitinous tubercle on internal surface of festoons
(arrowed). Abbreviations: F, femoral; G, genual; a, antiaxial; p, paraxial; d, dorsal; v, ventral;
Tt, tibiotarsus; Ph, post hypostomal. Scale bars: Fig. 7-8: 0.1 mm; Fig. 9-10: 0.05mm; Fig. 1112: 0.5 mm.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 38
Figures 13-18. Amblyomma brasiliense nymph. 13. Coxae I-II (ventral view), showing spurs
(arrowed); 14. Coxae III-IV (ventral view), showing spurs (arrowed); 15. Anal aperture,
showing anal groove (arrowed); 16. Spiracular plate, showing eccentric macula (arrowed); 17.
Tarsus I; 18. Tarsus IV. Abbreviations: CIa, CIIa, CIIIa, CIVa, antiaxial setae; CIp, CIIp, CIIIp,
CIVp, paraxial setae; CIpa, CIIpa, CIIIpa, CIVpa, paraxial setae; A, anal. Scale bars: Fig. 13-15
and 17: 0.1 mm; Fig. 16 and 18: 0.05 mm.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 39
Capítulo 2:
Título do artigo: Ovary and oocytes vitellogenesis description of the tick
Amblyomma brasiliense Aragão, 1908 (Acari: Ixodidae).
Autores: Gustavo Seron Sanches, Gervásio Henrique Bechara e Maria Izabel
Camargo Mathias.
Periódico: Micron.
Situação: Submetido.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 40
Resumo: Este estudo apresenta a morfologia do ovário, bem como o processo
da dinâmica da vitelogênese de carrapatos Amblyomma brasiliense. O ovário é
do tipo panoítsico, não apresentando células nutridoras e foliculares. Este
órgão consiste de estrutura tubular única, contínua e composta de um lúmen
delimitado por uma parede formada por pequenas células epiteliais com núcleo
arredondado. Nesta espécie de carrapato, os ovócitos foram classificados em
cinco estágios, variando de I a V e descritos de acordo com a aparência do
citoplasma, presença de vesícula germinal, aspecto dos grânulos de vitelo e
deposição do córion. Ovócitos de vários tamanhos e em diferentes estágios de
desenvolvimento permanecem ligados ao ovário por meio das células do
pedicelo, até completarem o estágio V. Posteriormente, tais ovócitos são
liberados no lúmem do ovário e deste para o exterior. Pela primeira vez foi
relatado em ovócitos de carrapatos o córion esculturado.
Abstract: This study presents the morphology of the ovary, as well as the
dynamics of the vitellogenesis process in oocytes of Amblyomma brasiliense
ticks. The ovary is of the panoistic type; therefore, it lacks nurse and follicular
cells. This organ consists of a single tubular structure, continuous, and
composed of a lumen delimitated by a wall of small epithelial cells with rounded
nuclei. In this tick species, the oocytes were classified into five stages ranging
from I to V and described according to cytoplasm appearance, presence of the
germ vesicle, yolk granules aspects, and chorion deposition. Oocytes of various
sizes and at different developmental stages remain attached to the ovary
through a cellular pedicel until completing stage V. Afterwards, they are
released into the ovary lumen and from there to the exterior. For the first time
was related in ticks oocytes chorium sculptured.
Key words: Amblyomma brasiliense; tick; ovary; histology; vitellogenesis;
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 41
1. Introduction
Ticks are ectoparasites of great medical and veterinary importance,
acting as vector of pathogens responsible for diseases that affect animal and
human health worldwide and cause significant economic losses (Jon Jongejan
and Uilenberg, 2004).
The tick species Amblyomma brasiliense Aragão 1908 is endemic to
South America, with reports in Brazil, Argentina, Paraguay (Guglielmone et al.,
2003) and under natural conditions, peccaries (Tayassu spp) are considered
the primary hosts for A. brasiliense ticks (Aragão, 1936; Guimarães et al.,
2001). Previous studies reported that larvae and nymphs of A. brasiliense were
among the most aggressive ticks to humans in Brazil (Aragão, 1936).
