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Abstract

Doxorubicin is a DNA-damaging agent, widely used as a chemotherapeutic in clinics to treat HER2-positive breast cancer patients. Despite the overall cytotoxic effect, some cancerous cells may survive the treatment by successfully repairing DNA breaks or converting the original damage into mutations. In the long term, their sustained presence may lead to therapy resistance, cancer relapse, and secondary malignancies. The interaction between DNA damage induced by drugs and repair pathways leaves characteristic patterns, called mutational signatures. While base substitutions or small indel signatures have been annotated for some chemotherapies, the pattern and impact of structural variants (SVs) have remained underexplored. In this thesis, I investigated the SV burden and transcriptomic changes promoted by doxorubicin, at the single-cell level, in a murine mammary gland organoid model of HER2-positive breast cancer. Single-cell transcriptomic profiling revealed the three main cell types present in the murine mammary gland organoids, as well as both global and cell-type-specific, changes induced by doxorubicin. In addition, single-cell DNA template strand sequencing (Strand-seq) was further developed and applied here for the first time to characterize doxorubicin-associated genomic instability in murine organoids. Thanks to a novel computational single-cell multi-omic method, scNOVA, genomic data were integrated with nucleosome occupancy (NO) measurements to enable simultaneous SV detection and cell-type classification in the same cell. Strand-seq and scNOVA integration showed that doxorubicin is associated with a higher SV burden and increased frequency of sister chromatid exchanges in all three cell types of murine mammary gland organoids. Deletions and complex rearrangements emerged as candidate mutational patterns of doxorubicin. Taken together, the results presented in this thesis exemplify the synergistic integration of organoid models with single-cell multi-omic readouts for the systematic study of heterogenous populations and demonstrate the necessity to expand the search for therapy-associated mutational signatures to SVs.

Translation of abstract (German)

Doxorubicin ist ein DNA-schädigender Wirkstoff, der in Kliniken häufig als Chemotherapeutikum zur Behandlung von HER2-positiven Brustkrebspatientinnen eingesetzt wird. Trotz der insgesamt zytotoxischen Wirkung der Behandlung können einige Krebszellen überleben, indem sie DNA-Brüche erfolgreich reparieren oder die ursprünglichen Schäden in Mutationen umwandeln. Langfristig kann ihre anhaltende Präsenz zu Therapieresistenz, Krebsrückfällen und sekundären Malignomen führen. Die Wechselwirkung zwischen den durch Medikamente verursachten DNA-Schäden und den Reparaturwegen hinterlässt charakteristische Muster, die so genannten Mutationssignaturen. Während für einige Chemotherapeutika Basensubstitutionen oder kleine Indelsignaturen beschrieben wurden, sind die Muster und Auswirkungen von Strukturvarianten (SVs) noch nicht ausreichend erforscht. In dieser Arbeit untersuchte ich die SV-Belastung und die transkriptomischen Veränderungen, die durch Doxorubicin gefördert werden, auf Einzelzellebene in einem murinen Brustdrüsenorganoidmodell von HER2-positivem Brustkrebs. Einzelzell-Transkriptom-Untersuchungen zeigten die drei wichtigsten Zelltypen, die in den Brustdrüsenorganoiden der Maus vorkommen, sowie globale als auch zelltypspezifische Veränderungen, die durch Doxorubicin ausgelöst werden. Darüber hinaus wurde die Einzelzell-DNA-Template-Strangsequenzierung (Strand-seq) weiterentwickelt und hier zum ersten Mal angewandt, um die Doxorubicin-assoziierte genomische Instabilität in murinen Organoiden zu charakterisieren. Dank einer neuartigen computergestützten Multi-Zell-Methode, scNOVA, wurden genomische Daten mit Messungen der Nukleosomenbelegung (NO) integriert, um eine gleichzeitige SV-Erkennung und Zelltyp-Klassifizierung in derselben Zelle zu ermöglichen. Die Integration von Strand-seq und scNOVA zeigte, dass Doxorubicin mit einer höheren SV-Belastung und einer erhöhten Häufigkeit von Schwesterchromatidaustauschen in allen drei Zelltypen von Brustdrüsenorganoiden der Maus verbunden ist. Deletionen und komplexe Rearrangements erwiesen sich als mögliche Mutationsmuster von Doxorubicin. Zusammengenommen veranschaulichen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse die synergistische Integration von Organoidmodellen mit multizellulären Einzelzellmessungen für die systematische Untersuchung heterogener Populationen und machen deutlich, dass bei der Suche nach therapieassoziierten Mutationssignaturen SVs einzuschliessen sind.