However, there have been few works focusing morphological aspects of
this tick specie, specially internal one and reproductive system.
Thus, the present study was designed to provide data on the morphology
and histology of the female reproductive system, as well as to attempt to
establish the dynamic of vitellogenesis in A. brasiliense.
2. Material and Methods
2.1 Ticks
About five engorged females of A. brasiliense were obtained from the tick
colony maintened under controlled condictions (20°C, 90% RH and 12 H
photoperiod) at the Department of Animal Pathology, Veterinary College,
UNESP – Jaboticabal, SP, Brazil. These specimens were maintened in the
refrigerator (4°C) for thermal shock anesthesia and dissected in PBS solution
(NaCl 7.5g/L, Na2HPO4 2.38g/L and KH2 PO4 2.72 g/L) for ovaries removal.
2.2 Morphology
The removed ovaries were sectioned by means of histological routine
and the oocytes schematically drawn using camera lucida coupled to a Zeiss
stereomicroscope.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 42
2.3 Scanning Electron Microscopy (SEM)
The ovaries removed were fixed in Karnovsky for 24 h and dehydrated in
a graded 70 -100% ethanol and acetone series. The material was processed by
cryptal point drying, sputtered with gold, and examined and photographed under
a SEM JEOL JSM 5410.
2.4 Histology
The ovaries were fixed in 4% paraformaldehyde and later dehydrated in
ethanol, embedded in JB4 resin during 24 h at 4°C and then transferred to
plastic mouds previously filled with resin containing a catalyzer. After resin
polymerization, the material was sectioned using a Sorvall JB4 microtome (Bio
Rad) and stained with hematoxiline and eosin, following routine histological
procedures.
3. Results
3.1 Ultramorphology
The scanning electron microscopy revealed that the ovary of ticks A.
brasiliense consists of a single tubular organ, horseshoe shaped, with a large
number of oocytes attached by pedicel cells of various sizes and developmental
stages, since immature ones until oocytes in reabsorption process (Fig. 1). This
morphological variation of the oocytes is related to the fact that their development
are processed simultaneously but asynchronously throught the ovary. The
external surface of mature oocytes (Fig. 1C) showed presence of micropores that
probably provide the oxygenation of internal structures recovered all surface.
3.2 Histology
Histologically, the ovary of A. brasiliense ticks was classified as panoistic,
consisting of only epithelial and germinative cells, without either specialized nurse
or follicular cells. The epithelial cells forming the wall of the ovary and delimiting a
narrow lumen are small and pavimentous or cubic, with rounded nuclei (Fig. 5A).
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 43
In some regions of the epithelial wall of the ovary the presence of a
multicellular structure formed by cubic or cilindric cells denominated pedicel (Figs.
3F, 5D, E, F) can be observed fixing the oocytes found at different stages of
development to the wall of the ovary. Once mature, the oocytes are liberated
inside the lumen and from there to the exterior through oviduct, wich has a thick
and cuticular external revetment (Figs. 5B, C).
3.3 Classification of the oocytes
Because of the variation in morphological and histological appearance of
the oocytes, they were classified in five stages (Fig. 2), following the criteria
previously established for the oocytes of A. cajennense by Denardi et al. (2004).
The classification suggested for the oocytes found in the ovary of A. brasiliense
is as follows.
3.3.1 Oocytes I or primary oocytes
Oocytes with small size and often varying their shape between rounded
and elliptical shape characterized by a thin plasmic membrane delimitates a
homogeneous cytoplasmic content a germ vesicle with an evident nucleolus
(Fig. 2, 3A, C, 4A).
3.3.2 Oocytes II
Oocytes were twice larger when compared with the previous stage
(oocytes I), frequently had ellipitical shape, with fine granulation dispersed
throughout the cytoplasm, showing the beginning of production (endogenous) or
incorporation (exogenous) of yolk. The germ vesicle still present an evident
nucleolus (Figs. 2, 3A-D, 4A).
3.3.3 Oocytes III
The volume in this stage is increased in relation to previous stage
(oocytes II) and the germ vesicle is not easily remarked. A fine yolk granulation
is observed dispersed throughout the cytoplasm. Large and intense granules
are observed occupying the central region of the oocyte. The plasmic
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 44
membrane appears thick, showing characteristics of a chorion deposition (Figs.
2, 3C, E, F, 4B).
3.3.4 Oocytes IV
The volume in this stage is larger when compared to the previous stages
and the germ vesicle was no longer observed due to the yolk granulation. Large
yolk granules appear at the central region of the cytoplasm, arising from smaller
granules at the peripheral region. The thick corium appears completely deposited
and sculptured (Figs. 2, 3E, 4D).
3.3.5 Oocytes V or mature oocytes
Oocyte at the maximum developmental stage, showing large and dense
yolk granules that fill the whole cytoplasm. The periphery (region just bellow
plasmic membrane) shows a fine yolk granulation, which
probably resulted from the final stage of exogenous incorporation of yolk. The
chorion showing irregular contour is very thick, except at contact region to
pedicel, that appears tenuous and these oocytes lack a pedicel because it was
pushed into the ovarian lumen.The germ vesicle is rarely observed (Figs. 2, 3B,
F, 4E, F).
4. Discussion
The ultramorphological analysis revealed that the ovary of Amblyomma
brasiliense consists of a single tubular organ, continuous and horseshoe
shaped located at the posterior third of the engorged female body. This data
corroborate the results obtained by Sonenshine (1991) in species Dermacentor
andersoni and D. variabilis, by Denardi et al. (2004) in A. cajennense, by Saito
et al. (2005) in Rhipicephalus (Boophilus) microplus, by Oliveira et al. (2005) in
Rhipicephalus sanguineus and by Oliveira et al. (2006) in A. triste.
The scanning electron microscopy showed oocytes in undergoing
reabsorption process, corroborating Oliveira et al. (2005) in R. sanguineus and
Saito et al. (2005) in R. (B.) microplus wich observed by mean of histological
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 45
techniques and characterized these oocytes by the abnormal aspect and
cellular disorganization, as well as the presence of autophagic vacuoles in the
cytoplasm.
The histological techniques allowed classify the ovary of A. brasiliense as
of panoistic type, in wich all the cells present, except the ones that compose the
ovarian wall, are oogonies, i. e., future oocytes. In this type of ovary, nurse and
follicular cells are absent. This classification was adopted by Denardi et al.
(2004) for A. cajennense and later by the other related authors wich studied
other ticks species.
Morphologically, as in the other described tick species, the ovary of A.
brasiliense was not segmented in distinct regions of development as in the
ovaries of most arthropods. According Denardi et al. (2004), most oocytes did
not reach maturity, since they had been retarded by earlier development of the
adjacent and more proximal ones, thus showing oocytes in different stages of
development, characterizing a simultaneous but asynchronyc development of
these cells, as reported in A. brasiliense.
The morphological variation that exists between the oocytes and the
amount of yolk allowed the classification of A. brasiliense oocytes into stages
that varied from I to V, based in that proposal by Denard et al. (2004) in wich
the authors have described five different developmental stages later related by
Oliveira et al. (2005). On the other hand, Saito et al. (2005) found six stages of
development in Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Oliveira et al. (2006)
four stages in A. triste.
There have been detected the large disposition of yolk granules in the
stages IV and V in A. brasiliense, as in A. cajennense and in R. sanguineus.
Morphologic evidences confirmed the transport of elements coming from
exterior to the interior of these oocytes since stage II, contradicting Balashov
(1983) that related the origin endogenous and exogenous of the yolk, with
endogenous production occurred before the exogenous.
For the first time was observed in ticks oocytes the corium thick and
sculptured, presented like minute setae with the role not know yet.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 46
The histological techniques have shown that oocytes I to stage V were
attached to the ovarian epithelium by a cellular structure denominated pedicel, as
observed in previous studies with ticks ovaries. According to Said (1992) and
Denardi et al. (2004) the pedicel would release the most developed oocytes to the
interior of the ovary´s lumen, due to a continuous growing pressure against the
ovary wall.
Oliveira et al. (2007) validated the role for the pedicel cells in the synthesis
and supply of yolk precursors for developing oocytes, like protein, lipids and
carbohydrates in species of ticks (A. triste, for example).
5. Acknowledgements
This research was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa no
Estado de São Paulo – FAPESP (G.S. Sanches’ scholarship 2007/52046-3,
Grant 2007/59020-0) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq (Grant 308733/2006-1; G.H. Bechara and M.I. Camargo
Mathias researcher fellowships), and to Monika Iamonte, Ronaldo del Vecchio,
Antonio Teruyoshi Yabuki and Gerson de Mello Souza for technical support.
Gustavo Seron Sanches
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Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 49
Fig. 1. Scanning electron microscopy of Amblyomma brasiliense ovary. (A, B) Oocytes in
several developmental stages. (C) Mature oocytes. (D) Oocytes in reabsorption process. mo=
mature oocyte; oo= young oocyte; or= oocyte in reabsorption process. Bars: A = 0.5mm; B =
0.1mm; C = 0.01mm; D = 0.1mm.
Fig. 2. Diagrammatic summary oocytes development in A. brasiliense ovary. (A) Oocyte I. (B)
Oocyte II. (C) Oocyte III. (D) Oocyte IV. (E) Oocyte V. gv= germ vesicle; ch= chorium; nu=
nucleolus; yg= yolk granules. Bar: 0.01mm.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 50
Fig. 3. Histological sections of Amblyomma brasiliense ovary showing general view. (A)
Oocytes I and II. (B) Oocyte V. (C) Oocytes I and III. (D) Oocytes II. (E) Oocytes III and IV.
(F) Oocytes III and V. I= oocyte I; II= oocyte II; III= oocyte III; IV= oocyte IV; V= oocyte IV;
ep= ovary epithelium. Bars: 0.1mm.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 51
Fig. 4. Histological sections showing details of Amblyomma brasiliense oocytes. (A) Oocytes I
and II. (B) Oocyte III. (C) Oocyte III/IV. (D) Oocyte IV, showing sculptured chorium arrowed.
I= oocyte I; II= oocyte II; III= oocyte III; III/IV= oocyte between stages III and IV; IV= oocyte
IV; V= oocyte IV; pm= plasmic membrane; gv= germ vesicle; nu= nucleolus; yg= yolk
granules; mo= mature oocyte; pe= pedicel; ow= ovary wall. Bars: 0.01mm.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 52
Fig. 5. Histological sections of Amblyomma brasiliense ovary structures. (A) Ovary wall. (B)
Oviduct. (C) Sclerotized final oviduct arrowed. (D) Pedicel of young oocyte. (E) Pedicel of
oocyte in stage III/IV. (F) Detail of pedicel cells. pc= pedicel cells; ow= ovary wall; ovd=
oviduct; pe= pedicel; oo= young oocyte; III/IV= oocyte between stages III and IV. Bars: A =
0.01mm; B = 0.1mm; C = 0.1mm; D = 0.01mm; E = 0.01mm.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 53
5. DISCUSSÃO GERAL
As descrições morfológicas de estágios imaturos de carrapatos do
gênero Amblyomma estão disponíveis para a maioria das espécies africanas e
australianas, porém, são muito fragmentadas para as espécies neotropicais.
Das espécies descritas do Novo Mundo, a maioria é para o estágio adulto,
sendo ainda incompleta para estágios imaturos (CAMICAS et al., 1998).
Clifford e Anastos (1960) atribuem a falta de conhecimento sistemático
de larvas de carrapatos a alguns fatores como caracteres pouco consistentes
para a inclusão em chaves taxonômicas, descrições e desenhos inadequados,
poucas espécies originadas em laboratório à partir de fêmeas identificadas e a
impossibilidade de associar larvas coletadas no campo com os adultos
correspondentes.
Dessa forma, estágios imaturos coletados no campo e em animais
naturalmente infestados são alimentados em hospedeiros de laboratório até
atingirem o estágio adulto para que possam ser identificados por meio de
chaves taxonômicas até o nível de espécie, procedimento utilizado por Szabó
et al. (2006) e Labruna et al. (2007).
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 54
Considerando que em algumas espécies de carrapatos como o
Amblyomma brasiliense as larvas e ninfas apresentam longo período e baixa
taxa de ecdise em laboratório (SANCHES et al. 2008), é importante conhecer
as características morfológicas dos estágios imaturos, uma vez que podem
auxiliar na sua prévia identificação.
A espécie de carrapato A. brasiliense teve os estágios de ninfa e adultos
descritos pela primeira vez por Aragão (1908) fazendo uso de microscópio de
luz, enquanto o estágio de larva permanecia até o presente momento não
descrito na literatura.
Alguns
estudos
realizados
no
Brasil
(SZABÓ
et
al.
2006;
OGRZEWALSKA et al. 2007) mostraram que o A. brasiliense tem sido
simpátrico com outras espécies como A. incisum e A. naponense, com estágios
imaturos também não descritos (BARROS-BATTESTI ET AL. 2006), e A. ovale,
com larvas descritas por Barbieri et al. (2008a).
Assim, as características morfológicas e as medidas do idiosoma,
gnatossoma e tarso I das larvas de A. brasiliense são comparadas com outras
espécies do Neotrópico previamente descritas tais como A. parvum e A.
pseudoparvum (GUGLIELMONE et al. 1990), A. nodosum (AMORIM E
SERRA-FREIRE 1994), A. cajennense (FAMADAS et al. 1997), A. triste
(ESTRADA-PEÑA et al. 2002), A. longirostre (BARROS-BATTESTI et al. 2005),
A. parvitarsum (ESTRADA-PEÑA et al. 2005), A. ovale (BARBIERI et al. 2008a)
and A. pacae (BARBIERI et al. 2008b).
A base do capítulo das larvas de A. brasiliense é retangular assim como
em A. parvitarsum, com dimensões similares a esta espécie, porém difere
desta por apresentar o palpo mais curto. Por outro lado, A. parvum e A.
pseudoparvum apresentam a base do capítulo subtriangular ou triangular,
assim como A. pacae e A. ovale. Todas as espécies utilizadas para
comparação apresentam hipostômio espatulado com formula dental 2/2, assim
como o A. brasiliense, cujas dimensões desta estrutura são próximas de A.
cajennense, A. parvum, A. pacae e A. ovale, porém tem comprimento menor
que em A. triste, A. longirostre e A. parvitarsum.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 55
O idiossoma das larvas de A. brasiliense é arredondado, com dimensões
similares às encontradas em A. parvum por Barbieri et al. (2007), e a
quetotaxia mostrou-se altamente similar e conservada entre as larvas de
Amblyomma spp. para o idiossoma, com exceção ao tibiotarso e à cerda dII (7
em A. brasiliense) no tarso I.
Clifford e Anastos (1960) descreveram a presença de quarto pares de
grandes glândulas de cera (large wax glands) no idiossoma de larvas de
Amblyomma, um par localizado dorsalmente na margem posterior lateral do
corpo, e os outros localizados atrás de cada coxa.
Famadas et al. (1997) registrou pela primeira vez um par de large wax
glands no quinto festão de larvas de A. cajennense e, posteriormente, Barbieri
et al. (2007, 2008b) relatou esses pares em larvas de A. parvum, A.rotundatum
e A. pacae assim como em larvas de A. brasiliense, enquanto A. longirostre
apresentou esses pares e ainda, um par adicional no quarto festão, assim
como as larvas de A. ovale (BARBIERI et al. 2008a).
As larvas de A. brasiliense possuem dois espinhos na coxa I, sendo o
externo mais longo que o interno, e coxas II e III com um espinho curto em
cada uma como A. cajennense, A. parvum, A. pseudoparvum e A. nodosum,
porém, neste último, o espinho externo é duas vezes mais longo que o interno.
De acordo com a formula proposta por Clifford e Anastos (1960) para o
gênero Amblyomma, as cerdas dorsais do tarso I de larvas de A. brasiliense
também apresentam o arranjo 2:2:2:2:2.
A presente redescrição das ninfas de A. brasiliense complementam
aquela realizada por Aragão (1908) utilizando apenas microscopia de luz.
As características morfológicas e as medidas do idiossoma, gnatossoma
e tarso I desta espécie são comparadas com outras espécies de ninfas
previamente
descritas,
tais
como
A.
parvum
e
A.
pseudoparvum
(GUGLIELMONE et al. 1990), A. dubitatum e A. triste (ESTRADA-PEÑA et al.
2002) e com características de A. neumanni, A. tigrinum e A. maculatum
listadas em chave taxonômica (ESTRADA-PEÑA et al. 2005).
As ninfas de A. brasiliense apresentam a base do capítulo retangular
com córnua pontiaguda e aurícula curta e arredondada, semelhante a A.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 56
pseudoparvum. Amblyomma neumanii também apresenta base do capítulo
retangular, porém, diferentemente de A. brasiliense, a córnua tem formato
arredondado e o palpo é mais largo e curto. Assim como nas larvas de
Amblyomma, as ninfas usadas para comparação também possuem hipostômio
espatulado com fórmula dental 2/2, característica que corrobora à Aragão
(1908).
O idiossoma das ninfas da espécie em discussão apresenta superfície
dorsal oval, com medidas próximas às encontradas em A. parvum, diferindo
desta pelo comprimento do escudo (mais curto em A. brasiliense).
Aragão (1908) relata medidas aproximadamente maiores para o
idiossoma, porém é importante considerar que neste estudo os espécimes
foram coletados em região geográfica diferente deste e que não é mencionado
o local exato de início e final para a realização de cada medida.
Ninfas de A. brasiliense apresentam pernas longas, coxa I com dois
espinhos evidentes, sendo o externo mais longo que o interno, coxas II e III
com um espinho em cada e coxa IV com um espinho bastante curto,
corroborando Aragão (1908). Tais características são similares a A. parvum e
diferem de A. dubitatum no tamanho do espinho na coxa IV (mais curta em A.
brasiliense). A mesma distribuição de espinhos é observada em A. neumanii,
porém os espinhos de A. brasiliense são maiores. A. triste com espinhos
externos da coxa I triangulares e A. tigrinum com espinho externo estreito e
pequeno espinho interno na coxa I e A. maculatum com espinho externo na
coxa I também estreito apresentam distribuição numérica e morfológica de
espinhos diferentes de A. brasiliense.
Parafraseando Barros-Battesti et al. (2005), é necessário utilizar as
características morfológicas com cuidado, visto que a maioria das larvas e
também ninfas do gênero Amblyomma da região Neotropical permanecem
ainda desconhecidas.
Complementando informações sobre a espécie de carrapato A.
brasiliense, é aqui apresentado pela primeira vez o estudo ultramorfológico do
sistema reprodutor de fêmeas desta espécie, revelando que o ovário consiste
em um órgão tubular único e contínuo em forma de ferradura, localizado no
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 57
terço posterior do corpo, confirmando os dados de Sonenshine (1991) em
Dermacentor andersoni e D. variabilis, Denardi et al. (2004) em A. cajennense,
Saito et al. (2005) em Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Oliveira et al.
(2005) em Rhipicephalus sanguineus e Oliveira et al. (2006) em A. triste.
A microscopia eletrônica de varredura mostrou também a presença de
ovócitos em processo de reabsorção. Oliveira et al. (2005) e Saito et al. (2005)
observaram ovócitos neste estágio em Rhipicephalus sanguineus e em R.
(Boophilus) microplus, respectivamente, e, através de técnicas histológicas os
caracterizaram pelo aspecto anormal e pela desorganização celular, incluindo a
presença de vacúolos autofágicos no citoplasma.
As técnicas histológicas permitiram classificar o ovário de A. brasiliense
como panoístico, uma vez que todas as células presentes, exceto as que
compõem a parede do ovário são ovogônias, ou seja, futuros ovócitos.
Segundo Denardi et al. (2004), neste tipo de ovário as células nutridoras e em
carrapatos também as foliculares estão ausentes.
Morfologicamente, como nas outras espécies de carrapatos já descritas,
o ovário de A. brasiliense não é segmentado em regiões distintas de
desenvolvimento como no ovário da maioria dos artrópodes. De acordo com
Denardi et al. (2004), a maioria dos ovócitos não atinge sincronicamente a
maturidade, uma vez que eles tem seu desenvolvimento inicial retardado pelos
ovócitos adjacentes e próximos destes, então, ovócitos em diferentes estágios
de desenvolvimento são encontrados, caracterizando um desenvolvimento
simultâneo, porém assincrônico, como observado também em A. brasiliense.
As variações morfológicas existentes entre os ovócitos do A. brasiliense
e a diferente deposição do vitelo no citoplasma permitiram classifica-los em
cinco estádios, conforme proposto por Denardi et al. (2004), em que os autores
descreveram também estes desenvolvimentos, assim como relatado por
Oliveira et al. (2005). Por outro lado, Saito et al. (2005) encontraram seis
estágios de desenvolvimento em R. (B.) microplus, enquanto Oliveira et al.
(2006) quatro em A. triste.
Em A. brasiliense foi detectada grande deposição de grânulos de vitelo
nos estágios IV e V assim como em A. cajennense e em R. sanguineus em que
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 58
as evidências morfológicas confirmam a ocorrência principalmente de
elementos vindo do exterior para o interior dos ovócitos (incorporação exógena)
desde o estágio II, contradizendo Balashov (1983) que sugere origem
endógena e exógena para o vitelo, porém relata primeiramente a origem
endógena e posterior a esta, a deposição exógena.
Pela primeira vez foi observado em carrapatos ovócitos com a presença
de córium espesso e esculturado, apresentando diminutas cerdas, cuja função
ainda não foi estabelecida.
As técnicas histológicas mostraram que os ovócitos I a V estão presos a
parede epitelial do ovário por uma estrutura celular denominada pedicelo,
também já observada em outros estudos com ovários de carrapatos. Said (1992)
e Denardi et al. (2004) relatam que o pedicelo exerce uma pressão crescente em
ovócitos desenvolvidos contra a parede do ovário, que os empurra para dentro do
lúmem.
Oliveira et al. (2007) estudando o A. triste validou a função de síntese e
suprimento de precursores de vitelo como lipídeos, proteínas e carboidratos para
as células do pedicelo.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 59
6. CONCLUSÕES
1. As principais características morfológicas observadas nas larvas de A.
brasiliense são: base do capítulo retangular, palpos curtos, idiossoma
arredondado, presença de “large wax gland” no quinto festão, coxa I
com dois espinhos, sendo o externo maior que o interno, e coxas II e III
com um espinho em cada uma.
2. A quetotaxia das larvas de A. brasiliense mostrou-se similar e
conservada entre as diversas espécies de do gênero Amblyomma, com
exceção ao tibiotarso e às cerda dII no tarso I.
3. As principais características morfológicas observadas nas ninfas de A.
brasiliense são: base do capítulo retangular com córnua pontiaguda,
aurícula curta e arredondada, idiossoma oval, coxa I com dois espinhos
evidentes, sendo o externo mais longo que o interno, coxas II e III com
um espinho curto e coxa IV com um espinho muito curto.
4. Ninfas de A. brasiliense apresentam tubérculos quitinosos na superfície
interna da borda posterior do idiossoma.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 60
5. Estudos adicionais são necessários para que seja possível a
identificação de estágios imaturos do gênero Amblyomma da região
Neotropical, por meio de chaves taxonômicas.
6. O ovário de carrapatos Amblyomma brasiliense é do tipo panoístico.
7. À parede do ovário de A. brasiliense estão presos ovócitos em cinco
estágios de desenvolvimento (I-V) por meio do pedicelo celular.
8. Os ovócitos de A. brasiliense apresentam desenvolvimento assincrônico.
9. Pela primeira vez é relatado em ovócitos de carrapatos presença de
córium espesso e esculturado, apresentando diminutas cerdas com
função ainda não estabelecida.
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 61
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Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 68
ANEXO A
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 69
ANEXO B
Gustavo Seron Sanches
Caracterização da morfologia externa e do sistema reprodutor de fêmeas de Amblyomma brasiliense 70
Gustavo Seron Sanches
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